KR20130024972A - 조직 특이적 펩티도미메틱 리간드를 사용하는 표적화된 전달 - Google Patents
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Abstract
본원에서는 조직 특이적 펩티도미메틱 리간드를 사용하여 치료제를 조직 특이적으로 표적 전달하기 위한 조성물 및 방법이 기재된다. 상기 리간드는 화학식 A-스캐폴드-A'의 조성 및 상기 스캐폴드에 공유 결합된 하나 이상의 소수성 앵커를 포함한다. 상기 스캐폴드에 결합된 A 화합물 및 A' 화합물은 1가의 펩티도미메틱 화합물을 포함하며, 상기 1가의 펩티도미메틱 화합물 각각은 IK, GK, ID, GS, GT, VS, TK, KT, AR, KI, KE, AE, GR, YS, IR 및 모르폴리노 단편들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
Description
본 발명은 일반적으로 질환 치료 및 진단 분야에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 제제를 특정 표적 조직에 전달하기 위한 신규한 조성물 및 방법의 개발에 관한 것이다.
본 발명의 범위를 제한하지 않으면서, 본 발명의 배경기술을 특정 표적 조직으로의 전달과 관련하여 기술한다.
암 치료를 위한 치료제의 정맥내 주사는 궁극적인 치료로서 간주되는데, 그 이유는 모든 종양 및 이의 전이가 혈관에 의해 지속되기 때문이다. 이들 종양 혈관층(vascular bed)은 리포솜이 종양 세포에 직접 접근할 수 있도록 충분히 누출성(leaky)이다. 종양 혈관에 전달된 항-혈관신생 약물 또는 유전자 치료제는 종양에 대한 혈액 공급을 차단함으로써 종양 회귀(tumor regression)를 유발하는데 사용될 수 있다.
표적화된 전달은 최대 효능 및 독성 감소를 위해 필수적이다. 대부분의 리포솜 전달 시스템의 광범위한 치료학적 적용 분야에서의 주요 제한사항은 이들의 불량한 생체내 형질전환 효율, 정맥내 전달 후 폐 내의 축적, 응집, [예컨대, 쿠퍼 세포(Kupffer cell)에 의한] 전신 전달 후의 청소율(clearance), 주입된 대량의 리포솜 복합체를 표적 세포 및 기관에 전달하지 못함 및 기타 문제들이다. 암 치료를 위한 표적화된 전달은 효율적인 표적화에 사용되는 공지된 세포 표면 수용체들의 부족 때문에 한층 더 복잡해진다.
본 발명은 치료제의 조직 특이적 표적 전달을 위한 표적화 리간드를 포함한다. 상기 리간드는 화학식 A-스캐폴드-A'의 조성 및 상기 스캐폴드에 공유 결합된 하나 이상의 소수성 앵커(hydrophobic anchor)를 포함한다. 상기 스캐폴드에 결합된 A 화합물 및 A' 화합물은 1가 펩티도미메틱 화합물(monovalent peptidomimetic compound)을 포함하며, 상기 1가 펩티도미메틱 화합물 각각은 IK, GK, ID, GS, GT, VS, TK, KT, AR, KI, KE, AE, GR, YS, IR 및 모르폴리노 단편들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 화합물 A와 화합물 A'는 동일할 수 있다. 상기 스캐폴드는 반응성 디클로로트리아진 그룹을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 소수성 앵커들 중의 하나 이상은 탄화수소 잔기를 포함한다. 일례로, 상기 탄화수소 잔기는 옥타데실 그룹일 수 있다. 상기 표적화 리간드는 상기 스캐폴드와 상기 소수성 앵커 사이에 기능적으로 개재된, 개열가능하거나 개열불가능한 하나 이상의 링커(linker)를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명 또한, 치료제의 표적 전달을 위한 소분자 복합체를 합성하는 방법도 제공한다. 상기 방법은, 둘 이상의 1가 펩티도미메틱 화합물을 스캐폴드에 공유적으로 커플링시킴(여기서, 상기 1가 펩티도미메틱 화합물 각각은 IK, GK, ID, GS, GT, VS, TK, KT, AR, KI, KE, AE, GR, YS, IR 및 모르폴리노 단편들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); 및 상기 스캐폴드에 하나 이상의 소수성 앵커를 공유적으로 커플링시킴을 포함한다. 화합물 A와 화합물 A'는 동일할 수 있다. 상기 스캐폴드는 반응성 디클로로트리아진 그룹을 포함할 수 있다. 하나의 양태에서, 상기 소수성 앵커들 중의 하나 이상은 탄화수소 잔기를 포함한다. 일례로, 상기 탄화수소 잔기는 옥타데실 그룹일 수 있다. 상기 표적화 리간드는, 상기 스캐폴드와 상기 소수성 앵커 사이에 기능적으로 개재된, 개열가능하거나 개열불가능한 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명은 또한, 치료제 담체 및 상기 치료제의 조직 특이적 표적 전달을 위한 표적화 리간드를 포함하는, 리간드-작용성 전달 시스템도 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 치료제 담체는 리포솜이다. 일례로, 상기 표적화 리간드는 하나 이상의 소수성 앵커를 통하여 내부 지질 이중층과 외부 지질 이중층을 갖는 양이온성 리포솜의 상기 외부 지질 이중층의 외부 표면에 비공유적으로 앵커링된다.
본 발명의 또 다른 양태는 표적 조직에 페이로드(payload)를 전달하는 방법을 포함한다. 상기 방법은, 치료제의 조직 특이적 표적 전달을 위한 표적화 리간드를 합성하는 단계; 상기 표적화 리간드를, 치료제를 캡슐화하는, 세포막 또는 준세포막(subcellular membrane)과 같은 지질 이중층 또는 다중라멜라 또는 이중라멜라 소포 또는 더욱 구체적으로는 이중라멜라 리포솜에 혼입시키는 단계; 상기 리포솜을 표적화 리간드로 피복하는 단계; 상기 표적화 리포솜 복합체를 가역적 마스킹제(reversible masking reagent)와 결합시키는 단계; 및 상기 마스킹된 표적화 리포솜 복합체의 치료학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 하나의 양태에서, 상기 리포솜은 이중라멜라 함입형 소포(BIV: bilamellar invaginated vesicle)일 수 있다. 분자량이 약 500 Da 이하인 소형 중성 지질이 가역적 마스킹제로서 사용될 수 있다. 상기 표적 조직으로는 사람 췌장암, 사람 유방암, 사람 비-소세포 폐암종, 사람 비-소세포 폐암종 혈관 내피, 흑색종 또는 사람 췌장암 혈관 내피가 포함될 수 있다. 표적화 리간드의 예로는 화합물 KB995, KB1001, KB1003, KB1005, KB1012, KB1023, KB1029, KB1035, KB1036, KB1039, KB1042, KB1051, KB1061, KB1062, KB1063, KB1064, KB1066, KB1067, KB1096, KB1107, KB1108 또는 KB1109 중의 적어도 하나가 포함된다. 하나의 측면에서, 상기 표적 조직은 흑색종이며, 상기 표적화 리간드는 화합물 KB1037, KB1109 및 KB1123 중의 적어도 하나이다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 표적 조직에 결합시키기 위한 펩티도미메틱 화합물을 단리하는 방법을 포함하며, 상기 방법은, 화학식 A-스캐폴드-A'의 조성(여기서, A 및 A'는 1가 펩티도미메틱 화합물을 포함하고, 상기 1가 펩티도미메틱 화합물 각각은 IK, GK, ID, GS, GT, VS, TK, KT, AR, KI, KE, AE, GR, YS, IR 및 모르폴리노 단편들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다); 및 상기 스캐폴드에 공유 결합된 하나 이상의 소수성 앵커를 제조하는 단계; 표적 조직을 상기 펩티도미메틱 화합물과 접촉시키는 단계; 상기 표적 조직에 특이적으로 결합하는 펩티도미메틱 화합물들을 단리하는 단계; 및 상기 표적 조직에 특이적으로 결합된 상기 조성의 화학식을 확인하는 단계를 포함한다. 상기 표적 조직으로는 사람 췌장암, 사람 유방암, 사람 비-소세포 폐암종, 사람 비-소세포 폐암종 혈관 내피, 사람 흑색종, 또는 사람 췌장암 혈관 내피가 포함될 수 있다. 하나의 측면에서, 상기 방법은 해리 직후 환자 세포를 스크리닝하기 위한 고속 대량 분석(high throughput assay)을 포함한다. 하나의 측면에서, 상기 펩티도미메틱 화합물 라이브러리는 소수성 꼬리 대신에 예를 들면 유로퓸 또는 테르븀 크립테이트로 라벨링된다. 해리된 환자 세포는 시분할 형광분석법(time resolved fluorometry)을 사용하여 종양 세포 대 정상 세포에 관해 직접 스크리닝된다.
하나의 양태에서, 본 발명은 표적 조직 또는 세포에 결합하는 펩티도미메틱 화합물을 스크리닝하는 방법을 포함하며, 상기 방법은, 화학식 A-스캐폴드-A'(여기서, A 및 A'는 펩티도미메틱 화합물을 포함하고, 상기 1가 펩티도미메틱 화합물 각각은 IK, GK, ID, GS, GT, VS, TK, KT, AR, KI, KE, AE, GR, YS, IR 및 모르폴리노 단편들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)의 조성의 펩티도미메틱 라이브러리를 제조하는 단계; 하나 이상의 이중-지질층 앵커를 상기 펩티도미메틱 화합물에 공유적으로 부착시키는 단계; 상기 펩티도미메틱 화합물을 지질과 혼합하여 리포솜을 형성하는 단계; 표적 조직을 상기 펩티도미메틱 화합물과 접촉시키는 단계; 상기 표적 조직에 특이적으로 결합하는 펩티도미메틱 화합물들을 단리하는 단계; 및 상기 표적 조직에 특이적으로 결합된 상기 조성의 화학식을 확인하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태는 표적 조직 또는 세포에 결합하는 펩티도미메틱 화합물을 스크리닝하는 방법으로서, 상기 방법은, 화학식 A-스캐폴드-A'(여기서, A 및 A'는 펩티도미메틱 화합물을 포함하고, 상기 1가 펩티도미메틱 화합물 각각은 IK, GK, ID, GS, GT, VS, TK, KT, AR, KI, KE, AE, GR, YS, IR 및 모르폴리노 단편들로 이루어진 그룹으로부터 선택된다)의 조성의 펩티도미메틱 라이브러리를 제조하는 단계; 하나 이상의 이중-지질층 앵커를 상기 펩티도미메틱 화합물에 공유적으로 부착시키는 단계; 상기 펩티도미메틱 화합물을 지질과 혼합하여 리포솜을 형성하는 단계(여기서, 상기 리포솜은 세포에 전달하기 위한 핵산을 추가로 포함한다); 표적 조직을 상기 펩티도미메틱 화합물과 접촉시키는 단계; 상기 표적 조직에 특이적으로 결합하는 펩티도미메틱 화합물들을 단리하는 단계; 및 상기 표적 조직에 특이적으로 결합된 상기 조성의 화학식을 확인하는 단계를 포함한다. 하나의 측면에서, 표적 조직은 추가로 조직 배양물 중의 세포로서 정의된다. 또 다른 측면에서, 표적 조직은 추가로 조직 배양물 중의 세포로서 정의되며, 상기 세포는 상기 세포에 대한 상기 핵산의 효과를 기반으로 선택된다. 또 다른 측면에서, 표적 조직은 추가로 조직 배양물 중의 세포로서 정의되며, 상기 핵산은 네거티브 또는 포지티브 선택에 대한 선택적 마커이거나, 포지티브 또는 네거티브 선택에 대한 선택적 마커를 발현하거나, 검출가능한 마커를 발현한다.
이제, 본 발명의 특징 및 이점의 더욱 완벽한 이해를 위해, 첨부된 도면을 참조로 본 발명을 상세히 설명한다.
도 1은 상기 화합물을 식별하기 위한 일반적 반응식의 도면이다.
도 2는 피페리딘과 치환된 플루오레세인의 선택적 반응을 통한 이량체의 제조를 도시한 것이다.
도 3은 정맥내 주사된 BIV 복합체의 90% 이상을 전적으로 표적 세포에 전달하기 위한 최적화된 표적화 전략의 최적 양태를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 각종 화합물들의 구조를 도시한 것으로, 일반적 구조가 상단에 도시되어 있고, 특정 구조물 KB991 내지 KB1005가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 열거되어 있다.
도 5는 본 발명의 결합 부분들(A 및/또는 A')의 조합을 요약한 것이다.
도 6은 본 발명에서의 구조의 일례를 도시한 것으로, 일반적 구조가 상단에 도시되어 있고, 특정 구조 KB991 내지 KB1005가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 열거되어 있다.
도 7a 내지 도 7d는 본 발명의 결합 부분들의 일부의 최적 양태를 보여준다(A= 단편 A 및/또는 A'= 단편 B).
도 8은 열거된 화합물의 MCF7 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다.
도 9는 열거된 화합물의 A549 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다.
도 10은 열거된 화합물의 MCF10A 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다.
도 11은 피복된 리포솜 전달 시스템 중의 열거된 화합물들을 사용한 Panc1 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 그래프이다.
도 12는 피복된 리포솜 전달 시스템 중의 열거된 화합물들을 사용한 Mia PaCa2 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 그래프이다.
도 13은 피복된 리포솜 전달 시스템 중의 열거된 화합물들을 사용한 HPDE 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 그래프이다.
도 14는 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 및 H1299 세포의 공동-배양물에서의 형질전환 향상을 도시한 것이다.
도 15는 열거된 화합물을 갖는 H1299 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 16은 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 향상을 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 17은 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 및 PANC1 세포의 공동 배양물에서의 형질전환 향상을 도시한 것이다.
도 18은 열거된 화합물을 갖는 PANC1 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 19는 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 20a 내지 도 20c. 공동-배양 후의 내피 CD31+ 발현의 증가. 본 발명자들은 세포 계수 후 HUVEC:H1299 30:1의 평판배양 비로 공동-배양물을 확립하였다. 피코에리트린-접합된 항-CD31 Ab에 의해 내피 세포를 염색하고, 접종 후 유동 세포 분석법(flow cytometry)을 사용하여 상기 내피 세포 군집[R3에 의해 게이팅(gated)됨]을 매일 측정하였다. 상기 내피 세포들 중 절대 다수는 낮은 수준의 CD31을 발현하였다(R4에 의해 게이팅됨). 상기 내피 세포들 중 소수는 높은 수준의 CD31을 발현하였다(R2에 의해 게이팅됨). 공동-배양 후 8일 후에, 상기 공동-배양물의 내피 세포 군집은 CD31 발현이 HUVEC 대조물의 것에 비해 현저하게 증가하였다(c). 9일 후 CD31 발현의 향상은 HUVEC 대조물(a, c)보다 공동-배양물(b, c)에서 훨씬 더 컸다. *P=0.026.
도 21a 및 도 21b. 공동-배양 후의 내피 VEGF-A 발현의 향상. HUVEC:PANC1 10:1의 평판배양 비로 공동-배양물을 확립하고, 8일간 2-챔버 트랜스웰 접시에서 경작하였다. 내피 세포를 수확하고, 실시간 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 VEGF-A 발현을 측정하였다. 내피 VEGF-A 발현은 공동-배양 후 전사 수준(a) 및 번역 수준(b)에서 HUVEC 대조물의 것에 비해 증가되었다. *P<0.01, N=6.
도 22a 내지 도 22f. 공동-배양 후의 지속된 관 생존(prolonged tube survival). 트랜스웰 접시에서 HUVEC:PANC1 10:1의 평판배양 비로 공동-배양한 후 8일 후에, 내피 세포를 수확하고 매트리겔(Matrigel) 상에 접종하였다. 16시간 후, HUVEC 대조물(a) 및 공동-배양물의 내피 세포(b)는 둘 다 모세혈관과 유사한 관상 구조물을 형성하였다. 이들 구조물은 48시간 후 분해되기 시작하였다. 약 72시간째에 HUVEC 대조물의 관상 구조는 거의 완전히 분해되었다(c). 그러나, 공동-배양물에서는 상당량의 관상 구조물이 생존하였다(d). 이들 구조물은 우수한 관상 망상구조를 유지하였으며 11일 이상 동안 생존하였다(e, f).
도 23a 및 도 23b. 2가 소분자 구조 및 라이브러리 스크리닝. 2가 소분자의 일반적 구조(23a)는 세포 표면 수용체와 상호작용하기 위한 2개의 β-턴 모사체, BIV 리포솜 복합체로의 삽입을 위한 탄화수소 꼬리 및 링커를 포함한다. 본 발명자들의 "적중물(hit)" 분자 KB1023의 구조도 도시되어 있다. 종양 내피 세포-특이적 표적화 리간드를 스크리닝하기 위해 고속 대량 루시퍼라제 분석(23b)을 사용하였다. 공동-배양 후 7일 후에, 세포를 수확하고 96-웰 플레이트에 2x104 세포/웰로 접종하였다. 같은 날, BIV-루시퍼라제 DNA:리포솜 복합체를 제조한 후, 다양한 화합물:DNA 비로 화합물들을 피복하였다. 피복된 복합체를 실온에서 밤새 항온처리하였다. 다음 날, 피복된 복합체 0.52㎕를 함유하는 무혈청 배지 50㎕로 세포를 형질전환시켰다. 형질전환 배지를 혈청을 함유하는 세포 배양 배지로 대체함으로써 형질전환을 종결시켰다. 형질전환 후 24시간 후에, 세포를 용해시키고, 루미노스캔(Luminoskan) 플레이트 판독기를 사용하는 루시퍼라제 분석을 위해 세포 용해물을 96-웰 플레이트에 20㎕/웰로 로딩하였다.
도 24는 본 발명의 방법의 흐름도이다.
도 25a 내지 도 25h. 췌장 및 폐 종양 내피 표적화 리간드. 화합물 KB1023은 PANC1+HUVEC 공동-배양물의 형질전환 효율을 증가시켰지만(a), PANC1 세포(b) 또는 HUVEC(c)에 대해서는 그렇지 않았다. 2-챔버 트랜스웰 배양 시스템을 사용하여 공동-배양물의 내피 분획(endothelium compartment)에 대해 표적화를 확증하였다(d). KB1023은 또한, AsPC1 세포와의 공동배양 후 내피 세포의 형질전환 효율을 증가시켰다(e). KB1061은 H1299 및 HUVEC의 공동-배양물에서는 형질전환 효율을 향상시켰지만(f), H1299 세포(g) 또는 HUVEC(h)에 대해서는 그렇지 않았다. 루시퍼라제 유전자 발현은 피복되지 않은 리포솜 복합체의 것에 필적하였다. *P<0.05.
도 26a 내지 도 26c. 생체내 표적화 및 최적화. IV 주사한 후 24시간 후에, KB1023 피복된 리포솜 복합체의 대부분은 폐 및 심장에서 비-특이적으로 형질전환되었다(a). 가역적 마스킹(RM)을 사용하여 가역적 마스킹제의 농도를 증가시키면서 주사하였을 때, IV 주사한 후 14시간 후에, 폐 및 심장에 의한 비-특이적 흡수가 현저하게 감소하였다. 11mM RM에서, 폐 및 심장은 IV 주사한 후 14시간 후에 비-특이적 흡수를 거의 또는 전혀 나타내지 않은 반면(b), 종양 조직에서의 전달 및 후속의 유전자 발현은 IV 주사한 후 14시간 후에 약 10배로 증가하였다(c). 간과 같은 기타 비-특이적 조직에서는 전달의 증가가 발견되지 않았으며(c), 이는 표적화가 종양 내의 내피에 특이적이라는 사실을 시사한다. CAT 분석 및 단백질 분석을 수행하기 위해 종양 조직으로부터 종양 혈관 내피를 해리시키는 것은 금지적이며, 따라서 종양 혈관 내피로의 10배 증가된 전달은 낮은 추정치이다. 종양 내피는 전체 종양 용적의 약 5%이기 때문에, 종양 혈관으로의 표적화된 전달의 증가는 피복되지 않은 BIV 복합체 단독을 사용한 전달에 비해 아마도 약 200배 더 높을 것이다. 11mM을 초과하여 더 증가된 RM은 종양 조직으로의 전달을 증가시키지 않았으며, 오히려 전달 및 후속의 유전자 발현을 감소시켰다. 따라서, 종양 내피로의 표적화된 전달을 위해서는 11mM RM을 사용하는 것이 최적이다. IV 주사 후 14시간 후에 #CAT 발현을 측정하고, RM 없이 표적화된 전달을 사용한 대조물에 비교하였다. *P<0.01. ^P<0.05. 그룹당 N= 4 내지 5.
도 27. TSP1 유전자의 표적화된 전달을 사용하는 종양 성장 억제. 공동-배양물을 IP 주사한 후 2주 후에, TSP1 DNA 35㎍을 캡슐화한 BIV 리포솜 복합체를 리간드 KB1023으로 피복시키고, 11mM 가역적 마스킹(RM)과 함께 각각의 마우스에 IV 공동 주사하였다. 총 3회의 IV 주사를 위해 격주로 주사하였다. 최종 주사 후 2주 (공동 배양물의 IP 주사 후 8주) 후에, 마우스를 희생시켜 복강내 종양 크기를 비교하였다. TSP1의 사람 종양 내피 표적화된 전달로 치료된 마우스는 리포솜만이 주사된 대조 마우스에 비해 현저한 암 성장 지연을 나타냈다. 표적화된 전달을 최적의 가역적 마스킹(RM)과 조합한 경우, 종양을 거의 근절시킬 정도로 크게 종양 성장이 억제되었다. 상기 처리를 총 5회의 IV 주사를 위한 주 1회 주사로 증진시킨 경우 종양 성장이 한층 더 억제되었다. *N=20. 기타 그룹들은 그룹당 5 내지 7마리의 마우스를 갖는다. #P<0.05.
도 28은 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 SK-MEL-28 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 보여준다.
도 29는 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 복부 벽 흑색종 종양 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 보여준다.
도 30은 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 좌측 둔근 흑색종 종양 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 각종 양태들의 제조 및 사용에 대해 아래에서 상세히 논의하겠지만, 본 발명은 매우 다양한 특정 맥락에서 구현될 수 있는 다수의 적용가능한 독창적 개념을 제공한다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 논의되는 특정 양태들은 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 특정 방식을 예시하는 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어들을 아래에서 정의한다. 본원에 정의된 용어들은 본 발명에 속한 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 단수 형태의 용어들은 단일 개체만을 나타내는 것이 아니라, 예시를 위해 특정예가 사용될 수 있는 일반적 부류를 포함하는 것으로 의도된다. 본원의 용어들은 본 발명의 특정 양태들을 설명하는데 사용되지만, 이들의 사용은 특허청구범위에 기재된 것을 제외하고는 본 발명을 한정하지 않는다.
리포솜의 표면 상에 다중화(multimerized)된 소형 펩티드는 반복적 주사, 특히 전신적인 반복적 주사 후에 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 펩티드는 종양의 간질 압력 구배(interstitial pressure gradient)를 통한 투과 및 전달을 불가능하게 할 수 있다. 항체, 항체 단편, 단백질, 부분 단백질 등을 포함하는 더 큰 기타의 리간드는 리포솜 표면 상의 표적화된 전달을 위한 소형 펩티드를 사용하는 것보다 훨씬 더 다루기 힘들다. 리포솜과 같은 전달 시스템의 표면 상에 위치하여 이들을 표적 조직에 선택적으로 표적화할 수 있는 소형 비-면역원성 분자가 요구된다.
펩티도미메틱은, 펩티드의 생물학적 활성을 모방하지만 화학적 성질에 있어서 더이상 펩티드성이 아닌 분자이다. 용어 펩티도미메틱은, 일반적으로, 더이상 어떠한 펩티드 결합(즉, 아미노산들 사이의 아미드 결합)도 함유하지 않는 분자를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "펩티도미메틱"은 유사펩티드, 세미-펩티드 및 펩토이드와 같이, 성질에 있어서 더이상 완전히 펩티드성이 아닌 분자를 나타낸다. 완전히 펩티드가 아니든지 부분적으로 펩티드가 아니든지, 본 발명에 따른 펩티도미메틱은 단백질-리간드 상호작용의 핫스팟(hotspot)에서 발견되는 2차 구조 모티프들의 3차원 배열과 밀접하게 닮은 반응성 화학 잔기들의 공간적 배열, 예를 들면, 세포 표면 수용체에 대한 친화성을 갖도록 고안된 2가 베타-턴 모사체(bivalent beta-turn mimic)를 제공한다.
리포솜 페이로드(payload)의 표적화된 전달은 최대 효능 및 독성 감소를 위해 필수적이다. 일반적으로, 본 발명은 기존의 방법에 비해 치료제의 표적 세포로의 전달을 더 효율적으로 매개하는 리간드를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 표적화 리간드를 합성하는 방법 및 상기 리간드를 사용하여 치료제를 표적 세포에 효율적으로 전달하는 방법도 제공한다. 이들 표적화 리간드가 소분자라는 사실 때문에, 면역 반응을 일으킴 없이 무기한으로 반복적 주입이 가능하다. 창출된 기술은 치료제 및 조영제를 병든 세포에 표적 전달하는 것을 개선시킨다. 이 기술은 상이한 타입의 암을 포함하는 다수의 질환 및 장애에 적용될 수 있다. 췌장암, 유방암, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 췌장암 혈관 내피, 흑색종 또는 NSCLC 암 혈관 내피와 같은 다수의 사람 암 조직에 대한 특이성을 위해 소분자 라이브러리가 창출 및 스크리닝되었다.
대부분의 리포솜 전달 시스템의 광범위한 치료학적 적용 분야에서의 주요 제한사항은, 이들의 불량한 생체내 형질전환 효율, 정맥내 전달 후 폐 내의 축적, 응집, (예컨대, 쿠퍼 세포에 의한) 전신 전달 후의 청소율, 주입된 대량의 리포솜 복합체를 표적 세포 및 기관에 전달하지 못함 및 기타 문제들이다. 이중라멜라 함입형 소포("BIV")는 이들 제한사항을 극복한다[1,2]. BIV-복합체의 표면 상에 위치하여 이들을 표적 세포로 유도할 수 있는 비-면역원성 리간드의 부재로 인해, 치료학적 도구로서의 BIV의 개발이 지체되고 있다. 리포솜의 표면 상에 다중화된 소형 펩티드는 반복적 주사, 특히 전신적인 반복적 주사 후에 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 펩티드는 종양의 간질 압력 구배를 통한 투과 및 전달을 불가능하게 할 수 있다. 항체, 항체 단편, 단백질, 부분 단백질 등을 포함하는 더 큰 기타의 리간드는 리포솜 표면 상의 표적화된 전달을 위한 소형 펩티드를 사용하는 것보다 훨씬 더 다루기 힘들다. 본 발명은 BIV 및 기타 치료제 담체를 암 조직에 선택적으로 전달하기 위한 비-면역원성 표적화 리간드를 제공한다.
본 발명은, 고형 종양의 간질 압력 구배를 포함하는 견고한 장벽을 투과한다는 점에 있어서 독특한 표적화 복합체를 제공하며[3], 이에 따라 BIV 복합체는 종양 세포로의 표적화된 전달을 직접적으로 달성한다. 이러한 치료학적 접근은 암 치료에서의 효능을 달성하기 위한 종양 세포 혈관으로의 전달에 한정되지 않는다. 다른 연구자들은 또한, 종양 혈관층은 리포솜이 종양 세포에 직접 접근할 수 있도록 충분히 누출성이라는 것을 입증하였다[4-6]. 더우기, 최근의 공보에는, 순환계에 접근가능한 종양 세포가 "맥관형성 의태(vasculogenic mimicry)"라고 불리우는 분화 과정을 경험하는데, 상기 종양 세포는 이들의 표면 상에서 종양 세포 마커 대신 혈관 마커를 발현한다는 것이 보고되어 있다[7,8]. 본 발명에서 제공되는 소분자 표적화 리간드는 항-혈관신생 약물 또는 유전자 치료제를 종양 혈관에 전달하여 종양에 대한 혈액 공급을 차단시킴으로써 종양 회귀를 유발할 수 있다.
암 치료를 위한 표적화된 전달은 효율적인 표적화에 사용되는 공지된 세포 표면 수용체들의 부족 때문에 한층 더 복잡해진다. 최적의 리간드는 작아야 하며(약 500 Da 이하, 예를 들면, 약물 및 소분자), 표적 세포 상에서 독점적으로 발견되는 독특한 수용체에 대한 높은 친화성 및 내재화를 가져야 한다. 본 발명 이전에는, 특정 암 세포 및 암 아형 상의 세포 표면 수용체를 선택적으로 표적화하는 최적의 소분자 리간드가 확인되지 않았다. 본 발명은 표적화된 전달에 사용하기 위한 더 양호한 세포 표면 수용체를 찾기 위한 소분자 표적화 리간드의 라이브러리를 포함한다. 이러한 표적화 전략은 최상의 독특한 수용체의 기능 및 정체성을 알아야 할 필요가 없다.
도 1은 당해 소분자 라이브러리 디자인의 필수 부분들을 보여준다. 단백질 핫스팟을 잠재적으로 모방하는 "1가" 소분자들을 사용하여 각각 탄화수소 앵커(예: 소수성 꼬리)를 갖춘 더 큰 라이브러리의 "2가 리간드"를 형성한다. 상기 2가 리간드는 세포 표면 수용체를 결합시키기에 특히 적절하며, 단백질-리간드 상호작용의 핫스팟에서 발견되는 2차 구조 모티프와 유사할 것이다. 상기 탄화수소 앵커는 단순히 혼합하고 밤새 배양함으로써 상기 1가 및 2가 리간드를 리포솜 복합체에 앵커링되게 할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 사용되는 리포솜은 BIV이다[1]. 다른 예에서, 상기 펩티도미메틱 화합물 라이브러리는 상기 소수성 꼬리 대신에 예를 들면 유로퓸 또는 테르븀 크립테이트로 라벨링된다. 그런 다음, 상기 라이브러리는 시분할 형광분석법을 사용하여 직접 스크리닝될 수 있다.
세포 표면 수용체를 결합시키도록 고안된 소분자: 세포 표면에서의 다수의 단백질-단백질 상호작용은 이량체성 또는 올리고머성 수용체와 도킹(docking)하는 이량체성 또는 올리고머성 리간드를 포함한다. 이들 상호작용에 관련된 리간드를 모방하는 소분자를 고안하기는 어렵다. 버지스(Burgess) 및 공동 연구자들에 의해 사용된 접근법은, 단백질-단백질 상호작용의 핫스팟에서 발견되는 단백질 2차 구조에 밀접하게 부합하는 유기 골격 상에, 단백질에서 발견되는 아미노산에 정확하게 상응하는 측쇄를 갖는 소분자를 제조하는 것이다. 이들은 이후에 함께 연결되어, 수용체 상의 두 위치를 잠재적으로 결합시켜서 결합시의 자유 에너지 손실을 상당히 증가시킬 수 있는 2가 분자들, 예를 들면, "세미-펩티드성" 베타-턴 유사체("semi-peptidic" beta-turn analog)를 형성한다[9-17]. 중요하게는, 이들 화합물은 임의의 아미노산 측쇄를 혼입시킬 수 있어, 이들은 해당 모티프를 포함하는 임의의 핫스팟에서의 턴을 모방하도록 고안될 수 있다. 이들은 베타-턴 형태와 잘 부합하는 경향이 있으며, 턴 핫스팟을 갖는 몇몇 단백질-단백질 상호작용 표적들에 대해 활성이다[18-25]. 이들 화합물의 2가 유도체는 결합 친화성을 현저하게 향상시킬 수 있다. 이들 2가 분자는 반응식 1에서 강조된 화학을 통해 제조되는데, 보호되지 않은 2개의 1가 펩티도미메틱을 단순히 트리아진 링커의 존재하에 혼합함으로써 이들을 선택적으로 커플링시킬 수 있다. 이러한 경로의 핵심적 특징은, 2개의 작용성 1가 분자가 조합되어 선택적으로 용액 중에서 헤테로이량체를 제공할 수 있으며, 이러한 커플링을 수행하는데에는 탄산칼륨만이 요구된다는 것이다. 대부분의 조합적 합성(combinatorial syntheses)과 달리, 이러한 접근의 최종 단계에서는 보호 그룹이 포함되지 않기 때문에, 보호 그룹 잔류물 및 첨가된 스캐빈저 재료로부터 최종 생성물을 정제시킬 필요가 없다.
탐색 라이브러리(exploratory library)의 합성: 개략적으로 설명된 방법을 사용하여 본 발명자들의 연구를 위해 150개 화합물, 즉, 15개의 동종이량체 2가 소분자 및 135개의 이종이량체 2가 소분자의 탐색 라이브러리를 제조하였다. 도 2는 피페리딘과 치환된 플루오레세인의 선택적 반응을 통한 상기 이량체들의 합성 반응식을 도시한 것이다. 이들의 구조는 도 4, 도 5, 도 6 및 도 7a 내지 도 7d에 열거되어 있다. 열거된 분자량은 당해 탄화수소 꼬리의 분자량 + 2개의 소분자의 분자량을 포함한다. 이들 화합물은 극성 "탄두(warhead)" 관능성(모사체 A 및 B) 및 소수성 꼬리를 갖는다는 점에서 종래에 제조되었던 기타 화합물 라이브러리와는 상이하다.
시험관내 전달 및 고속 대량 분석: 성공적인 고속 대량 스크린을 위해서는 높은 감도의 정밀한 검출 시스템이 요구된다. 표적화되지 않은 BIV 복합체보다 더 효율적으로 암 세포 또는 사람 종양 내피에 내재화되는 BIV 복합체의 표면에 부착된 1가 또는 2가 화합물을 식별하기 위해 고속 대량 분석을 사용하였다. BIV 복합체에 피복되는 2가 리간드는, 세포막을 통해 캡슐화 시약에 결합하고 그에 내재화되는 이들의 능력에 대해 선택된다. 스크리닝 방법은 파지 디스플레이(phage display)를 특징으로 하는 최상의 동시대적 방법들보다 훨씬 더 직접적이고 강력한데, 그 이유는 상기 동시대적 방법들은 단순히 세포 표면 결합에 대한 판독결과만을 제공하며 다수의 포지티브 오류(false positive)를 발생시키기 때문이다. 본 발명은 확인되지 않은 암 세포 표면 수용체를 통한 리간드-작용성 BIV의 전달을 가능하게 한다.
BIV의 가역적 마스킹: 가역적 마스킹은 초기에는 비-표적 기관을 우회(bypass)하기 위해 전달 중에 BIV 복합체의 양전하의 일시적 차폐를 제공하고, 그후 융합 도입(fusogenic entry)을 허용하기 위해 표적 세포 표면에서 재노출되는 전하를 제공한다. 따라서, 전하의 차폐를 제공하는 마스크는 BIV 복합체로부터 해리되며, 따라서 가역적이다. 상기 BIV 전달 시스템이 독특하게 효율적인 이유 중의 하나는, 상기 복합체가 세포막과의 융합에 의해 치료제를 세포 내로 전달하며 엔도시토시스 경로(endocytic pathway)를 회피하기 때문이다. 본 발명은, 생체내 주입 또는 투여 직전에 표적 전달에 사용되는 복합체에 첨가될 수 있는 "차폐/탈차폐 화합물(shielding/deshielding compound)"을 사용하여 폐 및 기타의 비-특이적 표적 기관으로의 흡수를 회피한다[참조: Templeton, N.S. 2006년 5월 2일자로 발행된 미국 특허 제7,037,520 B2호, 이에 참조로 인용된 관련 부분들]. 비-특이적 형질전환을 우회하기 위한 전략을 "가역적 마스킹(reversible masking)"이라 부르며, 상기 전략은 중성의 소분자량 지질(약 500 MW 이하), 예를 들면, n-도데실-베타-D-말토피라노시드를 사용한다. 이들 지질은 작고 하전되어 있지 않아서, 이들은 BIV 복합체의 표면과 느슨하게 연합되며 이들이 표적 세포에 도달하는 시간까지는 순전히 혈류의 전단력으로 제거된다.
BIV 리간드-피복된 가역적으로 마스킹된 복합체가 효율적으로 전달되는 또 다른 이유는, 상기 복합체는 이들이 표적 세포에 접근할 때 이들의 전체 양전하를 다시 노출시키기 때문이다. 표적 세포에서 "마스크"를 제거함으로써, 융합 경로(fusogenic pathway)에 의해 표적 세포에 진입하기 위한 적절한 전체 양전하가 복합체의 표면 상에 보존된다. 이에 의해, 최초 통과(first pass)에서 복합체의 90% 이상이 표적 세포에 도달 및 전달되면서, 비-표적 조직으로의 흡수가 회피되며, 세포 표면과 효율적으로 상호작용하여 최적의 형질전환을 생성함으로써 복합체의 최적 순환 시간(circulation time)이 달성된다.
도 26a는 CAT 암호화 플라스미드를 캡슐화하는 BIV를 마스킹제 없이 SCID 마우스에 정맥내(IV) 주사한 후의 폐 및 심장의 최적의 형질전환을 도시한 것이다. 도 3은 가역적 마스킹에 의한 탈차폐, 세포막과의 융합, 및 치료제 또는 조영제의 세포 및 (바람직한 경우) 핵으로의 도입을 포함하는 표적화된 전달을 달성하는데 사용된 최적화된 전략을 보여준다.
탐색 라이브러리의 스크리닝: MCF-7 사람 유방암 세포, A549 사람 폐암 세포, PANC1 및 Mia PaCa2 사람 췌장암 세포, H1299 사람 소세포 폐암 세포의 사람 종양 내피, PANC1 사람 췌장암 세포의 사람 종양 내피 및 상응하는 정상 세포 타입들에서 시험관내 스크리닝에서의 대량 처리를 사용하여 상기 150개 이량체의 라이브러리를 시험하였다. 본 발명자들의 독특한 DOTAP:합성 콜레스테롤(50:45) 수동 추출을 사용하여 BIV를 제조하였다[1]. 본 발명자들은 BIV 복합체를 탄화수소 꼬리를 갖는 2가 화합물과 혼합하고(리간드-피복된 BIV 복합체) 이것을 O/N 항온처리함으로써 작용성 복합체를 제조하였다. 항온처리시, 상기 탄화수소 꼬리는 BIV 복합체의 표면 지질 이중층에 자발적으로 삽입된다. 이들 2가 화합물 각각은 치료제(예: 화학요법 약물, 유전자 치료제) 또는 리포터(루시퍼라제 암호화 플라스미드) 1㎍당 1×10-1 내지 104 pg 범위의 표면 농도로 첨가되었다. 생체내 연구를 위해, 복합체를 1.0μM 폴리설폰 필터(Whatman)를 통해 여과한 후, 소분자 리간드를 첨가하고, 리간드 피복된 BIV 복합체에 마스킹제를 첨가한 후, 상술된 바와 같이 정맥내 주사하였다. 정상 세포에 비해 암 세포에 또는 정상 내피에 비해 종양 내피에 BIV를 선택적으로 유도하는 1가 또는 2가 리간드를 식별하기 위해 대조 연구를 사용하였다.
모든 세포 타입은 수백 또는 심지어 수천 개의 세포 표면 수용체(이들 중 대부분은 현재까지 확인되지 않고 있다)를 가지며, 제안된 접근법은 각각의 웰에서 최적의 리간드-수용체 상호작용을 확인하기 위해 이들 모두를 조사한다. 이 스크린을 "통과(pass)"하는 2가 화합물은 생체내에서 종양 및 이들의 전이 또는 종양 내피를 영상화하고/하거나 파괴하기 위한 조영제 또는 치료제를 캡슐화하는 가역적으로 마스킹된 BIV-복합체에 혼입된다. 상기 접근법은 따라서 생체내에서 상이한 암 세포들에 치료 물질 또는 조영제를 전달함에 있어 극히 직접적이다.
가장 성공적인 표적화된 전달을 제공하는 리간드에 결합하는 세포 표면 수용체들을 식별할 수 있다. 이들 리간드를 친화성 컬럼(affinity column) 상에 고정시킬 수 있고, 가용화된 세포 추출물을 상기 컬럼에 통과시킬 수 있다. 결합된 재료를 단백질 식별을 위해 질량 분석법 및 데이터베이스 분석에 의해 평가할 수 있다. 본 발명자들이 식별한 수용체가 공지된 신호전달 수용체인 경우, 본 발명자들은 또한, 본 발명자들의 리간드가 해당 수용체의 활성화를 활성화하는지 아니면 억제하는지에 대해 조사할 수 있다.
포지티브 히트(positive hit): MCF-7 세포의 형질전환에 있어서 BIV 복합체의 표면 상에 피복된 화합물 번호 1035, 1036, 1039, 1063, 1064, 1066 및 1067을 사용하여 유의한 포지티브 히트(히트)를 수득하였다. 한편, A549 세포에서는 화합물 번호 1001, 1003, 1042, 1051, 1062, 1096, 1107, 1108 및 1029를 사용하여 히트를 찾아냈다. 도 9는 열거된 화합물들의 A549 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다. 히트는 BIV 복합체 단독을 사용한 형질전환에 대하여 형질전환을 적어도 100%(Y축에서 +2) 증가시킨 화합물로서 정의되었다. 관찰된 최대 히트는 형질전환 효율에서 거의 300%(Y축에서 +4) 증가를 제공하였다. 이들 히트는 MCF-7에 대한 정상 또는 거의 정상의 대응 세포주 MCF-10A 세포를 스크리닝함에 있어서는 발견되지 않았다. 도 8은 열거된 화합물들의 MCF7 세포에 대한 형질전환 효율을 보여주는 그래프이다. MCF-10A 세포는 거의 정상의 대조 세포주로서 흔히 사용되는데, 그 이유는 이들이 정상 또는 거의 정상의 핵형(karyotype)을 갖는 사람 유선 세포이기 때문이다[참조: Soule, HD, et al. (1990) 자발적으로 불사화된(immortalized) 사람 유방 상피 세포주인 MCF-10의 단리 및 확인, Cancer Res 50: 6075-6086]. 도 10은 열거된 화합물들의 MCF10A 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다. 췌장 세포 스크리닝에 대해, 하기 결과는 PANC1 및 Mia PaCa2 세포에 대해서는 통계학적으로 유의한 히트를 나타냈으며, 이는 정상 세포인 HPDE 상에서는 발견되지 않았다. 도 11, 도 12 및 도 13은 각각 PANC1, Mia PaCa2 및 HDPE 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 것이다. 단지 하나의 화합물 KB-995만이 둘 모두의 세포주에서 히트를 나타냈다. HUVEC + 사람 종양 세포의 공동-배양물은 H1299 폐암 세포와 PANC1 췌장 세포 둘 모두에 대한 공동-배양물에서 8일 후 종양 내피로의 전이를 나타냈다. 이는, 유동 세포 분석법에 의해 내피 세포 분획 상에서 CD31+가 증가되었다는 점과, 상기 공동-배양물에서는 VEGFA가 상향조절되었고 HUVEC에서는 그렇지 않았다는 점에 의해 증명되었다(본원에 데이터는 기재되지 않음). KB1116, KB1063 또는 KB1123을 사용하는 시험관내 스크린으로부터의 데이터는 H1299 종양 내피의 형질전환에 대해서는 히트를 나타냈으며 HUVEC 또는 H1299에 대해서는 그렇지 않았다. 도 14 및 도 16은, 본원에서 제시된 화합물들을 이용한, HUVEC 세포와 H1299 세포의 공동-배양물 및 HUVEC 세포 단독에서의 형질전환 향상을 보여준다. 도 15는 본 발명의 화합물들을 이용한 H1299 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다. 한편, 상이한 화합물 KB1124 또는 KB1125를 사용한 경우 PANC1 종양 내피에 대한 히트가 생성되었다. 이들 화합물도 HUVEC 또는 PANC1을 스크리닝할 때에는 히트를 생성하지 않았다.
도 1은 상기 화합물을 식별하기 위한 일반적 반응식의 도면이다.
도 2는 피페리딘과 치환된 플루오레세인의 선택적 반응을 통한 이량체의 제조를 도시한 것이다.
도 3은 정맥내 주사된 BIV 복합체의 90% 이상을 전적으로 표적 세포에 전달하기 위한 최적화된 표적화 전략의 최적 양태를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 각종 화합물들의 구조를 도시한 것으로, 일반적 구조가 상단에 도시되어 있고, 특정 구조물 KB991 내지 KB1005가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 열거되어 있다.
도 5는 본 발명의 결합 부분들(A 및/또는 A')의 조합을 요약한 것이다.
도 6은 본 발명에서의 구조의 일례를 도시한 것으로, 일반적 구조가 상단에 도시되어 있고, 특정 구조 KB991 내지 KB1005가 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 열거되어 있다.
도 7a 내지 도 7d는 본 발명의 결합 부분들의 일부의 최적 양태를 보여준다(A= 단편 A 및/또는 A'= 단편 B).
도 8은 열거된 화합물의 MCF7 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다.
도 9는 열거된 화합물의 A549 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다.
도 10은 열거된 화합물의 MCF10A 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다.
도 11은 피복된 리포솜 전달 시스템 중의 열거된 화합물들을 사용한 Panc1 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 그래프이다.
도 12는 피복된 리포솜 전달 시스템 중의 열거된 화합물들을 사용한 Mia PaCa2 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 그래프이다.
도 13은 피복된 리포솜 전달 시스템 중의 열거된 화합물들을 사용한 HPDE 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 그래프이다.
도 14는 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 및 H1299 세포의 공동-배양물에서의 형질전환 향상을 도시한 것이다.
도 15는 열거된 화합물을 갖는 H1299 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 16은 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 향상을 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 17은 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 및 PANC1 세포의 공동 배양물에서의 형질전환 향상을 도시한 것이다.
도 18은 열거된 화합물을 갖는 PANC1 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 19는 열거된 화합물을 갖는 HUVEC 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다.
도 20a 내지 도 20c. 공동-배양 후의 내피 CD31+ 발현의 증가. 본 발명자들은 세포 계수 후 HUVEC:H1299 30:1의 평판배양 비로 공동-배양물을 확립하였다. 피코에리트린-접합된 항-CD31 Ab에 의해 내피 세포를 염색하고, 접종 후 유동 세포 분석법(flow cytometry)을 사용하여 상기 내피 세포 군집[R3에 의해 게이팅(gated)됨]을 매일 측정하였다. 상기 내피 세포들 중 절대 다수는 낮은 수준의 CD31을 발현하였다(R4에 의해 게이팅됨). 상기 내피 세포들 중 소수는 높은 수준의 CD31을 발현하였다(R2에 의해 게이팅됨). 공동-배양 후 8일 후에, 상기 공동-배양물의 내피 세포 군집은 CD31 발현이 HUVEC 대조물의 것에 비해 현저하게 증가하였다(c). 9일 후 CD31 발현의 향상은 HUVEC 대조물(a, c)보다 공동-배양물(b, c)에서 훨씬 더 컸다. *P=0.026.
도 21a 및 도 21b. 공동-배양 후의 내피 VEGF-A 발현의 향상. HUVEC:PANC1 10:1의 평판배양 비로 공동-배양물을 확립하고, 8일간 2-챔버 트랜스웰 접시에서 경작하였다. 내피 세포를 수확하고, 실시간 RT-PCR 및 웨스턴 블로팅을 사용하여 VEGF-A 발현을 측정하였다. 내피 VEGF-A 발현은 공동-배양 후 전사 수준(a) 및 번역 수준(b)에서 HUVEC 대조물의 것에 비해 증가되었다. *P<0.01, N=6.
도 22a 내지 도 22f. 공동-배양 후의 지속된 관 생존(prolonged tube survival). 트랜스웰 접시에서 HUVEC:PANC1 10:1의 평판배양 비로 공동-배양한 후 8일 후에, 내피 세포를 수확하고 매트리겔(Matrigel) 상에 접종하였다. 16시간 후, HUVEC 대조물(a) 및 공동-배양물의 내피 세포(b)는 둘 다 모세혈관과 유사한 관상 구조물을 형성하였다. 이들 구조물은 48시간 후 분해되기 시작하였다. 약 72시간째에 HUVEC 대조물의 관상 구조는 거의 완전히 분해되었다(c). 그러나, 공동-배양물에서는 상당량의 관상 구조물이 생존하였다(d). 이들 구조물은 우수한 관상 망상구조를 유지하였으며 11일 이상 동안 생존하였다(e, f).
도 23a 및 도 23b. 2가 소분자 구조 및 라이브러리 스크리닝. 2가 소분자의 일반적 구조(23a)는 세포 표면 수용체와 상호작용하기 위한 2개의 β-턴 모사체, BIV 리포솜 복합체로의 삽입을 위한 탄화수소 꼬리 및 링커를 포함한다. 본 발명자들의 "적중물(hit)" 분자 KB1023의 구조도 도시되어 있다. 종양 내피 세포-특이적 표적화 리간드를 스크리닝하기 위해 고속 대량 루시퍼라제 분석(23b)을 사용하였다. 공동-배양 후 7일 후에, 세포를 수확하고 96-웰 플레이트에 2x104 세포/웰로 접종하였다. 같은 날, BIV-루시퍼라제 DNA:리포솜 복합체를 제조한 후, 다양한 화합물:DNA 비로 화합물들을 피복하였다. 피복된 복합체를 실온에서 밤새 항온처리하였다. 다음 날, 피복된 복합체 0.52㎕를 함유하는 무혈청 배지 50㎕로 세포를 형질전환시켰다. 형질전환 배지를 혈청을 함유하는 세포 배양 배지로 대체함으로써 형질전환을 종결시켰다. 형질전환 후 24시간 후에, 세포를 용해시키고, 루미노스캔(Luminoskan) 플레이트 판독기를 사용하는 루시퍼라제 분석을 위해 세포 용해물을 96-웰 플레이트에 20㎕/웰로 로딩하였다.
도 24는 본 발명의 방법의 흐름도이다.
도 25a 내지 도 25h. 췌장 및 폐 종양 내피 표적화 리간드. 화합물 KB1023은 PANC1+HUVEC 공동-배양물의 형질전환 효율을 증가시켰지만(a), PANC1 세포(b) 또는 HUVEC(c)에 대해서는 그렇지 않았다. 2-챔버 트랜스웰 배양 시스템을 사용하여 공동-배양물의 내피 분획(endothelium compartment)에 대해 표적화를 확증하였다(d). KB1023은 또한, AsPC1 세포와의 공동배양 후 내피 세포의 형질전환 효율을 증가시켰다(e). KB1061은 H1299 및 HUVEC의 공동-배양물에서는 형질전환 효율을 향상시켰지만(f), H1299 세포(g) 또는 HUVEC(h)에 대해서는 그렇지 않았다. 루시퍼라제 유전자 발현은 피복되지 않은 리포솜 복합체의 것에 필적하였다. *P<0.05.
도 26a 내지 도 26c. 생체내 표적화 및 최적화. IV 주사한 후 24시간 후에, KB1023 피복된 리포솜 복합체의 대부분은 폐 및 심장에서 비-특이적으로 형질전환되었다(a). 가역적 마스킹(RM)을 사용하여 가역적 마스킹제의 농도를 증가시키면서 주사하였을 때, IV 주사한 후 14시간 후에, 폐 및 심장에 의한 비-특이적 흡수가 현저하게 감소하였다. 11mM RM에서, 폐 및 심장은 IV 주사한 후 14시간 후에 비-특이적 흡수를 거의 또는 전혀 나타내지 않은 반면(b), 종양 조직에서의 전달 및 후속의 유전자 발현은 IV 주사한 후 14시간 후에 약 10배로 증가하였다(c). 간과 같은 기타 비-특이적 조직에서는 전달의 증가가 발견되지 않았으며(c), 이는 표적화가 종양 내의 내피에 특이적이라는 사실을 시사한다. CAT 분석 및 단백질 분석을 수행하기 위해 종양 조직으로부터 종양 혈관 내피를 해리시키는 것은 금지적이며, 따라서 종양 혈관 내피로의 10배 증가된 전달은 낮은 추정치이다. 종양 내피는 전체 종양 용적의 약 5%이기 때문에, 종양 혈관으로의 표적화된 전달의 증가는 피복되지 않은 BIV 복합체 단독을 사용한 전달에 비해 아마도 약 200배 더 높을 것이다. 11mM을 초과하여 더 증가된 RM은 종양 조직으로의 전달을 증가시키지 않았으며, 오히려 전달 및 후속의 유전자 발현을 감소시켰다. 따라서, 종양 내피로의 표적화된 전달을 위해서는 11mM RM을 사용하는 것이 최적이다. IV 주사 후 14시간 후에 #CAT 발현을 측정하고, RM 없이 표적화된 전달을 사용한 대조물에 비교하였다. *P<0.01. ^P<0.05. 그룹당 N= 4 내지 5.
도 27. TSP1 유전자의 표적화된 전달을 사용하는 종양 성장 억제. 공동-배양물을 IP 주사한 후 2주 후에, TSP1 DNA 35㎍을 캡슐화한 BIV 리포솜 복합체를 리간드 KB1023으로 피복시키고, 11mM 가역적 마스킹(RM)과 함께 각각의 마우스에 IV 공동 주사하였다. 총 3회의 IV 주사를 위해 격주로 주사하였다. 최종 주사 후 2주 (공동 배양물의 IP 주사 후 8주) 후에, 마우스를 희생시켜 복강내 종양 크기를 비교하였다. TSP1의 사람 종양 내피 표적화된 전달로 치료된 마우스는 리포솜만이 주사된 대조 마우스에 비해 현저한 암 성장 지연을 나타냈다. 표적화된 전달을 최적의 가역적 마스킹(RM)과 조합한 경우, 종양을 거의 근절시킬 정도로 크게 종양 성장이 억제되었다. 상기 처리를 총 5회의 IV 주사를 위한 주 1회 주사로 증진시킨 경우 종양 성장이 한층 더 억제되었다. *N=20. 기타 그룹들은 그룹당 5 내지 7마리의 마우스를 갖는다. #P<0.05.
도 28은 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 SK-MEL-28 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 보여준다.
도 29는 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 복부 벽 흑색종 종양 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 보여준다.
도 30은 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 좌측 둔근 흑색종 종양 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 보여준다.
발명의 상세한 설명
본 발명의 각종 양태들의 제조 및 사용에 대해 아래에서 상세히 논의하겠지만, 본 발명은 매우 다양한 특정 맥락에서 구현될 수 있는 다수의 적용가능한 독창적 개념을 제공한다는 것을 이해해야 한다. 본원에서 논의되는 특정 양태들은 본 발명을 제조하고 사용하기 위한 특정 방식을 예시하는 것에 지나지 않으며, 본 발명의 범위를 한정하지 않는다.
본 발명의 이해를 용이하게 하기 위해, 다수의 용어들을 아래에서 정의한다. 본원에 정의된 용어들은 본 발명에 속한 분야의 통상의 숙련자가 일반적으로 이해하는 의미를 갖는다. 단수 형태의 용어들은 단일 개체만을 나타내는 것이 아니라, 예시를 위해 특정예가 사용될 수 있는 일반적 부류를 포함하는 것으로 의도된다. 본원의 용어들은 본 발명의 특정 양태들을 설명하는데 사용되지만, 이들의 사용은 특허청구범위에 기재된 것을 제외하고는 본 발명을 한정하지 않는다.
리포솜의 표면 상에 다중화(multimerized)된 소형 펩티드는 반복적 주사, 특히 전신적인 반복적 주사 후에 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 펩티드는 종양의 간질 압력 구배(interstitial pressure gradient)를 통한 투과 및 전달을 불가능하게 할 수 있다. 항체, 항체 단편, 단백질, 부분 단백질 등을 포함하는 더 큰 기타의 리간드는 리포솜 표면 상의 표적화된 전달을 위한 소형 펩티드를 사용하는 것보다 훨씬 더 다루기 힘들다. 리포솜과 같은 전달 시스템의 표면 상에 위치하여 이들을 표적 조직에 선택적으로 표적화할 수 있는 소형 비-면역원성 분자가 요구된다.
펩티도미메틱은, 펩티드의 생물학적 활성을 모방하지만 화학적 성질에 있어서 더이상 펩티드성이 아닌 분자이다. 용어 펩티도미메틱은, 일반적으로, 더이상 어떠한 펩티드 결합(즉, 아미노산들 사이의 아미드 결합)도 함유하지 않는 분자를 말한다.
본원에서 사용된 용어 "펩티도미메틱"은 유사펩티드, 세미-펩티드 및 펩토이드와 같이, 성질에 있어서 더이상 완전히 펩티드성이 아닌 분자를 나타낸다. 완전히 펩티드가 아니든지 부분적으로 펩티드가 아니든지, 본 발명에 따른 펩티도미메틱은 단백질-리간드 상호작용의 핫스팟(hotspot)에서 발견되는 2차 구조 모티프들의 3차원 배열과 밀접하게 닮은 반응성 화학 잔기들의 공간적 배열, 예를 들면, 세포 표면 수용체에 대한 친화성을 갖도록 고안된 2가 베타-턴 모사체(bivalent beta-turn mimic)를 제공한다.
리포솜 페이로드(payload)의 표적화된 전달은 최대 효능 및 독성 감소를 위해 필수적이다. 일반적으로, 본 발명은 기존의 방법에 비해 치료제의 표적 세포로의 전달을 더 효율적으로 매개하는 리간드를 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 표적화 리간드를 합성하는 방법 및 상기 리간드를 사용하여 치료제를 표적 세포에 효율적으로 전달하는 방법도 제공한다. 이들 표적화 리간드가 소분자라는 사실 때문에, 면역 반응을 일으킴 없이 무기한으로 반복적 주입이 가능하다. 창출된 기술은 치료제 및 조영제를 병든 세포에 표적 전달하는 것을 개선시킨다. 이 기술은 상이한 타입의 암을 포함하는 다수의 질환 및 장애에 적용될 수 있다. 췌장암, 유방암, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 췌장암 혈관 내피, 흑색종 또는 NSCLC 암 혈관 내피와 같은 다수의 사람 암 조직에 대한 특이성을 위해 소분자 라이브러리가 창출 및 스크리닝되었다.
대부분의 리포솜 전달 시스템의 광범위한 치료학적 적용 분야에서의 주요 제한사항은, 이들의 불량한 생체내 형질전환 효율, 정맥내 전달 후 폐 내의 축적, 응집, (예컨대, 쿠퍼 세포에 의한) 전신 전달 후의 청소율, 주입된 대량의 리포솜 복합체를 표적 세포 및 기관에 전달하지 못함 및 기타 문제들이다. 이중라멜라 함입형 소포("BIV")는 이들 제한사항을 극복한다[1,2]. BIV-복합체의 표면 상에 위치하여 이들을 표적 세포로 유도할 수 있는 비-면역원성 리간드의 부재로 인해, 치료학적 도구로서의 BIV의 개발이 지체되고 있다. 리포솜의 표면 상에 다중화된 소형 펩티드는 반복적 주사, 특히 전신적인 반복적 주사 후에 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 펩티드는 종양의 간질 압력 구배를 통한 투과 및 전달을 불가능하게 할 수 있다. 항체, 항체 단편, 단백질, 부분 단백질 등을 포함하는 더 큰 기타의 리간드는 리포솜 표면 상의 표적화된 전달을 위한 소형 펩티드를 사용하는 것보다 훨씬 더 다루기 힘들다. 본 발명은 BIV 및 기타 치료제 담체를 암 조직에 선택적으로 전달하기 위한 비-면역원성 표적화 리간드를 제공한다.
본 발명은, 고형 종양의 간질 압력 구배를 포함하는 견고한 장벽을 투과한다는 점에 있어서 독특한 표적화 복합체를 제공하며[3], 이에 따라 BIV 복합체는 종양 세포로의 표적화된 전달을 직접적으로 달성한다. 이러한 치료학적 접근은 암 치료에서의 효능을 달성하기 위한 종양 세포 혈관으로의 전달에 한정되지 않는다. 다른 연구자들은 또한, 종양 혈관층은 리포솜이 종양 세포에 직접 접근할 수 있도록 충분히 누출성이라는 것을 입증하였다[4-6]. 더우기, 최근의 공보에는, 순환계에 접근가능한 종양 세포가 "맥관형성 의태(vasculogenic mimicry)"라고 불리우는 분화 과정을 경험하는데, 상기 종양 세포는 이들의 표면 상에서 종양 세포 마커 대신 혈관 마커를 발현한다는 것이 보고되어 있다[7,8]. 본 발명에서 제공되는 소분자 표적화 리간드는 항-혈관신생 약물 또는 유전자 치료제를 종양 혈관에 전달하여 종양에 대한 혈액 공급을 차단시킴으로써 종양 회귀를 유발할 수 있다.
암 치료를 위한 표적화된 전달은 효율적인 표적화에 사용되는 공지된 세포 표면 수용체들의 부족 때문에 한층 더 복잡해진다. 최적의 리간드는 작아야 하며(약 500 Da 이하, 예를 들면, 약물 및 소분자), 표적 세포 상에서 독점적으로 발견되는 독특한 수용체에 대한 높은 친화성 및 내재화를 가져야 한다. 본 발명 이전에는, 특정 암 세포 및 암 아형 상의 세포 표면 수용체를 선택적으로 표적화하는 최적의 소분자 리간드가 확인되지 않았다. 본 발명은 표적화된 전달에 사용하기 위한 더 양호한 세포 표면 수용체를 찾기 위한 소분자 표적화 리간드의 라이브러리를 포함한다. 이러한 표적화 전략은 최상의 독특한 수용체의 기능 및 정체성을 알아야 할 필요가 없다.
도 1은 당해 소분자 라이브러리 디자인의 필수 부분들을 보여준다. 단백질 핫스팟을 잠재적으로 모방하는 "1가" 소분자들을 사용하여 각각 탄화수소 앵커(예: 소수성 꼬리)를 갖춘 더 큰 라이브러리의 "2가 리간드"를 형성한다. 상기 2가 리간드는 세포 표면 수용체를 결합시키기에 특히 적절하며, 단백질-리간드 상호작용의 핫스팟에서 발견되는 2차 구조 모티프와 유사할 것이다. 상기 탄화수소 앵커는 단순히 혼합하고 밤새 배양함으로써 상기 1가 및 2가 리간드를 리포솜 복합체에 앵커링되게 할 수 있다. 본 발명의 한 양태에서, 사용되는 리포솜은 BIV이다[1]. 다른 예에서, 상기 펩티도미메틱 화합물 라이브러리는 상기 소수성 꼬리 대신에 예를 들면 유로퓸 또는 테르븀 크립테이트로 라벨링된다. 그런 다음, 상기 라이브러리는 시분할 형광분석법을 사용하여 직접 스크리닝될 수 있다.
세포 표면 수용체를 결합시키도록 고안된 소분자: 세포 표면에서의 다수의 단백질-단백질 상호작용은 이량체성 또는 올리고머성 수용체와 도킹(docking)하는 이량체성 또는 올리고머성 리간드를 포함한다. 이들 상호작용에 관련된 리간드를 모방하는 소분자를 고안하기는 어렵다. 버지스(Burgess) 및 공동 연구자들에 의해 사용된 접근법은, 단백질-단백질 상호작용의 핫스팟에서 발견되는 단백질 2차 구조에 밀접하게 부합하는 유기 골격 상에, 단백질에서 발견되는 아미노산에 정확하게 상응하는 측쇄를 갖는 소분자를 제조하는 것이다. 이들은 이후에 함께 연결되어, 수용체 상의 두 위치를 잠재적으로 결합시켜서 결합시의 자유 에너지 손실을 상당히 증가시킬 수 있는 2가 분자들, 예를 들면, "세미-펩티드성" 베타-턴 유사체("semi-peptidic" beta-turn analog)를 형성한다[9-17]. 중요하게는, 이들 화합물은 임의의 아미노산 측쇄를 혼입시킬 수 있어, 이들은 해당 모티프를 포함하는 임의의 핫스팟에서의 턴을 모방하도록 고안될 수 있다. 이들은 베타-턴 형태와 잘 부합하는 경향이 있으며, 턴 핫스팟을 갖는 몇몇 단백질-단백질 상호작용 표적들에 대해 활성이다[18-25]. 이들 화합물의 2가 유도체는 결합 친화성을 현저하게 향상시킬 수 있다. 이들 2가 분자는 반응식 1에서 강조된 화학을 통해 제조되는데, 보호되지 않은 2개의 1가 펩티도미메틱을 단순히 트리아진 링커의 존재하에 혼합함으로써 이들을 선택적으로 커플링시킬 수 있다. 이러한 경로의 핵심적 특징은, 2개의 작용성 1가 분자가 조합되어 선택적으로 용액 중에서 헤테로이량체를 제공할 수 있으며, 이러한 커플링을 수행하는데에는 탄산칼륨만이 요구된다는 것이다. 대부분의 조합적 합성(combinatorial syntheses)과 달리, 이러한 접근의 최종 단계에서는 보호 그룹이 포함되지 않기 때문에, 보호 그룹 잔류물 및 첨가된 스캐빈저 재료로부터 최종 생성물을 정제시킬 필요가 없다.
탐색 라이브러리(exploratory library)의 합성: 개략적으로 설명된 방법을 사용하여 본 발명자들의 연구를 위해 150개 화합물, 즉, 15개의 동종이량체 2가 소분자 및 135개의 이종이량체 2가 소분자의 탐색 라이브러리를 제조하였다. 도 2는 피페리딘과 치환된 플루오레세인의 선택적 반응을 통한 상기 이량체들의 합성 반응식을 도시한 것이다. 이들의 구조는 도 4, 도 5, 도 6 및 도 7a 내지 도 7d에 열거되어 있다. 열거된 분자량은 당해 탄화수소 꼬리의 분자량 + 2개의 소분자의 분자량을 포함한다. 이들 화합물은 극성 "탄두(warhead)" 관능성(모사체 A 및 B) 및 소수성 꼬리를 갖는다는 점에서 종래에 제조되었던 기타 화합물 라이브러리와는 상이하다.
시험관내 전달 및 고속 대량 분석: 성공적인 고속 대량 스크린을 위해서는 높은 감도의 정밀한 검출 시스템이 요구된다. 표적화되지 않은 BIV 복합체보다 더 효율적으로 암 세포 또는 사람 종양 내피에 내재화되는 BIV 복합체의 표면에 부착된 1가 또는 2가 화합물을 식별하기 위해 고속 대량 분석을 사용하였다. BIV 복합체에 피복되는 2가 리간드는, 세포막을 통해 캡슐화 시약에 결합하고 그에 내재화되는 이들의 능력에 대해 선택된다. 스크리닝 방법은 파지 디스플레이(phage display)를 특징으로 하는 최상의 동시대적 방법들보다 훨씬 더 직접적이고 강력한데, 그 이유는 상기 동시대적 방법들은 단순히 세포 표면 결합에 대한 판독결과만을 제공하며 다수의 포지티브 오류(false positive)를 발생시키기 때문이다. 본 발명은 확인되지 않은 암 세포 표면 수용체를 통한 리간드-작용성 BIV의 전달을 가능하게 한다.
BIV의 가역적 마스킹: 가역적 마스킹은 초기에는 비-표적 기관을 우회(bypass)하기 위해 전달 중에 BIV 복합체의 양전하의 일시적 차폐를 제공하고, 그후 융합 도입(fusogenic entry)을 허용하기 위해 표적 세포 표면에서 재노출되는 전하를 제공한다. 따라서, 전하의 차폐를 제공하는 마스크는 BIV 복합체로부터 해리되며, 따라서 가역적이다. 상기 BIV 전달 시스템이 독특하게 효율적인 이유 중의 하나는, 상기 복합체가 세포막과의 융합에 의해 치료제를 세포 내로 전달하며 엔도시토시스 경로(endocytic pathway)를 회피하기 때문이다. 본 발명은, 생체내 주입 또는 투여 직전에 표적 전달에 사용되는 복합체에 첨가될 수 있는 "차폐/탈차폐 화합물(shielding/deshielding compound)"을 사용하여 폐 및 기타의 비-특이적 표적 기관으로의 흡수를 회피한다[참조: Templeton, N.S. 2006년 5월 2일자로 발행된 미국 특허 제7,037,520 B2호, 이에 참조로 인용된 관련 부분들]. 비-특이적 형질전환을 우회하기 위한 전략을 "가역적 마스킹(reversible masking)"이라 부르며, 상기 전략은 중성의 소분자량 지질(약 500 MW 이하), 예를 들면, n-도데실-베타-D-말토피라노시드를 사용한다. 이들 지질은 작고 하전되어 있지 않아서, 이들은 BIV 복합체의 표면과 느슨하게 연합되며 이들이 표적 세포에 도달하는 시간까지는 순전히 혈류의 전단력으로 제거된다.
BIV 리간드-피복된 가역적으로 마스킹된 복합체가 효율적으로 전달되는 또 다른 이유는, 상기 복합체는 이들이 표적 세포에 접근할 때 이들의 전체 양전하를 다시 노출시키기 때문이다. 표적 세포에서 "마스크"를 제거함으로써, 융합 경로(fusogenic pathway)에 의해 표적 세포에 진입하기 위한 적절한 전체 양전하가 복합체의 표면 상에 보존된다. 이에 의해, 최초 통과(first pass)에서 복합체의 90% 이상이 표적 세포에 도달 및 전달되면서, 비-표적 조직으로의 흡수가 회피되며, 세포 표면과 효율적으로 상호작용하여 최적의 형질전환을 생성함으로써 복합체의 최적 순환 시간(circulation time)이 달성된다.
도 26a는 CAT 암호화 플라스미드를 캡슐화하는 BIV를 마스킹제 없이 SCID 마우스에 정맥내(IV) 주사한 후의 폐 및 심장의 최적의 형질전환을 도시한 것이다. 도 3은 가역적 마스킹에 의한 탈차폐, 세포막과의 융합, 및 치료제 또는 조영제의 세포 및 (바람직한 경우) 핵으로의 도입을 포함하는 표적화된 전달을 달성하는데 사용된 최적화된 전략을 보여준다.
탐색 라이브러리의 스크리닝: MCF-7 사람 유방암 세포, A549 사람 폐암 세포, PANC1 및 Mia PaCa2 사람 췌장암 세포, H1299 사람 소세포 폐암 세포의 사람 종양 내피, PANC1 사람 췌장암 세포의 사람 종양 내피 및 상응하는 정상 세포 타입들에서 시험관내 스크리닝에서의 대량 처리를 사용하여 상기 150개 이량체의 라이브러리를 시험하였다. 본 발명자들의 독특한 DOTAP:합성 콜레스테롤(50:45) 수동 추출을 사용하여 BIV를 제조하였다[1]. 본 발명자들은 BIV 복합체를 탄화수소 꼬리를 갖는 2가 화합물과 혼합하고(리간드-피복된 BIV 복합체) 이것을 O/N 항온처리함으로써 작용성 복합체를 제조하였다. 항온처리시, 상기 탄화수소 꼬리는 BIV 복합체의 표면 지질 이중층에 자발적으로 삽입된다. 이들 2가 화합물 각각은 치료제(예: 화학요법 약물, 유전자 치료제) 또는 리포터(루시퍼라제 암호화 플라스미드) 1㎍당 1×10-1 내지 104 pg 범위의 표면 농도로 첨가되었다. 생체내 연구를 위해, 복합체를 1.0μM 폴리설폰 필터(Whatman)를 통해 여과한 후, 소분자 리간드를 첨가하고, 리간드 피복된 BIV 복합체에 마스킹제를 첨가한 후, 상술된 바와 같이 정맥내 주사하였다. 정상 세포에 비해 암 세포에 또는 정상 내피에 비해 종양 내피에 BIV를 선택적으로 유도하는 1가 또는 2가 리간드를 식별하기 위해 대조 연구를 사용하였다.
모든 세포 타입은 수백 또는 심지어 수천 개의 세포 표면 수용체(이들 중 대부분은 현재까지 확인되지 않고 있다)를 가지며, 제안된 접근법은 각각의 웰에서 최적의 리간드-수용체 상호작용을 확인하기 위해 이들 모두를 조사한다. 이 스크린을 "통과(pass)"하는 2가 화합물은 생체내에서 종양 및 이들의 전이 또는 종양 내피를 영상화하고/하거나 파괴하기 위한 조영제 또는 치료제를 캡슐화하는 가역적으로 마스킹된 BIV-복합체에 혼입된다. 상기 접근법은 따라서 생체내에서 상이한 암 세포들에 치료 물질 또는 조영제를 전달함에 있어 극히 직접적이다.
가장 성공적인 표적화된 전달을 제공하는 리간드에 결합하는 세포 표면 수용체들을 식별할 수 있다. 이들 리간드를 친화성 컬럼(affinity column) 상에 고정시킬 수 있고, 가용화된 세포 추출물을 상기 컬럼에 통과시킬 수 있다. 결합된 재료를 단백질 식별을 위해 질량 분석법 및 데이터베이스 분석에 의해 평가할 수 있다. 본 발명자들이 식별한 수용체가 공지된 신호전달 수용체인 경우, 본 발명자들은 또한, 본 발명자들의 리간드가 해당 수용체의 활성화를 활성화하는지 아니면 억제하는지에 대해 조사할 수 있다.
포지티브 히트(positive hit): MCF-7 세포의 형질전환에 있어서 BIV 복합체의 표면 상에 피복된 화합물 번호 1035, 1036, 1039, 1063, 1064, 1066 및 1067을 사용하여 유의한 포지티브 히트(히트)를 수득하였다. 한편, A549 세포에서는 화합물 번호 1001, 1003, 1042, 1051, 1062, 1096, 1107, 1108 및 1029를 사용하여 히트를 찾아냈다. 도 9는 열거된 화합물들의 A549 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다. 히트는 BIV 복합체 단독을 사용한 형질전환에 대하여 형질전환을 적어도 100%(Y축에서 +2) 증가시킨 화합물로서 정의되었다. 관찰된 최대 히트는 형질전환 효율에서 거의 300%(Y축에서 +4) 증가를 제공하였다. 이들 히트는 MCF-7에 대한 정상 또는 거의 정상의 대응 세포주 MCF-10A 세포를 스크리닝함에 있어서는 발견되지 않았다. 도 8은 열거된 화합물들의 MCF7 세포에 대한 형질전환 효율을 보여주는 그래프이다. MCF-10A 세포는 거의 정상의 대조 세포주로서 흔히 사용되는데, 그 이유는 이들이 정상 또는 거의 정상의 핵형(karyotype)을 갖는 사람 유선 세포이기 때문이다[참조: Soule, HD, et al. (1990) 자발적으로 불사화된(immortalized) 사람 유방 상피 세포주인 MCF-10의 단리 및 확인, Cancer Res 50: 6075-6086]. 도 10은 열거된 화합물들의 MCF10A 세포에 대한 형질전환 효율을 도시한 그래프이다. 췌장 세포 스크리닝에 대해, 하기 결과는 PANC1 및 Mia PaCa2 세포에 대해서는 통계학적으로 유의한 히트를 나타냈으며, 이는 정상 세포인 HPDE 상에서는 발견되지 않았다. 도 11, 도 12 및 도 13은 각각 PANC1, Mia PaCa2 및 HDPE 세포에서의 상대적 루시퍼라제 발현을 도시한 것이다. 단지 하나의 화합물 KB-995만이 둘 모두의 세포주에서 히트를 나타냈다. HUVEC + 사람 종양 세포의 공동-배양물은 H1299 폐암 세포와 PANC1 췌장 세포 둘 모두에 대한 공동-배양물에서 8일 후 종양 내피로의 전이를 나타냈다. 이는, 유동 세포 분석법에 의해 내피 세포 분획 상에서 CD31+가 증가되었다는 점과, 상기 공동-배양물에서는 VEGFA가 상향조절되었고 HUVEC에서는 그렇지 않았다는 점에 의해 증명되었다(본원에 데이터는 기재되지 않음). KB1116, KB1063 또는 KB1123을 사용하는 시험관내 스크린으로부터의 데이터는 H1299 종양 내피의 형질전환에 대해서는 히트를 나타냈으며 HUVEC 또는 H1299에 대해서는 그렇지 않았다. 도 14 및 도 16은, 본원에서 제시된 화합물들을 이용한, HUVEC 세포와 H1299 세포의 공동-배양물 및 HUVEC 세포 단독에서의 형질전환 향상을 보여준다. 도 15는 본 발명의 화합물들을 이용한 H1299 세포 단독의 배양물에서의 형질전환 결과를 도시한 것으로, 향상은 눈에 띄지 않았다. 한편, 상이한 화합물 KB1124 또는 KB1125를 사용한 경우 PANC1 종양 내피에 대한 히트가 생성되었다. 이들 화합물도 HUVEC 또는 PANC1을 스크리닝할 때에는 히트를 생성하지 않았다.
실시예 1
항-혈관신생은 종양 혈관으로 유도되는 경우에 효과적인 암 치료법이 될 수 있다. 본 발명자들은, 비-특이적 조직 및 기관을 우회하기 위한 가역적 마스킹과 함께 사용되는 본 발명자들의 독특한 이중라멜라 함입형 리포솜 복합체의 표면에 종양 내피-특이적 리간드를 부착시킴으로써 비-바이러스성 유전자 치료제의 사람 종양 혈관으로의 표적화된 전달을 달성하였다. 종양 내피 세포의 형질전환 효율은 향상시키지만 정상 내피 세포 또는 암 세포에 대해서는 그렇지 않은 소분자들을 식별하였다. 사람 종양 내피-췌장 종양을 갖는 마우스에게 본 발명자들의 가역적으로 마스킹된 표적화 복합체를 정맥내 투여한 경우, 상기 종양 내피에 대한 형질전환이 특이적으로 증가하였다. 본 발명자들의 트롬보스폰딘-1 암호화 플라스미드의 최적화된 표적 전달을 사용한 효능 연구는 종양 성장을 현저하게 억제시켰다. 따라서, 이들 소분자는 췌장 또는 폐 종양 내피를 특이적으로 표적화하며, 따라서 항-혈관신생적 암 치료에서 성공적으로 사용될 가능성을 갖는다.
지속적인 암 성장 및 전이에는 새로운 혈관이 형성되는 과정인 혈관신생(angiogenesis)이 요구된다[26,27]. FDA에 의한 항혈관신생 약물(예: 베바시주맙, 소라페닙 및 수니티닙)의 최근의 승인은 암 치료 전략으로서의 항-혈관신생의 이용을 뒷받침한다[28,29]. 유전자 치료요법에 사용되는 전달 비히클로는 바이러스성 벡터, 비-바이러스성 벡터 및 세균성 벡터가 포함된다([30]에서 검토됨). 생체내 전기천공법(electroporation), 탄도학적 전달 시스템 및 기타 무침(needle-free) 전달 시스템과 같은 기타의 전달 방법들도 사용된다([30]에서 검토됨). 안전성 우려의 감소 및 제조의 용이성으로 인해 비-바이러스성 벡터의 용도에 많은 연구가 집중되어 왔다. 비-바이러스성 벡터는 다수의 임상전 연구 및 임상 연구에서 성공적으로 사용되어 왔다([30]에서 검토됨)[31-34].
본 발명자들의 가역적 마스킹 기술과 함께 소분자를 사용하는 표적화된 전달이 비-표적 기관에서의 흡수를 우회시키기 위해 사용되었다는 것이 본원에서 증명된다(참조: Templeton, N.S. 2006년 5월 2일자로 발행된 미국 특허 제7,037,520 B2호). 버지스의 실험실에서 개발된 조합 라이브러리(combinatorial library)는 단백질을 선택적으로 결합시키도록 고안된 소분자들의 생성을 허용한다[35-38]. 상기 라이브러리의 구성원들은 단백질-리간드 상호작용의 핫스팟에서 발견되는 2차 구조 모티프, 예를 들면, 세포 표면 수용체에 대한 친화성을 갖도록 고안된 2가 베타-턴 모사체와 유사하다. 중요하게, 상기 2가 소분자는 세포 표면 수용체 결합에 대한 선택성을 가질 수 있다. 여기서, 상기 전략은 탄화수소 꼬리를 갖는 2가 분자를 생성하는데 적용되었으며, 본 발명자들의 실험실에서 이들로부터의 작용성 BIV 복합체의 제조는 신속하며 통상적이다.
마지막으로, 항-혈관신생 단백질인 사람 트롬보스폰딘-1(TSP1)을 암호화하는 플라스미드 DNA의 표적화된 전달에 효능 연구의 초점을 맞추었다. TSP1은 종양 성장을 지속시키는데 필요한 새로운 혈관의 형성인 혈관신생을 방지할 수 있는 분비성 단백질이다[39]. 변형된 TSP1 미메틱 ABT-510은 진행암을 치료하기 위한 II상 임상 시험이 진행 중에 있다[39]. 최근의 연구는 또한, 동물 모델에서 TSP1의 유전자 전달이 각종 암 및 종양 미세혈관 밀도의 성장을 현저하게 억제시킨다는 것도 입증하였다[32, 33, 40-42]. TSP1 발현 플라스미드의 가역적으로 마스킹된 표적화 전달이 TSP1 유전자 치료의 효율을 현저하게 개선시킨다는 것이 본원에서 증명된다.
BIV DNA:리포솜 복합체의 제조: 플라스미드 pCMV-THBS-1은 TSP1 유전자를 암호화한다. 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 플라스미드 DNA를 정제하였다. 합성 콜레스테롤을 DOTAP:콜레스테롤 50:45의 비로 사용한 것을 제외하고는, 이전에 기술된 바와 같이 DOTAP 및 DOTAP:Chol BIV 리포솜, BIV DNA:리포솜 복합체(BIV 복합체)을 제조하였다[43].
2가 소분자 제조: 간략하게는, 선택적 커플링을 통해 β-턴 1가 소분자들을 용액 중에서 혼합하여 2가 소분자인 동종이량체 KB991 내지 KB1005 및 이종이량체 KB1006 내지 KB1140을 제조하였다. 상기 과정에서, 커플링을 수행하는데에는 탄산칼슘만이 요구되었다. Boc-보호된 단량체성 화합물을 25℃에서 4시간 동안 CH2Cl2 중의 30% TFA로 처리하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 DMSO에 다시 용해시켜 0.03M 용액을 제조하였다. 디클로로트리아진 링커 스캐폴드 및 K2CO3을 순차적으로 첨가하였다. 수득된 현탁액을 15분간 초음파 처리하고, 7일간 진탕시켰다. DMSO를 동결건조시키고, 상기 고체 잔류물에 HCl 수용액(5%, 약 0.5㎖)을 첨가하고 3분간 초음파 처리하였다. 대부분의 화합물들이 산성 용액 중에 침전되었다. 원심분리한 후, 펠릿을 건조시키고 저장하였다. BIV 복합체의 표면 상에 1가 또는 2가 소분자를 피복시키기 위해, 표면 지질 이중층으로의 삽입을 위한 탄화수소 꼬리를 상기 분자 내에 포함시켰다. 화합물(약 10.0㎎)을 먼저 THF/H2O(v:v = 1:1) 1.0㎖에 용해시켰다. CuSO4 용액(1.0M, 10㎕)을 첨가한 후, Cu 분말(1.0㎎)을 첨가하였다. 상기 공정 후에, THF 중의 아지도옥타데칸 용액(0.1mmol, 0.2㎖)을 첨가하고, 수득된 현탁액을 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 실리카 겔로 충전된 유리 피펫을 통해 CH2Cl2 중의 30% 메탄올을 용리액으로서 사용하여 상기 현탁액을 여과하였다. 상기 용액을 건조 및 농축시켜 최종 생성물을 수득하였다. 합성 후, 고체 화합물을 유리 시험관 내에서 클로로포름:메탄올(1:1)에 용해시켰다. 조직 배양 후드 아래의 아르곤 기체 정상 스트림하에 상기 관의 바닥에서 박막이 생성되었다. 상기 막을 무균수에 용해시켜 5㎎/㎖ 저장용액을 생성하고, 50℃에서 초음파 처리하였다(Lab-Line Trans-sonic 820/H). 상기 재구성된 화합물의 분취량을 -80℃에서 저장하였다.
도 24. 시험관내 전달 및 고속 대량 루시퍼라제 분석: 표적화되지 않은 BIV 복합체보다 더 효율적으로 종양 혈관 내피 세포에 내재화되는 BIV 복합체의 표면에 부착된 1가 또는 2가 화합물들을 식별하기 위해 고속 대량 분석을 사용하였다.
생체내 표적화된 전달 및 CAT 분석: 상술된 바와 같은 공동-배양물을 IP 주사한 후 8주 후에, BIV-CAT DNA 복합체를 제조하고, 상기 논의된 바와 같이 소분자 KB1023(DNA 1㎍당 화합물 500pg)으로 피복하였다. 상기 복합체를 다양한 농도의 가역적 마스킹제 n-도데실-베타-D-말토피라노시드(Anatrace, Maumee, OH)와 혼합한 직후, 마우스에 정맥내(IV) 주사하였다. 각각의 마우스는 p4119 CAT DNA 50㎍을 함유하는 복합체 110㎕의 총 용적으로 주사되었다. IV 주사 후 14시간 후에, 마우스를 희생시키고, 조직을 수확하고, 이전에 기술된 바와 같이 총 단백질을 추출하였다[43]. CAT ELISA 키트(Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 CAT 단백질 생성을 측정하였다. Micro BCA 키트(Pierce)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 단백질 농도를 측정하였다.
항-혈관신생적 암 치료요법: 상술된 바와 같은 공동-배양물을 IP 주사한 후 2주 후에, TSP1 플라스미드 DNA 35㎍을 BIV-KB1023 피복된 복합체 내에 캡슐화하고 IV 주사 전에 11mM 가역적 마스킹제를 사용한 것을 제외하고는 상술된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 생체내 전달을 수행하였다. 총 3회의 주사를 위해 2주 마다 한 번씩 주사를 수행하였다. 상이한 그룹에서는, 총 5회의 주사를 위해 매주 주사를 수행하였다. 최종 주사 후 2주 후에(종양 모델을 확립하기 위해 공동-배양물을 IP 주사한 후 8주 후), 마우스를 희생시키고, 종양 크기를 측정하였다. 복강내 종양 및 기타 기관(간, 폐, 비장, 췌장 및 결장)을 해부한 후 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다.
시험관내 사람 종양 내피 모델: 종양 세포는 이들의 성장을 위한 혈관신생을 개시 및 자극하기 위해 성장 인자 및 사이토킨을 분비한다([44]에서 검토됨). 따라서, 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사람 H1299 비-소세포 폐암종 세포와 공동-배양하거나(H1299 공동-배양물) 사람 PANC1 췌관 선암과 공동-배양함으로써(PANC1 공동-배양물) 시험관내 사람 종양 내피 모델을 확립하였다.
표적화된 전달을 위한 소분자 라이브러리: "세미-펩티드성" β-턴 유사체인 15개의 동종이량체 및 135개의 이종이량체 2가 화합물의 제조된 라이브러리를 사용하였다. 유의하게, 이들 화합물은 임의의 아미노산 측쇄를 혼입시킬 수 있어서, 이들은 해당 모티프를 포함하는 임의의 핫스팟에서 턴을 모방하도록 고안될 수 있다. 이들 화합물은 극성 "탄두" 관능성(모사체 A 및 B)[45] 및 소수성 꼬리를 갖는다는 점에서 종래에 제조되었던 기타 화합물 라이브러리와는 상이하다. 종래의 연구에서 사용된 소분자 펩티도미메틱은 β-턴 핫스팟을 갖는 몇몇 단백질-단백질 상호작용 표적에 대해 활성이다[36, 37]. 상기 화합물들 중의 하나는 뉴런 상의 TrkA 수용체에 결합되고 뇌졸중 회복 및 치매를 포함하는 신경퇴행성 장애를 위한 용도를 갖는다[38, 46]. 본 발명자들의 연구에 사용되는 커스텀 라이브러리(custom library)를 위해, 커플링에 탄산칼슘만이 요구되는 화학적 단계들을 통해 2개의 1가 모사체를 조합하여 2가 동종이량체 및 이종이량체를 형성하였다. 이러한 변형은 세포 표면 수용체에 대한 상기 화합물의 친화성을 크게 향상시킨다. 대부분의 조합적 합성과 달리, 상기 접근법의 최종 단계에서는 보호 그룹이 포함되지 않아, 보호 그룹 잔류물 및 첨가된 스캐빈저 재료로부터 최종 생성물을 정제할 필요가 없다. 리포솜 복합체의 표면에 화합물을 피복시키기 위해 탄화수소 꼬리가 구조적으로 혼입되었다.
고속 대량 시험관내 스크리닝: 종양 내피 표적화 리간드에 대한 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 신규한 고속 대량 루시퍼라제 분석이 개발되었다. 성공적인 고속 대량 스크린을 위해서는 높은 감도의 정밀한 검출 시스템이 요구된다. 뿐만 아니라, 잠재적 리간드 결합 및 세포막을 통한 내재화의 검출을 위한 세포핵 내로의 전달은 가장 직접적이고 궁극적으로 신뢰할 수 있다. 상기 핵에 전달된 플라스미드 DNA에 의해 생성된 루시퍼라제 발현은 이들 기준을 만족시킨다.
본 발명자들의 고속 대량 스크린을 사용하여 2가 및 1가 소분자 라이브러리에 대해 공동-배양물 대 암 세포 대 HUVEC를 시험관내에서 스크리닝하였다. 히트는 BIV 복합체 단독을 사용한 형질전환에 대하여 루시퍼라제 플라스미드의 형질전환을 적어도 100%(Y축에서 +2) 증가시킨 화합물로서 정의되었다. 상기 라이브러리의 스크리닝에서, 본 발명자들은, PANC1 공동-배양물에서는 형질전환 효율을 100% 특이적으로 향상시키지만(도 17) PANC1 세포 단독(도 18) 또는 HUVEC 단독(도 19)에서는 그렇지 않은 화합물 KB1023을 식별하였다. KB1023의 구조가 도 23b에 도시되어 있다.
공동-배양물의 혈관 내피 세포에 대해서만 증가된 형질전환이 관찰되었다는 것을 추가로 입증하기 위해, 바닥 웰에서 성장한 HUVEC와 함께 트랜스웰 플레이트에서 8일간 PANC-1 세포 및 HUVEC의 성장을 수행하였다. 도 17에 도시된 데이터는, 공동-배양물의 혈관 내피 세포에 대해서만 KB1023 피복된 BIV-루시퍼라제 DNA 복합체에 의한 진정한 형질전환 증가가 생성된다는 것을 입증한다. 기타 사람 췌장 세포주를 HUVEC와 함께 공동-배양하고, 증가된 전달을 위해 KB1023을 사용하여 형질전환시켰다. AsPC1 세포만이 현저한 형질전환 증가를 나타냈으며, miaPaCa2 및 BxPC3 세포는 그렇지 않았다(데이터는 기재하지 않음). 이들 데이터는 종양 내피 상에서의 표적화 분자의 발현이 췌장 암종별로 상이할 수 있다는 것을 제안한다.
실시예 2
항-혈관신생적 암 치료요법을 위한 리포솜 복합체의 표적화된 전달. 항-혈관신생은 종양 혈관으로 유도되는 경우에 효과적인 암 치료요법이 될 수 있다. 본 발명자들은, 비-특이적 조직 및 기관을 우회하기 위한 가역적 마스킹과 함께 사용되는 본 발명자들의 독특한 이중라멜라 함입형 리포솜 복합체의 표면에 종양 내피-특이적 리간드를 부착시킴으로써 비-바이러스성 유전자 치료제의 사람 종양 혈관으로의 표적화된 전달을 달성하였다. 일차 사람 내피 세포를 사람 폐 또는 췌장암 세포와 함께 공동-배양함으로써 시험관내 사람 종양 혈관 모델을 창출하였다. 상기 모델은, CD31 및 VEGF-A를 포함하는 종양 내피 표현형들의 증가된 발현, 및 내피 모세혈관-유사 구조의 지속적 생존에 의해 확증되었다. 종양 내피-특이적 리간드를 식별하기 위한 특정 소분자 라이브러리의 고속 대량 스크리닝을 위해 공동-배양물이 사용되었다. 본 발명자들은, 종양 내피 세포의 형질전환 효율은 증가시키지만 정상 내피 세포 또는 암 세포에 대해서는 그렇지 않은 소분자들을 식별하였다. 본 발명의 가역적으로 마스킹된 표적화 복합체를 사람 종양 내피-췌장 종양을 갖는 마우스에게 정맥내 투여한 경우, 상기 종양 내피에 대한 형질전환이 특이적으로 증가하였다. 본 발명자들의 트롬보스폰딘-1 암호화 플라스미드의 최적화된 표적화 전달을 사용한 효능 연구는 종양 성장을 현저하게 억제시켰다. 이들 소분자는 췌장 또는 폐 종양 내피를 특이적으로 표적화하며 항-혈관신생적 암 치료에 유용하다는 것이 밝혀졌다.
사람 종양 내피 시험관내 및 생체내 마우스 모델. 종양 세포는 이들의 성장을 위한 혈관신생을 개시 및 자극하기 위해 성장 인자 및 사이토킨을 분비한다. 따라서, 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)를 사람 H1299 비-소세포 폐암종 세포와 공동-배양하거나(H1299 공동-배양물) 사람 PANC1 췌관 선암과 공동-배양함으로써(PANC1 공동-배양물) 시험관내 사람 종양 내피 모델을 확립하였다. 본 발명자들은 먼저 정상 내피가 종양 혈관 내피로 전이되는 것을 나타내는 내피 마커의 경시적 변화를 찾았다. 공보 문헌에는 유동 세포 분석법에 의해 검출된 바와 같이 상기 전이에서 내피 세포 상의 CD31의 증가가 일어날 수 있다고 제안되어 있다[30]. 유동 세포 분석법 데이터(도 20b, 도 20c)는 상기 전이가 H1299 세포와의 공동-배양물에서 8일째와 9일째 사이에 일어난다는 것을 보여준다. 대다수의 HUVEC가 낮은 수준의 CD31을 발현하였다(도 20a, R4에 의해 게이팅됨). 단지 소수의 HUVEC만이 높은 수준의 CD31을 발현하였다(R2에 의해 게이팅됨). H1299 공동-배양물에서 8일 후, 높은 수준의 CD31 발현 내피 세포의 백분율이 HUVEC 대조물의 것에 비해 113% 증가하였다(도 20b; 16.86% 대 7.9%). 공동-배양물에서 9일 후, 증가된 CD31 발현은 HUVEC 대조물에 비해 264% 현저하게 더 높았다(도 20c; 29.96% 대 8.23%).
종양 혈관에서는 VEGF-A 오토크린 루프(autocrine loop)가 활성화되며, mRNA 수준 및 단백질 수준 둘 다에서 VEGF 수용체 및 VEGF-A의 발현이 증가된다[31]. VEGF-A는 또한 핵심적인 혈관신생 촉진 인자이며, 내피 세포 증식 및 이동을 촉진시키고, 내피 세포 생존을 연장시키며, 내피 세포에 의해 형성되는 모세혈관-유사 관상 구조물을 유지시킨다[32, 33]. 도 21은 0.4㎛ 크기의 미세기공성 막을 갖는 2-챔버 트랜스웰 플레이트 내의 공동-배양물 중에서 8일째에 PANC-1 공동-배양물에서 정량적 RT-PCR(도 21a; 225%) 및 웨스턴 블로팅(도 21b; 160%)에 의해 검출된 바와 같은 VEGF-A의 증가된 발현을 도시한 것이다.
매트리겔 상에 평판배양할 때, 내피 세포는 시험관내에서 모세혈관-유사 관상 망상구조를 일시적으로 형성한다. 매트리겔 상에 평판배양한 후 16시간 후에, 본 발명자들의 분석 결과, HUVEC(도 22a)와 PANC1 공동-배양물의 내피 세포(도 22b; 트랜스웰 플레이트에서 8일간 공동-배양됨) 사이에 관 형성에 있어서 현저한 차이가 없는 것으로 나타났다. HUVEC 대조물의 관상 구조물은 48시간째에 분해되기 시작했으며 약 72시간째에는 거의 완전히 분해되었다(도 22c). 반면, PANC1 공동-배양물로부터의 내피 세포에서는 72시간째에 상당량의 관상 구조물이 생존해 있었고(도 22d), 11일 이상 동안 계속 생존하였다(도 22e 내지 도 22f). 상기 트랜스웰 플레이트로부터 PANC1 세포 삽입물을 제거했을 때, PANC1 공동-배양물로부터 분리된 내피 세포와 HUVEC 사이에는 관 생존에서의 차이가 검출되지 않았다. 이들 데이터는, 암 세포를 갖는 공동-배양물에 의해 생성된 인자는 아마도 증가된 VEGF-A 발현으로 인해 상기 공동-배양물의 내피 관상 구조물의 생존을 연장시킨다는 것을 증명한다.
표적화된 전달을 위한 소분자 라이브러리의 고속 대량 시험관내 스크리닝. "세미-펩티드성" β-턴 유사체인 15개의 동종이량체 및 135개의 이종이량체 2가 화합물의 라이브러리를 스크리닝하였다. 이들의 일반 구조는 도 4에 도시되어 있다. 도 4에서는 상단에 일반 구조가 도시되어 있고, 명칭 KB991 내지 KB1005의 특정 구조물들이 각각 왼쪽에서 오른쪽으로 도시되어 있다. 유의하게, 이들 화합물은 임의의 아미노산 측쇄를 혼입시킬 수 있어, 이들은 해당 모티프를 포함하는 임의의 핫스팟에서의 턴을 모방하도록 고안될 수 있다. 이들 화합물은 극성 "탄두" 관능성(모사체 A 및 B) 및 소수성 꼬리를 갖는다는 점에서 종래에 제조되었던 기타 화합물 라이브러리와는 상이하다. 종래 연구에서 사용되었던 소분자 펩티도미메틱은 β-턴 핫스팟을 갖는 몇몇 단백질-단백질 상호작용 표적에 대해 활성이다. 상기 화합물들 중의 하나는 뉴런 상의 TrkA 수용체에 결합되고 뇌졸중 회복 및 치매를 포함하는 신경퇴행성 장애를 위한 용도를 갖는다. 본 발명자들의 연구에 사용되는 커스텀 라이브러리를 위해, 커플링에 탄산칼슘만이 요구되는 화학적 단계들을 통해 2개의 1가 모사체를 조합하여 2가 동종이량체 및 이종이량체를 형성하였다. 이러한 변형은 세포 표면 수용체에 대한 상기 화합물의 친화성을 크게 향상시키는 것으로 밝혀졌다. 대부분의 조합적 합성과 달리, 상기 접근법의 최종 단계에서는 보호 그룹이 포함되지 않아, 보호 그룹 잔류물 및 첨가된 스캐빈저 재료로부터 최종 생성물을 정제할 필요가 없다. 리포솜 복합체의 표면에 화합물을 피복시키기 위해 탄화수소 꼬리가 구조적으로 혼입되었다.
종양 내피 표적화 리간드를 위한 소분자 라이브러리를 스크리닝하기 위한 신규한 고속 대량 분석이 개발되었다(도 24). 성공적인 고속 대량 스크린을 위해서는 높은 감도의 정밀한 검출 시스템이 요구된다. 뿐만 아니라, 잠재적 리간드 결합 및 세포막을 통한 내재화의 검출을 위한 세포핵 내로의 전달은 가장 직접적이고 궁극적으로 신뢰할 수 있다. 상기 핵에 전달된 플라스미드 DNA에 의해 생성된 루시퍼라제 발현은 이들 기준을 만족시킨다; 이는 간단하고 잘 정립된 기술이다. 형질전환 효율의 높은 감도의 대량 처리 정량화를 달성하기 위해 루미노스캔 어센트(Luminoskan Ascent) 플레이트 광도계(Thermo Labsystems)를 사용하였다.
본 발명자들의 고속 대량 스크린을 사용하여 2가 및 1가 소분자 라이브러리에 대해 공동-배양물 대 암 세포 대 HUVEC를 시험관내에서 스크리닝하였다. 히트는 BIV 복합체 단독을 사용한 형질전환에 대하여 루시퍼라제 플라스미드의 형질전환을 적어도 100%(Y축에서 +2) 증가시킨 화합물로서 정의되었다. 상기 라이브러리의 스크리닝에서, 본 발명자들은, PANC1 공동-배양물에서는 형질전환 효율을 100% 특이적으로 향상시키지만(도 25a) PANC1 세포 단독(도 25b) 또는 HUVEC 단독(도 25c)에서는 그렇지 않은 화합물 KB1023을 식별하였다. 세포 표면 수용체와 상호작용하기 위한 2개의 β-턴 모사체, BIV 리포솜 복합체로의 삽입을 위한 탄화수소 꼬리 및 링커를 포함하는 상기 2가 소분자의 일반 구조가 도 23a에 도시되어 있다. KB1023의 구조는 도 23b에 도시되어 있다.
공동-배양물의 혈관 내피 세포에 대해서만 증가된 형질전환이 관찰되었다는 것을 추가로 입증하기 위해, 바닥 웰에서 성장한 HUVEC와 함께 트랜스웰 플레이트에서 8일간 PANC-1 세포 및 HUVEC의 성장을 수행하였다. 도 25d에 도시된 데이터는, 공동-배양물의 혈관 내피 세포에 대해서만 KB1023 피복된 BIV-루시퍼라제 DNA 복합체에 의한 진정한 형질전환 증가가 생성된다는 것을 입증한다. 기타 사람 췌장 세포주를 HUVEC와 함께 공동-배양하고, 증가된 전달을 위해 KB1023을 사용하여 형질전환시켰다. AsPC1 세포만이 현저한 형질전환 증가를 나타냈으며, miaPaCa2 및 BxPC3 세포는 그렇지 않았다(도 25e). 이들 데이터는 종양 내피 상에서의 표적화 분자의 발현이 췌장 암종별로 상이할 수 있다는 것을 제안한다.
또한, 비-소세포 폐암종 H1299의 사람 종양 내피에 대한 특이적 결합에 대해 소분자 히트에 대한 라이브러리를 스크리닝하였다. H1299 공동-배양물에서는 형질전환 효율을 증가시키지만 H1299 세포 단독(도 25g) 또는 HUVEC 단독(도 25h)에서는 그렇지 않은 상이한 화합물 KB1061이 식별되었다(도 25f), 이상적으로, 본 발명자들은, 본 발명자들의 HUVEC + 종양 세포 공동-배양물에서 모든 종양 혈관 내피 세포로의 전달을 가장 잘 매개할 수 있는 하나의 리간드를 식별하기 위한 계획을 수립하였다. 그러나, 본 발명자들의 공동-배양물을 포함하는 상이한 종양 혈관 미세환경의 공지된 복잡성 및 다양성으로 인해, 본 발명자들의 데이터는 상이한 종양 혈관 표현형으로의 향상된 전달을 달성하기 위해 복수개의 리간드가 요구된다는 것을 나타낸다. 혈관신생 반응을 경험하는 내피 세포 표면 상에서 특이적으로 발현되는 수개의 마커가 식별되었으며 파지 입자, 약물, 치료학적 항체 및 기타 시약들의 표적화된 전달을 위해 사용되고 있다[23, 36-43]. 흥미롭게도, 유전자 발현 패턴 분석[23, 37] 및 감산 단백체학 맵핑(subtractive proteomic mapping)[43]은 상이한 종양 타입으로부터의 종양 혈관 내피 세포 표면 상에서 발견되는 마커들에서 다수의 차이점과 몇몇 유사점을 나타냈다. 종양 미세환경에서, 내피 세포는 종양 세포, 면역 세포, 혈관주위세포(pericyte), 섬유아세포, 혈관주위세포 및 세포외 매트릭스(ECM)와 상호작용한다. 종양 세포는 파라크린(paracrine) 매커니즘을 통해 또는 간접적으로는 ECM을 변경시키는 등에 의해, 내피 세포의 유전자 발현 및 표현형을 변경시킬 수 있다.
생체내 사람 종양 내피 표적화. 정맥내(IV) 주사 후의 비-특이적 흡수를 우회하기 위해 가역적 마스킹을 사용하여 생체내 KB1023의 표적화를 확증하고 전달을 최적화하였다. 공동-배양물에서 9일 후, PANC1 공동-배양물을 SCID 마우스에 복강내(IP) 주사하여 사람 췌장 종양 내피 + PANC1 종양 모델을 확립하였다. IP 주사 후 8주 후에, 췌장 종양이 약 400㎣일 때 표적화된 전달을 평가하였다. 본 발명자들의 PANC-1 공동-배양물 모델에서 KB1023 피복된 BIV-CAT DNA 복합체를 SCID 마우스에 IV 주사하였을 때, 절대 다수가 폐 및 심장에 비-특이적으로 전달되었다(도 26a). 단지 작은 부분만이 종양 조직에 전달되었다. 이 결과는, 대부분의 DNA:리포솜 복합체가 IV 주사 후 폐에 전달된 것을 보여주는 기타 보고서와 일치한다[15, 45]. 높은 수준의 표적 세포 형질전환을 유지하면서도, 비-특이적 전달을 최소화하기 위한 페길화보다 더 효율적인 신규한 "가역적 마스킹" 접근법이 사용되었다. 폐 및 기타 비-특이적 표적 기관에서의 흡수를 회피하기 위해, 본 발명은 또한 생체내 주입 또는 투여 직전에 표적화된 전달에 사용되는 복합체에 첨가될 수 있는 "차폐/탈차폐 화합물"을 사용할 수 있다(참조: Templeton, N.S. 미국 특허 제7,037,520 B2호, 이에 참조로 인용된 관련 부분들). 본 발명의 전략은 중성의 소분자량 지질(약 500 MW 이하), 예를 들면, n-도데실-β-D-말토피라노시드를 사용한다. 이들 지질은 작고 하전되어 있지 않기 때문에, 이들은 BIV 복합체의 표면과 느슨하게 연합되며 이들이 표적 세포에 도달하는 시간까지는 혈류에서 제거된다. 제타 전위 분석기(Delsa 440SX, Beckman-Coulter) 상에서 복합체의 전체 전하를 측정하였다. 표면 전하 45.5mV의 BIV 복합체는 가장 높은 수준으로 세포를 형질전환시킨다. 반면, 전하 4.8mV의 가역적 마스킹제로 피복된 BIV 복합체는 세포, 조직 또는 기관을 형질전환시키지 않는다(참조: Templeton, N.S., 미국 특허 제7,037,520 B2호, 이에 참조로 인용된 관련 부분들). 따라서, 복합체의 전체 전하는 주사 후 간단히 차폐되어야 하고, 이후 표적 세포를 형질전환할 때에 다시 노출되어야 한다.
가역적 마스킹제인 n-도데실-β-말토피라노시드를 증량시키면서 첨가함으로써 BIV 복합체의 전체 전하의 감소를 달성하였다(참조: Templeton, N.S. 미국 특허 제7,037,520 B2호, 이에 참조로 인용된 관련 부분들). 비-표적 기관 및 조직으로의 전달을 우회시키면서 주어진 표적 기관으로 전달하기 위해 상기 가역적 마스크를 최적화할 수 있다. 도 26b는 IV 주사 후 폐 및 심장으로의 BIV-CAT DNA 리포솜 복합체의 전달을 우회하기 위해 110㎕ 주사 용적의 11mM n-도데실-β-말토피라노시드(가역적 마스크)가 필요하다는 것을 보여준다(발현이 97% 이상 감소되었음). 상응하게, KB1023 피복된 BIV-CAT DNA 복합체 + 11mM 가역적 마스크의 전달은, 피복되지 않은 BIV 복합체 단독(대조물)에 비해, SCID 마우스에서 PANC-1 공동-배양물 모델의 사람 종양 혈관 내피를 포함하는 종양 조직에 대해 약 10배 증가된 전달을 나타냈다(도 26c). CAT 분석 및 단백질 분석을 수행하기 위해 종양 조직으로부터 종양 혈관 내피를 해리시키는 것은 금지적이며, 따라서 종양 혈관 내피로의 10배 증가된 전달은 낮은 추정치이다. 종양 내피는 전체 종양 용적의 약 5%이기 때문에, 종양 혈관으로의 표적화된 전달의 증가는 피복되지 않은 BIV 복합체 단독을 사용한 전달에 비해 아마도 약 200배 더 높을 것이다. 본 발명자들의 시험관내 데이터와 결부된 본 발명자들의 생체내 결과는, KB1023이 종양 내피 세포를 표적화하였으며 SCID 마우스에서 PANC-1 공동-배양물의 암 세포는 표적화하지 않았다는 것을 제안한다.
가역적 마스킹에 의해 수득된 증가된 CAT 발현은 간에 비해서도 종양에 특이적이었다. 도 26c는, KB1023 피복된 BIV-CAT DNA 복합체 + 가역적 마스크가 간에서의 CAT 발현을 증가시키지 않았으며, 11mM 가역적 마스크에서 간에서의 발현이 무시될 만한 정도였다는 것을 보여준다. 따라서, 표적화는 특이적이었으며 간에서의 쿠퍼 세포에 의한 복합체의 흡수 및 청소율을 증가시키지 않았다. 가역적 마스크의 양을 11mM 넘게 더 증가시켜도 종양에서의 CAT 발현의 추가의 증가가 유도되지 않았다. 오히려, 발현이 감소되었으며, 이는 11mM 가역적 마스크가 SCID 마우스에서의 PANC1 공동-배양물 모델에서 사용하기에 최적의 농도라는 것을 보여준다.
종양 성장 억제. CAT 리포터 유전자를 사용하여 생체내 표적화를 최적화한 후, 본 발명자들은 치료학적 유전자로서 항-혈관신생 TSP1을 사용하는 종양 성장 예방에서 본 발명자들의 표적화된 전달의 효능을 시험하였다. 도 27은, 소분자(리간드)인 KB1023의 존재하에 또는 부재하에, 및 가역적 마스킹(RM)의 존재하에 또는 부재하에, 본 발명자들의 사람 종양 내피 + PANC-1 종양을 갖는 마우스에 BIV-TSP1 DNA 복합체를 IV 주사한 후 발생되는 생체내 효능 데이터를 도시한 것이다. 도 27에 나타난 바와 같이, KB1023 피복된 BIV-TSP1 DNA 복합체로 처리된 마우스는 췌장암 성장의 현저한 억제를 나타냈다. 종양 성장이 BIV 리포솜 주사 대조물에 비해 87.99% 억제되었다(평균 종양 용적은 47.27㎣ 대 393.54㎣였다). 표적화된 전달을 가역적 마스킹과 결합시켰을 때, 종양 성장이 리포솜 주사된 대조물 393.54㎣에 비해 평균 종양 용적 5.25㎣로 98.67% 억제되었다. 이들 결과는 대략 2주 마다 1회로 총 3회 IV 주사된 후에 생성되었다. 뿐만 아니라, 본 발명자들이 주 1회 투여로 주사의 총 횟수를 총 5회로 늘림으로써 전체 TSP1 치료제 용량을 증가시켰을 때, 종양 성장이 한층 더 억제되었으며 종양이 거의 제거되었다(평균 종양 용적은 0.7㎣였다). TSP1의 표적화되지 않은 전달로 치료된 마우스는 146.82㎣의 평균 용적으로 62.69%의 종양 성장 지연을 나타냈지만, 상기 감소는 통계학적으로 유의하지 않았다(P>0.05). 흥미롭게도, 본 발명자들은, 바이러스 벡터들인 아데노바이러스[29] 또는 아데노-관련 바이러스[12], 양이온성 중합체[28] 또는 세균 벡터인 살모넬라 콜레라수이스(Salmonella choleraesuis)[27]를 사용하여, TSP1 항-혈관신생적 유전자 치료 접근법에 대해 보고된 효능 데이터를 초월하였다. 아마도, 본 발명자들의 증가된 효능은 전적으로 사람 종양 내피에서의 높은 수준의 특이적 전달 및 유전자 발현에 기인한다.
종양 혈관은 형태학적으로 비정상이며, 혈관 내피 세포는 분자적 수준 및 기능적 수준에서 정상 내피 세포와 상이하다. 가장 효율적인 항-혈관신생적 암 치료법을 개발하기 위해서는 종양 혈관의 생물학을 이해하고 고속 대량 스크리닝에 의해 항-혈관신생제를 식별하기 위한 강건하고 적절한 동물 모델을 확립하는 것이 필수적이다. 자성 비드를 사용하여 종양 조직으로부터 종양 내피 세포를 단리하는 것은 종양 내피 마커를 발견해내기 위한 강력한 접근법이지만, 이러한 접근법의 비용과 낮은 수율 때문에 종양 내피의 통상적 연구가 불가능하다. 또 다른 문제는 종양 내피 표현형은 종양 미세환경으로부터 단리된 직후 소실된다는 것이다. 종양과 세포 사이의 이러한 중요한 누화(crosstalk)를 유지시키기 위해, 폐 또는 췌장 암 세포를 HUVEC와 공동-배양함으로써 시험관내 종양 혈관신생 모델을 창출하였다. 본 모델 시스템은 VEGF-A 차단제와 같은 신규한 항-혈관신생 화합물을 발견하기 위한 강건한 플랫폼을 제공한다. 상기 모델은 또한 VEGF-A 회수 및 혈관 정상화의 연구를 가능하게 하는데, 그 이유는 암 세포로부터의 자극이 상기 시스템으로부터 편리하게 제거될 수 있기 때문이다. 요약하면, 이 모델은 종양과 내피 세포 사이에 동적 소통(dynamic communication)을 도입하기 위한 간단하고 실현가능한 방법을 제공한다. 이 모델이 수개의 종양 내피-표적화 리간드를 성공적으로 식별하는데 사용되었다는 것이 이러한 개념을 추가로 뒷받침한다.
본 발명은, 종양 내피로의 전달을 표적화하는 소형 리간드를 도입하고, 비-특이적 기관 및 조직의 우회를 제공하는 가역적 마스킹을 사용함으로써 BIV 리포솜의 크게 개선된 특이적 전달을 포함한다. 리포솜의 표면 상에 다중화된 소형 펩티드를 사용함으로써 표적화된 전달이 가능할 수도 있지만, 이들은 반복적 주사, 특히 전신적인 반복적 주사 후에 면역 반응을 일으킬 수 있으며, 펩티드는 종양의 간질 압력 구배를 통한 투과 및 전달을 불가능하게 할 수 있다. 항체, 항체 단편, 단백질, 부분 단백질 등을 포함하는 더 큰 기타의 리간드는 리포솜 표면 상의 표적화된 전달을 위한 소형 펩티드를 사용하는 것보다 훨씬 더 다루기 힘들다. 본 발명자들의 최적화된 표적화 전달은 마우스 이종이식 모델에서의 암 성장 예방에 매우 효율적이었고, 본 발명자들의 표적화 리간드가 소분자라는 사실 때문에, 면역 반응을 일으킴 없이 무기한으로 반복적 주입이 가능하다. 추가로, 리간드(<500 Da) 및 가역적 마스킹제를 포함하는 본 발명자들의 전달 시스템은 비-면역원성이고 비-독성이며 임상 용도에 대해 안전하다. 더우기, 2주 1회 또는 주 1회의 본 발명자들의 IV 투여는 편리하며 의학적 실행에 널리 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명자들의 가역적으로 마스킹된 표적화 전달 시스템은 효과적인 항-혈관신생적 암 치료법에 대한 커다란 잠재력을 갖는다.
사람 종양 이종이식 마우스 모델에서 암 치료를 위해 TSP1 유전자를 전달하는데에 또한 리포솜을 사용한 기타 그룹들로부터의 데이터와 비교하였다[33, 41]. 여기서 제시된 결과는 본 발명이 전적으로 사람 종양 내피에서의 높은 수준의 특이적 전달 및 유전자 발현에 기인하는 현저한 암 성장 억제를 제공한다는 것을 증명하였다. 기타 그룹들은 또한, p53 및 TSP-1 유전자 치료의 병용이 암 성장을 상승적으로 억제한다는 것을 나타냈다[33, 41]. 병용 요법이 또한 본 발명과 함께 사용될 수 있다. 양이온성 중합체(Superfect) 및 항-혈관신생적 암 치료를 위한 생물학적으로 약독화된 수개의 바이러스 벡터를 포함하는 비-바이러스성, 바이러스성 및 세균성 벡터도 사용되고 있다[32, 40-42]. 이들은 모두 국소 또는 전신 주사를 통한 현저한 암 성장 지연을 나타냈지만, 이들의 효능 데이터는 본원에서 증명된 만큼 확고하지 않았다(도 27). 육안으로 볼 수 있는 몇몇 타입의 일차 암, 예를 들면, 피부암, 유방암에서는 치료제를 종양에 직접 주사할 수 있다. 그러나, 이러한 접근법은 제한적이며, 흉내, 복강내 및 기타 암, 뿐만 아니라 암 전이에는 유용하지 않다. IV 투여가 이들 암의 치료에 가장 효과적인 전달 경로이다. 특히 전신 투여의 경우에는 바이러스성 벡터에 대한 안전성도 관심사이다. 약독화된 바이러스는 비-병원성이지만, 여전히 면역원성이며, 반복적 주사에는 적합하지 않다. 췌장암 치료에서 항혈관신생적 유전자 치료제의 재조합 아데노-관련 바이러스(rAAV)-매개된 전달이 장(Zhang)에 의해 보고되었다. 그러나, rAAV-매개된 이식유전자가 근육내 또는 문맥내 전달 후 순환계에서 최대 발현 수준에 도달하는데에는 4주가 소요되었으며, 상기 치료는 종양이 확립되기 4주 전에 개시되었다[32]. 치료학적 정상 상태에 도달하기까지의 연장된 지연은 이의 의학적 적용에 제약을 부여할 것이다. 반면, 본 발명의 BIV 리포솜 전달 시스템을 사용하는 유전자 발현은 전신 투여 후 24시간 이내에 최대이며[48] 암 성장에 대해 더 빠른 작용을 제공한다. 리 등(Lee et al .)은 TSP1 유전자를 발현하는 살모넬라(Salmonella)를 사용한 흑색종 종양 성장의 현저한 억제를 증명하였다. 그럼에도, 정상 조직(예: 간 및 비장)으로의 상기 벡터의 뚜렷한 전달이 존재하여, 더욱 특이적인 표적화를 위해 벡터를 개선시킬 필요가 있음이 강조되었다[40]. 반면, 본 발명자들의 가역적으로 마스킹된 표적화 BIV 전달 시스템의 경우, 생체내 CAT 분석 데이터는 간을 포함하는 비-표적 조직의 형질전환이 무시할 정도라는 것을 나타났다.
여러 연구들은 특정 타입의 종양에서 독특하게 발현되는 종양 내피 마커(TEM) 및 수개의 pan-TEM을 발견하였다[23, 37, 49]. 둘째로, 상기 잠재적 수용체는, 정상 내피 세포에서는 비교적 낮은 수준으로 발현되고 몇몇 췌장 종양 내피 세포에서 상향조절되는 분자일 것이다. 표적화된 전달에 사용하기 위한 더 양호한 세포 표면 수용체를 찾는 것은 중요하며, 본원에 보고된 본 발명자들의 접근법을 사용하여 달성할 수 있다. 유의하게, 이 표적화 전략을 위해서는 최상의 수용체의 기능과 정체성을 알 필요가 없다. 버지스 실험실에서 개발된 방법은 단백질을 선택적으로 결합시키도록 고안된 소분자의 생성을 가능하게 한다. 중요하게, 상기 2가 소분자는 둘 다 세포 표면 수용체에 대한 결합 선택성을 가지며, 단백질-리간드 상호작용의 핫스팟에서 발견되는 2차 구조 모티프와 유사할 것이다. 세포 표면 수용체에 대한 친화성을 갖는 2가 베타-턴 모사체가 고안되었다. 본 발명자들은 최근까지 리간드의 수용체를 식별하지 않았지만, 본 발명자들은 항-혈관신생적 암 치료를 위한 임상에서 본 발명자들의 표적화된 전달 시스템을 여전히 사용할 수 있다. 실제로, 다수의 약물들이 이들의 메커니즘이 숙지되기 전에 FDA에 의해 승인되어 왔다. 본 발명자들은 매우 효과적인 항-혈관신생 치료학적 접근법을 보고하였다. 뿐만 아니라, 기타 병든 표적 세포에 표적 전달하는 소분자를 사용하는 본 발명자들의 가역적으로 마스킹된 표적화 BIV 전달 시스템은 또한 암 및 전이 이외의 질환 및 장애를 치료하는데 적용될 수 있다.
세포 배양. PANC1, miaPaCa2 및 H1299 세포주는 미국 미생물 보존 센터(ATCC, Berthesda, MD)로부터 구입하였다. AsPC-1 및 BxPC-3은 조니 (창이) 첸(Johnny (Changyi) Chen) 박사로부터의 관대한 기증물이었다(Baylor College of Medicine, Houston, TX). PANC1 및 miaPaCa2는 높은 글루코오스 DMEM에서 배양하였다. AsPC-1, BxPC-3 및 H1299는 RPMI-1640 배지에서 배양하였다. 상기 배지는 모두 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보강되어 있으며, miaPaCa2 세포 성장에 대해서는 상기 배지에 2.5% 말 혈청이 첨가되었다. HUVEC는 론자(Lonza)(Clonetics, Walkersville, MD)로부터 구입하였으며, 싱글쿼츠(SingleQuots)(Clonetics)로 보강된 내피 기본 배지(Clonetics)에서 성장하였다. HUVEC는 3번째 내지 6번째 통과로 경작되었다. 세포 계수 후 HUVEC 및 암 세포의 공동-배양물을 확립하고, 이를 약 10 내지 30:1의 HUVEC:암 세포 비에서 5,000 HUVEC/㎠의 접종 밀도로 평판배양하였다. 몇몇 실험에서는, 0.4㎛ 크기의 미세기공 막(Corning)을 통해 두 세포 군집 사이에서의 자유 확산을 허용하면서 암 세포를 EC로부터 물리적으로 분리시키는 이중 챔버 트랜스웰(Transwell) 시스템에서 공동-배양물을 유지시켰다.
유동 세포 분석법. 세포를 수확하고 1×PBS에 10×106/㎖로 재현탁시켰다. 상기 세포 현탁액을 제조업자의 지시에 따라 항-CD31:RPE(GeneTex, Irvine, CA)와 함께 배양하였다. 세척 후, 상기 세포 현탁액에 요오드화프로피디움을 첨가하여 죽은 세포를 분석에서 배제시켰다. BD LSRII(BD Biosciences, San Jose, CA) 상에서 유동 세포 분석법을 수행하고, 전방 산란 대 측방 산란에서 설정된 게이트를 갖는 셀퀘스트(CellQuest) 프로그램에 의해 분석하였다.
실시간 정량적 RT-PCR. 다음과 같은 서열을 함유하는 사람 VEGF-A 프라이머를 합성하였다: 정방향 5'-TGGAATTGGATTCGCCATTT-3'(SEQ ID NO. 1) 및 역방향 5'-TGGGTGGGTGTGTCTACAGGA-3'(SEQ ID NO. 2). β-액틴 프라이머 서열은: 정방향 5'-CTGGAACGGTGAAGGTGACA-3'(SEQ ID NO. 3) 및 역방향 5'-AAGGGACTTCCTGTAACAATGCA-3'(SEQ ID NO. 4)였다. 공동-배양된 세포를 트랜스웰 플레이트에서 성장시켰다. 트리졸(Trizol)(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 제조업자의 프로토콜에 따라 상기 세포로부터 총 RNA를 추출하고, DNase I(Invitrogen)로 처리하였다. 올리고(dT)와 랜덤 프라이머의 혼합물을 함유하는 iScript cDNA 합성 키트(Bio-Rad, Hercules, CA)에 의해 총 RNA 1㎍을 cDNA로 역전사시켰다. DyNAmo HS SYBR Green qPCR 키트(New England BioLabs, Finnzymes, Finland)를 사용하여 ABI PRISM 7900HT 서열 검출 시스템(Applied Biosystems, Foster City, CA) 상에서 실시간 PCR을 수행하였다. 사이클링 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 10분간 초기 변성, 이후 95℃에서 15초간 및 60℃에서 1분간 40 사이클.
웨스턴 블롯. 트랜스웰 접시에서 공동-배양한 후 8일 후, EC 용해물로부터의 단백질 50㎎을 9% SDS-PAGE 겔 상에 로딩시킨 후, 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond ECL; Amersham Pharmacia Biotech)으로 웨스턴 트랜스퍼(Western transfer)시켰다. 상기 멤브레인을 TBS(20mM Tris-HCl, 150mM NaCl[pH 7.4] 및 0.05% Tween 20) 중의 5% 무지방유로 블로킹시켰다. 일차 사람 항-VEGF 항체(R&D Systems, Minneapolis, MN)와 함께 1㎍/㎖로 실온(RT)에서 2시간 동안 배양한 후, 상기 멤브레인을 TBS/0.05% Tween 20으로 5분 간격으로 6회 세척하고, 2차 항-염소 호스래디쉬 퍼옥시다제-접합된 항체(Transduction Laboratories, Lexington, KY)와 함께 배양하였다[50].
관(tube) 형성 분석. 트랜스웰 접시에서 공동-배양한 후 8일 후, 4℃에서 비어있는 6-웰 트랜스웰 플레이트의 수용 챔버에 매트리겔(BD Biosciences, San Jose, CA)을 첨가하고, 37℃에서 2시간 동안 배양하였다. 매트리겔이 고형화된 후, 내피 세포를 트립신화하고, 계수하고, 5×105 세포/웰로 상단부에 접종하였다. 세포를 16시간 동안 배양하여 모세혈관-유사 구조물이 형성되도록 하였다. 상기 공동-배양 조건을 유지시키기 위해, 상기 트랜스웰 플레이트의 상부 챔버에서 암 세포를 경작하였다. 관상 구조물을 매일 관찰하여 모폴로지(morphology), 통합성 및 생존을 모니터링하였다.
BIV DNA:리포솜 복합체의 제조. 플라스미드 p4241 및 p4119는 로버트 뎁스(Robert Debs)로부터의 관대한 기증물이었다(California Pacific Medical Center Research Institute, San Francisco, CA). 이들은 각각 루시퍼라제와 CAT 유전자를 암호화한다. pCMV-THBS-1은 데이비드 로버츠(David Roberts)로부터의 유익한 기증물이었으며(National Institutes of Health, Bethesda, MD), 이는 TSP1 유전자를 암호화한다. 모든 플라스미드는 DH5α 에쉐리히아 콜라이(Escherichia coli) 중에서 선택가능한 암피실린 하에 성장되었다. Qiagen Endo-Free Plasmid Giga Kit(Qiagen, Hilden Germany)를 사용하여 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 플라스미드 DNA를 정제하였다. 합성 콜레스테롤(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)을 DOTAP:콜레스테롤 50:45의 비로 사용한 것을 제외하고는 이전에 기술된 바와 같이 하여 DOTAP 및 DOTAP:Chol BIV 리포솜, BIV DNA:리포솜 복합체(BIV 복합체)을 제조하였다[15].
2가 소분자 생성. 간략하게, 선택적 커플링을 통해 β-턴 1가 소분자들을 용액 중에서 혼합하여 2가 소분자인 동종이량체 KB991 내지 KB1005 및 이종이량체 KB1006 내지 KB1140을 제조하였다. 상기 과정에서, 커플링을 수행하는데에는 탄산칼슘만이 요구되었다. Boc-보호된 단량체성 화합물을 25℃에서 4시간 동안 CH2Cl2 중의 30% TFA로 처리하였다. 용매를 제거하고, 잔류물을 DMSO에 다시 용해시켜 0.03M 용액을 제조하였다. 디클로로트리아진 링커 스캐폴드 및 K2CO3을 순차적으로 첨가하였다. 수득된 현탁액을 15분간 초음파 처리하고, 7일간 진탕시켰다. DMSO를 동결건조시키고, 상기 고체 잔류물에 HCl 수용액(5%, 약 0.5㎖)을 첨가하고 3분간 초음파 처리하였다. 대부분의 화합물들이 산성 용액 중에 침전되었다. 원심분리한 후, 펠릿을 건조시키고 저장하였다. BIV 복합체의 표면 상에 1가 또는 2가 소분자를 피복시키기 위해, 표면 지질 이중층으로의 삽입을 위해 상기 분자 내에 탄화수소 꼬리를 포함시켰다. 화합물(약 10.0㎎)을 먼저 THF/H2O(v:v = 1:1) 1.0㎖에 용해시켰다. CuSO4 용액(1.0M, 10㎕)을 첨가한 후, Cu 분말(1.0㎎)을 첨가하였다. 상기 공정 후에, THF 중의 아지도옥타데칸 용액(0.1mmol, 0.2㎖)을 첨가하고, 수득된 현탁액을 25℃에서 24시간 동안 교반하였다. 실리카 겔로 충전된 유리 피펫을 통해 CH2Cl2 중의 30% 메탄올을 용리액으로서 사용하여 상기 현탁액을 여과하였다. 상기 용액을 건조 및 농축시켜 최종 생성물을 수득하였다. 합성 후, 고체 화합물을 유리 시험관 내에서 클로로포름:메탄올(1:1)에 용해시켰다. 조직 배양 후드 아래의 아르곤 기체 정상 스트림하에 상기 관의 바닥에서 박막이 생성되었다. 상기 막을 무균수에 용해시켜 5㎎/㎖ 저장용액을 생성하고, 50℃에서 초음파 처리하였다(Lab-Line Trans-sonic 820/H). 상기 재구성된 화합물의 분취량을 -80℃에서 저장하였다.
시험관내 전달 및 고속 대량 루시퍼라제 분석. 표적화되지 않은 BIV 복합체보다 더 효율적으로 종양 혈관 내피 세포에 내재화되는 BIV 복합체의 표면에 부착된 1가 또는 2가 화합물들을 식별하기 위해 본 발명의 고속 대량 분석을 사용하였다. 상기 분석은 루시퍼라제 리포터 유전자, 및 루시퍼라제 발현의 초고감도 검출에 대해 인증된 정교한 플레이트 판독기 광도계인, 3개의 주입기/로봇식 분산기를 갖는 루미노스캔 어센트(Luminoskan Ascent)(Thermo Electron Corp., Waltham, MA)를 특징으로 한다. 루미노스캔은 단일 10㎝ 조직 배양 접시로부터 384-웰 플레이트까지 매우 다양한 시료 포맷을 허용하며, 이들 모두가 시료의 상부 또는 저부 중 어느 하나로부터 분석될 수 있기 때문에 다용도로 이용될 수 있다. 이는 작은 차이를 관찰하기 위해 매우 높은 감도(<1 fmol ATP/웰)를 제공하며, 또한 시료에 대해 높은 동적 범위를 제공한다[전체 게인 세팅 에리어(gain setting area)에 걸쳐 >9 디케이드(decade)]. 루미노스캔은 온도(발광량은 작은 변화에 매우 민감하다), 시약들의 적절한 혼합[오비탈 쉐이킹 피쳐(orbital shaking feature)], 각각의 측정 사이의 일정한 지연 및 기타 특징들, 예를 들면, 시료 1개당 다수 복제의 허용(30/웰 및 3500/배양 접시 이하)을 포함하는 분석 조건들의 최적의 제어를 허용함으로써 정확한 데이터를 제공한다. 마지막으로, 루미노스캔 어센트 소프트웨어는 데이터 보존을 위해 잘 고안되어 있다. 루시퍼라제를 암호화하는 플라스미드 DNA가 내재화되어 핵에 효율적으로 수송된 경우에는, 플레이트의 웰에서 성장한 세포에서 생물발광이 검출된다. 판독이 빨라서 웰 1개당 하나의 2가 화합물 포맷에서의 작용성 BIV 복합체의 신속한 시험이 가능하다. 대조를 위해 정상적 HUVEC를 사용하였고, 종양 세포 단독에 대한 또는 공동-배양물에 대한 전달을 비교하였다. 사람 종양 세포와 공동-배양된 HUVEC에서 가장 높은 수준의 루시퍼라제 유전자 발현을 생성하고 정상 HUVEC 세포 또는 종양 세포에서는 그렇지 않은 2가 화합물들을 식별하기 위해 루미노스캔 데이터가 사용되었다. 상기 소분자 라이브러리 중 대략 150개의 구성원이 BIV-루시퍼라제 복합체의 표면 상에서 다양한 농도로 시험되었다. 최적의 형질전환 시간, 형질전환에 사용된 복합체의 양, 최적의 통합 시간 및 지체 시간(lag time)을 또한 측정하였다. 간략하게, 공동-배양 후 7일 후에, 세포를 수확하고, 세포 현탁액 50㎕를 96-웰 접시에 2×104 세포/웰로 접종하였다. 앞서 기술된 바와 같이 복합체를 제조하였다[15]. 복합체에 캡슐화된 DNA 1㎍당 화합물 0.5, 10, 200 및 500pg을 포함하는 농도로 화합물을 희석시켰다. 96-웰 플레이트에 프리-로딩(pre-loaded)된 BIV-루시퍼라제 DNA 복합체 10㎕의 중앙에 화합물 1㎕를 서서히 피페팅한 후, 최대 피복을 위해 실온에서 밤새 배양하였다. 다음 날, 5㎕로 희석된 화합물-피복 BIV 복합체 0.52㎕로 세포를 형질전환시키고, 상기 세포를 무혈청 배지 45㎕에 넣었다. 형질전환 후 세포 배양 배지에서 세포를 성장시켰다. HUVEC 세포와 H1299 세포의 공동-배양물에 대해서는, DOTAP BIV 리포솜을 사용하고, 세포를 4시간 동안 형질전환시켰다. HUVEC 세포와 PANC1 세포의 공동-배양물에 대해서는, DOTAP:Chol BIV 리포솜을 사용하고, 세포를 2시간 동안 형질전환시켰다. 형질전환 후 24시간 후에, 1% Triton X-100(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO)를 사용하여 세포를 용해시킨 다음, 유전자 발현을 검출하기 위해 루미노스캔 어센트(Luminoskan Ascent)를 사용하여 고속 대량 루시퍼라제 분석을 수행하였다. 상기 분석 과정에서는 1초의 통합 시간 및 14초의 지체 시간이 적용되었다. 화합물 피복된 BIV 리포솜 복합체의 형질전환 효율을 피복되지 않은 복합체의 효율과 비교하였다. 각각의 조건에 대해 3회씩 측정하였다. 모든 희석물은 물 중의 5% 덱스트로오스(D5W) 중에서 제조되었다.
사람 종양 내피-췌장암 마우스 모델. HUVEC 및 PANC1 공동-배양 세포를 수확하고 공동 배양물 중에서 8일 후 1×PBS에 재현탁시켰다. 2×106 공동-배양 세포(약 1×106 PANC1 세포)를 함유하는 세포 현탁액 500㎕를 각각 8 내지 10주령의 중증 복합성 면역결핍(SCID: severe combined immunodeficient) 마우스에 IP 주사하였다. 모든 동물 처리 과정은 승인된 동물 프로토콜을 사용하여 베일러 의대(Baylor College of Medicine)(Houston, TX) 기관 지침에 따라 수행되었다.
생체내 표적화 전달 및 CAT 검정. 상술된 공동-배양물을 IP 주사한 후 8주 후에, BIV-CAT DNA 복합체를 제조하고, 상기 논의된 바와 같이 소분자 KB1023으로 500pg 화합물/㎍ DNA로 피복하였다. 상기 복합체를 다양한 농도의 가역적 마스킹제 n-도데실-β-D-말토피라노시드(Anatrace, Maumee, OH)와 혼합한 직후, 마우스에 정맥내(IV) 주사하였다. 각각의 마우스는 p4119 CAT DNA 50㎍을 함유하는 복합체로 총 용적 110㎕로 주사되었으며, 마우스를 희생시키고, 조직을 수확하고, 앞서 설명된 바와 같이 총 단백질을 추출하였다[15]. CAT ELISA 키트(Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 CAT 단백질 생성을 측정하였다. Micro BCA 키트(Pierce)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 단백질 농도를 측정하였다.
항-혈관신생적 암 치료법. 상술된 공동-배양물을 IP 주사한 후 2주 후에, TSP1 플라스미드 DNA 35㎍을 BIV-KB1023 피복된 복합체 내에 캡슐화하고 IV 주사 전에 11mM 가역적 마스킹제를 사용한 것을 제외하고는 상술된 바와 같은 프로토콜을 사용하여 생체내 전달을 수행하였다. 총 3회의 주사를 위해 2주 마다 한 번씩 주사를 수행하였다. 상이한 실험 그룹에서는, 총 5회의 주사를 위해 매주 주사를 수행하였다. 최종 주사 후 2주 후에(종양 모델을 확립하기 위해 공동-배양물을 IP 주사한 후 8주 후), 마우스를 희생시키고, 종양 크기를 측정하였다. 복강내 종양 및 기타 기관(간, 폐, 비장, 췌장 및 결장)을 해부한 후 10% 중성 완충 포르말린에 고정시켰다.
통계학적 분석. 데이터는 평균±SEM으로 표시하였다. 실험 그룹과 대조 그룹을 독립 표본 스튜던트 t 검정을 사용하여 비교하였다. P<0.05가 유의한 것으로 간주되었다.
SK-MEL-28 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 수득된 흑색종 세포주이다. 복부 벽 흑색종 종양 세포 및 좌측 둔근 흑색종 종양 세포는 메디컬 시티(Medical City)(Dallas, TX)의 외과의에 의해 제공되었으며, 이의 시료들은 그라달리스, 인크.(Gradalis, Inc.)(Dallas, Texas)에 있다. 먼저 표준 공정을 사용하는 조직 해리기(Miltenyl Biotec, Bergisch Gladbach, Germany)를 사용하여 제조업자의 지시에 따라 환자 조직을 콜라게나제 및 풀모자임(pulmozyme)에 의해 먼저 해리시켰다. SK-MEL-28 세포를 ATCC의 특정 조건에 따라 성장시켰다. 환자 세포를 주 1회 통과시키고, 9번째 통과 후 분석하였다. 모든 세포는 10% 소 태아 혈청으로 보강된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 중에서 성장시켰다. 기타 모든 조건들은 본원에서 상기 발견되는 바와 같다.
도 28은 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 SK-MEL-28 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 도시한 것이다. 도 29는 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 복부 벽 흑색종 종양 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 도시한 것이다. 도 30은 KB1037, KB1109 및 KB1123을 사용한 좌측 둔근 흑색종 종양 세포의 형질전환 후의 증가된 발현을 도시한 것이다. KB1109는 모든 공급원으로부터의 흑색종 세포 상에서 발현을 현저하게 증가시킨 것으로 밝혀졌다. KB1037 및 KB1123은 SK-MEL-28 및 환자 GB0270의 복부 벽으로부터의 흑색종에서 발현을 증가시켰다.
본 명세서에서 논의된 어떠한 양태도 본 발명의 임의의 방법, 키트, 시약 또는 조성물에 관하여 실행될 수 있으며 그 역도 성립하는 것으로 사료된다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 본 발명의 방법을 달성하는데 사용될 수 있다.
본원에 기술된 특정 양태들은 예시를 위해 기재된 것이며 본 발명을 제한하지 않는다는 것을 이해할 것이다. 본 발명의 주요 특징들은 본 발명의 범위를 벗어남 없이 다양한 양태들에서 사용될 수 있다. 당업자들은 통상의 실험을 행하지 않고서도 본원에 기술된 특정 공정들에 대한 다수의 등가 공정들을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이러한 등가 공정들은 본 발명의 범위에 속하는 것으로 간주되며 특허청구범위에 포함된다.
본 명세서에서 언급된 모든 문헌 및 특허 출원은 본 발명이 속한 기술 분야의 숙련자들의 기술 수준을 나타낸다. 모든 문헌 및 특허 출원은, 각각의 개별 문헌 또는 특허 출원이 참조로 인용되도록 특정하게 개별적으로 지시된 것과 동일한 정도로 본원에서 참조로 인용된다.
특허청구범위 및/또는 본 명세서에서 용어 "포함하는"과 함께 사용된 단수 형태의 용어는 "하나"를 의미할 수 있지만, "하나 이상", "적어도 하나" 및 "하나 또는 하나 이상"의 의미와도 부합된다. 특허청구범위에서 용어 "또는"은, 명백하게 해당 선택대상만을 나타내도록 지시되거나 상기 선택대상들이 서로 배타적이지 않는 한, "및/또는"을 의미하는데 사용되며, 본 기재 내용은 해당 선택대상만을 의미하기도 하고 "및/또는"을 의미하기도 하는 정의를 지지한다. 본 출원 전체에 걸쳐, 용어 "약"은 해당 값을 측정하는데 사용되는 장치 및 방법 또는 연구 대상자들 사이에 존재하는 변동성에 대한 오차의 고유 변동성을 포함하는 값을 나타내는데 사용된다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용되는 용어 "포함하는"(및 "포함한다"와 같은 임의의 기타 형태), "갖는"(및 "갖는다"와 같은 임의의 기타 형태), "포괄하는"(및 "포괄한다"와 같은 임의의 기타 형태) 또는 "함유하는"(및 "함유한다"와 같은 임의의 기타 형태)은 포괄적 또는 비제한적이며, 언급되지 않은 추가의 요소들 또는 방법 단계들을 배제시키지 않는다.
본원에서 사용된 용어 "또는 이들의 조합"은 상기 용어 앞에 열거된 항목들의 모든 순열 및 조합을 나타낸다. 예를 들어, "A, B, C, 또는 이들의 조합"은 A, B, C, AB, AC, BC, 또는 ABC 중의 적어도 하나를 포함하는 것으로 의도되며, 특정 맥락에서 순서가 중요하다면, BA, CA, CB, CBA, BCA, ACB, BAC, 또는 CAB도 포함되는 것으로 의도된다. 상기 예에 이어서, BB, AAA, MB, BBC, AAABCCCC, CBBAAA, CABABB 등과 같이 하나 이상의 항목 또는 용어의 반복을 함유하는 조합이 명확하게 포함된다. 당업자는, 해당 맥락으로부터 달리 분명하지 않다면, 통상적으로 항목 또는 용어의 수에 대해서는 제한이 없다는 것을 이해할 것이다.
본원에서 사용된 근사치의 용어들, 예를 들면, 비제한적으로, "약", "실질적인" 또는 "실질적으로"와 같은 용어들은, 이와 같이 변형되었을 때, 반드시 절대적이거나 완전한 것으로 이해되는 것은 아니지만 당업자들에게는 현재의 상태를 지정하는 근거에 충분히 가깝다고 간주될 때의 상태를 나타낸다. 당해 기술 사항이 변화할 수 있는 정도는 얼마나 큰 변화가 도입될 수 있는지에 좌우될 것이며, 당업자는 변형된 특징이 변형되지 않은 특징의 필수 특성 및 능력을 여전히 갖고 있음을 계속 인식해야 한다. 일반적으로, 앞서 논의된 주제이지만, 본원에서 "약"과 같은 근사치의 용어에 의해 변형되는 수치는 언급된 값으로부터 적어도 ±1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 10, 12 또는 15% 변화될 수 있다.
본원에 기재되고 특허청구된 모든 조성물 및/또는 방법은 본 기재 내용에 비추어 부적절한 실험없이 제조 및 실행될 수 있다. 본 발명의 조성물 및 방법을 바람직한 양태들에 의해 설명하였지만, 본 발명의 개념, 취지 및 범위로부터 벗어남 없이, 본원에 기술된 조성물 및/또는 방법 및 상기 방법의 단계들에 또는 단계들의 순서에 변형이 적용될 수 있다는 것이 당업자에게 자명할 것이다. 당업자들에게 자명한 이러한 모든 유사한 대체 및 변형은 첨부된 특허청구범위에 의해 정의되는 바와 같은 본 발명의 취지, 범위 및 개념에 포함되는 것으로 사료된다.
참조 문헌
상세한 설명 전체에 걸쳐 굵은 글자의 참조 번호들은 각각 승인서 및 논문에서의 고유 번호에 해당한다. 이탤릭체 번호는 특허 출원에서 사용된 번호이다. 다음의 번호는 정정된 번호이다.
1. Improved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression, N. S. Templeton, D. D. Lasic, P. M. Frederik, H. H. Strey, D. D. Roberts, and G. N. Pavlakis, Nature Biotechnology, 1997, 15, 647-652.
2. Liposomal delivery of nucleic acids in vivo, N. S. Templeton, DNA and Cell Biology, 2002, 21, 857-867.
3. Successful treatment of primary and disseminated human lung cancers by systemic delivery of tumor suppressor genes using an improved liposome vector, R. Ramesh, T. Saeki, N. S. Templeton, L. Ji, L. C. Stephens, I. Ito, D. R. Wilson, Z. Wu, C. D. Branch, J. D. Minna, and J. A. Roth, Molecular Therapy, 2001, 3, 337-350.
4. Openings between defective endothelial cells explain tumor vessel leakiness, H. Hashizume, P. Baluk, S. Morikawa, J. W. McLean, G. Thurston, S. Roberge, R. K. Jain, and D. M. McDonald, Am J Pathol, 2000, 156, 1363-1380.
5. Effect of transvascular fluid exchange on pressure-flow relationship in tumors: a proposed mechanism for tumor blood flow heterogeneity, P. A. Netti, S. Roberge, Y. Boucher, L. T. Baxter, and R. K. Jain, Microvasc Res, 1996, 52, 27-46.
6. Vascular permeability and microencapsulation of gliomas and mammary carcinomas transplanted in rat and mouse cranial windows, F. Yuan, H. A. Salehi, Y. Boucher, U. S. Vasthare, R. F. Tuma, and R. K. Jain, Cancer Res, 1994, 54, 4564-4568.
7. Vasculogenic mimicry, R. Folberg, and A. J. Maniotis, APMIS, 2004, 112, 508-525.
8. Remodeling of the microenvironment by I melanoma tumor cells, M. J. Hendrix, E. A. Seftor, D. A. Kirschmann, V. Quaranta, and R. E. Seftor, Ann N Y Acad Sci, 2003, 995, 151-161.
9. Discovering High-Affinity Ligands for proteins: SAR by NMR, S. B. Shuker, P. J. Hajduk, R. P. Meadows, and S. W. Fesik, Science, 1996, 274, 1531-1534.
10. Discovery of Potent Nonpeptide Inhibitors of Stromelysin Using SAR by NMR, P. J. Hajduk, G. Sheppard, D. G. Nettesheim, E. T. Olejniczak, S. B. Shuker, R. P. Meadows, D. H. Steinman, G. M. Carrera, P. A. Marcotte, J. Severin, K. Walter, H. Smith, E. Gubbins, R. Simmer, T. F. Holzman, D. W. Morgan, S. K. Davidsen, J. B. Summers, and S. W. Fesik, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 5818-5827.
11. One-Dimensional Relaxation- and Diffusion-Edited NMR Methods for Screening Compounds That Bind to Macromolecules, P. J. Hajduk, E. T. Olejniczack, and S. W. Fesik, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 12257-12261.
12. NMR-Based Discovery of Lead Inhibitors That Block DNA Binding of the Human Papillomavirus E2 Protein, P. J. Hajduk, J. Dinges, G. F. Miknis, M. Merlock, T. Middleton, D. J. Kempf, D. A. Egan, K. A. Walter, T. S. Robins, S. B. Shuker, T. F. Holzman, and S. W. Fesik, J. Med. Chem, 1997, 40, 3144-3150.
13. Structure-Activity Relationships by NMR: A New Procedure for Drug Discovery by a Combinatorial-Rational Approach, H. Kessler, Angew. Chem. Int. Ed., 1997, 36, 829-831.
14. Stromelysin Inhibitors Designed from Weakly Bound Fragments: Effects of Linking and Cooperativity, E. T. Olejniczak, P. J. Jahduk, P. A. Marcotte, D. G. Nettesheim, R. P. Meadows, R. Edalji, T. F. Holzman, and S. W. Fesik, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 5828-5832.
15. Identification of a Small Molecule Inhibitor of the IL-2/IL-2Ra Receptor Interaction Which Binds to IL-2, J. W. Tilley, L. Chen, D. C. Fry, S. D. Emerson, G. D. Powers, D. Biondi, T. Varnell, R. Trilles, R. Guthrie, F. Mennona, G. Kaplan, R. A. LeMahieu, R. Palermo, and G. Ju, J. Am. Chem. Soc., 1997, 119, 7589-7590.
16. The SHAPES strategy: an NMR-based approach for lead generation in drug discovery, J. Fejzo, C. A. Lepre, J. W. Peng, G. W. Bemis, Ajay, M. A. Murcko, and J. M. Moore, Chem. Biol., 1999, 5, 755-769.
17. Privileged Molecules for Protein Binding Identified from NMR-Based Screening, P. J. Hajduk, M. Bures, J. Praestgaard, and S. W. Fesik, J. Med. Chem., 2000, 43, 3443-3447.
18. SNAr Cyclizations to Form Cyclic Peptidomimetics of b-Turns, Y. Feng, Z. Wang, S. Jin, and K. Burgess, J. Am. Chem. Soc., 1998, 120, 10768-10769.
19. Solid Phase SNAr Macrocyclizations to Give Turn-extended-turn Peptidomimetics, Y. Feng, and K. Burgess, Chem. Eur. J., 1999, 5, 3261-3272.
20. Conformations of Peptidomimetics Formed by SNAr Macrocyclizations: 13- to 16-Membered Ring Systems, Y. Feng, Z. Wang, S. Jin, and K. Burgess, Chem. Eur. J., 1999, 5, 3273-3278.
21. Stereochemical Implications of Diversity in b-Turn Peptidomimetic Libraries, Y. Feng, M. Pattarawarapan, Z. Wang, and K. Burgess, J. Org. Chem., 1999, 64, 9175-9177.
22. Facile Macrocyclizations to b-Turn Mimics with Diverse Structural, Physical, and Conformational Properties, C. Park, and K. Burgess, J. Comb. Chem., 2001, 3, 257-266.
23. A New Solid-Phase Linker for Suzuki Coupling with Concomitant Macrocyclization: Synthesis of b-Turn Mimics, W. Li, and K. Burgess, Tetrahedron Lett., 1999, 40, 6527-6530.
24. Preferred Secondary Structures as a Possible Driving Force for Macrocyclization, S. Reyes, M. Pattarawarapan, S. Roy, and K. Burgess, Tetrahedron, 2000, 56, 9809-9818.
25. Solid-Phase Syntheses of b-Turn Analogues To Mimic or Disrupt Protein-Protein Interactions, K. Burgess, Acc. Chem. Res., 2001, 34, 826-835.
25. Long-Lasting Rescue of Age-Associated Deficits in Cognition and the CNS Cholinergic Phenotype by a Partial Agonist Peptidomimetic Ligand of TrkA, M. A. Bruno, P. B. S. Clarke, A. Seltzer, R. Quirion, K. Burgess, A. C. Cuello, and H. U. Saragovi, J. Neuroscience, 2004, 24, 8009-8018.
26. Folkman, J, and Kalluri, R (2004). Cancer without disease. Nature 427: 787.
27. Tandle, A, Blazer, DG, 3rd, and Libutti, SK (2004). Antiangiogenic gene therapy of cancer: recent developments. J Transl Med 2: 22.
28. Ferrara, N, Hillan, KJ, Gerber, HP, and Novotny, W (2004). Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov 3: 391-400.
29. Faivre, S, Demetri, G, Sargent, W, and Raymond, E (2007). Molecular basis for sunitinib efficacy and future clinical development. Nat Rev Drug Discov 6: 734-745.
30. Templeton, NS (ed) (2008). Gene and Cell Therapy: Therapeutic Mechanisms and Strategies. CRC Press: Boca Raton, FL. 1101 p.
31. Ramesh, R, et al. (2001). Successful treatment of primary and disseminated human lung cancers by systemic delivery of tumor suppressor genes using an improved liposome vector. Mol Ther 3: 337-350.
32. Zhang, X, Xu, J, Lawler, J, Terwilliger, E, and Parangi, S (2007). Adeno-associated virus-mediated antiangiogenic gene therapy with thrombospondin-1 type 1 repeats and endostatin. Clin Cancer Res 13: 3968-3976.
33. Xu, M, Kumar, D, Stass, SA, and Mixson, AJ (1998). Gene therapy with p53 and a fragment of thrombospondin I inhibits human breast cancer in vivo. Mol Genet Metab 63: 103-109.
34. Liu, S, et al. (2008). PDX-1 acts as a potential molecular target for treatment of human pancreatic cancer. Pancreas 37: 210-220.
35. Park, C, and Burgess, K (2001). Facile macrocyclizations to beta-turn mimics with diverse structural, physical, and conformational properties. J Comb Chem 3: 257-266.
36. Reyes, S, Pattarawarapan, M, Roy, S, and Burgess, K (2000). Preferred secondary structures as a possible driving force for macrocyclization. Tetrahedron 56: 9809-9818.
37. Burgess, K (2001). Solid-phase syntheses of beta-turn analogues to mimic or disrupt protein-protein interactions. Acc Chem Res 34: 826-835.
38. Bruno, MA, et al. (2004). Long-lasting rescue of age-associated deficits in cognition and the CNS cholinergic phenotype by a partial agonist peptidomimetic ligand of TrkA. J Neurosci 24: 8009-8018.
39. Isenberg, JS, Martin-Manso, G, Maxhimer, JB, and Roberts, DD (2009). Regulation of nitric oxide signalling by thrombospondin 1: implications for anti-angiogenic therapies. Nat Rev Cancer 9: 182-194.
40. Lee, CH, Wu, CL, and Shiau, AL (2005). Systemic administration of attenuated Salmonella choleraesuis carrying thrombospondin-1 gene leads to tumor-specific transgene expression, delayed tumor growth and prolonged survival in the murine melanoma model. Cancer Gene Ther 12: 175-184.
41. Xu, M, Chen, QR, Kumar, D, Stass, SA, and Mixson, AJ (1998). In vivo gene therapy with a cationic polymer markedly enhances the antitumor activity of antiangiogenic genes. Mol Genet Metab 64: 193-197.
42. Liu, P, et al. (2003). Adenovirus-mediated gene therapy with an antiangiogenic fragment of thrombospondin-1 inhibits human leukemia xenograft growth in nude mice. Leuk Res 27: 701-708.
43. Templeton, NS, Lasic, DD, Frederik, PM, Strey, HH, Roberts, DD, and Pavlakis, GN (1997). Improved DNA: liposome complexes for increased systemic delivery and gene expression. Nat Biotechnol 15: 647-652.
44. Kerbel, RS (2008). Tumor angiogenesis. N Engl J Med 358: 2039-2049.
45. Angell, Y, Chen, D, Brahimi, F, Saragovi, HU, and Burgess, K (2008). A combinatorial method for solution-phase synthesis of labeled bivalent beta-turn mimics. J Am Chem Soc 130: 556-565.
46. Maliartchouk, S, et al. (2000). A designed peptidomimetic agonistic ligand of TrkA nerve growth factor receptors. Mol Pharmacol 57: 385-391.
47. Thurston, G, et al. (1998). Cationic liposomes target angiogenic endothelial cells in tumors and chronic inflammation in mice. J Clin Invest 101: 1401-1413.
48. Lu, H, Zhang, Y, Roberts, DD, Osborne, CK, and Templeton, NS (2002). Enhanced gene expression in breast cancer cells in vitro and tumors in vivo. Mol Ther 6: 783-792.
SEQUENCE LISTING
<110> GRADALIS, INC.
<120> TARGETED DELIVERY USING TISSUE-SPECIFIC PEPTIDOMIMETIC LIGANDS
<130> GRAD:2005
<150> 61/239,648
<151> 2009-09-03
<160> 4
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide.
<400> 1
tggaattgga ttcgccattt 20
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucloetide.
<400> 2
tgggtgggtg tgtctacagg a 21
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide.
<400> 3
ctggaacggt gaaggtgaca 20
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Synthetic oligonucleotide.
<400> 4
aagggacttc ctgtaacaat gca 23
Claims (49)
- 제1항에 있어서, A와 A'이 동일한, 표적화 리간드.
- 제1항에 있어서, 상기 스캐폴드가 반응성 디클로로트리아진 그룹을 포함하는, 표적화 리간드.
- 제1항에 있어서, 상기 소수성 앵커들 중의 하나 이상이 탄화수소 잔기를 포함하는, 표적화 리간드.
- 제4항에 있어서, 상기 소수성 잔기들 중의 하나 이상이 옥타데실 그룹을 포함하는, 표적화 리간드.
- 제1항에 있어서, 상기 스캐폴드와 상기 소수성 앵커들 사이에 기능적으로 개재된 하나 이상의 링커(linker)를 추가로 포함하는, 표적화 리간드.
- 제6항에 있어서, 상기 링커들 중의 하나 이상이 특이적으로 개열될 수 있는, 표적화 리간드.
- 제1항에 있어서, 상기 조직이 췌장암, 유방암, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 췌장암 혈관 내피 또는 NSCLC 암 혈관 내피로부터 선택되는 암성 세포, 조직 또는 내피인, 표적화 리간드.
- 치료제의 표적화 전달을 위한 소분자 복합체(small molecular complex)를 합성하는 방법으로서, 상기 방법이 보호되지 않은 하기 화학식 A와 A'의 1가의 펩티도미메틱 화합물 2개 이상을 스캐폴드에 공유적으로 커플링시키는 단계; 및
상기 스캐폴드에 하나 이상의 소수성 앵커를 공유적으로 커플링시키는 단계를 포함하는, 치료제의 표적화된 전달을 위한 소분자 복합체를 합성하는 방법.
[상기 화학식에서,
상기 스캐폴드는 화학식이
a) 또는
b) 이며,
상기 점선은 A 및 A'에 대한 결합 지점을 나타내고,
A 및 A'는 1가의 펩티도미메틱 화합물이며, 여기서 상기 1가의 펩티도미메틱 화합물 각각은 모르폴리노이다]. - 제9항에 있어서, 상기 선택된 1가 펩티도미메틱 화합물들이 동일한, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 스캐폴드가 반응성 디클로로트리아진 그룹을 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 소수성 앵커들 중의 하나 이상이 탄화수소 잔기를 포함하는, 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 소수성 잔기들 중의 하나 이상이 옥타데실 그룹을 포함하는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 스캐폴드와 상기 소수성 앵커들 사이에 하나 이상의 링커를 기능적으로 개재시키는 추가의 단계를 포함하는, 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 링커들 중의 하나 이상이 특이적으로 개열될 수 있는, 방법.
- 제9항에 있어서, 상기 조직이 췌장암, 유방암, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 췌장암 혈관 내피 또는 NSCLC 암 혈관 내피로부터 선택되는 암성 세포, 조직 또는 내피인, 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 치료제 담체가 리포솜인, 리간드-작용성 전달 시스템.
- 제17항에 있어서, 상기 치료제 담체가 내부 지질 이중층 및 외부 지질 이중층을 갖는 양이온성 리포솜인, 리간드-작용성 전달 시스템.
- 제17항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 하나 이상의 소수성 앵커를 통해 상기 양이온성 리포솜의 상기 외부 지질 이중층의 외부 표면에 비-공유적으로 앵커링(anchored)되는, 리간드-작용성 전달 시스템.
- 제17항에 있어서, 상기 조직이 췌장암, 유방암, 비-소세포 폐암종(NSCLC), 췌장암 혈관 내피 또는 NSCLC 암 혈관 내피로부터 선택되는 암성 세포, 조직 또는 내피인, 리간드-작용성 전달 시스템.
- 페이로드(payload)를 표적 조직에 전달하는 방법으로서,
화학식 A-스캐폴드-A'의 조성으로 이루어지며, 상기 스캐폴드에 공유 결합된 하나 이상의 소수성 앵커를 포함하는 표적화 리간드를 제조하는 단계;
상기 조성으로 이루어진 표적화 리간드를, 치료제를 캡슐화하는, 세포막 또는 준세포막(subcellular membrane)과 같은 지질 이중층 또는 다중라멜라 또는 이중라멜라 소포 또는 더욱 구체적으로는 이중라멜라 리포솜에 혼입시키는 단계;
상기 리포솜을 표적화 리간드로 피복하는 단계;
상기 표적화 리포솜 복합체를 가역적 마스킹제(reversible masking reagent)와 결합시키는 단계; 및
상기 마스킹된 표적화 리포솜 복합체의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 환자에게 투여하는 단계
를 포함하는, 방법.
[상기 화학식에서,
상기 스캐폴드는 화학식이
a) 또는
b) 이며,
상기 점선은 A 및 A'에 대한 결합 지점을 나타내고,
A 및 A'는 1가의 펩티도미메틱 화합물이며, 여기서 상기 1가의 펩티도미메틱 화합물 각각은 모르폴리노이다]. - 제22항에 있어서, 상기 리포솜이 이중라멜라 함입형 소포(bilamellar invaginated vesicle)인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 가역적 마스킹제가 약 500 Da 이하의 분자량을 갖는 작은 중성 지질인, 방법.
- 제24항에 있어서, 상기 작은 중성 지질이 n-도데실-베타-D-말토피라노시드인, 방법.
- 제25항에 있어서, 상기 표적 조직이 사람 췌장암인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 화합물 KB995, KB1005, KB1012 및 KB1109 중의 하나 이상인, 방법.
- 제27항에 있어서, 상기 표적 조직이 사람 유방암인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 화합물 KB1035, KB1036, KB1039, KB1063, KB1064, KB1066 및 KB1067 중의 하나 이상인, 방법.
- 제29항에 있어서, 상기 표적 조직이 사람 비-소세포 폐암종인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 화합물 KB1001, KB1003, KB1042, KB1051, KB1062, KB1096, KB1107, KB1108 및 KB1029 중의 하나 이상인, 방법.
- 제31항에 있어서, 상기 표적 조직이 사람 비-소세포 폐암종 혈관 내피인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 화합물 KB1061인, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 표적 조직이 사람 췌장암 혈관 내피인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 화합물 KB1023인, 방법.
- 제35항에 있어서, 상기 항암 치료제가 항혈관신생 단백질 사람 트롬보스폰딘-1(TSP1)을 암호화하는 플라스미드 DNA인, 방법.
- 제33항에 있어서, 상기 표적 조직이 흑색종인, 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 표적화 리간드가 화합물 KB1037, KB1109 및 KB1123 중의 하나 이상인, 방법.
- 표적 조직에 결합시키기 위한 펩티도미메틱 화합물을 단리하는 방법으로서,
화학식 A-스캐폴드-A'의 조성 및 상기 스캐폴드에 공유 결합된 하나 이상의 소수성 앵커의 펩티도미메틱 라이브러리(peptidomimetic library)를 제조하는 단계;
표적 조직을 상기 펩티도미메틱 화합물과 접촉시키는 단계;
상기 표적 조직에 특이적으로 결합하는 펩티도미메틱 화합물들을 단리하는 단계; 및
상기 표적 조직에 특이적으로 결합된 상기 조성의 화학식의 특성을 분석하는 단계를 포함하는, 표적 조직에 결합시키기 위한 펩티도미메틱 화합물을 단리하는 방법.
[상기 화학식에서,
상기 스캐폴드는 화학식이
a) 또는
b) 이며,
상기 점선은 A 및 A'에 대한 결합 지점을 나타내고,
A 및 A'는 1가의 펩티도미메틱 화합물이며, 여기서 상기 1가의 펩티도미메틱 화합물 각각은 모르폴리노이다]. - 제39항에 있어서, 상기 방법이 고속 대량 분석(high throughput assay)이고, 상기 표적 조직이 해리 단계(dissociation step) 직후에 분석되는 환자의 세포를 포함하는, 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 앵커가 유로퓸 크립테이트, 테르븀 크립테이트 또는 소수성 꼬리(hydrophobic tail) 중의 하나 이상으로부터 선택되는, 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 펩티도미메틱 라이브러리의 결합이, 종양 세포와 정상 세포 사이에서 결합을 비교함으로써 스크리닝되는, 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 펩티도미메틱 라이브러리가 시분할 형광분석법(time resolved fluorometry)을 사용하여 직접 스크리닝되는, 방법.
- 제39항에 있어서, 상기 펩티도미메틱 라이브러리가 형질전환 기반 시스템(transfection based system)에서 스크리닝되는, 방법.
- 표적 조직 또는 세포에 결합하는 펩티도미메틱 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
화학식 A-스캐폴드-A'의 조성의 펩티도미메틱 라이브러리를 제조하는 단계;
하나 이상의 이중-지질층 앵커를 상기 펩티도미메틱 화합물에 공유 결합시키는 단계;
상기 펩티도미메틱 화합물을 지질과 혼합하여 리포솜을 형성하는 단계;
표적 조직을 상기 펩티도미메틱 화합물과 접촉시키는 단계;
상기 표적 조직에 특이적으로 결합하는 펩티도미메틱 화합물들을 단리하는 단계; 및
상기 표적 조직에 특이적으로 결합된 상기 조성의 화학식의 특성을 분석하는 단계를 포함하는, 표적 조직 또는 세포에 결합하는 펩티도미메틱 화합물을 스크리닝하는 방법.
[상기 화학식에서,
상기 스캐폴드는 화학식이
a) 또는
b) 이며,
상기 점선은 A 및 A'에 대한 결합 지점을 나타내고,
A 및 A'는 1가의 펩티도미메틱 화합물이며, 여기서 상기 1가의 펩티도미메틱 화합물 각각은 모르폴리노이다]. - 표적 조직 또는 세포에 결합하는 펩티도미메틱 화합물을 스크리닝하는 방법으로서,
화학식 A-스캐폴드-A'의 조성의 펩티도미메틱 라이브러리를 제조하는 단계;
하나 이상의 이중-지질층 앵커를 상기 펩티도미메틱 화합물에 공유 결합시키는 단계;
상기 펩티도미메틱 화합물을 지질과 혼합하여 리포솜을 형성하는 단계(여기서, 상기 리포솜은 세포로의 전달을 위한 핵산을 추가로 포함한다);
표적 조직을 상기 펩티도미메틱 화합물과 접촉시키는 단계;
상기 표적 조직에 특이적으로 결합하는 펩티도미메틱 화합물들을 단리하는 단계; 및
상기 표적 조직에 특이적으로 결합된 상기 조성의 화학식의 특성을 분석하는 단계를 포함하는, 표적 조직 또는 세포에 결합하는 펩티도미메틱 화합물을 스크리닝하는 방법.
[상기 화학식에서,
상기 스캐폴드는 화학식이
a) 또는
b) 이며,
상기 점선은 A 및 A'에 대한 결합 지점을 나타내고,
A 및 A'는 1가의 펩티도미메틱 화합물이며, 여기서 상기 1가의 펩티도미메틱 화합물 각각은 모르폴리노이다]. - 제46항에 있어서, 상기 표적 조직이 조직 배양물 중의 세포로서 추가로 정의되는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 표적 조직이 조직 배양물 중의 세포로서 추가로 정의되고, 상기 세포가 상기 세포에 대한 상기 핵산의 효과를 기준으로 선택되는, 방법.
- 제46항에 있어서, 상기 표적 조직이 조직 배양물 중의 세포로서 추가로 정의되고, 상기 핵산이 네거티브(negative) 또는 포지티브(positive) 선택에 대한 선택적 마커이거나, 포지티브 또는 네거티브 선택에 대한 선택적 마커를 발현하거나, 검출가능한 마커를 발현하는, 방법.
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