DK163134B - Fremgangsmaade til fremstilling af et enzym med fibrinolytisk aktivitet og/eller aktivitet som en plasminogenaktivator - Google Patents

Description

i

DK 163134 B

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af et enzym med fibrinolytisk aktivitet per se og/eller aktivitet som en plasminogenaktivator.

5 Thrombotisk vaskulær okklusion, sædvanligvis af kar med skade af gammel dato på deres vægge, er den væsentligste dødsårsag i Storbritannien, idet den står for mindst 2 ud af 5 dødsfald.

I denne sygdomsgruppe dræber alene thrombose i kranspulsåren lige så mange mennesker som alle cancertyper tilsammen. Der 10 eksisterer ingen sammenlignelige størrelser for dødeligheden, der er knyttet til thrombose-sygdomme (udtrykt ved hospitaliserede patienter eller sygdom i hjemmene), men antallet må være meget stort. En tilsvarende situation eksisterer i Vesteuropa og Nordamerika, og en artikel i "Time" magazine angav, 15 at kardiovaskulære sygdomme tegner sig for halvdelen af alle årligt registrerede dødsfald i U.S.A. (Time, 1. juni 1981, 43).

Der er derfor et stort behov for effektive behandlinger af 20 disse almindelige sygdomme. Det er imidlertid symptomatisk for knapheden af medicinsk terapi på dette område, at kirurgi spiller en stor rolle i den daglige medicinske praksis, hvilket fremgår af den meget store forøgelse i antallet af kranspulsåreomløbsoperationer, som udføres i Amerika. Hidtil (bortset 25 fra sådanne ikke specielle behandlinger som digitalis for et svagt ischaemisk hjerte) har antikoaguleringsmidler været den mest anvendte type medicin. Dog kan antikoaguleringsmidler i bedste fald kun inhibere yderligere thrombose, og kombinationen af mulige hæmorrhagiske komplikationer koblet med usikre 30 resultater i korrekt styrede kliniske forsøg, har begrænset deres mere udbredte anvendelse med undtagelse af nogle få klart definerede situationer (f.eks. lav dosering af heparin som en metode til at begrænse tilfælde af dyb venøs thrombose efter operation).

Den mest rationelle medicinske behandling må i teorien være selektivt at opløse det skadevoldende størknede blod. I reagensglasset vil 35

DK 163134B

2 mange proteolytiske enzymer lysere koaguleret blod, men disse enzymer, f.eks. trypsin, ville også nedbryde mange andre blodproteiner og hurtigt være dødbringende (en tilstand, der ofte ses i hurtigt udviklende akut hæmorrhagisk pankreatitis).

5 Hvad der behøves er et enzym med høj specificitet over for fibrin og kun minimal generel proteolytisk aktivitet. I legemet har de naturlige plasminenzymer disse egenskaber.

I blodstrømmen eksisterer plasmin sædvanligvis i sit inaktive forstadie, plasminogen. Størknet blod lyseres ved, at det 10 plasminogen, der allerede er indespærret i blodproppen, aktiveres til plasmin ved hjælp af stoffer, der er frigjort fra den tilstødende beskadigede karvæg, og som kendes som vaskulære plasminogenaktivatorer. På denne måde bliver ikke dødbringende størknet blod i kar efterhånden bragt tilbage i blodsystemet, 15 selv om processen er langsom og ineffektiv, idet det ofte varer måneder eller år. Det er således klart, at brugen af plasminogenaktivatorer, der er egnede til administration hos patienter, kunne være en fremgangsmåde til behandling af throm-botiske vaskulære okklusioner.

20 Tillet opdagede i 1933, at et exotoksin, opnået ud fra kulturer af hæmolytiske streptokokker, er en stærk plasminogenak-tivator. Dette kaldte han streptokinase (SK). Det har aldrig opnået generel klinisk godkendelse til brug som et fibrinoly-tisk middel på grund af, at (a) det er stærkt antigent (som 25 det ville forventes af et bakterielt exotoksin), og derfor er hyppige pyrogene reaktioner og undertiden tilfælde af ana-fylaktisk chok blevet omtalt, og (b) administrationen deraf er forbundet med en væsentlig risiko for blødning, der breder sig i hele organismen, fordi SK aktiverer såvel cirkulerende 30 plasminogen, som plasminogen, der er bundet til størknet blod, og det førstnævnte forårsager en udbredt ødelæggelse af flere af de normale blodkoaguleringsfaktorer, såsom Faktor I (fibrinogen), Faktor II (prothrombin), Faktor V (labil faktor) og Faktor VIII (anti-hæmofil globulin).

3

DK 163134 B

Ti år senere påvistes en anden piasminogenaktivator i normal human urin, og kaldtes urokinase (UK). Denne er i meget mindre grad (hvis overhovedet) antigenet, men også den er forbundet med aktivering af plasminogen i blodet, og bærer derfor en 5 lignende risiko for alvorlig blødning, hvilket begrænser dens kliniske brugbarhed.

Man har i mange år haft en formodning om, at andre væv end blodkar indeholder plasminogenaktivatorer. Disse benævnes sam-10 let "vævsaktivatorer". Man ved meget mindre om vævsaktivatorer end om streptokinase og urokinase. Det kan være, at vævsaktivatorer kemisk er en spredt gruppe af stoffer, der kun er fælles om deres evne til at omdanne plasminogen til plasmin. Dog mener de fleste, der arbejder indenfor dette område, at alle 15 vævsaktivatorer stammer fra blodkarrene i de væv, hvori de findes (dvs. fra vaskular endothelium) og derfor er identiske med vaskular plasminogenaktivator, der har en molekylvægt på 72.000 daltons. Det påstås yderligere, at andre væv tilegner sig en plasminogenaktivator, hvis de bliver cancerogene, og at 20 dette er årsagen til nogle maligne cellers indtrængende egenskaber.

En nylig opdaget vævsaktivator (henvist til som Human Extrinsic Plasminogen Activator-HEPA (jf. Rijeken, C.D. og Collen, 25 D., J. Biol. Chem. vol. 256, side 7035-7041 (1981))) har været emnet i en nylig serie publikationer. Denne vævsaktivator af-sondres af en cellelinie af (maligne) menneskemelanomceller, og den har også en molekylvægt på 72.000 daltons. I nærværelse af reducerende midler deler den sig i to underenheder på 30 39.000 og 33.000 daltons. Denne vævsaktivator er afprøvet både eksperimentelt (hos kaniner) og på to patienter, men stoffets cancerogene oprindelse begrænser dets kliniske anvendelse, da det er tydeligt utilfredsstillende at bruge et stof, der er afledt af maligne celler, som terapeutisk middel. Faktisk var 35 de to humane patienter, på hvilke vævsaktivatoren blev prøvet, dødeligt syge og ville sikkert være døde uden behandling. Ikke desto mindre har HEPA (både klinisk og eksperimentelt) vist 4

DK 163134 B

sig at være et meget effektivt og meget sikrere lyserende middel til størknet blod end urokinase. Dette skyldes, at HEPA selektivt aktiverer plasminogen, der er bundet til thrombus, og skåner det cirkulerende plasminogen.

5

Fra Chemical Abstracts, vol. 92 (1980), nr. 144655q og Biol. Abstr., vol. 69, nr. 51892 kendes enzymer med plasminogen-aktivatoraktivitet fra ikke-kræftepithelceller. Fra nævnte Abstracts er det imidlertid ikke kendt at fremstille enzymer 10 med fibrinolytisk aktivitet per se og/eller aktivitet som en plasminogenaktivator ved brug af etablerede cellelinier.

Anvendelsen af en etableret epithelcellelinie indebærer en meget væsentlig afvigelse fra de hidtil kendte procedurer, 25 som enten har benyttet primære cellekulturer, der er uegnet til langvarig kommerciel produktion i stor målestok eller var baseret på anvendelsen af maligne celler. Sidstnævnte celler indebærer selvsagt sundheds- og sikkerhedsrisici ved anvendelse til fremstilling af lægemidler.

20

Det har nu overraskende vist sig, at visse cellelinier, der er afledt af ikke cancerogene epithelceller, er i stand til i vævskulturer at frembringe enzymer, der er aktive som plasmi-nogenaktivatorer. Desuden har et enzym fra én cellelinie i det 25 mindste vist sig at have fibrinolytisk aktivitet per se, dvs. enzymet er i sig selv aktivt til lysering af fibrin ved fravær af plasminogen.

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til frem-30 stilling af et enzym med fibrinolytisk aktivitet per se og/eller aktivitet som plasminogenaktivator, og fremgangsmåden er kendetegnet ved, at man dyrker celler af den etablerede epi-thelcellelinie betegnet GPK (CNCMI-222) eller celler af den etablerede epithelcellelinie betegnet BEB (CNCMI-221) og iso-35 lerer en enzymholdig fraktion fra kulturen. Den enzymholdige fraktion kan enten opnås ved opsamling af en supernatantfrak-tion indeholdende enzymet eller ved at den enzymholdige fraktion ekstraheres fra cellerne.

DK 163134B

5

Ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af enzymet kan de valgte celler dyrkes i seriekultur ved hjælp af sædvanlige vævsdyrkningsteknikker, f.eks. i et serumholdigt medium. Når der er opnået en passende formering af cellerne, 5 kan det serumholdige medium erstattes af et serumfrit medium. Cellerne kan derpå opbevares under fysiologisk egnede betingelser, indtil en passende enzymproduktion har fundet sted, og enzymet kan derpå opnås fra supernatentdelen eller ved direkte ekstraktion fra cellerne.

10

En hvilken som helst egnet indvindingsteknik kan benyttes, men fortrinsvis indvindes enzymet fra forenede aliquoter af ovenpå svømmende væske ved centrifugering for at fjerne alle suspenderede celler, efterfulgt af metalchelat, ionbytning j5 og/eller udelukkelse ved kromatografi. Fraktioner, der indeholder proteiner, kan identificeres ved at måle U.V. ekstinktionen ved 280 nm, og ved at man udsætter de proteinholdige fraktioner for fibrinolytisk og/eller plasminogenaktiverende aktivitet ved fibrinplademetoden og/eller fibrinklumplyserings-20 tidsmetoden.

Enzymer er blevet isoleret i overensstemmelse med opfindelsen fra en tilvejebragt cellelinie af marsvine-keratocytter og fra en tilvejebragt cellelinie af ikke-cancerøst humant bryst-2g epithelium, og disse enzymer har begge en molekylvægt bestemt ved natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel-elektroforese (SDS-PAGE) i et reducerende medium, på 62.000 + 3000 Dalton, en molekylvægt under ikke-reducerende betingelser på ca. 56.000 Dalton og et isoelektrisk punkt på 4,6. Enzymet, der er opnået af keratocytter fra marsvin, og enzymet, der er opnået fra ikke-cancerogent humant brystepithelium, har en aminosyresammensæt-ning, der i det væsentlige svarer til, hvad der er vist i tabel 3.

35 Disse enzymer er hidtil ukendte, ligesom isoleringen af disse enzymer ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen og farmaceutiske midler, der omfatter enzymerne og et farmaceutisk acceptabelt

DK 163134B

6 fortyndingsmiddel eller en bærer, er nyt. Valget af bærer vil være afhængig af den ønskede administrationsvej, og ved parenteral administration er steril pyrogen-fri normal saltopløsning en egnet bærer. Enzymerne kan også administreres oralt, 5 og sædvanlige tilsætningsstoffer til oral brug kan benyttes. Kliniske indikationer for anvendelse af enzymerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indbefatter diagnose, forebyggelse og behandling af venøse thromboser (indbefattende thromboser dybt i venerne og nethindethromboser), blodpropper 10 i lungerne, intrakardial blodstørkning, arteriel thromboembo- 1i, mikrovaskulær thromboemboli, inflammatoriske exuderende tilstande og nærværelsen af blod i hulrum i legemet såsom i hæmothorax.

15 Cellelinien af marsvinekeratocytter, der er henvist til ovenfor, bevares i en samling af kulturer ved University College, London under betegnelsen GPK, og cellelinien af humant bryst-epithelium bevares i en samling af kulturer ved University College, London under betegnelsen BEB, og begge er deponeret 20 ved det (internationalt anerkendte) Collection Nationale de

Cultures de Microorganismes ved Institut Pasteur, den 25. februar 1983, Accessionsnumre I 221 for BEB og I 222 for GPK.

I modsætning til den tidligere beskrevne humane ydre plasmino-25 genaktivator (HEPA), der er omtalt ovenfor, kan enzymerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen opnås ud fra ikke-cancerogene, afledte godartede vævskulturceller og har også en anden molekylvægt og aminosyresammensætning (se tabel 3). Enzymet, der er afledt fra GPK, har i det mindste vist sig 30 at være fibrinolytisk i sig selv (dvs. ved direkte enzymatisk virkning på fibrin, og ikke blot gennem frigørelse af plasmin, j f. f i g. 4).

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen til fremstilling af enzymer · 35 og disses karakterisering vil nu blive beskrevet mere detaljeret ved hjælp af eksempler.

7

DK 163134 B

Celler anvendt i vævskulturerne.

(a) Tilvejebringelse af keratocytter fra marsvin (GPK).

Dyrkningen indledtes den 16. november 1971, og linien blev tilvejebragt af skindet fra et sort marsvin. En Thiersch biopsi-5 prøve blev inkuberet med 10% trypsinopløsning i 20 minutter og epidermisen skilt fra. De grundliggende celler blev skilt fra, og de resulterende celler blev hældt i en glassutteflaske indeholdende et næringssubstrat bestående af 20 mM Hepes-pufret Minimum Essential Medium, Eagle (MEM) suppleret med 10% (volu-10 men/volumen) føtal bovinserum (FBS) og indeholdende penicil lin (1000 i.e./ml) og streptomycin (^g/ml). Ved den anden overførsel den 12. januar 1972 bestod kulturen af granuløse, tæt sammenknyttede, velordnede epithelceller.

(b) Tilvejebringelse af ikke-cancerogent humant brystepithel 15 (BEB).

En linie epithelceller blev udtaget fra en kirurgisk udtaget biopsiprøve fra et humant kvindebryst den 22. marts 1972. Mikroskopi (University College Hospital Laboratory report nr. 1017-72) af det oprindelige væv viste kun godartet cystisk 20 hyperplasi og var negativ over for tumor (patienten deltog i rutineundersøgelser i 6 måneder og blev derpå udskrevet i god form og har ikke været tilbage på klinikken siden).

Vævet blev disaggregeret ved hjælp af elastase og de resulterende celler hældt i en sutteflaske indeholdende et nærings-25 substrat. Cellerne voksede hurtigt, og efter 8 dages dyrkning var de overvejende epithele med nogle fibroblaster. Subkultur af denne cellelinie blev fortsat med trypsinisering og vækst i dyrkningsbeholdere af polystyren. Efter tre overførsler var cellerne alle epithele. Cytologi af cellelinien ved over-30 førsel nr. 15 viste, at den ikke var cancerogen.

(c) Metoder til rutinedyrkning.

Cellerne bevares rutinemæssigt ved hjælp af et ugentligt sub- 8

DK 163134 B

kultiveringssystem. Når det er lige før, de flyder sammen,skilles cellerne fra, ved at de udsættes for 10% trypsin i dextrose-saltopløsning i ca. 2-3 minutter, overføres til et rør i en centrifuge med ca. 2 ml næringssubstrat og centrifugeres ved 5 800 omdrejninger pr. minut i 4 minutter. Den lille cellekugle resuspenderes derpå i 1 ml næringssubstrat, en 20 μΐ aliquot tælles af Coulter Counter, og cellerne podes i rene sterile petriskåle indeholdende et næringssubstrat og efterlades i C09 inkubatoren ved 37°C i en uge som lagerlinien. Den normale 10 podningsdensitet for GPK-celler er 10 c/ml. Prøver for kontamination udførtes ved hjælp af autorøntgenfotografering (BEB overførsel 19 og GPK overførsel 34 og 50). Celler blev podet 3 på objektglas og mærket i fem timer med H thymidin, slutkon-cer.tration 1,0 pCi/ml. Efter belægning med Ilford K2-emul-15 sion på gelform, blev objektglassene opbevaret ved 4°C i en uge, fremkaldt og farvet med Giemsa-farve og undersøgt med hensyn til deres kernemærkning og en hvilken som helst cyto-plasmisk eller ikke-cellulær mærkning. Begge linier viste kun den normale kernemærkning. Mycoplasma-kontamination blev 20 også udelukket med kødafkogskulturer (BEB 17 og GPK overførsel 7).

Overførslerne, der anvendtes til enzymopsamlingerne, var GPK (33-53) og BEB (19-27).

(d) Lagring i flydende nitrogen.

25 Efter trypsinanbringelse og tælling ved den ovenfor beskrevne metode centrifugeres cellerne fra, og de små cellekugler resuspenderes i næringssubstratet indeholdende 7,5% dimethylsulfoxid g (DMSO) til opnåelse af en cellekoncentration på ca. 2 x 10 celler/ml.

30 Cellesuspensionen anbringes i ampuller i en polystyrenæske, der køles trinvis som følger: 3 timer ved +4°C, 30 minutter ved -18°C og natten over ved -70°C, og derpå overføres den til nitrogenkøleren.

DK 163134B

9 (e) Rekonstituering efter lagring i flydende nitrogen.

Ampuller indeholdende celler, der skal rekonstitueres, fjernes fra nitrogenet og får lov til at tø hurtigt i et bæger med varmt vand (35°C). Cellerne overføres derpå til en petriskål 5 indeholdende 10 ml vækstmedium og henstår natten over ved 37°C. Mediet byttes den efterfølgende dag for at fjerne DMSO.

(f) Forøgelse af kulturstørrelsen.

Udbyttet af enzymer pr. celle er meget lille (0,1 pg/celle) og deraf behovet for at anvende dyrkningssystemer i stor skala 10 for at fremme høje koncentrationer af celler i en apparaturenhed til forøgelse (i modsætning til mange apparater af lille størrelse). Det er også vigtigt, at dyrkningssystemet vil producere et produkt, der er så koncentreret som muligt for at lette rensningsproceduren. Følgende dyrkningssystemer er benyttet 15 til at forøge celle- og enzymproduktionen fra beholdere på 25 og 75 cm2: (i) Rullekultur Polystyren- og glasflasker af forskellige størrelser rulles langsomt (12 omdrejninger pr. time), idet der benyttes et standardvsvsdyrknings med omrulning.

20 Produktiviteten hæves, fordi hele det indre overflade areal benyttes frem for kun en enkelt overflade. Der opnås mere koncentrerede udbytter af enzymet, fordi forholdet mellem cellen og substratet kan øges sammenlignet med stationære kulturer.

25 (ii) Stabelpladekulturer Overfladen til dyrkning er en række flade, cirkulære plader af rustfrit stål, der med et mellemrum på 2-4 mm er anbragt horisontalt på en omrører-arm. Det hele anbringes i en fermenteringsbeholder og omrøres langsomt (op til 100 omdrejninger pr. minut).

2 30 Kulturens størrelse varierer fra 5 liter (12.200 cm ) til 210 liter (330.000 cm2) dyrkningsareal, og selv 10

DK 163134 B

om det muliggør en større forøgelse i cellekapaciteten i en enkelt enhed, tillader det ikke en mere koncentreret produktdannelse.

(iii) Mikrobærerkulturer Mikrobærere er småkugler, der tillader 5 cellevækst på deres overflade og kan holdes omrørt i suspension. Dette muliggør, at fermenteringsudstyr i stor målestok, sædvanligvis kun tilgængeligt for suspensionsceller, kan anvendes til celler, der vokser vedhæftet til et substrat. Fordelene ved dette system er fuldstændig miljøregulering, som bevarer kulturen homogen og i et optimalt miljø, ubegrænsede muligheder for at bringe det op i større skala, og at forholdene mellem celle og medium er lette at ændre, således at der kan dannes et mere koncentreret produkt. Mikrobærere n e . 2 15 tilvejebringer typisk 5000 cm kulturareal pr. gram og anvendes i koncentrationer mellem 3 og 15 g/1, afhængig af dyrkningsapparatets udformning.

Principperne ved celledyrkning er de samme for alle typer og størrelser af dyrkningsbeholdere.

20 3 Eksempel.

(a) Høstninq af GPK celle-afledt enzym (CDE) fra en mikrobarerkul tur.

Cytodex-3 (Pharmacia Fine Chemicals) var den mikrofcærer, der anvendtes i en koncentration på 10 g/1. Dyrkningsapparaturet 25 var en 5 liter Biocul Fermenter (L.H. Fermentation Ltd.) med en kapacitet på 4,5 liter, forbundet med en beholder til overgydning, som indeholdt 2 liter substrat. Forholdet mellem overfladearealet og substratet er mere end fire gange større end i rullekolber under anvendelse af denne mængde mikrobærer, 30 og cellerne kan kun holdes i live og aktive ved hjælp af kritisk 11

DK 163134 B

styring af oxygenindhold, pH-værdi og næringsstofkoncentrationer og hurtige overgydningshastigheder. Dyrkningsapparaturet, der opfylder disse krav, er beskrevet (Griffiths, J.B. og Thornton, B.J. Chem. Tech. Biotechnol. 1982, 32, 324-329).

q 5 Cellekim på 2,5 x 10 celler blev fremstillet i en rullekolbe-kultur og sat til kulturen indeholdende Eagles (MEM) næringssubstrat tilsat 10% FBS, 0,001% "Tween" 80 og Hepes puffer.

Efter 72-96 timers vækst ved 37°C vokser cellerne tilstrækkeligt til at dække ca. 70% af det tilgængelige substrat (typisk 10 ca. 1,4 x 1010 celler). Mediet dekanteres, cellerne plus mikro-berestofferne vaskes to gange med et serumfrit substrat og efterfyldes derpå med serumfrit MEI-1. Inkubering ved 37°C fortsættes derpå i nindst 60 timer for at give mulighed for, at der foregår yderligere cellevækst og enzymsekretion.

15 Ved afslutningen af inkuberingen hældes den ovenpå svømirende væske fra og centrifugeres ved 450 g i 10 minutter for at fjerne alle celler i suspensionen. Den ovenpå svømmende væske centrifugeres derpå ved 40.000 g i 30 minutter ved 5°C. En 50 μΐ aliquot udtages til fibrinpladeprøvning, idet det ovenpå 20 svømmende lag frysetørres og overføres til en afvejet kolbe og lagres i køleren med flydende nitrogen. Den ovenpå flydende væske kan alternativt koncentreres ved ultrafiltrering.

(b) Rensning af GPK ovenpå svømmende cellekultur.

Den koncentrerede, ovenpå svømmende kultur blev delvis renset 25 ved kromatografi på en søjle af zinkchelatagarose (4,4 cm x 12 cm) i forvejen ved 4°C bragt i ligevægt ired 0,02M tris-HCl, pH-vsrdi 7,5 indeholdende 1M NaCl og 0,01% "Tween" 80. 5 liter af det behandlede medium blev sat til søjler, med en strømningshastighed på 120 ml/time. Efter at have vasket søjlen med 30 2 liter ligevægtspuffer blev de bundne proteiner elueret med en lineær gradient fra 0 til 0,05M inidazol (totalvolurnen 1 liter) i ligevægtspufferen. Eluatet blev opsamlet i frak- 12

DK 163134 B

tioner på 8 ml. Den ultraviolette (UV) ekstinktion af hver fraktion blev undersøgt ved 280 nm og den fibrinolytiske aktivitet blev bestemt ved fibrinpladeanalyse (fig. 1). De aktive fraktioner blev forenet og den specielle aktivitet heraf bestemt 5 ved fibrinklump lyseringstidsmetode.

I det næste trin blev de forenede fraktioner overført til en concanavalin A-agarose-søjle (2,2 x 15 cm) bragt i ligevægt med 0,01M natriumphosphatpuffer, pH-værdi 7,5, indeholdende 1M NaCl og 0,01% "Tween" 80. Søjlen blev vasket med lige-10 vægtspufferen ved en strømningshastighed på 10 ml/time, indtil UV-ekstinktionen ved 280 nm af eluatet var 0,15. En lineær gradient af ligevægtspufferen (200 ml) til 0,01M natriumphosphatpuf fer, pH-værdi 7,5 indeholdende 0,6M a-D-methylmannosid, 2M KSCN og 0,01% "Tween" 80 anvendtes til at eluere det absor-15 berede materiale. Fraktioner på 5 ml blev opsamlet til måling af UV-ekstinktionen og fibrinolytisk aktivitet som tidligere beskrevet (fig. 2). De aktive fraktioner blev samlet, og koncentrationen af KSCN blev forøget til 1,6M ved tilsætning af fast KSCN til de forenede fraktioner. Opløsningen blev 20 derpå koncentreret ved dialyse mod fast polyethylenglycol med en molekylvægt på 15.000-20.000 dalton.

Den koncentrerede opløsning (5-8 ml) blev centrifugeret og gelfiltreret på en "Sephadex" G150 (superfin) kolonne (2,5 x 90 cm) i 0,01M natriumphosphatpuffer, pH-værdi 7,5, inde-25 holdende 1,6M KSCN og 0,01% "Tween" 80. Fraktioner på 3 ml blev opsamlet ved en strømningshastighed på 9 ml/time. Det aktive enzym blev elueret som en enkelt top, der var sammenfaldende med en lille proteintop (fig. 3). Fraktioner indeholdende aktivt enzym blev samlet, koncentreret ved dialyse mod 30 polyethylenglycol og lagret ved -80°C.

13

DK 163134 B

Alternativt kan eluatet fra concanavalin-A-agarosekolonnen renses yderligere ved affinitetskronatografi på lysin-sepha-rose eller fibrin-sepharose. Resultaterne af rensningen af det GPK-afledte enzym er opsummeret i tabel 1.

5 (c) Enzymanalyse.

(i) Fibrinpladeanalyse.

Fibrinplader blev tilberedt som følger. I en polystyrenpetriskål med en diameter på 52 mm blev 3 ml 1 mg/ml fibrinogen i fibrin-pladepuffer størknet med 10 ul thrombin (250 enheder/ml) og 10 hens tod i mindst 30 minutter ved stuetemperatur. 50 ul af den ovenpå flydende væske blev to gange sat til en plade sammen med 50 ul plasminstandard (10 μΐ/ml) og pladen inkuberet i 20 timer ved 37°C. Det lyserede areal blev målt ved ortho-gonaldiametre og udtrykt som. ”plasminenheder" (1 Pu = lysis 15 fremstillet af 1 ng plasmin).

(ii) Fibrinklump lyseringstidsmetode.

De fibrinolytiske aktiviteter af GPK og BEB afledte enzymer blev sammenlignet med aktiviteten af en standard urokinaseop-løsning (1. International Reference Preparation of human uro-20 kinase, oprettet i 1966). En standardprøve af urokinase blev opløst i 50 mM natriumdiethylbarbituratpuffer, pH-værdi 7,8 indeholdende 0,1M NaCl og 0,25% vægt/volumen gelatine. Flere fortyndinger af standardurokinase og fibrinolytisk enzym blev fremstillet i den ovennævnte puffer. Alle andre reagenser 25 blev fortyndet i den samme puffer og holdt på is før blanding. 0,2 ml fortyndet urokinase eller enzymopløsninger blev anbragt i en serie på 10 x 50 mm rør. Dette blev efterfulgt af 0,05 ml human plasminogen (3 mg/ml), 0,5 ml human fibrinogen (0,25% vægt/volumen) og 0,05 ml thrombin (40 NIH enheder/ 30 ml). Indholdene blev blandet hurtigt og rørene blev anbragt i et 37,5°C vandbad. Et stopur blev startet øjeblikkeligt, 14

DK 163134 B

og sluttidspunktet for lyseringstiden blev målt ved forsigtigt at stille røret skråt. En kalibreringskurve blev fremstillet ved at afbilde log lyseringstid (i minutter) mod log urokinasekoncentration i klumpen. Fortyndingsfaktoren af en-5 zymopløsningen, der giver samme lyseringstid som urokinase- standardopløsningen på 0,5 lU/ml blev bestemt til beregning af den ikke fortyndede enzymopløsningsaktivitet. Enzymets fibrinolytiske aktivitet blev derfor udtrykt i internationale enheder (IU).

10 Den gennemsnitlige specifikke aktivitet (fibrinolytisk akti-vitet/ng protein) af GPK-afledt renset enzym var ca. 12.500 lU/mg.

(d) Proteinbestemmelse.

Proteinkoncentrationen blev målt ved forbedret Coomassie Blue 15 G farvebindingsanalyse fra Read & Northcote (Anal. Biochem.

116, 53-64, 1981) under anvendelse af bovinserumalbumin, fraktion V, som standard.

(e) Kontroller.

En-portion på 670 mg frysetørret materiale blev fremstillet 20 på den under (a) ovenfor beskrevne måde, men uden tilstedeværelse af celler. Dette materiale gav et negativt resultat på en fibrinpladeanalyse. De ovenstående vasker fra flere andre cellelinier blev også undersøgt for fibrinolytisk aktivitet, men var enten negative eller udviste kun spor af 25 fibrinolytisk virkning. Resultaterne fremgår af tabel 2 nedenfor.

(f) Virkning af opvarmning (enzyminaktivering).

Inden frysetørring af en portion af celleafledt materiale (GPK 37, portion 3), udtoges to 0,5 ml aliquoter. Den ene 30 blev opvarmet i et kogende vandbad i 5 minutter, og den anden blev anvendt som den normale kontrol. Ved fibrinpladeanalysen 15

DK 163134 B

var den kogte prøve inaktiv.

Fysiokemiske egenskaber.

(a) Fibrinpladeanalyse.

Fibrinolytiske aktiviteter af enzymopløsninger afledt af GPK 5 blev bestemt på plasminogenholdige bovin-fibrinplader. 3 ml fibrinogenopløsning (ex-Sigma, 1 ng/nl) blev koaguleret i en petriskål (Gibco Europe Ltd.) 52 min i diameter, ved tilsætning af 2,5 enheder throrabin i 10 ul puffer. Pladerne henstod ved stuetemperatur i mindst 30 minutter inden anvendelse.

10 50 ul volumener af forsøgsprøverne sattes til pladerne, der derpå blev inkuberet i 18 timer ved 37°C. Lyseringszonen blev målt og udtrykt som en procentdel af det samlede lyserede areal forårsaget af plasmin (10 ug/ml).

(b) Forbehandling af fibrinplader.

15 For at inaktivere fibrinlagets naturlige indhold af plasminogen, opvarmedes fibrinpladerne til 80°C i 45 minutter. De fik derpå lov til at afkøle til stuetemperatur inden brug. Man sørgede for, at kondensationen ikke forekom på fibrinlagets overflade.

Denne fremgangsmåde resulterede i denaturering af det kontami-20 nerende plasminogen og ophævede pladernes modtagelighed over for virkningen af plasrainogenaktivatorer såsom urokinase (og reducerede også pladernes følsomhed over for proteolyse).

Resultaterne er vist i fig. 4, hvorfra man kan foretage en sammenligning af den fibrinolytiske aktivitet af GPK-afledt 25 enzym med plasnins og urokinases på opvarmede og ikke opvarmede fibrinplader. Som ventet var der for urokinases vedkommende ingen fibrinolytisk aktivitet på den opvarmede plade som følge af inaktiveringen af kontaminerende plasminogen.

16

DK 163134 B

GPK-afledt enzym var dog stadig i stand til at lysere fibrin-laget på den opvarmede plade, dog i et mindre omfang end lyseringen på en plade, der ikke var blevet opvarmet- Disse resultater viser, at GPK-afledte enzymer besidder både direkte 5 fibrinolytisk og plasminogen aktivatoraktivitet i modsætning til kendte plasminogenaktivatorer.

Den fibrinolytiske aktivitet af GPK-afledt enzym blev også undersøgt på plasminogenfri fibrinplader fremstillet af kommercielt tilgængeligt plasminogenfri fibrinogen, og viste sig 10 at være lytisk. Urokinase gav negativt resultat ved dette forsøg og lyserede ikke plasminogenfri fibrinplader.

DK 163134B

17 (c) Bestemmelse af molekylvagten.

Molekylvægten af GPK afledt enzym blev bestemt på en 10% poly-acrylamidgelplade i natriumdodecylsulfat under reducerende og ikke-reducerende betingelser i overensstemmelse med Laeim-5 mli-metoden (1973). (Laemnli, U.K. og Favre, M., J. Mol. Biol. 80, 575-599 (1973)).

Prøver blev opvarmet til 90°C i 5 minutter inden elektroforese, og de følgende referenceproteiner anvendtes som standarder. Phosphorylase b (92.500), bovinserunalbumin (67.000), ovalbu-10 min (45.000), carbonisk anhydrase (31.000), sojabønnetrypsin-inhibitor (21.500) og lysozym (14.400).

Ξη densitometrisk kurve af gelpladen stammende fra ét forsøg blev benyttet til beregning af molekylvægten. Man bestemte den afstand, som GPK-afledt enzym havde vandret, på en stand-15 ardkurve fremkommet ved at optegne referenceproteinernes relative vandring mod deres log molekylvægte.

Resultaterne viser, at molekylvægten af det GPK-afledte enzym var omtrent 56.000 + 2000 under ikke-reducerende betingelser og 62.000 t 3000 under reducerende betingelser (ved tilsætning 20 af 2-mercaptoethanol), der antyder nærværelsen af disulfidbroer i enzymmolekylet. Molekylvægten stemmer nøje overens med den tilnærmede molekylvægt på 65.000 + 3000 bestemt ved gelfiltrering på en "Sephadex" G150-søjle. Lignende resultater blev opnået for det BEB-afledte enzym.

25 (d) Isoelektrisk fokusering.

Isoelektrisk fokusering blev udført på tyndtlags-LKB-Ampho-lin-polyacrylamidgelplader i pH-værdi-intervallet 3,5-9,5 under anvendelse af en LKB-Multiphor-enhed. 20 μ1 aliquot GPK enzym sattes til gelen. Fokuseringen gennemførtes ved 18

DK 163134 B

konstant energitilførsel på 8 W med en begyndelsesstrømstyrke på 20 mA og en maksimal spending på 1,1 KV. Fokuseringstemperaturen var 10°C og forsøgstiden var 90 minutter.

pH-gradienten over gelen blev målt ved stuetemperatur i inter-5 valler på 0,5 cm under anvendelse af miniaturekombinations- overfladeelektrode (Pye-Ingold type 4Q3-30-M3) med en spids med en diameter på 3 mm. og et pE-meter (Corning model 7030). Gelen farves med henblik på protein under anvendelse af Coomas-sie brilliant blue R-250 (Sigma Chemical Co.) efter fiksering 10 . i en 10% trichloreddikesyre(TCA)opløsning.

De opnåede resultater er vist i fig. 5. De isoelektriske punkter (pi) af de rensede GPK og ΒΞΒ afledte enzymer viste sig at være 4,6.

(e) Aminosyresammensætninq.

15 Aminosyresamnensætningerne af GPK og BE3 enzymer blev bestemt ved hjælp af en Locarte aminosyreanalyseapparat efter hydrolyse af proteinprøven raed konstant kogende 6M HC1 (Aristar) i vakuum ved 110°C i 20 timer.

Aminosyresammensstningerne af enzymerne er vist i tabel 3.

20 Til sammenligning er sammensætningen af plasrainogenaktivatoren afledt af human malign melanoma (ESPA) også indbefattet i tabellen. (Rijken, D.C. og Collen, D., J. Biol. Chem. 256, 7035-7041 (1981)).

Det fremgår, at GPK- og BEB-enzymerne dybest set har ensartet 25 sammensætning, men har de små forskelle, der kan forventes mellem to forskellige arter (menneske og marsvin). Både GPK og ΒΞΒ har en aminosyresammensstning, der er forskellig fra den, der er beskrevet for HEPA.

DK 163134B

19 (f) Kinetiske undersøgelser.

Den ainidolytiske aktivitet af det GPK-afledte enzym blev bestemt under anvendelse a£ forskellige chromogene substrater. Aktiviteten blev nålt spektrofotonetrisk i en cuvette med en 1 cm 5 transmissionslængde ved 37°C med et Gilford system 2600 spek-trofotometer forbundet med en Hewlett Packard 7225A Graphics Plotter.

Det delvis rensede enzym blev inkuberet med forskellige koncentrationer af hver af de chromogene substrater i 0,05M tris-10 HC1-puffer ved den pK-værdi og ionstyrke, der er angivet i tabel 4, der angiver værdierne af de kinetiske parametre, der er opnået for det GPK-afledte enzym med forskellige substrater. Begyndelsesfrigivelsen af p-nitroanilin blev overvåget ved 405 nm. Sn molær ekstinktionskoefficient på 10.500 1 15 mol 1 cm--· blev benyttet til p-nitroanilin.

(g) Undersøgelser af fibrinbindlng.

Absorptionen af GPK og BEB afledte enzymer til fibrinsammen-klumpninger blev bestemt ved at blande 1 ni plasminogenfri fibrinogen (1,5 mg/ml), 25 >.:1 GPK eller ΒΞΒ (25 jjg/ml) og 20 50 μ1 thrombin (20NIH U/nl). De ovennævnte blandinger blev tilberedt i 0,05M natriumdiethylbarbituratpuffer, pH-vardi 7,8 indeholdende 0,1M NaCl og inkuberet ved 37°C i 30 minutter. Sammenklumpningerne blev indsamlet ved centrifugering, vasket med puffer og derpå ekstraheret med 1 ml 0,05M natrium-25 diethylbarbituratpuffer, pH-værdi 7,8 indeholdende 1M KSCN. Aliquoter af væsken over den størknede masse og ekstrakter af den størknede masse blev prøvet på plasminogenholdige fi-brinplader.

Resultaterne viser, at det meste af det tilsatte enzym var 30 bundet til fibrinklumperne med lidt eller intet aktivt enzym tilbage i den ovenstående væske. Lignende forsøg med urokinase 20

DK 163134 B

viste imidlertid, at der var en ubetydelig binding til fibrin-sammenklumpningerne.

(h) Binding af GPK afledt enzym til en eksperimentel thrombus i et kunstigt kredsløb.

5 GPK-afledt enzyms evne til at binde sig til fuldblodspropper blev undersøgt i et in vitro Chandler lokalkredsløb. En eksperimentel tværbundet thrombus blev fremstillet i et polvethy-lenrør med en indre diameter på 3 mm (forvasket med 0,01% "Tween") ved blanding af humant citratfuldblod (1 ml) med 10 50 μΐ 0,0514 CaC^ og 25 ul thrombin (100 NIH U/ml). Efter inkubering ved 37°C i 1 time på en drejeskive (30 omdrejninger pr. minut) blev blodproppen hældt i en petriskål og vasket to gange med 0,05M natriumdiethylbarbituratpuffer, pH-værdi 7,3 indeholdende 0,25% vægt/volumen gelatine og 0,1M NaCl.

15 Blodproppen blev derpå suget tilbage i røret sammen med 0,9 ml autologplasma eller puffer. 100 μΐ GPK afledt enzym (ca.

500 IU) blev tilsat. Sløjfen blev igen anbragt på drejeskiven og inkuberet i yderligere 2 timer ved 37°C. Klumperne blev fjernet, vasket med puffer som før og derpå ekstraheret med 20 1 ml 0,05M diethylbarbituratpuffer, pH-værdi 7,8 indeholdende 1M KSCN i 1 time ved 4°C. 50μ1 aliquoter af ekstraktet fra . sammenklumpningerne og af den over sammenklumpningerne værende væske fra røret blev påført plasminogenholdige fibrinplader og inkuberet i 18 timer ved 37°C.

25 De opnåede resultater viser, at den fibrinolytiske aktivitet af ekstrakterne fra sammenklumpningerne og således mængden af bundet enzym, var væsentlig højere for den over sammenklumpningerne stående væske. Lignende resultater blev opnået, når forsøget blev gentaget med indium1 ^-mærket enzym.

30 På baggrund af disse resultater kan det radioaktivt mærkede enzym benyttes diagnostisk som et effektivt middel til in vivo thrombuslokalisering.

21

DK 163134 B

(i) Immunodiffusionsanalyse.

Antisera nod GPK- og BEB-afledt materiale og human urokinase blev fremkaldt hos kaniner ifølge metoden, der er beskrevet af Rijken & Collen (J. Biol. Chen. 25β, 13, 7035-7041, 1981).

5 IgG-fraktionerne af antisera blev isoleret ved affinitetskro-natografi på protein-A-sepharose-søjle.

Dobbelte immunodiffusionsanalyser blev udført i 1,5% agargeler i overensstemmelse med teknikken beskrevet af Ouchter-long and Nilsson (Handbook of Experimental Immunology, 2.

10 udgave, kapitel 19, Blackwell, Oxford). Prøver blev sat til den perforerede beholder og fik lov til at diffundere natten over ved 4°C i en fugtig atmosfære.

Resultaterne angiver, at GPK- og ΒΞΒ-afledte enzymer er immunologisk ens, og at kanin-anti-GPK IgG og anti-ΒΞΒ IgG ikke 15 reagerede med urokinase. På lignende måde cross-reagerede ingen af enzymerne på antistoffer mod urokinase.

(j) Inhibering af GPK-afledt enzymaktivitet ved hjalp af 2-mercaptoethanol.

Forskellige fortyndinger af grundopløsningen af 2-mercaptoetha-20 nol blev fremstillet i 0,05M natriumdiethylbarbituratpuffer, pH-vsrdi 7,8 indeholdende 0,01% '"Tween" 80. GPK-afledt enzym (25 ug/ml) blev blandet med en tilsvarende mængde fortyndet 2-mercaptoethanolopløsning, og blandingen inkuberedes ved 37°C. En kontrolprøve indeholdt enzym med en lignende mængde 25 puffer. Efter 15 minutter blev 50 ul aliquot af blandingen overført til en plasminogenholdig fibrinplade for at bestemme den resterende en2ymaktivitet. Enzymaktiviteten blev også kvantiseret ved fibrinsammenklumpningslyseringstidsmetoden.

De opnåede resultater angiver, at en væsentlig mængde 080%)

DK 163134B

22 af enzymaktiviteten blev inhiberet ved inkubering med 2-mercap-toethanol ved en koncentration på lOmM eller derover. Disse resultater viser sammen med de, der er opnået ved bestemmelse af molekylvægt, at de intramolekylære disulfidbroer er essen-5 tielle for enzymaktiviteten.

(k) Virkning af poly-D-lysin på GPK afledt enzyraaktivitet.

Virkningen af poly-D-lysin på plasminogenaktivatoraktiviteten af det delvis rensede GPK-afledte enzym blev undersøgt, i det væsentlige efter Allen's metode (Thromb. Iiaemostas. (Stutt-10 gart) 47, 41-45, 1982). Reaktionsblandingen bestod af 400 μΐ 0,05M tris-HCl-puffer, pH-værdi 7,5, 25 μΐ "Tween" 80 (0,4%), 125 μΐ plasminogen (200 ug/ml), 200 y.l chromogent substrat S-2251 (3,5 raM) og 50 ;.;1 poly-D-lysin (5 :.ig/ml) eller vandkontrol. Omsætningen blev sat igang ved tilsætning af 200 ral 15 enzym, og ændringen i optisk densitet ved 405nm blev overvåget ved 37°C i 20 minutter.

Det viste sig, at der ved fravær af poly-D-lysin opnåedes en parabolfornet kurve svarende til den, der opnås med urokinase i nærværelse af poly-D-lysin under disse betingelser.

20 Når poly-D-lysin sattes til reaktionsblandingen indeholdende GPK-afledt enzym, blev opløsningen uklar, hvilket gav anledning til en kompleks ændring i optisk densitet med tiden.

Disse foreløbige resultater antyder, at poly-D-lysin samvirker med det GPK-afledte enzym på en måde, der er forskellig fra 25 urokinases.

Man vil fra den ovennævnte beskrivelse forstå, at enzymerne fremstillet ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen er nyttige til terapeutiske, profylaktiske og diagnostiske formål.

Til terapeutisk og profylaktisk brug kan enzymerne formuleres 30 til farmaceutiske midler, især et hvilket som helst middel, der er egnet til parenteral administration. Midlerne kan så-

DK 163134B

23 ledes omfatte en hvilken som helst konventionel parenteral barer, såsom steril, pyrogenfri fysiologisk saltopløsning.

Til human administration er en egnet doseringsmængde fra ca.

10 mg til ca. 80 ng pr. døgn, fortrinsvis i 2 eller 3 doser 5 ved intravenøs administration.

Til diagnostiske formål kan enzymerne være mærket radioaktivt 125 ved konventionelle mærkningsteknikker, f.eks. med I eller 111

In . Det radioaktivt mærkede enzym kan derpå indføres i et vaskulært system, der skal undersøges, og der søges efter 10 områder med øget radioaktivitet.

DK 163134B

24 i m o> a -ft u β o _ ra -i-) ” J* ·“! ift p. tø C« 0 ίυ 05 p$ m co 0 -μ 4-> >4 _ ja λ o co to to tå 6¾ o æ to -tf

P w H

P

M 0 •H -P Λ p-; "d ω ω ^ ^ o F- 'ps ζ s co to to o 'Ν'; ø jJ s β ¢24,¾ 1-1 co ca 0 02 ro w -<

-P - · -P

>0 0 •P*

.-i -ft O O Q O

'•ft I-I > o o o o <J j® -ft C 60 1-1 1-4 o J - I P +j 1-t t- rr CO to rHl E-'^'-'OlOCOOa ro h * ' '· ø ^

Λ - J

Ιβ c

Ft '•W r-l -Η CO ΙΩ r-l oa

ro ci φ o o t-H

+5 -M to CD oa & O O £ C £ p ^ ft •ft β tn β β øø ο ο oa ο- od Β λ ο » ο- οα ^ 3 Μ Ο ιΗ Ε Ο w (Ω > 0

CQ

S ο 3 Ρ -η 0 ro Ό Μ O' 0 ο ro £ jj i ro «: , -P O' i ø ro β ft f 4 -ri 0 -P- P) o » β ro ro in

O r-H > S

•pø ro i p xa β o -η o ro =,.

ό & ø s β β fi % O -ft O oj W tSl U Λ O.

<0 ja

DK 163134B

i · ' 25

Tabel 2.

Fibrinolyse ned cellelinier

Fibrinolytisk indeks. + S.D.

Celler anført som plasmiriénheder

Betegnelse Oprindelse Ovenstående Celleekstrakt væske GPK Marsvin keratocyter 643 + 101 787 4· 69 BEB Human bryst 376 + 43 I.B.

HeLa Human cervical carcinoma nul 34+8 MRC5 Human lunge fibroblaster nuj 30+8

Swiss 3T3 muse-endothel celler 17 + 4 153 + 21 RLC W Rottelever parenchymal celler 50 +13 96 + 13 PCC chimpm-elever parenchymalcell er ,nu 1 3 GLV 3 grøn abe nyre- I.B.

epithel nul SV40 3T3 Virus transformeret 3T3 celler 39 + 17 I.B.

I.B. = Ikke bestemt.

DK 163134 B

' ’ 26

Tabel 3.

Aminosyresammensstninger (udtrykt som restprocent)

Ondartet

MELANOMA

Aminosyre PLASMINOGEN

AKTIVATOR (HEPA) * GPK BEB

Cysteinsyre I..B; ** 2,1

Asp 9,8 10,9 9j8

Thr 5,4 * 5,1 4,6

Ser · 9,2 6,4 6,4

Glu 13,1 10,1 11,5

Pro 7,1 6,1 4,3

Gly 10,4 8,4' 7,1

Ala 6,6 7,8 8,3

Val 4,1 6,0 6,7

Met 0,9 ‘ 2,4 1,0 I Leu 3,0 4,8 3,5

Leu 8,1 9,7 13,9

Tyr 4,0 3,5 2,2

Phe 3,7 4,5 3,6

His 3,3 2,8 2,6 . Lys 5,5 6,5 7,1

Arg 5,9 4,8 5,1 * Data fra Rijken, C.D. og Collen D.,J.3iol. Cheo. 256, 7035-7041 (1981) = Ikke bestemt.

27 DK 163134 B

d

P

o κι A a P 0 „ V. Ή ·“

•H \ D S

8 § P S’ N > > 'pfi I Ή ε Χ·Η Ό1 \ *Η ο ε 3 ε ιη « s Η \ α \ Ο Ή Ν «β ·> a Η s * „ η to χ a t-^ η * ο Νιοοηο ο μ ø __________ ε ------- >1 Μ C ο ο _ ø . ο ο ο ο '9 ο Μ Ο 05 Ο "*· * ø ο ο η η -g Η · Μ « ο æ _ s - 0 - £ rrt tncwrt.j 5>i

^ ^ C β S n . S S Γ! Τί N

5 g 2 -H C-ηΛ c 2 ^ i r; < g g Ti g g -H s^i—' H lp

Ww§ JtfMO Λ « C -P o ø · te Q es U Or-t-rH.&>b η η η λ i; ®-pra £ +> Η A PAHPSjfl^. ^1 Øi 0 M tn· 0 0 H C|

0 —————— <0 -P P

tn · ø μ-i ·

S ^ > 0 -P

øs - ω n S' C fi ·η øs o o > Ό ©. iH i—( Ή (· Ή T* C X f, co oo æ to -4J » +3 0 gi ess^-O in in eo ^^-0^0 Ό g «< *» «,Λ. »» *»· ** tj v I.

(XJ > \ H « -tf CJN lO ^ .μ ^ +J Ό M P ri C ' · 0 • m e 0 0 c ε * -H < 0 0 0 _ -p * s c c y+j

Ti 0 * 0 0 2 ø øgjfai'^ MM -P »ø Λ -H ft .μ μ li Cl M ° øø C) ft & g μ h 0 0-

C>i 4J 4-) -P

n „ iP cn τη -PM

c Λ O O „ « t* o n -HØ

ivj E 3 CD O ·Η CO -» *- 74 _J

^ K o -tf to ton co ® ^ m © S „ t,

wO'J'W ιΗιΗ N CO in ø O 0 H

rH iH 05 > O f-r 00 tn —' TJi 0^0

UH

~--—-Η H

m 0 0

S i« tn to H H

•f; cd -c co cn co ΌΌ

C to o p too o tnoo « HH

??; HOrH <H O O OO O H - Γ3 rj ø o O O O O o O O O o - c. *' ; o

H

rji O Ό< τ)< 00 O

rr* ^ *v -* ** A t"· 05 C000 00 05

Ji i i ^ < to to t 2 p i a o· < <

i i I I

S, “ 2 H d ^ < ft O > i}Q OO 60 Η H » 5 - HK Η O η Η

JN AM <= >U AO

drH* O 3 - H-. H · HCi 1-1 H >1 <J Λ*Ι$ W 002 02 ml I I N A N ft

« n Q Q 3 C S

H *r* i · «η cj O

Claims (4)

1. Fremgangsmåde til fremstilling af et enzym med fibrino-lytisk aktivitet per se og/eller aktivitet som en plasmino-5 genaktivator, kendetegnet ved, at man dyrker celler af den etablerede epithelcellelinie betegnet GPK (CNCMI-222) eller celler af den etablerede epithelcellelinie betegnet BEB (CNCMI-221) og isolerer en enzymholdig fraktion fra kulturen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den enzymholdige fraktion opnås ved opsamling af en super-natantfraktion indeholdende enzymet.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den enzymholdige fraktion opnås ved ekstrahering af en 15 enzymholdig fraktion fra cellerne.

4. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at cellerne dyrkes på et serum-holdigt medium, at det serumholdige medium erstattes af et serumfrit medium, og at enzymet udvindes fra en supernatent- 20 fraktion omfattende det serumfri medium eller ekstraheres direkte fra cellerne. - i