SU1507204A3

SU1507204A3 - Способ получени вещества, обладающего фибринолитической активностью и/или активностью активатора плазминогена

Info

Publication number: SU1507204A3
Application number: SU833664932A
Authority: SU
Inventors: Аткинсон Энтони; Электриквала Эсгар; Брайан Гриффитс Джон; Латтер Эми; Энтони Райли Патрик; Морган Саттон Петер
Original assignee: Паблик Хелт Лаборатори Сервис Борд (Фирма); Юниверсити Колледж (Фирма)
Priority date: 1982-03-05
Filing date: 1983-11-04
Publication date: 1989-09-07
Also published as: CA1213231A; DK506683D0; EP0104194A1; AU567491B2; EP0104194B1; DK163134C; BR8306108A; NO834024L; JPS59500351A; ZA831399B; IE54593B1; AU1214688A; DE3375491D1; WO1983003101A1; NO161445C; FI76375C; DK506683A; AU1337783A; NO161445B; FI834042A0

Abstract

Изобретение относитс к области медицины , в частности, к способам получени фибринолитических энзимов. Целью изобретени вл етс повышение фармакологической чистоты целевого продукта. Дл этого при культивировании в среде MINIMUM ESSENTIAL MEDIUM EAGLE, содержащей 10% фоетальной бычьей сыворотки, 0,001% TWEEN-80 и 20 мМ буферного раствора HEPES, используют линию клеток GPK(CUCMI -222) или BEB (CUCMI- 221), культивацию провод т до концентрации 1,4^.10¹° клеток, затем среду отдел ют, клетки заливают средой, не содержащей сыворотку, и повторно культивируют. Отбирают среду, освобождают от клеток и центрифугируют в течение 30 мин при 40000 G, супернатант концентрируют, пропускают через колонку, заполненную агарозой хелата цинка и предварительно уравновешанную 0,02 M раствором трис-сол ной кислоты PH 7,5, содержащим 1М хлорида натри и 0,01% TWEEN-80. Затем элюируют белки линейным градиентом от 0 до 0,05 М имидазолом, отбирают активные фракции, ввод т их в колонку, заполненную конканавалином -А-агарозой и уравновешанную 0,01М раствором фосфата натри рН 7,5, содержащим 1М хлорида натри и 0,01% TWEEN-80. Вновь провод т элюцию линейным градиентом 0,01М раствором фосфата натри , содержащим 0,6 М альфа-Д-метилманнозида, 2М роданида кали , 0,01% TWEEN-80, вновь собирают активные фракции, к ним добавл ют роданид кали до концентрации 1,6 М. Полученный раствор диализируют через твердый полиэтиленгликоль, затем центрифугируют, супернатант пропускают через колонку, заполненную сефадексом G-150 в буферном растворе 0,01М сульфата натри рН 7, 5, содержащем 1, 6 М роданида кали и 0,01% TWEEN-80, затем целевой продукт элюируют и концентрируют диализом на полиэтиленгликоле. Полученный энзим характеризуетс молекул рной массой в восстанавливающих услови х 62000±3000, а в невосстанавливающих 56000±2000, величина изоэлектрической точки равна 4,6 ед. Способ позвол ет получить вещество, обладающее фибринолитической активностью и/или активностью активатора плазминогена с более высокой фармакологической чистотой. 2 ил., 3 табл.

Description

Изобретение относитс к медицине, в частности к способам получени фибринолитических энзимов.

Целью изобретени вл етс повышение фармакологической чистоты целевого продукта.

На фиг.1 показана фибринолитичес- ка активность, полученной после элюироваии фракции, на фиг.2 - пик активного энзима совпадает с маленьким протеиновым пиком.

Пример. При выполнении способа получени в качестве микроносител используют Цитодекс-3 (Cytodex-3) производимый фирмой Pharmacia Fine Chemicals, в концентрации 10 г/л. Аппаратура дл культуры представл ет собой ферментер типа Biocul объемом 5 л, производимый фирмой L.H. Per- mentation Std, с рабочей емкостью, равной 4,5 л,соединенной с резервуаром дл разбрызгивани , содержащим 2 л среды. Соотношение между площадь поверхности и средой бьию более чем в 4 раза выше, чем в бутылочках,установленных в роллере при использовании того же самого уровн концеи гра- цни микроносител , и клетки могли поддерживатьс жизнеспособными и активными только с помощью тщательного контрол концентрации кислорода, величины водородного показател ,концентрации питательного вещества и высоких скоростей полива, Дл куль- тивировани используют линии клеток GPK (cucmi-222) или ВЕБ (cucmi-221), которые задепонированы а Институте Пастера.

Поле дл клеток, содержащее 2,

клеток, получают в культуре, наход щейс в роллерной бутылочке, и добавл ют к культуре, содержащей Eagles (MEM) среду дл роста с добавлением 10% фоетальной бычьей сыворотки, 0,001% Tween-80 и буферного раствора HEPES. Через 72-96 ч при 37°С клетки вырастают в достаточном количестве и покрывают примерно 70% от имевил гос количества субстрата (как правило, примерно 1,4 10 клеток ). Среду сливают, клетки и носители промывают два раза средой, не содержащей сыворотку и затеи за- ливают сверху не содержащей сыворотку средой дл роста (МЕМ). Далее производ т инкубацию при 37 С в течение по меньщей мере 60 ч с тем.

чтобы обеспечить дальнейший рост клеток и секрецию энзима.

В конце периода инкубации верхний слой сливают и подёергают вращению в течение 10 мин, в количестве 450 g с тем, чтобы удалить любые клетки,присутствующие в суспензии. Верхний слой затем подвергают вращению в течение 30 мин при , при 40000 g. Аликвот- ную долю объемом 50 мл отдел ют дл анализа фибрина на пластинке, и верхний слой подвергают сущке вымораживанием и перенос т во взвещенную бутылочку и хран т в холодильнике с жидким азотом. Альтернативно верхний слой может быть подвергнут концентрированию путем ультрафильтрации.

Ко 1центрированный верхний слой культуры подвергают частичной очистке путем хроматографировани на колонке, заполненной агарозой хелата цинка (размером 4,4 12 см), предварительно уравновешенной при с помощью 0,02 М трис-НС1 рН 7,5, содержащего 1 М хлорида натри и 0,01% Tween-80. 5 л среды, подвергнутой кондициони- рова)1ию, подают на эту коло} ку, скорость подачи составл ет 120 мл/ч. После промывани колонки 2 литрами уравновещивающего буферного раствора соединенные протеины подвергают элюи- рованию с линейным градиентом от О до 0,05 М имидазола (общий объем 1 л) в уравновешивающем буферном растворе . Элюант собирают в фракции объемом 8 мл. Ультрафиолетовое поглощение дл каждой фракции определ ют при длине волны, равной 280 нм, и фибри- Нолитическую активность определ ют с помощью опыта на фибриновой пластинке . Активные фракции объедин ют и их характерную активность определ ют по методу времени лизиса фибринового тромба.

Иа следующей стадии слитые вместе фракции ввод т в колонку размером 2,2x15 см, заполненную конканавалин- -А-агарозой, урап)1овешенную с помощью 0,01 М буферного раствора фосфата натри (рН 7,5), содержащего 1 М хлорида натри и 0,01% Tween-80.Эту колонку промывают уравновешивающим буфзрным раствором со скоростью подачи , равной 10 мл/ч, до тех пор, пока ультрафиолетовое поглощение элюанта при длине волны, равной 280 нм, не стало ниже 0,15. Линейный 1 радиент. уравновешивающего буферного

раствора (200 мл) к 0,01 М буферному раствору фосфата натри (рН 7,5), содержащему О,6 М альфа-В-метилман- нозида, 2М KSCN и 0,01% Tween-80,HC- пользовалс дл элюировани абсорбированного материала. Фракции объемом 5 мл собирают с целью измерени ультрафиолетового поглощени и фиб- ринолитической активности, как В1адно на фиг.1. Активные фракции сливают вместе, и концентрацию KSCN увеличивают до 1,6 М путем добавлени твердого KSCN. Полученный таким образом раствор далее подвергают концентрированию путем диализа с помощью твердого полиэтиленгликол , имеющего мол.м. 15000-20000 дальто- нов.

Концентрированный раствор (5-8 мл) подвергают центрифугированию и гель- фильтрированию на колонке размером 2, см, заполненный Sephadex G-150 (сверхмелкий) в буферном растворе 0,01 М сульфата натри (рН 7,5), содержащем 1,6 М KSCH и 0,01% Tween-80. Фракции объемом 3 мл собирают при скорости подачи, равной . Активный энзим элюировалс в качестве единственного пика, который совпадает с маленьким протеиновым пиком (фиг.2). Фракции, содержащие активный энзим, сливают вместе, концентрируют путем диализа по отношению к полиэтиленгликолю и хран т при -80°С. Альтернативно элюант,по- лу 1енный из колонки, заполненной кон- канавалин-А-агарозой,может быть далее

подвергнут очистке с помощью афин- ной хроматографии на лизин-сефаро- зе или фибрин-сефарозе. Результаты, полученные при очистке энзима, произведенного из кера- тоцитов морскгос свинок, суммированы в табл.1.

Фибринолитическую активность эк- зимов, полученных из кератоцитов морских свииок и эпители грудной железы человека, сравнивали с ак тив- ностью paciBopa стандартной урокина- зы. Стандартна порци (бутылочка) урокиназы подвергалась растворению в 50 мМ буферном растворе диэтилбар- битурата натри , содержащем 0,1 М хлорида натри и 0,25 вес.%/объем- ным желатина (рН 7,8). Несколько растворов стандартной урокиназы и фибринолитического энзима были приготовлены в указанном буферном растворе . Все другие реагенты разбавл лись в том же самом буферном раство- ре и держались на холоде перед смешением 0,2 мл разбавленной урокиназы или растворов/энзима помещались в серию трубок, размером мм. Далее в трубки вводилось 0,05 мл человеческого плазминогена (3 мг/мл), 0,5 мл человеческого фибриногена (0,25 вес.%/объемным) и 0,05 мл тромбина (40 NIH ед/мл). Содержимое трубок подвергалось быстрому перемешиванйю и затем трубки помещались в вод ную баню, имеющую температуру 37,5 С. Сразу же производилось включение секундомера, и пром , соответствующее окончанию лизиса, фиксировалось при аккуратном переворачивании трубки. Калибровочный график был получен в логарифмических координатах как дл времени лизиса, (в минутах), так и содержани урокиназы

в тромбе. Фактор разбавлени раствора энзима, дающего то же самое врем лизиса, что и раствор стандартной урокиназы при 0,5 IU/мл был гТрин т дл расчета активности неразбавленного раствора энзима. Фибринолитическа активность энзима была таким образом варажена в международных единицах (international units).

Средн характерна активность (Фибринолитическа активпость/мг протеина) очище}1ного энзима, полученного из кератоцитов морских свинок, бьша равна примерно 12500 IU/мг. Контроль. Одна порци объемом

670 мг материала, высушенного вымораживанием , была получена в соответствии с предложенной методикой, но без присутстви в нем клеток. Этот материал дал отрицательные результаты при проведении анзлпза пластинки фибрина. Верхние слои из нескольких других линий клеток также проанализированы на Фибринолитическую активность и также дали либо отрицательиый результат, либо показали только следы фибринолитической активности.

Полученные результаты представлены в табл.2.

Молекул рна масса очищенного энзима , полученного из кератоцитов морских свинок, бьша равна примерно 56000i2000 в невосстанапливающих услови х , и примерно, 6200013000 в восстанавливающих услови х (путем добав

леии 2-мерка11Тоэтаиола) , что позвол ет сделать вывод о присутствии ди- сульфидиых мостиков в молекуле энзима . Молекул рна масса хорошо согласуетс с приблизительным молекул рной массой, равным 65000t3000,как было оценено с помощью гельфильтра- ции на колонке, заполненной Sep- hadex G-1ЗО.Изоэлектрические точки (pi) очищенных энзимов, полученных из кератоцитов морских свинок и эпи- тел человеческой грудной железы, равны 4,6 ед.

Иэ табл.3 следует, что энзимы кератоцитов морских свинок и эпител человеческо грудной железы вл ютс в основном одинаковыми по составу, но с небольшими различи ми, которые можно ожидать, поскольку это два различных вида животных (человек и морска свинка) . Как .кератоци- ты морских свинок, так и эпителий человеческой грудной железы имеют аминокислотный состав, отличающийс от аминокислотного состава, опубликованного дл НЕРА.

Способность , произведенного из кератоцита морских свинок, присоедин тьс к полному кров ному тром бу была экспериментально исследована в пробирке с помощью замкнутой циркул ционной системы типа Chandler Экспериментальны сщитый был произведен в полиэтиленовой трубке с внутренним диаметром 3 мм (которую предвари ельно промывали 0,01%- ным раствором Tween) путем смешени цитрированной цельной человеческой крови (1 мл) с 50 мл 0,02 М , и 25 мл тромбина (100NIH V/мл). После инкубировани в течение 1 ripii 37 С при вращении со скоростью 30 об/мин тромб выливалс в чашку Петри,дважды промывалс буферным раствором 0,05 М диэтилбарбитурата натри (рН 7,8), содержащим 0,25 вес.%/объемным желатина и 0,01М хлорида натри . Это тромб затем аспиратором переносилс обратно в трубку вместе с 0,9 мл аутогенной плазмы или буферного раствора . Затем добавл ли 100 мл энзима, произведенного из кератоцитов морских свинок (примерно 500 международных единиц). Циркул ционна система снова устанавливалась на вращающийс стол и подвергалась инкубации 2 ч при 37°С. Полученные тромбы затем извлекали, промынали буферным

раствором, как было указано выше, и затем экстрагировали с помощью 1 мл буферного раствора 0,05 М диэтилбарбитурата натри , характеризуемого величиной водородного показател , равной 7,8 ед рН и содержащего ЧМ KSCN в течение 1 ч при 4 С. Аликвот- ные доли экстракта и верхнего сло тромба, объемом 50 мл, из трубки далее наносились на пластинки фибрина , содержащие плазминоген, и подвергались инкубированию в течение 18 ч при .

Полученные результаты показывают, что фибринолитическа активность экстракта тромбов, а следовательно, и количество соединенного энзима были значительно выше, чем в верхнем слое тромбов. Аналогичные результаты

были получены при экспериментах, которые повторены с использованием

энзима, меченого

изотопом

In.

15 20 25

30

35

40

45

50

55

с точки зрени этих результатов энзим, меченый радиоактивным изотопом , может быть использован в диагностических цел х как эффективное средство оПокализации тромба в организме . I

Таким образом, использование стабильной линии неканперогенных клеток дл получени энзима, характеризующегос фибринолитической активностью самого по себе или как плаз- могенный активатор позвол ет получить вещество с более высокой фармакологической чистотой. Известные .способы получени подобных энзимов с аналогичной активностью либо используют канцерогенные клетки, либо нестабильные линии клеток. Использование линии канцерогенных клеток неприемлемо ввиду опасности использовани вредного материала. Пс стабильные линии клеток нельз использовать в промышленном способе из-за их ограниченного времени жиз)и.

Claims

Формула изобретени

Способ получени вещества, обладающего фибринолитпческоГ активностью и/или активностью а стиватора плазми- ногена путем культшшронани завис щей от сыворотки крови культуры клеток, отбора культуралыюй среды, ее центрифугировани с последующим хроматографическим от/имением и

очисткрй целевого продукта, о т л ич а 10 щ н и с тем, что, с целью повышени фармакологической чистоты целевого продукта, дл культивирова- ии используют линию клеток GPK (cue mi-222) или ВЕВ (cucmi-221), при этом культивацию провод т в среде Minimum Essential Medium Eagle, содержащей 10% фоетальной бычьей сыво ротки, 0,001% Tween-80 и 20 мМ буферного раствора HEPES, до концентрации клеток 1,Ах10 клеток, затем среду отдел ют, клетки заливают средой , не содержащей сыворотку, и пов- торпо культивируют, отобранную среду освобождают от клеток и центрифугируют в течение 30 мин при ДОООО g, супарнатант концентрируют, пропускают через колонку, заполненную ага- розой хелата цинка и предварительно уравновешенную 0,02 М раствором трис-сол ной кислоты рИ 7,5, содержащем 1 М хлорида натри и 0,01% Tween-80, затем элюируют белки ли-

нейным градиентом от О до 0,05 М имидазолом, отбирают активные фрак- ции, ввод т их в колонку, заполненную конканавалин-А-агарозой и уравновешенную 0,01 М раствором фосфата натри рН 7,5, содержащем 1 М хлорида натри и 0,01% Tween-80, вновь провод т элюцию линейным градиентом 0,01 М раствором фосфата натри ,содержащем 0,6 М альфа-О-метилманнози- да, 2 М роданида кали , 0,01% Tween-80, вновь собирают активные фракции, к ним добавл ют роданид кали до концентрации 1,6 М,, полученный раствор дпализнрую г через твердый полиэтиленгликоль, затем центрифугируют , супернатант пропускают через колонку, заполпрнпук сефадексом G-150 в буферном растворе 0,01 М сульфата натри рН 7,5, содержащем 1,6 М роданида кали и 0,01% 1 ееп-80, затем целевой продукт элюируют и концентрируют диализом на полиэтиленгликоле,

Таблица 1

Ф1 0ринолиз ЛИНИЯМИ клеток

Таблица 2

Таблица 3

Составы аминокислот (выраженные как количество, оставшеес в процентах)

инова

та

He определ лось

9,8

5,4

9,2 13,1

7,1 10,4

6,6

4,1

0,9 .

3,0

8,1

4,0

3,7

3,3

5,5

5,9

Продолжение табл.2

0,9 5,1 6,4

0,1 6,1 8,4 7,8 6,0 2,4 4,8 9,7 3,5 4,5 2,8 6,5 4,8

2,1 9,8 4,6 6,4 11,5 4,3

7,1 8,3 6,7 1,0 3,5 13,9 2,2 3,6 2,6 7,1 5,1

100 200 (мл)

фиг.2

(нл) фи-г