JPS62285784A - プラスミノ−ゲン活性化因子および血栓ほう壊組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、発明の詳細な説明 ［産業上の利用分野］ この発明は、新規プラスミノーゲン活性化因子およびそ
の製造法、並びに上記プラスミノーゲン活性化因子を含
む血栓ほう壊組成物に関するしのである。

［背景技術］ プラスミノーゲン活性化因子と呼ばれる酵素物質か、ひ
とまたは動物に静脈投与したときインビボで血栓ほう壊
活性を示し得ることは知られている。これらの活性は血
液成分であるプラスミノーゲンの活性化に基つ′くらの
であり、これは、血液循環系に血餅か存在する場合最終
的にフィブリン含有血餅の溶解（ほう壊）に至る一連の
反応を始動する。

活性化の総メカニズムは複准であり、使用したプラスミ
ノーゲン活性化因子のタイプにより変化する可能性かあ
る。これに関連して、２１のプラスミノーゲン活性化因
子、すなわち組織タイププラスミノーゲン活性化因子（
ｔ−Ｐ、いおよびウロキナーゼタイププラスミノーゲン
、活性化因子（ｕ−ＰＡ）を区別する必要があり、後者
のタイプはさらに分子のコンホメーノヨンに猜づいて２
本鎖形（ウロキナーゼとも称する）および１本鎖形（ｓ
ｃｕ　−ＰＡともトドする）とに分けられる。これら３
Ｆｌｉのプラスミノーゲン活性化因子の活性化機構は同
一でない。

組織タイプのプラスミノ−ケン活性化因子（１−ＰＡ）
はプラスミノーゲンを活性化し得るが、これは実質的に
フィブリン存在下に限られる。このことは、活性化か血
餅の近傍で主として生起してこれを溶かし、血管内を流
れる血液中てはプラスミノーゲンの活性化が実際上起こ
らないことを意味する。このプラスミノーゲン活性化因
子は、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因
子に対する抗血清と反応しない。

２本鎖形のｕ−ＰＡ（ウロキナーゼとして示す）はフィ
ブリンのｉ’；ＩＪＥ下および不存在下の何れにおいて
ら血液中のプラスミノーゲンに効果的な活性化をしたら
す。このことは、確かに血餅は溶解するかも知れないか
、総フィブリンほう壊血液システムの活性化ら起こり、
そのためフィブリノ−ケンのほう壊と出血傾向が起こる
可能性があることを色味する。

１本鎖形のｕ　−Ｐ　Ａ　（ｓｃｕ　−Ｐ　Ａとして示
す）はプラスミノ−ケンを効果的に活性化するが、これ
はフィブリン含有血餅の存在下に限られる。それ故、ｊ
−ＰＡの場合と同様、血流中のフィブリンほう壊システ
ムの活性化は全くまたはほとんど起こらない。但し、活
性化機構は異なり、またｓｃｕ−ＰＡは免疫学的にｔ−
ＰＡと関係しない。

３種のプラスミノ−ケン活性化因子中、ウロキナーゼは
副作用活性が不都合なことが判明しているが既に長期に
わたって医療に用いられている。

残る２Ｆｉのプラスミノーゲン活性化因子はまた臨床実
験の段階にあり、Ｌ−ＰＡの場合の方か進んでいる。

ウロキナーゼはｔキ通尿から採取されろか、そっ）中に
はｌリットル当ｆこり４０−５０μ９のウロキナーゼに
加えて１０−２０μ９／リツトルの５ＣＬＩ　−Ｐ、へ
が含まれている［スタンプ等、ツヤ−ナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミスト’）−（Ｊ　、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、）２Ｇ　ＩＱ１２６７−１２７３頁、１９８
６年コ。尿中のｓｃｕ　−Ｐ　Ａは容易にウロキナーゼ
に変換されるため、ｓｃｕ　−Ｐ　Ａの採取に尿が適当
とはいえないが、最近ある種のセルライン培養液、例え
ばセルラインＣＡＬＵ−３の培養液から安定な状態かつ
良好な収率でｓｃｕ　−Ｐ　Ａを採取てきろことが判明
した［スタンプ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー（Ｊ、　［３ｉｏ１．０ｈｅｍ、）２６
１９１２７４−１２７８頁、■９８６年］。

［発明の記載コ このようなセルラインの培養液からのｓｃｕ−ＰＡの採
取についてさらに研究を重ねたところ、分子量（Ｍｒ）
約５４０００をもつ既知ｓｃｕ−ＰＡに加えて、分子量
約３２０００でｓｃｕ　−Ｐ　Ａとほぼ同じ性質を有す
る別の生産物が場合により自然に生成することが判明し
た。

ドブノル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドケル電
気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によると、この新規生産物
は、還元条件および非還元条件の何れにおいてら分子ｆ
ｆｉ（Ｍｒ）約３２０００の１本ポリペプチド鎖のみか
らなっている。アミノ酸配列のアミン末端は Ｌｅｕ　−Ｌｙｓ　−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ　−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ｇｌｎ　−Ｌｙｓてあり、これはＬｅｕ−１４／ｌ
から始まるＭｒ＝５４０００のｓｃｕ　−Ｐ　Ａのアミ
ノ酸配列に対応する。

さらに、この生産物は、例えばフィブリン溶解血液シス
テムを活性化せずに血流中のフィブリン含有血餅を溶解
する能力のような既知ｓｃｕ　−Ｐ　Ａの性質とほとん
ど同じ性質を有する。このような事実から、この新規生
産物はｓｃｕ−ＰＡの低分子形と考えることができる。

それ故、このプラスミノーゲン活性化因子をｓｃｕ−Ｐ
Ａ−３２にとして示し、必要ならば公知のｓｃｕ　−Ｐ
　Ａをｓｃｕ−［’Ａ−５４にと表示する。

この新規生産物ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋが公知のｓｃｕ−
ＰＡ−５４にと同様に極めて有用な血栓ほう壊組成物と
して有用であることの証拠かある。さらに、分子鎖か短
いため、ｓｃｕ−ＰＡ−３２にはｓｃｕ−ＰＡ−５４に
より簡単に製造できると思われる。

その点では、遺伝子操作によりこのプラスミノーゲン活
性化因子を産生ずる能力を得たセルラインまたは微生物
が利点をらたらす可能性がある。

この発明の第１の態様は、 分子量（Ｍｒ）約３２０００でアミノ末端アミノ酸配列
が Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ
ｌｎ−Ｌｙｓである１本ポリペプチド鎖、 およびフィブリン溶解性血液システムを活性化せずに血
液中のフィブリン含有血餅の溶解を生起させる能力 を特徴とする、ｓｃｕ−ＰＡ−３２にと称するプラスミ
ノーゲン活性化因子を提供する。

さらに、この発明はｓｃｕ−ＰＡ−３２にの製造法およ
び有効成分としてｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋを含有する面栓
溶壊組成物を提供する。

ウロキナーゼは高分子形（Ｍｒ＝　５４０００）でも低
分子形（Ｍｒ＝３３０００）でも存在することに注意す
べきである。低分子形は、場合により尿中に見出され、
トリプシンまたはプラスミンの作用で１３５アミノ酸の
アミノ末端部を除去させることによる高分子形の加水分
解的変換により生成すると思われる。しかし、この低分
子形生産物は機能の而て新規ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋに類
似性をもたない。

ｓｃｕ−ＰＡ−３２にの性質については、下記の点が注
目されろ。実験室試験において、ｓｃｕ　−Ｐ　Ａ−３
２にはウロキナーゼの高活性を誘発する低分子クロモゲ
ン性基質に対して比較的不活性である。

さらに、ｓｃｕ−ＰＡ　　５４にと全く同様に、高親和
性および低代謝回転率でプラスミノーゲンを活性化する
能力を有する。ｓｃｕ−ＰＡ−３２には、プラスミンに
より、クロモゲン性基質に対して完全な活性を示し低親
和性かつ高代謝回転率でプラスミノーゲンを活性化し得
るウロキナーゼに変換されろ。ｓｃｕ−ＰＡ−３２には
フィブリン膜に対して高いフィブリン溶解活性を示す（
ウロキナーゼの国際標品に比較して。５００００１Ｕ／
ｘ９以上）。

ひと血漿中の血餅を含むシステムにｓｃｕ　−Ｐ　Ａ　
−３２ｋを加えると、周囲の血漿中のフィブリン溶解シ
ステムを活性化せＪ、また感知できろフィブリノーゲン
分解もなく、一定濃度範囲て血餅を溶解する。それにも
拘わらず、ｓｃｕ−ＦＡ−３２には特異的フィブリン親
和性を有しない。

ｓｃｕ７ＰＡ−３２には原則的に数種の方法で製造し得
る。まず最初に、ｓｃｕ　−Ｐ　Ａ産生セルラインを培
養し、ついで培養液（適合し１こ培地またはその抽出液
）を処理することによりこれを製造し得る。処理工程は
、例えば亜鉛キレート・アガロースクロマトグラフィー
、ＳＰ−セファデックスクロマトグラフィー、ゲル濾過
、不溶化モノクローナルもしくはポリクローナル抗体ク
ロマトグラフィー、またはこれらの組合わせのような数
種の方法で実施することができる。適当な条件下では、
ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋが公知生産物ｓｃｕ−ＰＡ−５４
にと共に最終生産物として得られる。

ひと肺腺がんセルラインＣＡＬＵ−３（ＡＴＣＣ−ＨＴ
Ｂ−５５）か、ｓｃｕ　−Ｐ　Ａの産生に最も適　。

したセルラインであると思われている。このセルライン
は主としてｓｃｕ−ＰＡ−５４ｋを産生ずるが、適当な
条件下ではｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋが培養液の処理工程中
にかなりの量で得られろ。ｓｃｕ　−Ｐ　Ａ　−３２に
の収率の最適化および培養液中ｓｃｕ　−Ｐ　Ａ　−５
＝ｌ　ｋのほぼ全量のｓｃｕ−ＰＡ−３２にへの変換は
、条件の最適化および／または適当なプロテアーゼの使
用により得られる。さらに、（自然にまたは遺伝子操作
後に）ひとｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋを直接生産しうるセル
ラインまたは微生物が見出されるかも翔れず、その場合
、このようなセルラインまたは微生物を培養しついで培
養液またはその抽出液を処理することにより、簡単な方
法でｓｃｕ　−Ｐ　Ａ−３２ｋを採取することができる
。実施例４〜６参照。

ｓｃｕ−ＰＡ−３２には適当な賦形剤と配合して血栓溶
解作用をもつ医薬組成物とすることができろ。

賦形剤は、当分野で用いられる任色の常用媒質であり得
る。さらに、ｔ−ＰＡのような他のプラスミノーゲン活
性化因子をｓｃｕ−ＰＡ−３２にと併用して相乗効果を
らくろむことかてきろ。静脈内注入液が最ら有効な結果
を生し易いので、組成物としてはこの形態が好ましい。

以下、実施例によりこの発明を説明するか、数種の試験
が用いられているのでまず試験法について説明する。

［試験法］ （ウロキナーゼ抗原測定法・ＥＬＩＳＡ）ポリスチレン
マイクロタイタープレートを、ウロキナーゼに対する家
兎抗血清から得た総１ｇＧで被覆し、ついで洗浄した。

その後、プレートのウェルに０．０５Ｍりん酸および０
．１ＭＮａｃｃ緩衝液で希釈した試料とつａキナーゼ標
品を適用した。この緩衝ａ（Ｐ　Ｂ　Ｓ　−トウィーン
と称する）は、ｐＨ７，４で、さらに０．０１％トウィ
ーン（Ｔｗｅｅｎ、商標）を含む。ウェルの内容物を室
温で１時間インキュベートした。ＰＢＳ−トウイーンで
洗浄後、ウェルをナカ不およびカヮオイＣジャーナル・
オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトセミストリ
ー（Ｊ　、　Ｉｌ−１ｉｓｔｏｃｈｅ、　Ｃｙｔｏｃｈ
ｅｍ、　）２２巻１０８４−１０９１頁、■９７４年］
の方法で西洋わさびベルオキンダーゼとコンジュゲート
したねずみのモノクローナル抗体（４ＤＩ−Ｅ８）とイ
ンキュベートした。このモノクローナル抗体は分子１１
５４０００のウロキナーゼと分子量３３０００のウロキ
ナーゼの雨音と反応し、したがって両形態のウロキナー
ゼの検出を可能にする。

３７℃で１時間インキュベート後、０−フェニレンジア
ミンを加え４９２ｎｍにおける吸収を測定することによ
り、結合したＩｇＧを定量した。分子３５４０００の場
合４９２ｎｍの吸収とウロキナーゼの濃度との間にｌ　
−１Ｏｎ９７ｚσの範囲で直線関係（ｒ＝０．９９）か
見られ、分子量３３０００の場合０　、６−６　ｎ９／
ｌｉＱの範囲で直線関係か見られた。

同様な試験を高分子量ウロキナーゼ抗１県のみの険山に
用いた。この試験では、モノクローナル１ＩＤｉ−Ｅ８
の代わりにモノクローナル抗体１３Ｉ３６−Ａ８を用い
たが、これは高分子量ウロキナーゼとは反応するか低分
子量ウロキナーゼとは反応しないしのである。

（フィブリン溶解活性試験） フィブリン溶解活性は、プラスミノーゲン含何うしフィ
ブリンプレートと３７℃で一夜インキュベート後測定す
るか［アストラップ等、アーカイブス・オブ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフィノックス（Ａｒｃｈ、
　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　）１０巻３４
６−３５１頁、１９５２年コまたはスタンプ等の方法［
ツヤ−ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ
　、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　）２６１＠１２６７−
１２７３頁、１９８６年］の方法にしたがってフィブリ
ン血餅溶解により測定した。

（分子遣測定） 分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により、場合によっては０．０５Ｍノ
チオエリスリトール（ＤＴＥ）でジスルフィド架橋を還
元して測定した。この方法は５ＤＳ−ＰＡＧＥと弥する
。

実施例１ （細抱培痒） この実施例では、ひと肺腺がん細胞ＣＡＬＵ−３（ＡＴ
ＣＣ保存ラインうＴＢ−５５）を用いた。

細胞を、プラスチックフラスコ中、３７℃、５％ＣＯ２
含有大気中で培養した。培地としては、４゜５９／Ｑグ
ルコースおよび２５ｍＭ　Ｉ（ＥＰＥＳを含有し４ｍＭ
グルタミン、Ｏ，１％ＮａＨＣＯ３，１ｍＭピルビン酸
ナトリウム、非必須アミノ酸および１０％うし胎千直情
を添加した改良ダルベツコ培地を用いた。さらに、ペニ
シリンとストレプトマイシンを各最終濃度としてｌ　０
０１　Ｕ／ｍＱ加えた。

７日後に全面生長となった。全面生長した単層培養物を
滅菌緩衝液で洗浄し、トリブンンとＥＤＴＡの混合物で
５分間処理し、デカント後、３７°Ｃ１５％ＣＯ７含有
大気中でインキュベートした。その後、細胞を再び改良
ダルベック培地にけんだくし、１／３の率で分割し、さ
らに全面生長になるまで培養した。

採取過程で、全品生長した単層培養物をｐＨ７。

４の滅菌緩衝液で２回洗浄した後、１ｍＭグルタミン、
０　【％ｌ’Ｊ　ａ　Ｉ−Ｉ　ＣＯ３，１％フンギシン
（［ｕｎｇｉｚｏｎｅ）、２００　［Ｕ／ｍＱペニノリ
ンおよびアプロチニンｌ　ＯＫ　［Ｕ／；ｎ（ｌを添加
したイーグル必須培地２５Ｒや８７８６とイノキュベー
トした。培養液を１−３日の間隔で採取し、４°Ｃて３
０分間遠心し、使用時まで一２０°Ｃで凍結した。

（培養液の精製） ｓｃｕ　−Ｐ　Ａを得るために、ＣＡＬＵ−３細胞の培
ＩＮをＩ）キレート・セファロース、ＳＰ−セファデッ
クスおよびセファデックスＧ−１ｏｏ上でクロマトグラ
フィーに付した。

第１工程として、培養液５０リツトルを、０゜０５ＭＮ
ａＣｌ２，０．０５ＭＮａＨ２ＰＯ−並びに０゜Ｏ１％
トウィーン８０および２０　Ｋ　Ｉ　Ｕ７１Ｑアプロチ
ニンを含むｐｌ−［７，５の緩衝液で平衡化した亜鉛キ
レート・セファロースのカラムに流速ｌ００ｒｒＱ／時
間て通した。ついて、カラムを緩衝液２リツトルで洗浄
し、０−０１モルイミダゾールの直線勾配を含む緩衝液
４リツトルで溶離した。

２０？！７！フラクノヨンを２０　Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｎＱア
ブロヂニンを含む試験管に集め、ＥＬＩＳ、Ａ（固相酵
素免疫測定法）試験によりウロキナーゼ抗原の存否につ
いて測定した。抗原含有フラクションを集め、ｐＨ６，
８に調節し、蒸留水で３倍に希釈した。

上記精製を２回行なって集めた溶離液を、０゜０５ＭＮ
ａＣＬ　０．０５Ｍりん酸塩並びに０．Ｏ１％トウイー
ンおよび２０　Ｋ　ｒ　ＩＪ／ｒｎＱアプロチニンを含
むｐＨ６，８の緩衝液で平衡化したＳＰ−セファデック
スＣ−５０のカラムに通した。カラムを緩衝液で洗浄し
、０．０５−０．５ＭＮａＣｌ２を含む緩衝液で溶離し
た。５０ＫＩＵ／ｍ（アプロチニンを含む試験管に１Ｏ
ｉＱ、フラクションを集めた。ウロキナーゼ抗原を含む
フラクションを集めて、固体ＫＳＣＮを添加後固体ポリ
エチレングリコールに対して透析し、１Ｏｙ（ｌまで濃
縮した。

濃縮した溶離液を、１．ＯＭＫＳ（、Ｊ、００１　Ｍ　
Ｎ　ａｌｌ　２　Ｐ　Ｏ４並びに００１％トウィーン８
０　ｊ；、にヒ２０　Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｘｌｌ！７プロチニ
ンを含ムｐ　［１７５の緩衝液て平衡化したセファデッ
クスＧ−１００微拉のカラムに通した。５１のフラクシ
ョンを集め、２８０ｎｍの吸収を測定することにより総
蛋白を測定した。さらに、Ｅ　Ｌ　Ｉ　Ｓ　Ａ試験によ
りウロキナーゼ抗原の存否を調へ、血餅の溶解によりフ
ィブリン溶解活性を測定しＬ０ 第３精製工毘の結果、２種の異なる生成物（ピーク■お
よびピーク■）を得たが、これらは何れらＥＬＩＳＡ試
験によるとウロキナーゼ抗原を含んでいた。収量は、そ
れぞれ当初培養液に対し７９±１１μ９および５６±２
０μ９／Ｑであった。

両生酸物を、０　、　１５　ＭＮａＣＱ、　０　、　０
１　ＭＮａＨｔ　Ｐ　Ｏ４，並びにＯＯ１％トウイーン
８０および２０　Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍＱ７プロー！−＝　ン
を含むｐｌ−１７，５の緩衝液に対して別個に透析して
ＫＳＣＮを除き、その後−２０°Ｃで凍結条件下に保存
した。

５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、非還元条件および還元条
件の何れにおいてらピークＩの物質は分子ｆｆ１５４０
００の単−帯として泳動した。ピークＨの物質は還元条
件および非還元条件の何れにおいてら分子量約３２００
０をもつ実質的に均一な帯として泳動した。それ故、こ
の生産物は低分子量１本鎖ＰＡまたはｓｃｕ−ＰＡ−３
２にである。

実施例２ （生産物の同定） ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋ（実施例１でピーク■として得た
もの）を分析した結果、アミノ末端アミノ酸配列として
Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｘ−Ｘ−Ｇｌｙ　−Ｇ　
ＬＸ（Ｘ　＝観測されず）を有すると思われた。これは
、基１４．１で始まる分子量５４０００のｓｃｕ　−Ｐ
Ａのアミノ酸配列Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃ
ｙｓ　−Ｇ　ｌｙ　−Ｇ　Ｉｎ　−Ｌ　ｙｓに対応する
。すなわち、ポリペプチド鎖はアミノ酸単位１４３と１
４４の間て開裂したと思われろ。

さらに、ｓｃｕ−ＰＡ−３２にの特性はｓｃｕ　−Ｐ　
Ａ−５４にの特性に極めて類似する。ピークｌとピーク
■の生成物はフィブリンプレート上でそれぞれ３５００
０と７１０００１０／ｍ９の比活性を有するが、クロモ
ゲン性基質Ｓ−２２４４に対してそれぞれ５０００およ
び１００ＯＯＩＬＩ／乃の活性をらつにすぎない。両生
成物と乙、プラスミノーゲンを高親和性（それぞれＫｍ
＝０．８μＭおよび０．９μＭ）および低代謝回転率（
それぞれｋｃａｔ＝０．００９および０．ＱＯＺ８ｓ−
’）で活性化する。両生成物とし、プラスミンによりウ
ロキナーゼ（２本鎖ＰＡ）に変換され、この場合のｋｍ
値はそれぞれ５および！２μＭであり、ｋｃａｔ値はそ
れぞれ０．２３および０．３１ｓ−’である。ｓｃｕ−
ＰＡ−５４におよびｓｃｕ−ＰＡ−３２にとも、ｔｍ漿
中のフィブリノーゲンのほう壊なしにひと血漿に沈猜し
た１２５■標識フイブリン血餅を溶解しｆこ。この溶解
能力は、血漿中で４８時間予備インキュベーションした
後でも存在し−た。さらに、血餅の溶解はフィブリノに
対するｓｃｕ−ＰＡ−５４ｋまたは５Ｃｕ−ＰＡ−３２
にの直接結合を伴わなかった。

家兎に静脈投与すると、ｓｃｕ−ＰＡ−５４におよびｓ
ｃｕ−ＰＡ−３２には、循環血流中のフィブリノーゲン
の破壊を伴なわずに頚静脈中の標識血餅をインビボでか
なり溶解した。試験した動物モデルは文献既知のもので
ある。

実施例３ （ウロキナーゼとの比較） ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試験では、ピークＨの生産物は少なく
とら非還元条件下でひとの尿から得た分子ｆｉ３３００
０のウロキナーゼと一緒に泳動するように思えろ。しか
し、０．０５Ｍジチオエリスリトールでジスルフィド橋
を還元すると、分子量３３０００のウロキナーゼは分子
量３００００のＢ鎖と分子ｆｌｔ３０００の視認できな
いＡｗｌに開裂するのに対し、ピークＵの生産物は不変
の分子量３２０００を示す。

ｓｃｕ−ＰＡ−３２にのアミノ酸配列はポリペプチド鎖
の単位１４４から始まるようだが、分子量３３０００の
ウロキナーゼのアミノ酸配列はポリペプチド鎖の単位＋
３６から始まる。

ピーク■の物質と異なって、分子ｆｆ１３３　Ｑ　Ｑ　
Ｑのウロキナーゼと分子量５４０００のウロキナーゼは
低親和性（高に＋ｎ）および高代謝回転率（高ｋｃａＬ
）てプラスミノーゲンを活性化する。さらに、分子量３
３０００のウロキナーゼは低分子屯括質に対して高い活
性をらら、インヒドロおよびインビボにおける血餅の溶
解効果は周辺および循環血漿中のフィブリノーゲン破壊
を伴う。

実施例４ この実施例は、遺伝子操作によりｓｃｕ　−Ｐ　Ａ　−
３２にの直接生産能を獲得したセルラインについて述べ
る。遺伝子操作の主要工程、すなわちｓｃｕ−ＰＡ−３
２ｋをコードするｃＤＮＡの構成およびその発現ベクト
ルの構成を第１図に示す。

図において、使用した制限酵素（Ｈｉｎｄ　　ＩＩＩ、
ＥｃｏＲ［および５ｓｔｌ）はそれぞれｔ−ｔ、Ｃおよ
びＳで示し、開始コドンおよび停止コドンは上線を付し
ている。アミノ酸ｃｔｙ−’およびＬｅｕ１４′のコド
ンは下線を付し、コードするアミノ酸により示す。

黒ぬり部はＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサー領
域を、斜線部はβ−グロビン遺伝子３°−配列を、白ぬ
き部はｓｃｕ　−Ｐ　ＡｃＤ　Ｎ　Ａを、直線は細菌配
列を示す。

遺伝子操作に数種の物質を用いるが、これらは下記文献
の記載による。

λ９ｔｌｌ：フイン等、λ＠ｔｌｏアンドλ９ｔｌｌＤ
ＮＡクローニング・テクニックスニア・プラクティカル
・アプローチ（λ９ｔ　ｌ　Ｏａｎｄλ９ｔｚＤＮＡ　
　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：　Ａ　　Ｐ
ｒａｃｔｉｃａｌ　　Ａｐｐｒｏａｃｈ）　Ｉ　ｎ　Ｃ
ブレス、オフスフオート、１９８４年。

Ｍ１３ｍｐ１９およびｐＵｃ１８：ヤニッンユ１１ペン
等、ノーン（Ｇｅｎｅ）３３巻＋０３−１１９頁、１９
８５年。

ｐＳＶ３２８Ａ’　　コドン・ヘラベル等、ジャーナル
・才ブ・フエネチル・ピロロノー（Ｊ、Ｇｅｎ。

Ｖｉｒｏｌ、　）６７巻２２１５−２２２２頁、１９８
６年。

Ｄ　ＩＩ　Ｆ　Ｒ欠乏ＣＩ−１０細胞　ウルラウブ等、
プロン−ディンゲス・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニーニスエイ（ＰｒｏｓＮａｔ
ｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　）７
７巻４２１［３−４２２０頁、１９８０年。

遺伝子操作の各工程を説明すると次の通りである。

ａ）ＣＡＬＵ−３細胞の総ＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）プ
ライムｃＤＮＡを作り、λ９ｔｌｌにクローンした。数
種のクローンが得られた。３つの重量したｃＤＮＡクロ
ーンをスプライスしてｓｃｕ　−Ｐ　Ａ全長をコードす
る連続ｃＤＮＡ配列を作った。このｃＤＮＡはＨｉｎｄ
［ｌｌ制限部位を備え、これをｐＵｃＩ８にクローンし
た。得られたクローンをｐＵＬｓｃｕ−ＰＡと呼ぶ。

ｂ）　５°−非翻訳ＤＮＡの８８塩居対を含むｌ１ｉｎ
ｄ［［−ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼフラグメン
ト（図に下線を付した、Ｓ　ｅｔ’　−Ｇ　ｌｕ１″３
のアミノ酸コドンが続く）をｐＵＬｓｃｕ−ＰＡから単
離し、Ｍ１３ｍｐ＋９にサブクローンした。得られたＤ
ＮＡ中間体をＭ１３ｉｎｔｌと呼ぶ。

Ｃ）中間体Ｍ１３ｉｎｔｌを欠失変異形成に付し、切形
Ｑｒｕｎｃａｔｅｄ）　Ｄ　Ｎ　Ａ配列を有する中間体
ｊｖｌ　ｌ　３１ｎｔ２を得た。これは、ｓｃｕ　−Ｐ
　Ａ配列のＡｓｐ−’−ｃ＋ｙ−’およびＬｅｕ１４’
　−Ｇ　Ｉｎ”’アミノ酸コドンに相捕的な合成オリゴ
ヌクレオチド ５°−ＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＣＣＴＴＴＧＧＡＧ
ＴＣ−３’を用いて行なった。ｓｃｕ　−Ｐ　Ａの総配
列はホルメス等、バイオケミストリー（Ｂｉｏｃｈｍ、
　）３巻９２３−９２９頁、１９８５年に開示されてい
る。

ｄ）　！−１１ｎｄｌＩｌ　−ＥｃｏＲＩ制限フラグメ
ント（破線）はＭ１３ｉｎし２から単離し、ｐＵＬｓｃ
ｕ−ＰＡ中の野生形Ｄ　Ｎ　Ａと置換しｆ二。これは、
上記フラグメントを５ｓｔ−［部分ＥｃｏＲＩフラグメ
ントとｐＵＬｓｃｕ　−Ｐ　ＡからのＩｔ　１ｎｄｌｌ
ｌ−９ｓｔ　Ｉベクターフラグメント（破線）中に結合
した。得られたプラスミドをｐｓｃｕ−ＰＡ−３２にと
呼ぶ。

ｅ）　ｓｃｕ　−Ｐ　Ａ　−，３２ｋコード配列を完全
に含む、ｐｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋから得たＨｉｎｄ［ｌ
Ｉ制限フラグメントを、ｐｓｃｕ−ＰＡ　−３２ｋから
単離し、真核細胞発現ベクターｐＳＶ３２８Ａ”のｌ１
ｉｎｄｌｌｌ制限部位に挿入し、ベクターＰＳＶｓｃｕ
−１”Ａ−３２ｋを得た。

ｆ）ＤＨＦＲ−欠乏チャイニーズハムスター卵巣細胞に
ｌ　ＯμｇｐＳＶｓｃｕ−ＰＡ−３２におよび１μ９ｐ
ＳＶ５ＤｔｌＦＲをりん酸カルンウム共沈法を用いて形
質導入した。Ｄ　ｔｌ　Ｆｆｌ　　細胞の進択は、グリ
シン、チミジンおよびヒボキサンヂン欠乏・８％透析う
し胎子血清添加ハムＦ−１２培地中で行った。単離しり
Ｄ　ＨＰ　Ｒ細胞は、ｎη記ＥＬＩＳＡ試験によりウロ
キナーゼ抗原の分泌存否を監視した。最高量の抗原産生
を示ず１セルラインを蛋白の大量生産に用いた。

実施例５ この実施例は、実施例１１で得たセルラインからの組換
えｓｃｕ−ＰＡ−３２に製造を示す。

（細胞培養） 細胞は、回転びんに入れた、１０％うし胎子血清および
２５ｍＭ！−ＩＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７，３）添加Ｎ　
Ｅ　Ｍα培地（ギブコ／ＳＲＬ、ゴーント、ベルギー）
３００１１（２中で培養した。全面生長になったとき、
培地をｌＯμ９ＩＲＱインシュリン、５μ９／ｌｌ１（
ｌトランスフェリン、ＩＸ非必須アミノ酸、■００Ｕ／
ＲＱペニシリン／ストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グル
タミン酸、５ｍＭＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐｔｌ　７　、　
３　）、１ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび７５μｇ／
ｘＱグリシンおよび２０　Ｋ　Ｉ　Ｕ／ｍＱアプロチニ
ン添加オプニチメム（ギブコ／ＢＲＬ）からなる血清欠
乏培地で置きかえた。２日間インキュベート後、調整培
地を３−７ｉ回採取した。

（調整培地の精製） 形質導入ＣＨＯ細胞の調整培地を、亜鉛キレート・セフ
ァロースクロマトグラフィーおよび不溶化モノクローナ
ル抗体ＭＡ−４ＤＩＥ８免疫吸着により精製してｓｃｕ
−ＰＡ−３２ｋを得た。

調整培地１３リツトルを、Ｔ　Ｎ　Ｔ　Ａ緩衝液で平衡
化した亜鉛キレート・セファロースカラムに４６Ｃ１流
速２００Ｒ１２／時間で通した。カラムを平衡に用いた
緩衝液て洗浄し、５０ｍＭイミダゾールを含む緩衝液で
溶離した。フラクション中におけろウロキナーゼ抗原の
存否はＥＬ［ＳＡ試験て測定した。抗原含ａフラクソヨ
ンを集積した。

第１精製工程で集めたフラクション（約１３０Ｆ（２）
を４°Ｃでモノクローナル抗体ＭＡ−４ＤＩＥ８の免疫
吸着カラムに流速１０ｍＱ／時間で通した。

カラムをＴＮＴＡ緩衝液で洗浄し、同緩衝液中２ＭＫＳ
ＣＮで溶離した。ウロキナーゼ抗原含仔フラクンヨンを
集積し、ＴＮＴＡ緩衝液に対して透析し、小さなベンズ
アミノン・セファロースカラム（ゲル２ｍＱ）に通し、
セントリコン３０マイクロコンセントレータ−上で洗浄
してアプロチニンを除いた。生成物は１．Ｌ！９／＆の
収量、８０％回収率で得られた。この生成物を、組換え
ｓｃｕ　−ＰＡ−３２ｋまたはｒｓｃｕ−ＰＡ−３２に
と呼ぶ。

実施例６ （ｒｓｃｕ−ＰＡ　−３２にの特性） 実施例５の生成物を種々の試験に供した。５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥで分析すると、生成物は、還元条件下および非還元
条件下の何れにおいても、Ｍ　ｒ　＝３２０００の主バ
ンドとして泳動した。さらに、別１：Ｍｒ＝３３０００
−３５０００４７）３個の弱いバンドか認められた。ア
ミノ末端のアミノ酸配列は１本鎖配列Ｌｅｕ−・・・・
であり、このことは、ＣＤＮＡの翻訳生成物が正確に処
理されたこと、およびＳ　Ｄ　Ｓ　−Ｐ　Ａ　Ｇ　Ｅに
おいてＭｒが数種存在するのはおそらく炭水化物の不均
質性によるものであることを示している。生成物ｒｓｃ
ｕ−ＰＡ−３２には、５−２４４４（＋　２０１０／ｚ
９）のようなりロモゲン性基質に対する極めて低い活性
、フィブリンプレート上におけるプラスミノーゲン依存
フィブリン溶解活性（比活性１７００００１Ｕ／ｘ９）
およびフィブリンに対する特異結合の欠如を示した。

また、氷晶は比較的高い親和性（Ｋｍ＝２．９μＭ）お
よび極めて低い代謝回転率定数（Ｋ２＝０．０００２ｓ
”’）で直接ミバエリス・メンテン機構にしたかってプ
ラスミノーゲンを活性化する。この生産物はＫｍ＝＋１
．３μＭおよびＫ　２＝　０　、６２　ｓ−’でミバエ
リス・メンテン機構にしたがってプラスミンにより活性
な２本鎖ウロキナーゼ（ｒｔｃｕ　−ＰＡ−３２ｋ）に
変換される。得られろｒｔｃｕ　−Ｐ　Ａ　−３２には
Ｋｍ＝８３μＭおよびｋｚ＝　４　、　０　ｓ”でプラ
スミノーゲンを活性化する。

ｒｓｃｕ−ＰＡ−３２におよびｒｔｃｕ−ＰＡ−３２に
の両者とらひと血漿中に浸漬した＋２５１標識フイブリ
ン血餅に対して同様な用量依存溶解を示すが、２本鎖形
に較べて１本鎖形の方がフィブリノ−ケン破壊が少ない
。

ｒｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋ（高効率で発現）の機能的性質
は実施例３で述へた天然形対応物と氏めて類似している
ことが結論される。

【図面の簡単な説明】

第１図は、遺伝子操作の主要工程すなわちｓｃｕ−ＰＡ
−３２ｋをコードするｃＤＮＡの構成およびその発現ベ
クトルの構成を示す工程図である。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. （１）分子量（Ｍｒ）約３２０００でアミノ末端アミノ
   酸配列が Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇ
   ｌｎ−Ｌｙｓである１本ペプチド鎖、 およびフィブリン溶解性血液システムを活性化せずに血
   液中のフィブリン含有血餅の溶解を生起させる能力 によって特徴づけられた、ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋとして
   示されるプラスミノーゲン活性化因子。
2. （２）高親和性および低代謝回転率でプラスミノーゲン
   を活性化する能力により特徴づけられたものである、特
   許請求の範囲第１項記載のプラスミノーゲン活性化因子
   。
3. （３）プラスミノーゲン活性化因子産生能力を有するセ
   ルラインの培養液または抽出物からプラスミノーゲン活
   性化因子ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋを採取することを特徴と
   する、プラスミノーゲン活性化因子の製造法。
4. （４）ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋを、亜鉛キレート・アガロ
   ースクロマトグラフィー、ＳＰ−セファデックスクロマ
   トグラフィー、ゲル濾過、不溶化モノクローナルもしく
   はポリクローナル抗体クロマトグラフィーまたはそれら
   の組合わせにより、培養液または抽出物から採取する、
   特許請求の範囲第３項記載の方法。
5. （５）ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋを、（自然にまたは遺伝子
   操作の結果として）ｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋ直接産生能力
   を有するセルラインまたは微生物の培養液または抽出物
   から採取する、特許請求の範囲第３または４項記載の方
   法。
6. （６）有効成分として、特許請求の範囲第１または２項
   記載のプラスミノーゲン活性化因子ｓｃｕ−ＰＡ−３２
   ｋを含有することを特徴とする、血栓ほう壊活性を示す
   医薬組成物。
7. （７）有効成分として他のプラスミノーゲン活性化因子
   をｓｃｕ−ＰＡ−３２ｋと組合わせて含む、特許請求の
   範囲第６項記載の医薬組成物。
8. （８）プラスミノーゲン活性化因子ｓｃｕ−ＰＡ−３２
   ｋを適当な賦形剤と配合することを特徴とする、血栓ほ
   う壊活性を示す医薬組成物の製造法。
9. （９）プラスミノーゲン活性化因子ｓｃｕ−ＰＡ−３２
   ｋと他のプラスミノーゲン活性化因子を適当な賦形剤ま
   たはその組合わせ中で配合することを特徴とする、特許
   請求の範囲第７項記載の医薬組成物の製造法。