JPS62285784A - プラスミノ−ゲン活性化因子および血栓ほう壊組成物 - Google Patents
プラスミノ−ゲン活性化因子および血栓ほう壊組成物Info
- Publication number
- JPS62285784A JPS62285784A JP62119978A JP11997887A JPS62285784A JP S62285784 A JPS62285784 A JP S62285784A JP 62119978 A JP62119978 A JP 62119978A JP 11997887 A JP11997887 A JP 11997887A JP S62285784 A JPS62285784 A JP S62285784A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- scu
- plasminogen activator
- plasminogen
- urokinase
- molecular weight
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 230000002537 thrombolytic effect Effects 0.000 title claims abstract description 7
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 title claims description 14
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 title claims description 14
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 title claims description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title abstract description 8
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 title abstract description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 claims abstract description 23
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 claims abstract description 23
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 claims abstract description 23
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 claims abstract description 16
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 claims abstract description 16
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 16
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 claims abstract description 16
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims abstract description 9
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 7
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 6
- 230000007306 turnover Effects 0.000 claims description 6
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000012190 activator Substances 0.000 claims description 5
- 239000013522 chelant Substances 0.000 claims description 5
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 5
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 239000011701 zinc Substances 0.000 claims description 5
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 claims description 4
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000010266 Sephadex chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 claims description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 claims 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 abstract description 8
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 abstract description 6
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 38
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 38
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 22
- 239000000047 product Substances 0.000 description 22
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 19
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 11
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 11
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 6
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 6
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 6
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 5
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 5
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 5
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 5
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 5
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 5
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 5
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 4
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 4
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 4
- LIPDUIOSIFXENT-UHFFFAOYSA-N 1,3,5-triazido-2,4,6-trinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=C(N=[N+]=[N-])C([N+]([O-])=O)=C(N=[N+]=[N-])C([N+]([O-])=O)=C1N=[N+]=[N-] LIPDUIOSIFXENT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- 208000010507 Adenocarcinoma of Lung Diseases 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000012411 cloning technique Methods 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000005249 lung adenocarcinoma Diseases 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004264 monolayer culture Methods 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000010998 test method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000011330 Armoracia rusticana Nutrition 0.000 description 1
- 240000003291 Armoracia rusticana Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100083507 Caenorhabditis elegans acl-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 206010062713 Haemorrhagic diathesis Diseases 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N Leu-Lys Chemical group CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN OTXBNHIUIHNGAO-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 208000003251 Pruritus Diseases 0.000 description 1
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 239000012503 blood component Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N flutamide Chemical compound CC(C)C(=O)NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C(C(F)(F)F)=C1 MKXKFYHWDHIYRV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004731 jugular vein Anatomy 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000027939 micturition Effects 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 230000033885 plasminogen activation Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6462—Plasminogen activators u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21073—Serine endopeptidases (3.4.21) u-Plasminogen activator (3.4.21.73), i.e. urokinase
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
3、発明の詳細な説明
[産業上の利用分野]
この発明は、新規プラスミノーゲン活性化因子およびそ
の製造法、並びに上記プラスミノーゲン活性化因子を含
む血栓ほう壊組成物に関するしのである。
の製造法、並びに上記プラスミノーゲン活性化因子を含
む血栓ほう壊組成物に関するしのである。
[背景技術]
プラスミノーゲン活性化因子と呼ばれる酵素物質か、ひ
とまたは動物に静脈投与したときインビボで血栓ほう壊
活性を示し得ることは知られている。これらの活性は血
液成分であるプラスミノーゲンの活性化に基つ′くらの
であり、これは、血液循環系に血餅か存在する場合最終
的にフィブリン含有血餅の溶解(ほう壊)に至る一連の
反応を始動する。
とまたは動物に静脈投与したときインビボで血栓ほう壊
活性を示し得ることは知られている。これらの活性は血
液成分であるプラスミノーゲンの活性化に基つ′くらの
であり、これは、血液循環系に血餅か存在する場合最終
的にフィブリン含有血餅の溶解(ほう壊)に至る一連の
反応を始動する。
活性化の総メカニズムは複准であり、使用したプラスミ
ノーゲン活性化因子のタイプにより変化する可能性かあ
る。これに関連して、21のプラスミノーゲン活性化因
子、すなわち組織タイププラスミノーゲン活性化因子(
t−P、いおよびウロキナーゼタイププラスミノーゲン
、活性化因子(u−PA)を区別する必要があり、後者
のタイプはさらに分子のコンホメーノヨンに猜づいて2
本鎖形(ウロキナーゼとも称する)および1本鎖形(s
cu −PAともトドする)とに分けられる。これら3
Fliのプラスミノーゲン活性化因子の活性化機構は同
一でない。
ノーゲン活性化因子のタイプにより変化する可能性かあ
る。これに関連して、21のプラスミノーゲン活性化因
子、すなわち組織タイププラスミノーゲン活性化因子(
t−P、いおよびウロキナーゼタイププラスミノーゲン
、活性化因子(u−PA)を区別する必要があり、後者
のタイプはさらに分子のコンホメーノヨンに猜づいて2
本鎖形(ウロキナーゼとも称する)および1本鎖形(s
cu −PAともトドする)とに分けられる。これら3
Fliのプラスミノーゲン活性化因子の活性化機構は同
一でない。
組織タイプのプラスミノ−ケン活性化因子(1−PA)
はプラスミノーゲンを活性化し得るが、これは実質的に
フィブリン存在下に限られる。このことは、活性化か血
餅の近傍で主として生起してこれを溶かし、血管内を流
れる血液中てはプラスミノーゲンの活性化が実際上起こ
らないことを意味する。このプラスミノーゲン活性化因
子は、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因
子に対する抗血清と反応しない。
はプラスミノーゲンを活性化し得るが、これは実質的に
フィブリン存在下に限られる。このことは、活性化か血
餅の近傍で主として生起してこれを溶かし、血管内を流
れる血液中てはプラスミノーゲンの活性化が実際上起こ
らないことを意味する。このプラスミノーゲン活性化因
子は、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン活性化因
子に対する抗血清と反応しない。
2本鎖形のu−PA(ウロキナーゼとして示す)はフィ
ブリンのi’;IJE下および不存在下の何れにおいて
ら血液中のプラスミノーゲンに効果的な活性化をしたら
す。このことは、確かに血餅は溶解するかも知れないか
、総フィブリンほう壊血液システムの活性化ら起こり、
そのためフィブリノ−ケンのほう壊と出血傾向が起こる
可能性があることを色味する。
ブリンのi’;IJE下および不存在下の何れにおいて
ら血液中のプラスミノーゲンに効果的な活性化をしたら
す。このことは、確かに血餅は溶解するかも知れないか
、総フィブリンほう壊血液システムの活性化ら起こり、
そのためフィブリノ−ケンのほう壊と出血傾向が起こる
可能性があることを色味する。
1本鎖形のu −P A (scu −P Aとして示
す)はプラスミノ−ケンを効果的に活性化するが、これ
はフィブリン含有血餅の存在下に限られる。それ故、j
−PAの場合と同様、血流中のフィブリンほう壊システ
ムの活性化は全くまたはほとんど起こらない。但し、活
性化機構は異なり、またscu−PAは免疫学的にt−
PAと関係しない。
す)はプラスミノ−ケンを効果的に活性化するが、これ
はフィブリン含有血餅の存在下に限られる。それ故、j
−PAの場合と同様、血流中のフィブリンほう壊システ
ムの活性化は全くまたはほとんど起こらない。但し、活
性化機構は異なり、またscu−PAは免疫学的にt−
PAと関係しない。
3種のプラスミノ−ケン活性化因子中、ウロキナーゼは
副作用活性が不都合なことが判明しているが既に長期に
わたって医療に用いられている。
副作用活性が不都合なことが判明しているが既に長期に
わたって医療に用いられている。
残る2Fiのプラスミノーゲン活性化因子はまた臨床実
験の段階にあり、L−PAの場合の方か進んでいる。
験の段階にあり、L−PAの場合の方か進んでいる。
ウロキナーゼはtキ通尿から採取されろか、そっ)中に
はlリットル当fこり40−50μ9のウロキナーゼに
加えて10−20μ9/リツトルの5CLI −P、へ
が含まれている[スタンプ等、ツヤ−ナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミスト’)−(J 、 Biol。
はlリットル当fこり40−50μ9のウロキナーゼに
加えて10−20μ9/リツトルの5CLI −P、へ
が含まれている[スタンプ等、ツヤ−ナル・オブ・バイ
オロジカル・ケミスト’)−(J 、 Biol。
Chem、)2G IQ1267−1273頁、198
6年コ。尿中のscu −P Aは容易にウロキナーゼ
に変換されるため、scu −P Aの採取に尿が適当
とはいえないが、最近ある種のセルライン培養液、例え
ばセルラインCALU−3の培養液から安定な状態かつ
良好な収率でscu −P Aを採取てきろことが判明
した[スタンプ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー(J、 [3io1.0hem、)26
191274−1278頁、■986年]。
6年コ。尿中のscu −P Aは容易にウロキナーゼ
に変換されるため、scu −P Aの採取に尿が適当
とはいえないが、最近ある種のセルライン培養液、例え
ばセルラインCALU−3の培養液から安定な状態かつ
良好な収率でscu −P Aを採取てきろことが判明
した[スタンプ等、ジャーナル・オブ・バイオロジカル
・ケミストリー(J、 [3io1.0hem、)26
191274−1278頁、■986年]。
[発明の記載コ
このようなセルラインの培養液からのscu−PAの採
取についてさらに研究を重ねたところ、分子量(Mr)
約54000をもつ既知scu−PAに加えて、分子量
約32000でscu −P Aとほぼ同じ性質を有す
る別の生産物が場合により自然に生成することが判明し
た。
取についてさらに研究を重ねたところ、分子量(Mr)
約54000をもつ既知scu−PAに加えて、分子量
約32000でscu −P Aとほぼ同じ性質を有す
る別の生産物が場合により自然に生成することが判明し
た。
ドブノル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルアミドケル電
気泳動(SDS−PAGE)によると、この新規生産物
は、還元条件および非還元条件の何れにおいてら分子f
fi(Mr)約32000の1本ポリペプチド鎖のみか
らなっている。アミノ酸配列のアミン末端は Leu −Lys −Phe−Gln −Cys−Gl
y−Gln −Lysてあり、これはLeu−14/l
から始まるMr=54000のscu −P Aのアミ
ノ酸配列に対応する。
気泳動(SDS−PAGE)によると、この新規生産物
は、還元条件および非還元条件の何れにおいてら分子f
fi(Mr)約32000の1本ポリペプチド鎖のみか
らなっている。アミノ酸配列のアミン末端は Leu −Lys −Phe−Gln −Cys−Gl
y−Gln −Lysてあり、これはLeu−14/l
から始まるMr=54000のscu −P Aのアミ
ノ酸配列に対応する。
さらに、この生産物は、例えばフィブリン溶解血液シス
テムを活性化せずに血流中のフィブリン含有血餅を溶解
する能力のような既知scu −P Aの性質とほとん
ど同じ性質を有する。このような事実から、この新規生
産物はscu−PAの低分子形と考えることができる。
テムを活性化せずに血流中のフィブリン含有血餅を溶解
する能力のような既知scu −P Aの性質とほとん
ど同じ性質を有する。このような事実から、この新規生
産物はscu−PAの低分子形と考えることができる。
それ故、このプラスミノーゲン活性化因子をscu−P
A−32にとして示し、必要ならば公知のscu −P
Aをscu−[’A−54にと表示する。
A−32にとして示し、必要ならば公知のscu −P
Aをscu−[’A−54にと表示する。
この新規生産物scu−PA−32kが公知のscu−
PA−54にと同様に極めて有用な血栓ほう壊組成物と
して有用であることの証拠かある。さらに、分子鎖か短
いため、scu−PA−32にはscu−PA−54に
より簡単に製造できると思われる。
PA−54にと同様に極めて有用な血栓ほう壊組成物と
して有用であることの証拠かある。さらに、分子鎖か短
いため、scu−PA−32にはscu−PA−54に
より簡単に製造できると思われる。
その点では、遺伝子操作によりこのプラスミノーゲン活
性化因子を産生ずる能力を得たセルラインまたは微生物
が利点をらたらす可能性がある。
性化因子を産生ずる能力を得たセルラインまたは微生物
が利点をらたらす可能性がある。
この発明の第1の態様は、
分子量(Mr)約32000でアミノ末端アミノ酸配列
が Leu−Lys−Phe−Gln−Cys−Gly−G
ln−Lysである1本ポリペプチド鎖、 およびフィブリン溶解性血液システムを活性化せずに血
液中のフィブリン含有血餅の溶解を生起させる能力 を特徴とする、scu−PA−32にと称するプラスミ
ノーゲン活性化因子を提供する。
が Leu−Lys−Phe−Gln−Cys−Gly−G
ln−Lysである1本ポリペプチド鎖、 およびフィブリン溶解性血液システムを活性化せずに血
液中のフィブリン含有血餅の溶解を生起させる能力 を特徴とする、scu−PA−32にと称するプラスミ
ノーゲン活性化因子を提供する。
さらに、この発明はscu−PA−32にの製造法およ
び有効成分としてscu−PA−32kを含有する面栓
溶壊組成物を提供する。
び有効成分としてscu−PA−32kを含有する面栓
溶壊組成物を提供する。
ウロキナーゼは高分子形(Mr= 54000)でも低
分子形(Mr=33000)でも存在することに注意す
べきである。低分子形は、場合により尿中に見出され、
トリプシンまたはプラスミンの作用で135アミノ酸の
アミノ末端部を除去させることによる高分子形の加水分
解的変換により生成すると思われる。しかし、この低分
子形生産物は機能の而て新規scu−PA−32kに類
似性をもたない。
分子形(Mr=33000)でも存在することに注意す
べきである。低分子形は、場合により尿中に見出され、
トリプシンまたはプラスミンの作用で135アミノ酸の
アミノ末端部を除去させることによる高分子形の加水分
解的変換により生成すると思われる。しかし、この低分
子形生産物は機能の而て新規scu−PA−32kに類
似性をもたない。
scu−PA−32にの性質については、下記の点が注
目されろ。実験室試験において、scu −P A−3
2にはウロキナーゼの高活性を誘発する低分子クロモゲ
ン性基質に対して比較的不活性である。
目されろ。実験室試験において、scu −P A−3
2にはウロキナーゼの高活性を誘発する低分子クロモゲ
ン性基質に対して比較的不活性である。
さらに、scu−PA 54にと全く同様に、高親和
性および低代謝回転率でプラスミノーゲンを活性化する
能力を有する。scu−PA−32には、プラスミンに
より、クロモゲン性基質に対して完全な活性を示し低親
和性かつ高代謝回転率でプラスミノーゲンを活性化し得
るウロキナーゼに変換されろ。scu−PA−32には
フィブリン膜に対して高いフィブリン溶解活性を示す(
ウロキナーゼの国際標品に比較して。500001U/
x9以上)。
性および低代謝回転率でプラスミノーゲンを活性化する
能力を有する。scu−PA−32には、プラスミンに
より、クロモゲン性基質に対して完全な活性を示し低親
和性かつ高代謝回転率でプラスミノーゲンを活性化し得
るウロキナーゼに変換されろ。scu−PA−32には
フィブリン膜に対して高いフィブリン溶解活性を示す(
ウロキナーゼの国際標品に比較して。500001U/
x9以上)。
ひと血漿中の血餅を含むシステムにscu −P A
−32kを加えると、周囲の血漿中のフィブリン溶解シ
ステムを活性化せJ、また感知できろフィブリノーゲン
分解もなく、一定濃度範囲て血餅を溶解する。それにも
拘わらず、scu−FA−32には特異的フィブリン親
和性を有しない。
−32kを加えると、周囲の血漿中のフィブリン溶解シ
ステムを活性化せJ、また感知できろフィブリノーゲン
分解もなく、一定濃度範囲て血餅を溶解する。それにも
拘わらず、scu−FA−32には特異的フィブリン親
和性を有しない。
scu7PA−32には原則的に数種の方法で製造し得
る。まず最初に、scu −P A産生セルラインを培
養し、ついで培養液(適合し1こ培地またはその抽出液
)を処理することによりこれを製造し得る。処理工程は
、例えば亜鉛キレート・アガロースクロマトグラフィー
、SP−セファデックスクロマトグラフィー、ゲル濾過
、不溶化モノクローナルもしくはポリクローナル抗体ク
ロマトグラフィー、またはこれらの組合わせのような数
種の方法で実施することができる。適当な条件下では、
scu−PA−32kが公知生産物scu−PA−54
にと共に最終生産物として得られる。
る。まず最初に、scu −P A産生セルラインを培
養し、ついで培養液(適合し1こ培地またはその抽出液
)を処理することによりこれを製造し得る。処理工程は
、例えば亜鉛キレート・アガロースクロマトグラフィー
、SP−セファデックスクロマトグラフィー、ゲル濾過
、不溶化モノクローナルもしくはポリクローナル抗体ク
ロマトグラフィー、またはこれらの組合わせのような数
種の方法で実施することができる。適当な条件下では、
scu−PA−32kが公知生産物scu−PA−54
にと共に最終生産物として得られる。
ひと肺腺がんセルラインCALU−3(ATCC−HT
B−55)か、scu −P Aの産生に最も適 。
B−55)か、scu −P Aの産生に最も適 。
したセルラインであると思われている。このセルライン
は主としてscu−PA−54kを産生ずるが、適当な
条件下ではscu−PA−32kが培養液の処理工程中
にかなりの量で得られろ。scu −P A −32に
の収率の最適化および培養液中scu −P A −5
=l kのほぼ全量のscu−PA−32にへの変換は
、条件の最適化および/または適当なプロテアーゼの使
用により得られる。さらに、(自然にまたは遺伝子操作
後に)ひとscu−PA−32kを直接生産しうるセル
ラインまたは微生物が見出されるかも翔れず、その場合
、このようなセルラインまたは微生物を培養しついで培
養液またはその抽出液を処理することにより、簡単な方
法でscu −P A−32kを採取することができる
。実施例4〜6参照。
は主としてscu−PA−54kを産生ずるが、適当な
条件下ではscu−PA−32kが培養液の処理工程中
にかなりの量で得られろ。scu −P A −32に
の収率の最適化および培養液中scu −P A −5
=l kのほぼ全量のscu−PA−32にへの変換は
、条件の最適化および/または適当なプロテアーゼの使
用により得られる。さらに、(自然にまたは遺伝子操作
後に)ひとscu−PA−32kを直接生産しうるセル
ラインまたは微生物が見出されるかも翔れず、その場合
、このようなセルラインまたは微生物を培養しついで培
養液またはその抽出液を処理することにより、簡単な方
法でscu −P A−32kを採取することができる
。実施例4〜6参照。
scu−PA−32には適当な賦形剤と配合して血栓溶
解作用をもつ医薬組成物とすることができろ。
解作用をもつ医薬組成物とすることができろ。
賦形剤は、当分野で用いられる任色の常用媒質であり得
る。さらに、t−PAのような他のプラスミノーゲン活
性化因子をscu−PA−32にと併用して相乗効果を
らくろむことかてきろ。静脈内注入液が最ら有効な結果
を生し易いので、組成物としてはこの形態が好ましい。
る。さらに、t−PAのような他のプラスミノーゲン活
性化因子をscu−PA−32にと併用して相乗効果を
らくろむことかてきろ。静脈内注入液が最ら有効な結果
を生し易いので、組成物としてはこの形態が好ましい。
以下、実施例によりこの発明を説明するか、数種の試験
が用いられているのでまず試験法について説明する。
が用いられているのでまず試験法について説明する。
[試験法]
(ウロキナーゼ抗原測定法・ELISA)ポリスチレン
マイクロタイタープレートを、ウロキナーゼに対する家
兎抗血清から得た総1gGで被覆し、ついで洗浄した。
マイクロタイタープレートを、ウロキナーゼに対する家
兎抗血清から得た総1gGで被覆し、ついで洗浄した。
その後、プレートのウェルに0.05Mりん酸および0
.1MNacc緩衝液で希釈した試料とつaキナーゼ標
品を適用した。この緩衝a(P B S −トウィーン
と称する)は、pH7,4で、さらに0.01%トウィ
ーン(Tween、商標)を含む。ウェルの内容物を室
温で1時間インキュベートした。PBS−トウイーンで
洗浄後、ウェルをナカ不およびカヮオイCジャーナル・
オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトセミストリ
ー(J 、 Il−1istoche、 Cytoch
em、 )22巻1084−1091頁、■974年]
の方法で西洋わさびベルオキンダーゼとコンジュゲート
したねずみのモノクローナル抗体(4DI−E8)とイ
ンキュベートした。このモノクローナル抗体は分子11
54000のウロキナーゼと分子量33000のウロキ
ナーゼの雨音と反応し、したがって両形態のウロキナー
ゼの検出を可能にする。
.1MNacc緩衝液で希釈した試料とつaキナーゼ標
品を適用した。この緩衝a(P B S −トウィーン
と称する)は、pH7,4で、さらに0.01%トウィ
ーン(Tween、商標)を含む。ウェルの内容物を室
温で1時間インキュベートした。PBS−トウイーンで
洗浄後、ウェルをナカ不およびカヮオイCジャーナル・
オブ・ヒストケミストリー・アンド・サイトセミストリ
ー(J 、 Il−1istoche、 Cytoch
em、 )22巻1084−1091頁、■974年]
の方法で西洋わさびベルオキンダーゼとコンジュゲート
したねずみのモノクローナル抗体(4DI−E8)とイ
ンキュベートした。このモノクローナル抗体は分子11
54000のウロキナーゼと分子量33000のウロキ
ナーゼの雨音と反応し、したがって両形態のウロキナー
ゼの検出を可能にする。
37℃で1時間インキュベート後、0−フェニレンジア
ミンを加え492nmにおける吸収を測定することによ
り、結合したIgGを定量した。分子354000の場
合492nmの吸収とウロキナーゼの濃度との間にl
−1On97zσの範囲で直線関係(r=0.99)か
見られ、分子量33000の場合0 、6−6 n9/
liQの範囲で直線関係か見られた。
ミンを加え492nmにおける吸収を測定することによ
り、結合したIgGを定量した。分子354000の場
合492nmの吸収とウロキナーゼの濃度との間にl
−1On97zσの範囲で直線関係(r=0.99)か
見られ、分子量33000の場合0 、6−6 n9/
liQの範囲で直線関係か見られた。
同様な試験を高分子量ウロキナーゼ抗1県のみの険山に
用いた。この試験では、モノクローナル1IDi−E8
の代わりにモノクローナル抗体13I36−A8を用い
たが、これは高分子量ウロキナーゼとは反応するか低分
子量ウロキナーゼとは反応しないしのである。
用いた。この試験では、モノクローナル1IDi−E8
の代わりにモノクローナル抗体13I36−A8を用い
たが、これは高分子量ウロキナーゼとは反応するか低分
子量ウロキナーゼとは反応しないしのである。
(フィブリン溶解活性試験)
フィブリン溶解活性は、プラスミノーゲン含何うしフィ
ブリンプレートと37℃で一夜インキュベート後測定す
るか[アストラップ等、アーカイブス・オブ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフィノックス(Arch、
Biochem、 Biophys、 )10巻34
6−351頁、1952年コまたはスタンプ等の方法[
ツヤ−ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J
、 Biol、 Chem、 )261@1267−
1273頁、1986年]の方法にしたがってフィブリ
ン血餅溶解により測定した。
ブリンプレートと37℃で一夜インキュベート後測定す
るか[アストラップ等、アーカイブス・オブ・バイオケ
ミストリー・アンド・バイオフィノックス(Arch、
Biochem、 Biophys、 )10巻34
6−351頁、1952年コまたはスタンプ等の方法[
ツヤ−ナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(J
、 Biol、 Chem、 )261@1267−
1273頁、1986年]の方法にしたがってフィブリ
ン血餅溶解により測定した。
(分子遣測定)
分子量は、ドデシル硫酸ナトリウム含有ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動により、場合によっては0.05Mノ
チオエリスリトール(DTE)でジスルフィド架橋を還
元して測定した。この方法は5DS−PAGEと弥する
。
ミドゲル電気泳動により、場合によっては0.05Mノ
チオエリスリトール(DTE)でジスルフィド架橋を還
元して測定した。この方法は5DS−PAGEと弥する
。
実施例1
(細抱培痒)
この実施例では、ひと肺腺がん細胞CALU−3(AT
CC保存ラインうTB−55)を用いた。
CC保存ラインうTB−55)を用いた。
細胞を、プラスチックフラスコ中、37℃、5%CO2
含有大気中で培養した。培地としては、4゜59/Qグ
ルコースおよび25mM I(EPESを含有し4mM
グルタミン、O,1%NaHCO3,1mMピルビン酸
ナトリウム、非必須アミノ酸および10%うし胎千直情
を添加した改良ダルベツコ培地を用いた。さらに、ペニ
シリンとストレプトマイシンを各最終濃度としてl 0
01 U/mQ加えた。
含有大気中で培養した。培地としては、4゜59/Qグ
ルコースおよび25mM I(EPESを含有し4mM
グルタミン、O,1%NaHCO3,1mMピルビン酸
ナトリウム、非必須アミノ酸および10%うし胎千直情
を添加した改良ダルベツコ培地を用いた。さらに、ペニ
シリンとストレプトマイシンを各最終濃度としてl 0
01 U/mQ加えた。
7日後に全面生長となった。全面生長した単層培養物を
滅菌緩衝液で洗浄し、トリブンンとEDTAの混合物で
5分間処理し、デカント後、37°C15%CO7含有
大気中でインキュベートした。その後、細胞を再び改良
ダルベック培地にけんだくし、1/3の率で分割し、さ
らに全面生長になるまで培養した。
滅菌緩衝液で洗浄し、トリブンンとEDTAの混合物で
5分間処理し、デカント後、37°C15%CO7含有
大気中でインキュベートした。その後、細胞を再び改良
ダルベック培地にけんだくし、1/3の率で分割し、さ
らに全面生長になるまで培養した。
採取過程で、全品生長した単層培養物をpH7。
4の滅菌緩衝液で2回洗浄した後、1mMグルタミン、
0 【%l’J a I−I CO3,1%フンギシン
([ungizone)、200 [U/mQペニノリ
ンおよびアプロチニンl OK [U/;n(lを添加
したイーグル必須培地25Rや8786とイノキュベー
トした。培養液を1−3日の間隔で採取し、4°Cて3
0分間遠心し、使用時まで一20°Cで凍結した。
0 【%l’J a I−I CO3,1%フンギシン
([ungizone)、200 [U/mQペニノリ
ンおよびアプロチニンl OK [U/;n(lを添加
したイーグル必須培地25Rや8786とイノキュベー
トした。培養液を1−3日の間隔で採取し、4°Cて3
0分間遠心し、使用時まで一20°Cで凍結した。
(培養液の精製)
scu −P Aを得るために、CALU−3細胞の培
INをI)キレート・セファロース、SP−セファデッ
クスおよびセファデックスG−1oo上でクロマトグラ
フィーに付した。
INをI)キレート・セファロース、SP−セファデッ
クスおよびセファデックスG−1oo上でクロマトグラ
フィーに付した。
第1工程として、培養液50リツトルを、0゜05MN
aCl2,0.05MNaH2PO−並びに0゜O1%
トウィーン80および20 K I U71Qアプロチ
ニンを含むpl−[7,5の緩衝液で平衡化した亜鉛キ
レート・セファロースのカラムに流速l00rrQ/時
間て通した。ついて、カラムを緩衝液2リツトルで洗浄
し、0−01モルイミダゾールの直線勾配を含む緩衝液
4リツトルで溶離した。
aCl2,0.05MNaH2PO−並びに0゜O1%
トウィーン80および20 K I U71Qアプロチ
ニンを含むpl−[7,5の緩衝液で平衡化した亜鉛キ
レート・セファロースのカラムに流速l00rrQ/時
間て通した。ついて、カラムを緩衝液2リツトルで洗浄
し、0−01モルイミダゾールの直線勾配を含む緩衝液
4リツトルで溶離した。
20?!7!フラクノヨンを20 K I U/nQア
ブロヂニンを含む試験管に集め、ELIS、A(固相酵
素免疫測定法)試験によりウロキナーゼ抗原の存否につ
いて測定した。抗原含有フラクションを集め、pH6,
8に調節し、蒸留水で3倍に希釈した。
ブロヂニンを含む試験管に集め、ELIS、A(固相酵
素免疫測定法)試験によりウロキナーゼ抗原の存否につ
いて測定した。抗原含有フラクションを集め、pH6,
8に調節し、蒸留水で3倍に希釈した。
上記精製を2回行なって集めた溶離液を、0゜05MN
aCL 0.05Mりん酸塩並びに0.O1%トウイー
ンおよび20 K r IJ/rnQアプロチニンを含
むpH6,8の緩衝液で平衡化したSP−セファデック
スC−50のカラムに通した。カラムを緩衝液で洗浄し
、0.05−0.5MNaCl2を含む緩衝液で溶離し
た。50KIU/m(アプロチニンを含む試験管に1O
iQ、フラクションを集めた。ウロキナーゼ抗原を含む
フラクションを集めて、固体KSCNを添加後固体ポリ
エチレングリコールに対して透析し、1Oy(lまで濃
縮した。
aCL 0.05Mりん酸塩並びに0.O1%トウイー
ンおよび20 K r IJ/rnQアプロチニンを含
むpH6,8の緩衝液で平衡化したSP−セファデック
スC−50のカラムに通した。カラムを緩衝液で洗浄し
、0.05−0.5MNaCl2を含む緩衝液で溶離し
た。50KIU/m(アプロチニンを含む試験管に1O
iQ、フラクションを集めた。ウロキナーゼ抗原を含む
フラクションを集めて、固体KSCNを添加後固体ポリ
エチレングリコールに対して透析し、1Oy(lまで濃
縮した。
濃縮した溶離液を、1.OMKS(、J、001 M
N all 2 P O4並びに001%トウィーン8
0 j;、にヒ20 K I U/xll!7プロチニ
ンを含ムp [175の緩衝液て平衡化したセファデッ
クスG−100微拉のカラムに通した。51のフラクシ
ョンを集め、280nmの吸収を測定することにより総
蛋白を測定した。さらに、E L I S A試験によ
りウロキナーゼ抗原の存否を調へ、血餅の溶解によりフ
ィブリン溶解活性を測定しL0 第3精製工毘の結果、2種の異なる生成物(ピーク■お
よびピーク■)を得たが、これらは何れらELISA試
験によるとウロキナーゼ抗原を含んでいた。収量は、そ
れぞれ当初培養液に対し79±11μ9および56±2
0μ9/Qであった。
N all 2 P O4並びに001%トウィーン8
0 j;、にヒ20 K I U/xll!7プロチニ
ンを含ムp [175の緩衝液て平衡化したセファデッ
クスG−100微拉のカラムに通した。51のフラクシ
ョンを集め、280nmの吸収を測定することにより総
蛋白を測定した。さらに、E L I S A試験によ
りウロキナーゼ抗原の存否を調へ、血餅の溶解によりフ
ィブリン溶解活性を測定しL0 第3精製工毘の結果、2種の異なる生成物(ピーク■お
よびピーク■)を得たが、これらは何れらELISA試
験によるとウロキナーゼ抗原を含んでいた。収量は、そ
れぞれ当初培養液に対し79±11μ9および56±2
0μ9/Qであった。
両生酸物を、0 、 15 MNaCQ、 0 、 0
1 MNaHt P O4,並びにOO1%トウイーン
80および20 K I U/mQ7プロー!−= ン
を含むpl−17,5の緩衝液に対して別個に透析して
KSCNを除き、その後−20°Cで凍結条件下に保存
した。
1 MNaHt P O4,並びにOO1%トウイーン
80および20 K I U/mQ7プロー!−= ン
を含むpl−17,5の緩衝液に対して別個に透析して
KSCNを除き、その後−20°Cで凍結条件下に保存
した。
5DS−PAGE分析の結果、非還元条件および還元条
件の何れにおいてらピークIの物質は分子ff1540
00の単−帯として泳動した。ピークHの物質は還元条
件および非還元条件の何れにおいてら分子量約3200
0をもつ実質的に均一な帯として泳動した。それ故、こ
の生産物は低分子量1本鎖PAまたはscu−PA−3
2にである。
件の何れにおいてらピークIの物質は分子ff1540
00の単−帯として泳動した。ピークHの物質は還元条
件および非還元条件の何れにおいてら分子量約3200
0をもつ実質的に均一な帯として泳動した。それ故、こ
の生産物は低分子量1本鎖PAまたはscu−PA−3
2にである。
実施例2
(生産物の同定)
scu−PA−32k(実施例1でピーク■として得た
もの)を分析した結果、アミノ末端アミノ酸配列として
Leu−Lys−Phe−Glx−X−Gly −G
LX(X =観測されず)を有すると思われた。これは
、基14.1で始まる分子量54000のscu −P
Aのアミノ酸配列Leu−Lys−Phe−Gln−C
ys −G ly −G In −L ysに対応する
。すなわち、ポリペプチド鎖はアミノ酸単位143と1
44の間て開裂したと思われろ。
もの)を分析した結果、アミノ末端アミノ酸配列として
Leu−Lys−Phe−Glx−X−Gly −G
LX(X =観測されず)を有すると思われた。これは
、基14.1で始まる分子量54000のscu −P
Aのアミノ酸配列Leu−Lys−Phe−Gln−C
ys −G ly −G In −L ysに対応する
。すなわち、ポリペプチド鎖はアミノ酸単位143と1
44の間て開裂したと思われろ。
さらに、scu−PA−32にの特性はscu −P
A−54にの特性に極めて類似する。ピークlとピーク
■の生成物はフィブリンプレート上でそれぞれ3500
0と7100010/m9の比活性を有するが、クロモ
ゲン性基質S−2244に対してそれぞれ5000およ
び100OOILI/乃の活性をらつにすぎない。両生
成物と乙、プラスミノーゲンを高親和性(それぞれKm
=0.8μMおよび0.9μM)および低代謝回転率(
それぞれkcat=0.009および0.QOZ8s−
’)で活性化する。両生成物とし、プラスミンによりウ
ロキナーゼ(2本鎖PA)に変換され、この場合のkm
値はそれぞれ5および!2μMであり、kcat値はそ
れぞれ0.23および0.31s−’である。scu−
PA−54におよびscu−PA−32にとも、tm漿
中のフィブリノーゲンのほう壊なしにひと血漿に沈猜し
た125■標識フイブリン血餅を溶解しfこ。この溶解
能力は、血漿中で48時間予備インキュベーションした
後でも存在し−た。さらに、血餅の溶解はフィブリノに
対するscu−PA−54kまたは5Cu−PA−32
にの直接結合を伴わなかった。
A−54にの特性に極めて類似する。ピークlとピーク
■の生成物はフィブリンプレート上でそれぞれ3500
0と7100010/m9の比活性を有するが、クロモ
ゲン性基質S−2244に対してそれぞれ5000およ
び100OOILI/乃の活性をらつにすぎない。両生
成物と乙、プラスミノーゲンを高親和性(それぞれKm
=0.8μMおよび0.9μM)および低代謝回転率(
それぞれkcat=0.009および0.QOZ8s−
’)で活性化する。両生成物とし、プラスミンによりウ
ロキナーゼ(2本鎖PA)に変換され、この場合のkm
値はそれぞれ5および!2μMであり、kcat値はそ
れぞれ0.23および0.31s−’である。scu−
PA−54におよびscu−PA−32にとも、tm漿
中のフィブリノーゲンのほう壊なしにひと血漿に沈猜し
た125■標識フイブリン血餅を溶解しfこ。この溶解
能力は、血漿中で48時間予備インキュベーションした
後でも存在し−た。さらに、血餅の溶解はフィブリノに
対するscu−PA−54kまたは5Cu−PA−32
にの直接結合を伴わなかった。
家兎に静脈投与すると、scu−PA−54におよびs
cu−PA−32には、循環血流中のフィブリノーゲン
の破壊を伴なわずに頚静脈中の標識血餅をインビボでか
なり溶解した。試験した動物モデルは文献既知のもので
ある。
cu−PA−32には、循環血流中のフィブリノーゲン
の破壊を伴なわずに頚静脈中の標識血餅をインビボでか
なり溶解した。試験した動物モデルは文献既知のもので
ある。
実施例3
(ウロキナーゼとの比較)
SDS−PAGE試験では、ピークHの生産物は少なく
とら非還元条件下でひとの尿から得た分子fi3300
0のウロキナーゼと一緒に泳動するように思えろ。しか
し、0.05Mジチオエリスリトールでジスルフィド橋
を還元すると、分子量33000のウロキナーゼは分子
量30000のB鎖と分子flt3000の視認できな
いAwlに開裂するのに対し、ピークUの生産物は不変
の分子量32000を示す。
とら非還元条件下でひとの尿から得た分子fi3300
0のウロキナーゼと一緒に泳動するように思えろ。しか
し、0.05Mジチオエリスリトールでジスルフィド橋
を還元すると、分子量33000のウロキナーゼは分子
量30000のB鎖と分子flt3000の視認できな
いAwlに開裂するのに対し、ピークUの生産物は不変
の分子量32000を示す。
scu−PA−32にのアミノ酸配列はポリペプチド鎖
の単位144から始まるようだが、分子量33000の
ウロキナーゼのアミノ酸配列はポリペプチド鎖の単位+
36から始まる。
の単位144から始まるようだが、分子量33000の
ウロキナーゼのアミノ酸配列はポリペプチド鎖の単位+
36から始まる。
ピーク■の物質と異なって、分子ff133 Q Q
Qのウロキナーゼと分子量54000のウロキナーゼは
低親和性(高に+n)および高代謝回転率(高kcaL
)てプラスミノーゲンを活性化する。さらに、分子量3
3000のウロキナーゼは低分子屯括質に対して高い活
性をらら、インヒドロおよびインビボにおける血餅の溶
解効果は周辺および循環血漿中のフィブリノーゲン破壊
を伴う。
Qのウロキナーゼと分子量54000のウロキナーゼは
低親和性(高に+n)および高代謝回転率(高kcaL
)てプラスミノーゲンを活性化する。さらに、分子量3
3000のウロキナーゼは低分子屯括質に対して高い活
性をらら、インヒドロおよびインビボにおける血餅の溶
解効果は周辺および循環血漿中のフィブリノーゲン破壊
を伴う。
実施例4
この実施例は、遺伝子操作によりscu −P A −
32にの直接生産能を獲得したセルラインについて述べ
る。遺伝子操作の主要工程、すなわちscu−PA−3
2kをコードするcDNAの構成およびその発現ベクト
ルの構成を第1図に示す。
32にの直接生産能を獲得したセルラインについて述べ
る。遺伝子操作の主要工程、すなわちscu−PA−3
2kをコードするcDNAの構成およびその発現ベクト
ルの構成を第1図に示す。
図において、使用した制限酵素(Hind III、
EcoR[および5stl)はそれぞれt−t、Cおよ
びSで示し、開始コドンおよび停止コドンは上線を付し
ている。アミノ酸cty−’およびLeu14′のコド
ンは下線を付し、コードするアミノ酸により示す。
EcoR[および5stl)はそれぞれt−t、Cおよ
びSで示し、開始コドンおよび停止コドンは上線を付し
ている。アミノ酸cty−’およびLeu14′のコド
ンは下線を付し、コードするアミノ酸により示す。
黒ぬり部はSV40初期プロモーター/エンハンサー領
域を、斜線部はβ−グロビン遺伝子3°−配列を、白ぬ
き部はscu −P AcD N Aを、直線は細菌配
列を示す。
域を、斜線部はβ−グロビン遺伝子3°−配列を、白ぬ
き部はscu −P AcD N Aを、直線は細菌配
列を示す。
遺伝子操作に数種の物質を用いるが、これらは下記文献
の記載による。
の記載による。
λ9tll:フイン等、λ@tloアンドλ9tllD
NAクローニング・テクニックスニア・プラクティカル
・アプローチ(λ9t l Oandλ9tzDNA
Cloning Techniques: A P
ractical Approach) I n C
ブレス、オフスフオート、1984年。
NAクローニング・テクニックスニア・プラクティカル
・アプローチ(λ9t l Oandλ9tzDNA
Cloning Techniques: A P
ractical Approach) I n C
ブレス、オフスフオート、1984年。
M13mp19およびpUc18:ヤニッンユ11ペン
等、ノーン(Gene)33巻+03−119頁、19
85年。
等、ノーン(Gene)33巻+03−119頁、19
85年。
pSV328A’ コドン・ヘラベル等、ジャーナル
・才ブ・フエネチル・ピロロノー(J、Gen。
・才ブ・フエネチル・ピロロノー(J、Gen。
Virol、 )67巻2215−2222頁、198
6年。
6年。
D II F R欠乏CI−10細胞 ウルラウブ等、
プロン−ディンゲス・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニーニスエイ(ProsNat
l、 Acad、 Sci、 U、 S、 A、 )7
7巻421[3−4220頁、1980年。
プロン−ディンゲス・才ブ・ザ・ナショナル・アカデミ
−・オブ・サイエンス・ニーニスエイ(ProsNat
l、 Acad、 Sci、 U、 S、 A、 )7
7巻421[3−4220頁、1980年。
遺伝子操作の各工程を説明すると次の通りである。
a)CALU−3細胞の総RNAからオリゴ(dT)プ
ライムcDNAを作り、λ9tllにクローンした。数
種のクローンが得られた。3つの重量したcDNAクロ
ーンをスプライスしてscu −P A全長をコードす
る連続cDNA配列を作った。このcDNAはHind
[ll制限部位を備え、これをpUcI8にクローンし
た。得られたクローンをpULscu−PAと呼ぶ。
ライムcDNAを作り、λ9tllにクローンした。数
種のクローンが得られた。3つの重量したcDNAクロ
ーンをスプライスしてscu −P A全長をコードす
る連続cDNA配列を作った。このcDNAはHind
[ll制限部位を備え、これをpUcI8にクローンし
た。得られたクローンをpULscu−PAと呼ぶ。
b) 5°−非翻訳DNAの88塩居対を含むl1in
d[[−EcoRI制限エンドヌクレアーゼフラグメン
ト(図に下線を付した、S et’ −G lu1″3
のアミノ酸コドンが続く)をpULscu−PAから単
離し、M13mp+9にサブクローンした。得られたD
NA中間体をM13intlと呼ぶ。
d[[−EcoRI制限エンドヌクレアーゼフラグメン
ト(図に下線を付した、S et’ −G lu1″3
のアミノ酸コドンが続く)をpULscu−PAから単
離し、M13mp+9にサブクローンした。得られたD
NA中間体をM13intlと呼ぶ。
C)中間体M13intlを欠失変異形成に付し、切形
Qruncated) D N A配列を有する中間体
jvl l 31nt2を得た。これは、scu −P
A配列のAsp−’−c+y−’およびLeu14’
−G In”’アミノ酸コドンに相捕的な合成オリゴ
ヌクレオチド 5°−CTGAAATTTTAAGCCTTTGGAG
TC−3’を用いて行なった。scu −P Aの総配
列はホルメス等、バイオケミストリー(Biochm、
)3巻923−929頁、1985年に開示されてい
る。
Qruncated) D N A配列を有する中間体
jvl l 31nt2を得た。これは、scu −P
A配列のAsp−’−c+y−’およびLeu14’
−G In”’アミノ酸コドンに相捕的な合成オリゴ
ヌクレオチド 5°−CTGAAATTTTAAGCCTTTGGAG
TC−3’を用いて行なった。scu −P Aの総配
列はホルメス等、バイオケミストリー(Biochm、
)3巻923−929頁、1985年に開示されてい
る。
d) !−11ndlIl −EcoRI制限フラグメ
ント(破線)はM13inし2から単離し、pULsc
u−PA中の野生形D N Aと置換しf二。これは、
上記フラグメントを5st−[部分EcoRIフラグメ
ントとpULscu −P AからのIt 1ndll
l−9st Iベクターフラグメント(破線)中に結合
した。得られたプラスミドをpscu−PA−32にと
呼ぶ。
ント(破線)はM13inし2から単離し、pULsc
u−PA中の野生形D N Aと置換しf二。これは、
上記フラグメントを5st−[部分EcoRIフラグメ
ントとpULscu −P AからのIt 1ndll
l−9st Iベクターフラグメント(破線)中に結合
した。得られたプラスミドをpscu−PA−32にと
呼ぶ。
e) scu −P A −,32kコード配列を完全
に含む、pscu−PA−32kから得たHind[l
I制限フラグメントを、pscu−PA −32kから
単離し、真核細胞発現ベクターpSV328A”のl1
indlll制限部位に挿入し、ベクターPSVscu
−1”A−32kを得た。
に含む、pscu−PA−32kから得たHind[l
I制限フラグメントを、pscu−PA −32kから
単離し、真核細胞発現ベクターpSV328A”のl1
indlll制限部位に挿入し、ベクターPSVscu
−1”A−32kを得た。
f)DHFR−欠乏チャイニーズハムスター卵巣細胞に
l OμgpSVscu−PA−32におよび1μ9p
SV5DtlFRをりん酸カルンウム共沈法を用いて形
質導入した。D tl Ffl 細胞の進択は、グリ
シン、チミジンおよびヒボキサンヂン欠乏・8%透析う
し胎子血清添加ハムF−12培地中で行った。単離しり
D HP R細胞は、nη記ELISA試験によりウロ
キナーゼ抗原の分泌存否を監視した。最高量の抗原産生
を示ず1セルラインを蛋白の大量生産に用いた。
l OμgpSVscu−PA−32におよび1μ9p
SV5DtlFRをりん酸カルンウム共沈法を用いて形
質導入した。D tl Ffl 細胞の進択は、グリ
シン、チミジンおよびヒボキサンヂン欠乏・8%透析う
し胎子血清添加ハムF−12培地中で行った。単離しり
D HP R細胞は、nη記ELISA試験によりウロ
キナーゼ抗原の分泌存否を監視した。最高量の抗原産生
を示ず1セルラインを蛋白の大量生産に用いた。
実施例5
この実施例は、実施例11で得たセルラインからの組換
えscu−PA−32に製造を示す。
えscu−PA−32に製造を示す。
(細胞培養)
細胞は、回転びんに入れた、10%うし胎子血清および
25mM!−IEPES緩衝液(pH7,3)添加N
E Mα培地(ギブコ/SRL、ゴーント、ベルギー)
30011(2中で培養した。全面生長になったとき、
培地をlOμ9IRQインシュリン、5μ9/ll1(
lトランスフェリン、IX非必須アミノ酸、■00U/
RQペニシリン/ストレプトマイシン、2mML−グル
タミン酸、5mMHEPES緩衝液(ptl 7 、
3 )、1mMピルビン酸ナトリウムおよび75μg/
xQグリシンおよび20 K I U/mQアプロチニ
ン添加オプニチメム(ギブコ/BRL)からなる血清欠
乏培地で置きかえた。2日間インキュベート後、調整培
地を3−7i回採取した。
25mM!−IEPES緩衝液(pH7,3)添加N
E Mα培地(ギブコ/SRL、ゴーント、ベルギー)
30011(2中で培養した。全面生長になったとき、
培地をlOμ9IRQインシュリン、5μ9/ll1(
lトランスフェリン、IX非必須アミノ酸、■00U/
RQペニシリン/ストレプトマイシン、2mML−グル
タミン酸、5mMHEPES緩衝液(ptl 7 、
3 )、1mMピルビン酸ナトリウムおよび75μg/
xQグリシンおよび20 K I U/mQアプロチニ
ン添加オプニチメム(ギブコ/BRL)からなる血清欠
乏培地で置きかえた。2日間インキュベート後、調整培
地を3−7i回採取した。
(調整培地の精製)
形質導入CHO細胞の調整培地を、亜鉛キレート・セフ
ァロースクロマトグラフィーおよび不溶化モノクローナ
ル抗体MA−4DIE8免疫吸着により精製してscu
−PA−32kを得た。
ァロースクロマトグラフィーおよび不溶化モノクローナ
ル抗体MA−4DIE8免疫吸着により精製してscu
−PA−32kを得た。
調整培地13リツトルを、T N T A緩衝液で平衡
化した亜鉛キレート・セファロースカラムに46C1流
速200R12/時間で通した。カラムを平衡に用いた
緩衝液て洗浄し、50mMイミダゾールを含む緩衝液で
溶離した。フラクション中におけろウロキナーゼ抗原の
存否はEL[SA試験て測定した。抗原含aフラクソヨ
ンを集積した。
化した亜鉛キレート・セファロースカラムに46C1流
速200R12/時間で通した。カラムを平衡に用いた
緩衝液て洗浄し、50mMイミダゾールを含む緩衝液で
溶離した。フラクション中におけろウロキナーゼ抗原の
存否はEL[SA試験て測定した。抗原含aフラクソヨ
ンを集積した。
第1精製工程で集めたフラクション(約130F(2)
を4°Cでモノクローナル抗体MA−4DIE8の免疫
吸着カラムに流速10mQ/時間で通した。
を4°Cでモノクローナル抗体MA−4DIE8の免疫
吸着カラムに流速10mQ/時間で通した。
カラムをTNTA緩衝液で洗浄し、同緩衝液中2MKS
CNで溶離した。ウロキナーゼ抗原含仔フラクンヨンを
集積し、TNTA緩衝液に対して透析し、小さなベンズ
アミノン・セファロースカラム(ゲル2mQ)に通し、
セントリコン30マイクロコンセントレータ−上で洗浄
してアプロチニンを除いた。生成物は1.L!9/&の
収量、80%回収率で得られた。この生成物を、組換え
scu −PA−32kまたはrscu−PA−32に
と呼ぶ。
CNで溶離した。ウロキナーゼ抗原含仔フラクンヨンを
集積し、TNTA緩衝液に対して透析し、小さなベンズ
アミノン・セファロースカラム(ゲル2mQ)に通し、
セントリコン30マイクロコンセントレータ−上で洗浄
してアプロチニンを除いた。生成物は1.L!9/&の
収量、80%回収率で得られた。この生成物を、組換え
scu −PA−32kまたはrscu−PA−32に
と呼ぶ。
実施例6
(rscu−PA −32にの特性)
実施例5の生成物を種々の試験に供した。5DS−PA
GEで分析すると、生成物は、還元条件下および非還元
条件下の何れにおいても、M r =32000の主バ
ンドとして泳動した。さらに、別1:Mr=33000
−3500047)3個の弱いバンドか認められた。ア
ミノ末端のアミノ酸配列は1本鎖配列Leu−・・・・
であり、このことは、CDNAの翻訳生成物が正確に処
理されたこと、およびS D S −P A G Eに
おいてMrが数種存在するのはおそらく炭水化物の不均
質性によるものであることを示している。生成物rsc
u−PA−32には、5−2444(+ 2010/z
9)のようなりロモゲン性基質に対する極めて低い活性
、フィブリンプレート上におけるプラスミノーゲン依存
フィブリン溶解活性(比活性1700001U/x9)
およびフィブリンに対する特異結合の欠如を示した。
GEで分析すると、生成物は、還元条件下および非還元
条件下の何れにおいても、M r =32000の主バ
ンドとして泳動した。さらに、別1:Mr=33000
−3500047)3個の弱いバンドか認められた。ア
ミノ末端のアミノ酸配列は1本鎖配列Leu−・・・・
であり、このことは、CDNAの翻訳生成物が正確に処
理されたこと、およびS D S −P A G Eに
おいてMrが数種存在するのはおそらく炭水化物の不均
質性によるものであることを示している。生成物rsc
u−PA−32には、5−2444(+ 2010/z
9)のようなりロモゲン性基質に対する極めて低い活性
、フィブリンプレート上におけるプラスミノーゲン依存
フィブリン溶解活性(比活性1700001U/x9)
およびフィブリンに対する特異結合の欠如を示した。
また、氷晶は比較的高い親和性(Km=2.9μM)お
よび極めて低い代謝回転率定数(K2=0.0002s
”’)で直接ミバエリス・メンテン機構にしたかってプ
ラスミノーゲンを活性化する。この生産物はKm=+1
.3μMおよびK 2= 0 、62 s−’でミバエ
リス・メンテン機構にしたがってプラスミンにより活性
な2本鎖ウロキナーゼ(rtcu −PA−32k)に
変換される。得られろrtcu −P A −32には
Km=83μMおよびkz= 4 、 0 s”でプラ
スミノーゲンを活性化する。
よび極めて低い代謝回転率定数(K2=0.0002s
”’)で直接ミバエリス・メンテン機構にしたかってプ
ラスミノーゲンを活性化する。この生産物はKm=+1
.3μMおよびK 2= 0 、62 s−’でミバエ
リス・メンテン機構にしたがってプラスミンにより活性
な2本鎖ウロキナーゼ(rtcu −PA−32k)に
変換される。得られろrtcu −P A −32には
Km=83μMおよびkz= 4 、 0 s”でプラ
スミノーゲンを活性化する。
rscu−PA−32におよびrtcu−PA−32に
の両者とらひと血漿中に浸漬した+251標識フイブリ
ン血餅に対して同様な用量依存溶解を示すが、2本鎖形
に較べて1本鎖形の方がフィブリノ−ケン破壊が少ない
。
の両者とらひと血漿中に浸漬した+251標識フイブリ
ン血餅に対して同様な用量依存溶解を示すが、2本鎖形
に較べて1本鎖形の方がフィブリノ−ケン破壊が少ない
。
rscu−PA−32k(高効率で発現)の機能的性質
は実施例3で述へた天然形対応物と氏めて類似している
ことが結論される。
は実施例3で述へた天然形対応物と氏めて類似している
ことが結論される。
第1図は、遺伝子操作の主要工程すなわちscu−PA
−32kをコードするcDNAの構成およびその発現ベ
クトルの構成を示す工程図である。
−32kをコードするcDNAの構成およびその発現ベ
クトルの構成を示す工程図である。
Claims (9)
- (1)分子量(Mr)約32000でアミノ末端アミノ
酸配列が Leu−Lys−Phe−Gln−Cys−Gly−G
ln−Lysである1本ペプチド鎖、 およびフィブリン溶解性血液システムを活性化せずに血
液中のフィブリン含有血餅の溶解を生起させる能力 によって特徴づけられた、scu−PA−32kとして
示されるプラスミノーゲン活性化因子。 - (2)高親和性および低代謝回転率でプラスミノーゲン
を活性化する能力により特徴づけられたものである、特
許請求の範囲第1項記載のプラスミノーゲン活性化因子
。 - (3)プラスミノーゲン活性化因子産生能力を有するセ
ルラインの培養液または抽出物からプラスミノーゲン活
性化因子scu−PA−32kを採取することを特徴と
する、プラスミノーゲン活性化因子の製造法。 - (4)scu−PA−32kを、亜鉛キレート・アガロ
ースクロマトグラフィー、SP−セファデックスクロマ
トグラフィー、ゲル濾過、不溶化モノクローナルもしく
はポリクローナル抗体クロマトグラフィーまたはそれら
の組合わせにより、培養液または抽出物から採取する、
特許請求の範囲第3項記載の方法。 - (5)scu−PA−32kを、(自然にまたは遺伝子
操作の結果として)scu−PA−32k直接産生能力
を有するセルラインまたは微生物の培養液または抽出物
から採取する、特許請求の範囲第3または4項記載の方
法。 - (6)有効成分として、特許請求の範囲第1または2項
記載のプラスミノーゲン活性化因子scu−PA−32
kを含有することを特徴とする、血栓ほう壊活性を示す
医薬組成物。 - (7)有効成分として他のプラスミノーゲン活性化因子
をscu−PA−32kと組合わせて含む、特許請求の
範囲第6項記載の医薬組成物。 - (8)プラスミノーゲン活性化因子scu−PA−32
kを適当な賦形剤と配合することを特徴とする、血栓ほ
う壊活性を示す医薬組成物の製造法。 - (9)プラスミノーゲン活性化因子scu−PA−32
kと他のプラスミノーゲン活性化因子を適当な賦形剤ま
たはその組合わせ中で配合することを特徴とする、特許
請求の範囲第7項記載の医薬組成物の製造法。
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
NL8601240 | 1986-05-15 | ||
NL8601240A NL8601240A (nl) | 1986-05-15 | 1986-05-15 | Plasminogeenactivator en trombolytisch geneesmiddel. |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS62285784A true JPS62285784A (ja) | 1987-12-11 |
Family
ID=19848019
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP62119978A Pending JPS62285784A (ja) | 1986-05-15 | 1987-05-15 | プラスミノ−ゲン活性化因子および血栓ほう壊組成物 |
Country Status (7)
Country | Link |
---|---|
EP (1) | EP0247674B1 (ja) |
JP (1) | JPS62285784A (ja) |
AT (1) | ATE78292T1 (ja) |
DE (1) | DE3780357T2 (ja) |
ES (1) | ES2033295T3 (ja) |
GR (1) | GR3005408T3 (ja) |
NL (1) | NL8601240A (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0316068A1 (en) * | 1987-10-09 | 1989-05-17 | Collaborative Research Inc. | Modified low molecular weight plasminogen activator and method of preparation |
DE3735917A1 (de) * | 1987-10-23 | 1989-05-03 | Basf Ag | Neue polypeptide, ihre herstellung und verwendung |
GB8809093D0 (en) * | 1988-04-18 | 1988-05-18 | Erba Carlo Spa | Low molecular weight derivatives of prourokinase |
GB8919803D0 (en) * | 1989-09-01 | 1989-10-18 | Ciba Geigy | Pharmaceutical compositions |
DE4101736A1 (de) | 1991-01-22 | 1992-07-23 | Gruenenthal Gmbh | Neue als plasminogenaktivatoren einsetzbare polypeptide, dafuer codierende plasmide und verfahren zu deren herstellung und deren verwendung |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL68366A (en) * | 1982-04-15 | 1990-08-31 | Genentech Inc | Process for expressing a gene encoding a protein comprising the enzymatic portion of human urokinase in a microorganism or cell culture |
DE3486023T2 (de) * | 1983-09-13 | 1993-06-24 | Green Cross Corp | Verfahren zur herstellung von urokinase zymogen. |
-
1986
- 1986-05-15 NL NL8601240A patent/NL8601240A/nl not_active Application Discontinuation
-
1987
- 1987-05-15 JP JP62119978A patent/JPS62285784A/ja active Pending
- 1987-05-15 DE DE8787200909T patent/DE3780357T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-15 AT AT87200909T patent/ATE78292T1/de active
- 1987-05-15 EP EP87200909A patent/EP0247674B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-05-15 ES ES198787200909T patent/ES2033295T3/es not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-08-11 GR GR920401735T patent/GR3005408T3/el unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE78292T1 (de) | 1992-08-15 |
DE3780357T2 (de) | 1992-12-17 |
GR3005408T3 (ja) | 1993-05-24 |
NL8601240A (nl) | 1987-12-01 |
EP0247674B1 (en) | 1992-07-15 |
EP0247674A1 (en) | 1987-12-02 |
DE3780357D1 (de) | 1992-08-20 |
ES2033295T3 (es) | 1993-03-16 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
EP0155387B1 (en) | Fibronolytically active hybrid protein, process for its preparation and pharmaceutical composition | |
Rouf et al. | Tissue-type plasminogen activator: characteristics, applications and production technology | |
Evanson et al. | Studies on collagenase from rheumatoid synovium in tissue culture | |
Stump et al. | Urokinase-related proteins in human urine. Isolation and characterization of single-chain urokinase (pro-urokinase) and urokinase-inhibitor complex. | |
US4245051A (en) | Human serum plasminogen activator | |
EP0123304B1 (en) | A method for stabilizing tissue plasminogen activator and a stable aqueous solution or powder containing the same | |
JP2631645B2 (ja) | 新規化合物、その製法及びそれを含む医薬組成物 | |
Lijnen et al. | Biochemical and thrombolytic properties of a low molecular weight form (comprising Leu144 through Leu411) of recombinant single-chain urokinase-type plasminogen activator. | |
Laug | Secretion of plasminogen activators by cultured bovine endothelial cells: Partial purification, characterization and evidence for multiple forms | |
EP0355068A2 (en) | Recombinant hybrid immunoglobulin molecules and their use | |
Harris | A collagenolytic system produced by primary cultures of rheumatoid nodule tissue | |
Dodd et al. | Isolation and preliminary characterisation of active B-chain of recombinant tissue-type plasminogen activator | |
Shih et al. | Plasminogen and plasminogen activator assembly on the human endothelial cell | |
Rijken et al. | On the composition and function of the carbohydrate moiety of tissue-type plasminogen activator from human melanoma cells | |
US4780412A (en) | Fibrinolytic enzymes produced from established non-cancerous cell lines | |
Stump et al. | Pharmacokinetics of single chain forms of urokinase-type plasminogen activator. | |
JPS62285784A (ja) | プラスミノ−ゲン活性化因子および血栓ほう壊組成物 | |
US9943575B2 (en) | Pharmaceutical compositions of tenecteplase | |
US5977056A (en) | Treatment of thrombotic events | |
EP0139447B1 (en) | A process for preparing urokinase zymogen | |
EP0275606A1 (en) | Hybrid plasminogen activators with improved thrombolytic properties and drugs comprising these plasminogen activators | |
EP0151996B1 (en) | Process for the preparation of a double-chain plasminogen activator | |
Li et al. | Biochemical properties of recombinant mutants of nonglycosylated single chain urokinase-type plasminogen activator | |
Henkin et al. | High sialic acid content slows prourokinase turnover in rabbits | |
JP3045307B2 (ja) | 活性化プロテインcを生成するための細胞培養法 |