JPS59500351A - 新規な繊維素分解酵素、その製法およびそれらを含む製薬組成物 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 新規な１．乍素分解酵素、その側法およびそれら？含む製薬組成物 １、緒言 本発明は新規のｆプＥ素分解酵素、その製法およびそれら會含む製薬組成物に関 する。

血栓性管閉塞は普通ｇ壁における長年の損傷を伴ない英国にシいては全死亡５人 に対し少なくも２人の死亡主因である。この病気群中冠状動脈血栓のみで全癌腫 症死亡人数に匹敵する人数を死処至らしめている。血栓病に原因する罹病率の比 較数値（入院患者又は家庭における病人について）はないが数値は大きいにちが いない。西欧と北米では状態が似ており、”タイム誌には心臓血管病は米国年間 全死亡数の半分全数えると報告されているＣＴｉ−ｍｅ、　４３巻６月１日（１ ９８１））。

故てこの一般的病気の有効治療法が強く要請さｎている。し〃入し米国において なされた冠状動脈バイパス処置数の異常増加で立証さ九るとおシ、外科手術が最 近の実際医療において大きな役割を演じていることはこの分野における薬剤治療 法の不足徴候である。現在迄（衰える阻両性心臓知対するジギタリスの様な非− 特殊治療法は別として）凝固防止剤が最も広く使われている種畑の医薬である。

して）シせいぜい凝固防止剤は血栓で防ぎうるだけであり％また２、３のはつき シ説明される場合（例えば手術後のひどい静脈血栓発生減少法としてのヘパリン 少１投与）ケ除いて正常調奎さｎた臨床実験にンける意義１改昧な結果と結びつ いた可能な出血合併症はその広範な使用全組んでいる。

理論的に最も合理的医薬治療法はいやな血塊を選択的にとかす必要がある。試験 管内で多くの蛋白質分解酵素は凝固血液、全とかすが、この酵素、９１１えばト リプシンも、また多くの他の血液蛋白質全分解し急速に致命的である。（時々爆 発約数しい出血性葦炎にみられる事態）。必要なものに、−１素に対する高度の 特異性と僅かに最小の一般蛋白質分解活性でもつ酵素でおる。この集団中天然に ある酵素プラズミンがこの性質をもっている。

血流中ブラズミンは通常その不活性先４ｐ質、ブラズミノーゲ／として存生する 。血塊は損傷した管壁から出た血管プラスミノーゲン活性剤として仰られている １ｙＪ寅によってブラズミンに活性化されており血栓に既にひっかかっているブ ラズミノーゲンに工って分解される。この様にして血管中や致命的でない血塊な 漸次再び油路であけられるが、この経過はゆつくシ非効果的でしばしば数ケ月又 は敷年〃）ρよる。故に患者に投与するに適するプラスミノーゲン活性剤の使用 は血栓性管閉塞治療法となシうるだろうことは明らかである。

１９３３年ｆしはへモリチツクストレプトコクシの培養からえたエキソトキシ／ が強力なプラスミノーゲン活性剤であること全発見しこれ奮ストレプトキナーゼ Ｃ５Ｋ）と呼んだ。これは（α）これが強力に抗原的（菌性エキントキシン全予 想できる様）でろ広したがってしばしば発熱反応お工び時ｙｃ＊アナフイラクチ ック（ａｎａｐｈｌｌａｃｔｉｃ　）なショック状態が報告されている〃１ら、 また（ｂ）ＳＫは循環しているプラズミノーゲ／および塊と結合したプラズミノ ーゲンの両方で活性化し、前者は多くの通常血液凝固要素、即ち要素！（フィブ リノーゲン）、要素■（プロトロンビン）、要素Ｖ（なり易い要素）お工び要素 ■（アンチーヘモフイリツクグロブリン）の広範な破壊ｔおこすからエキソトキ シン投与ハ普逼ｆヒされた出血危険がかな９あるので、このエキントキシンを線 維製分解剤として一般臨床に使用することに決して受入れられていない。

１０年後に通常人尿中に他のプラスミノーゲン活性剤が発見されウロキナーゼＣ ＵＫ）と名づけられた。これにずっと抗原性が小さい（殆んどない）がこれもま た血液中のブラズミノーゲンの活性化と絶びついて同様のはげしい出血の危険を おこすのでその臨床使用は拘束される。

多年にわたり血管以外の組織がブラズミノーゲン活性ｇｉＩＩ　ｋ含むと考えら れている。集合的に＠組啼活性剤″といわ几るが、ストレプトキナーゼとウロキ ナーゼ＝９もずっと粗織活性剤について知られていない。粗織活性剤にブラズミ ノーゲンｔブラズミンに変える能力のあるだけで一括された化学的に雑多な物質 群であるだろう。しかし殆んどの研究者は組織活性剤はすべてそれらの発見さｎ たＭｉ懺血１から（即ち血管内皮）から生じ、したがって分子量７２．０００’ にもつ血管プラスミノーゲン活性剤と同じであると信じている。更に他の組織は 癌腫性・てなったならばブラズミノーゲン活性剤′ｆ獲得しまたこれは悪性細胞 のある攻垂た７説明していると主張さｎている。

新発見組織活性ｉ１（人間に固有でないプラズミノーゲン活性剤−ＨＥｐＡとい う）は最近の一連発表の主題となっている。この組織活性剤は人のＣ悪性）黒色 腫細胞線によって分泌さｎこれも分子−１７２，０００ダルトン全もつ。還元剤 の存在でこれは３９，０００と３３．０００ダルトンの２亜単位江分けられる。

この組織活性剤！−１実験的（兎シてついて）にまた２患者て共に試験されてい るが、治外剤として悪性細胞からとり出した物質？使うことは明らカムによくな いので、癌：１市源物貰の臨床使用は制限する心安がある。事実この組織活性剤 ？試訣された２患者は重病となり治療もできず死亡した様である。とはいえＨＥ ＰＡ　（臨床的と実、験的両方において）はウロキナーゼエりはエリ効果があり またずつと安全な塊分解剤であると示されている。これｆｌＨＥＰＡが血栓に結 合したプラスミノーゲン全選択的に活性化し循環するプラスミノーゲンを助ける からである。

今中非癌２１世上皮畑巌びら見られたあ６劫空線が組織培ｉｆておいてプラスミ ノーゲン活性剤として活性？もつ酵素全生成できることが発見されたのである。

また１軸胞線クエらの酵素は少なくもそれ自体線４素分解活性？もつと発見され ている、即ち酵素それ自体プラスミノーゲンなしで緑、油製分解活性？もつので ある。

本発明の１形πにＬり非癌；匝性上皮釉肥テ培養し、培養物力）ら酵素含有部分 を分離すること工り成るそれ自体線維素分肩活性お工び（又は）プラスミノーゲ ン活性剤としての活性ｔもつ酵素の製法が提供される。酵素含有部分は酵素金倉 む上澄液？捕集し又は、′細胞がら酵素含有部分全抽出するいずれ〃Ｓの方法で 見られる。

補乳勅物からのものである細胞は確立した細胞線づ１らえられた細胞か好１ｏシ い。適当する１匍胞例は角實匍胞お工び約上皮和」胞である。

ｉ′発明による酵素製造において、遇んだ細胞は通常の佳環培養法による、例１ えは血清含有媒質中における連続培養によって成長させる。細胞の適当な増殖が −変えられたならば、血清含有媒質は血清のない媒質に置換してもよい。次いで 細胞は尋緊の適当生成がおこるまで生理学的に適切条件に保った＠酵素で上澄液 から回収し又は細胞刀１ら直接抽出して回収できる。

どんな適当な回収法も使用できるカニ、懸渦細胞を除くため遠心分離した後金主 キレート、イオン交換および（又に）除外クロマトグラフによって合併上澄液か ら回収すれはよい。蛋白質を含も・部分は２８０ｕｍＫおける紫外線吸収測定に よりまた蛋白質含有部分の線維素分解お工び（又は）ブラズミノーゲン活性ｆヒ 活註全線傑素叛法お工び（又シー）鞄維素流分解時間法に裏って試験して同定で きる。

酵素は本発明に裏ジギネア豚角λ七戦の確立さｎ次細胞線りユらまた非癌側性人 胸上皮の確立された細胞線〃・ら分離されており、これらの酵素ないずｎもドデ シル５９ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気原動＜５Ｄｓ−ＰＡＧＥ）によ って還元央件のもとでホ１１定して６２．０００±３．０００ダルトン、また非 還元条件のもとて約５６．０００ダルトンの分子量をもちまた４、６の＝Ｘ点會 もっている。

ギネア豚角質模胞と非癌腫性人胸上反カムらえた酵素のアミノ酸分析値な表３に 示すとおりである。

これらの酵素は新規のものと信じられており、上記の方法による酵素の分離法お よび酵素と製薬上許容される櫂釈剤又に担体とから成る組成物がそうである様に 本発明の別の形態全成す。担体の選択は望む投与法によるもので、非経口投与用 には無菌発熱源のない通常塩溶液が適当である。酵素な経口投与もでき、経口用 の普過の賦形剤が使用できる。本発明の酵素使用上の臨床指示には静脈血栓症（ 深静脈と網膜血栓症で含む）、肺動脈塞栓、心臓内凝固、動脈血栓塞栓症、微血 管血栓塞栓症、炎症性滲出状態お工び血胸症における様な体腔内の血液存在の診 断、予防および治療？包含する。

上記のギネア豚角λＭｅのａＦ＠線はロンドンのユニバシティ刀レッジにおける 培養コレクションにＧＰＫとして保存されまた人胸上皮の細胞線はロンドンのユ ニバシティ　カレッジにおける培養コレクション中にＢＥＢと七て保存さ几、い ず几もパスツール研究所の（国際公認）微生物増養コレクションに１９８３／ｌ Ｅ２月２５臼ＢＥＨに対し受付、ＫＩ２２１として７たＧＰＫに対しＡ１２２２ として寄託されている。

前記の人間固有でないブラズミノーゲン活注剤Ｃｌ１Ｅ？Ａ）と反対に不発明の 酵素は非ｇｉ１痙世からえら几た良負粗熾熔責、匍１梱でうえられるもので異な る分子１とアミノ酸徂成（安３手照）をもっている。またＧＰＫｘｐらえられた 酵素は少なくも当然総姫素分解匣であると（即ちブラズミン放出によるのみでな く線維素に直接酵素的作用に工っで、図４参照）発見さｎている。

本発明ＫＬる酵素製造とその特性な今や実施例て工って計画記載さ几るであろう 。

培養は１９７１年１１月１６日開始され、線に黒ギネア豚の耳皮膚で）ら確立さ れた。チールシュ生検試料に１０％トライスピン溶液と共に２０分間培養し表皮 ？分離した。基礎細胞孕しず〃・にはなしえた細胞金１０チ（〃）牛脂児抑清（ ＦＢＳ）で補足されまたペニシリン（１０００ｉ、ｕ、　／ｍｌ　）とストレプ トマイシン（１μｙ／ｎｔ）？含む２０机Ｖヘベスー緩衝された漬少本實媒質、 イーグルＣＭＥＮ”）工り成る成長媒質で入れたガラス踊乳びん中に接種した。

１９７２年１月１２日の第２継代接種によって培養は粒状でかたく矩合しよくで きた上皮釉、把の島より成っていた。

ｂ、非−癌腫匣人胸上皮（ＢＥＢ　）の確立上皮細胞の線は婦人胸の外科的切除 −生検試料から１９７２年３月２２日えらｎた。原組織の顕微鏡検査（ユニ）く シティ　カレッジ病院実験報告；ｆｆ１１０１７−７２　）はのう、散性過形成 増殖のみであること全示し種層に対し陰性であった。（患者は６ケ月間平常看護 ヶうけた後解放さｎ工くなり以来病院てもとることはなかった）。甜壷なエラス ターゼに工ってばらばらにされた。

成長媒質？入れた４乳びん中にえられた細胞ケ接種した。細胞に迅速に成長し壜 養８日後主として上皮となり線俄芽他胞を僅かに含んでいた。このｍ　ｒ＠蕾の サブ培養？ポリスチレン培養フラスコ中で抗トリズシン白破壊と成長によってつ づけた。３砧代接種後釉１烟は全部上皮となった。この細酌線の継代手種１５に おける細胞学は非癌ｌ！［Ｉ！件と報告された。

（ｃ）　定常培養法 匍胞扛毎週ププ培養法で日常的（保存された。正にサブコンフルーエンド（５ｖ ｈｃｏｎｆｌπｅｎｔ　）の楊合、細胞はデキストロース−項＠腋中１０％）リ プシンに約２〜３分さらされてはなされ約２＋ｍ！の成長媒質と共〈遠心分離管 に移され８００ｒｐｆｆｌで４分回転された。細胞ペレットに次いで１ゴの成長 好質に再び懸濁させられ、２０μｌ試料はクールターカウンターによってカウン トされまた祷＠全成長媒λ入り清浄無勿暗養フラスコ中に接種し貯蔵看として３ ７℃Ｃｏ２培養器中に１週問おいた。ＧＰＫ釉胞細胞常種づけ密度は１ｏ３ｃ／ −である。汚染検査は万一トラジ万グラフィに裏って行なった（ＢＥＢ綿代綿様 接種１９；びＧＰＫ継代接種３４と５０）。細胞はスライド上に接種され３Ｈチ ミジンで５時間ラベル付けし最終、９に１．０μＣｉ／ゴであった。

ゲル形イルフォードに２乳剤でスライドを被号し１週間４℃に保ち、現像しギー ムサ染料で着色し、その核ラベルと画用質又は非細胞ラベリングケ検べた。両線 な通常の杉ラベルのみを示した。マイコプラズマ汚染は肉汁培養ニよっても排除 された。

ＣＢＥＢ１７とＧＰＫ惟代接惺７）。

（孝素コレクションて１史われた潜伏接種μＧ７’Ｋ（３３−５３）とＢＥＢ（ １９−２７）であった。

ｄ、液体窒素貯蔵 上記のトリプシン化とカウント法後に画用？回転分離し画側ペレッ）”ｚ７．５ ％ジメチルスルフオキシド（］ハのケ含む成長９１積昭５９−５（１０３５１（ ４） 媒質中に再び懸濁し約２Ｘ１０６／−の細胞濃度とした。細胞懸１５？ｔＬｒポ リスチレン箱中のアンプルに入れそれｔ次の段階的に冷却した＝４℃に３時間、 −１８℃に３０分、−７０℃に一夜、その後窒素冷凍令に移した。

ｅ、液体窒素貯蔵後の再構成 再構成する細胞？含むアンプル全窒素からとり出し温水（３５Ｃ）入りビーカー に入れて急速にとカ・した。Ｗａｆｌｌｔｌｏ−の成長媒質入り培養フラスコに 移し３７Ｃで一夜おいた。翌日ＤＭＳＱｋ除くため媒質を変えた。

ｆ、培養大きさの拡大 細胆当りの酵素収量が倦めて小さい（０，１ｐグ／鞘ＩＦ２）ので単位規模拡大 方式（小規模装置多数に対して）で仙＠葛撰度を維持するため大規模培養方式を 用いる必要がある。培養方式は精製法ができる様可能な限り高濃度生成＞’ｘ生 成することも重要である。次の培養方式は２５と７５ｄフラスコ〃・ら刻粗とき 李生成の規模拡大に使われている： （ｉ）ローラー培養　標漁組織培養ローラー装置會使って種々め大きさのポリス チレンとガラスびん葡しず刀・に（１２ｒｐｈ）回転させた。１面たけでなく全 内部表面積が利用されるので生産性は向上した。静止培養に比べて佃胞対媒負比 が増加できるので酵素の高湿度収号が見られた。

（１１）重ね板培養　培養面に攪拌軸上２〜４ｗＲ間隔に水平につけられた一連 の偏平スティンレス鍋円板であった。全、徂合せ装置？発酵容器内においてしず かに攪拌した（１００τｐｍまで）培９素’ｔｌ　培養面Ｈノ５１　（１２，２ ００ｃｄ　）Ｄｓら２１０ｚ（３３０，０００ｄ）まで変えた。単一装置中セル 容量の増大はできるが高渦度生成拗生成はできなかった。

（ｉｉｉ３　微担体培養　微担体はその表面で１Ｊｊｌ　％成長ｔさせる小球で あり、また懸濁液中で攪拌可能である。これは基質に付看成長する細胞に使用の だめの通常海渇癲胞にのみ使われる大規模発酵装置に１更用される。方の方式の 利点は均一培養を保つ十分な環境調整と最適環境における無制限規模拡大可能性 お工びエリ濃厚生成物生成するための容易なｈＷａ対媒質比可変性である。代表 的微担体に５０００　ｉ／　５’の培養面積全与え細胞培養の原理はすべての型 および規模の＠養容器について同シトデツクス−３（ファーマシア　ファイン　 ケミ刀ルズ社）に１０グ／ｌの濃度で使われる微担体である。培養装置は媒質２ ｔケ入れている散布貯槽ンこ呆絖したｒ「莱容量４．５ｔｉもつ５ｔビオ力ル発 酵器（Ｌ、Ｈ，ファーメンティジョン社）であった。表面積対″＄貝比率はこの ｌの微担体ケ用いるローラーびんにおけるよりも４倍以上高くまた細胞は４素、 ｐＨど栄養温室お工び早い散布速度にわたる精密調節に工ってのみ生育し活曲ゲ 保たれる。この要求に適合する培養装置なグリフイス１．ｙ、　Ｂ、とソーント ン、１ Ｂ、、によるＪ、Ｃｈｅｍ、Ｔｅｃｈ、　Ｂｉｏｔｅｃｈｙｗｌ、　３２．３２ ４−３２９　（１９８２）に記載されている。

細胞２．５Ｘ１０９の細胞種はローラーびん培養に工りつくられ、１０係ＦＢＳ 、０．００１チトウイーン８ｏとヘペス緩衝液で補足されたイーグルＣＭＥＭ） 成長媒質ケ含む培養液に加えられた。

３７Ｃで７２〜９６時間成長後＋＠胞は有効基質の約７０係金おおうに十分に成 長した。（普通柚廚約１．４　Ｘ　１０１０）媒質全傾瀉し細胞と微担体會血清 のない媒質で２回洗った後血清のないＭＥＭで一杯に満した。３７℃培養を少く も６０時間つづけて更に細胞全成長させ算素全分泌させた。

培養終了時上澄液？出し４５０１で１０分間回転し懸ＰＡ細胞？除去した。次い で上澄ｙｙｓｃにおいて４０，０ＯＯｔで３０分間回転させた。５０μを試料を 線維素板試論のためとシ、上澄液全凍結乾燥し秤量びんにとり液体窒素冷凍ｆ中 に貯蔵した。別に上澄液は超濾過法に工って濃化できる。

（ｂ）ＧＰＫ抛胞培養上澄液の精製 濃化した培養上澄液なＩＭＮａＣｌ　と０．０１チト啓−ン８０ｉ含むｐ　Ｈ７ ，５の０．０２Ｍ）リス−１−、Ｔ：ｌと４℃において予め平衡させた亜鉛キレ ートアガロースの管（４，４℃ＭＸ　１２ｃｎ　）上クロマトグラフ法で部分精 製した。５ｔの論整媒質ｆ　１２０ｍ１７時の流速でこの管に入れた。管に２Ｌ の平衡緩衝液で洗った後、結合蛋白質全平衡緩衝液中イミダゾール０から０．０ ５Ｍ１での直線段階傾斜液（全ｉ　１１−　）で溶離した。各分別部分の２８０ ７Ｌｍにおける紫外線（ＵＶ）吸収全検べまた線維素分解活性を線維素板試論験 て工って評価した（図１）。活性部分？併せその比活性金線維素塊分解時間法に よって検べた。

次段階で併せた部分ｔ１□υＮａＣ１と０．０１％トウイーン８０を含むｐ　Ｈ ７，５の００１Ｍりん酸ナトリウム緩衝液と平衡させたコンカナバリンＡ−アガ ロース管（２，２Ｘ　１５ｃｍ）に入れた。溶離液の２８０重ｍにおけるＵＶ吸 収が０．１５以下となるまで管７ｉｌ−１伽シ′時の流速の平衡緩衝液で洗った 。吸収物頁を溶離するに０．６Ｍα−Ｄ−メチルマンノシド、２１υＫＳＣＮお よび０．０１％トウイーン８０７ｉｌ−含むｐ　Ｈ７，５の０．ＯＩＭりん酸ナ トリウム緩衝液までの直線傾斜の平衡緩衝液（２００ｍＩり　ｋ用いた。５−分 別部分ｙｒ−ＵＶ吸収と前記線維素分解活性測定のため取った（図２）。活性部 分？併せこれに固体ＫＳＣＮｋ加えてＫＳＣＮ濃度ｋ　１．６　Ｍに増加した。

次いで分子ｉ　１５，０００〜２０，０００ダルトンの固体ポリエチレングリコ ールに対し透析して溶液？濃化した。

濃化Ｒ（５〜８　ｍｌ　）　２遠心分ｊｌた後、１．６　、Ｗ　ＫＳＣＮ　と０ ．０１トウイーン８０を含むｐ　Ｈ７，５の０．０１ＡＱん酸ナトリウム緩衝液 中のセファテックスＧ１５０　（シュバーファイン）Ｗ（２，５ｘ９０ｃＭ）上 でゲル濾過した。９ｍ７！／時の流速で３ｄの分別部分でとった。小蛋白質ビー ク（図３）と行号する単一ピークとして活性酵素で溶離した。活性酵素？含む部 分で併せポリエチレングリコールに対する透析に二って濃化し一８０℃で貯蔵し た。

別にコンカナバリン−Ａ−アガロース管からの溶離物は更にリシン−セファロー ス又’ｒｈｌｉＨ［−セファロース上親和カクロマトグラフ法によ！ｌｌ精尖で きる。ＧＰＫから見られた酵素の鵜製結果１３　持表昭５９−５００３５１（５ ンは表１に示している。

＠雑素板は次のとおり！＃造した。５２間直径ポリスチレンベトリ皿中に線維素 板緩衝液１−中にフィブリノーゲン１智の液３ｉ會トロンビン（２重０単位／ｄ ）　１０ｐｔに裏ってかた１らせ室温で少なくも３０分放置した。１枚の板上に 上澄液５０μｔｆ５０μｔのブラズミン標草液（１０μｔ／ｍｌ　’）と共に２ 重に塗布し板金３７℃で２０時間培養した。分解面積で直交直径によって測定し “ブラズミＺＪＩＬ位−（Ｉ　Ｐ？７．　＝　ｌ　ｎＪブラズミンによって生成 した分解）として表わした。

（１１）線維素塊分解時間法 ＧＰＫとＢＥＢからえられた酵素の線維素分解活性を４茎ウロキナーゼ溶液（１ ９６６年に確立された人のウロキナーゼの第１回国際参考芙法）の活性と比較し た。

４拳ガラスびんのウロキナーゼ七〇、　Ｉ　ＭＮａＣｌと０．２５チＷ／Ｖゼラ チンで含むｐ　Ｈ７，８の５０ミリモルジエチルバルピチュル酸ナトリウム緩衝 液にとたした。上記緩衝液中に４准ウロキナーゼと線維素分解性酵素の稀漱液数 個でつくった。他の試薬もすべて同一緩衝液にとかし混合する前氷上に保管した 。０．２７！の稲沢ウロキナーゼ又は溝素溶液奮一連の１０Ｘ５０闇管知入れた 。次いで０．５−の人のプラスミノーゲン（３■／　＋＋ｊ　）　、０．５　ｍ ｌの人のフィブリノーゲン（０，２５ｔｌ）Ｗ／Ｖ）お工び０．０５−のトユ、 ビ。

Ｃ４０ＮＩＨ単位／−）ケ加えた。管内容物ケよく混合し３７．５Ｃ温浴中に入 れた。ストップウオッチケ直ちにうごかししずη・に￥ｊｒ＋＞けて分解終点ケ 記録した。分解時間（分で表した）対数対塊中のウロキナーゼ濃度対数の関係ケ プロットして補正グラフ全つくった。０．５１Ｕ／−のウロキナーゼ４進溶液と 同じ分解時間會与える酵素溶液の稀釈率ケ非稀釈詳素溶液の活性計算用にとった 。したがって酵素の線維素分解活１生は国際届−位（ＩＵ）で表わされる。

ＧＰＫからえた稍芙酵素の平均比活性（蛋白質彎当りの緑維素分解活性）は約１ ２．５００　ＩＵ／■であった。

（ぬ　蛋白誓測定 ４退として牛血清アルブミンファクター■を用いてリードとノースコートしＡｎ ａｌ、　Ｂｉｏｃｎｖ几１１６．５３−６４　（１９８１））の改良クーマシー 肯−Ｇ染料結合性試論によって蛋白員濃度ケ測定した。

（ｅ）対照品 凍結乾燥物置６７０巧の１パツチ？上記ら）の方法に工って、但し細胞なしでつ くった。この物メは徴維素坂試訣において陰性で与えた。いくつで）の他の画用 線刀Ｓらの上澄液の磯逍累分堺活注もしらべたが、いずＱ’４．陰性ヶ示し又に 極僅炉な線婚素分解作用を示した。結果μ表２に示している。

■　加熱の影響（酵素不活性ｆヒ） −雁つ）らえた物ヌバツチＣＧＰＫ３７．バッチ３）で凍結乾深する前０．５ｍ ｌ試料２個金とった。１万？沸とう水浴に５分間入れ加熱した。他方ｖ１仙常対 照品として用いた。線維素板試験において那とうさせ元試料は不活すであった。

５ ＧＰＫからえた酵素溶液の線維素分解活性？１ラズミノーゲン含有午硼雉素板上 で検べた。フィブリノーゲン溶液Ｃｅバーシグマ１η／ｖａｌｅ”）　３１ｎｌ ！ｉ５２１直径ベトリ皿（ギブコ　ニーローブ社）中で１０μを緩衝液中のトロ ンビン２．５重位によってかたまらせた。

板は１更用前室温に少なくも３０分放置した。５０μを容量の試験試料？板につ け３７℃で１８時間培養した。分屏域？測定しプラズミン（１０μｒ／ｍｌ）に よっておこされた全分解面積のパーセントとして表わした。

Ｃｂ）　？！＠維素仮の予処理 線維累層含有の固有プラズミノーゲン？不活性化するため線維素板に８０℃で４ ５分間加熱した。これらは１史用前室温に冷却し、緑礒素層の表面・′／Ｃ凝縮 が生じない掃注意した。

この方法は汚呆しているグラズミノーゲンｆＫ貞さぞ板がウロキナーゼの様なプ ラズミノーゲン活註剤の作用全うけることを防いだ（また蛋白員分解ンζ対する 板の感度で小さくした。）。

結果に図４に示している。こ６刀１らＧＰＫρユらえた≦４素の線維素分屏活件 とプラスミン２工びウロそナーゼのそ几との加熱および非加熱線維素板上の比較 ケした。予想ど２す、ウロキナーゼの場合は汚染しているプラスミノーゲンの不 活曲比シζよって加熱板上の祿姫索分、解活法はな刀為った。

し刀ｓＬ、ＧＰＫからえた）季素の加熱板上の述恨素、七分昨は非加熱板上の分 が−よりも程、朋は小さいがでお０重北文つｔのである。この結果は知られたプ ラスミノーゲン活性剤とちがってＧＰＫ刀）らえた酵素は直接緑維素分解活性と プラズミノーゲン活性剤活性全共にもつことを示している。

ＧＰＫからえた酵素の線維素分解活性は市販のプラズミノーゲン金含まぬフィブ リノーゲンから製造されたプラズミノーゲンを含まぬ線維素板上でも試験され分 解性とわかった。ウロキナーゼはこの試験において陰性であってプラズミノーゲ ン？含まぬ線維素板全分解しなかった。

（ｃ）分子量測定 ＧＰＫＺ）−らえた酵素の分子量ｔレムリの方法（１９７３）に工り還元および 非還元宋件においてドデシル硫酸す）　ＩＪウム中１０％ポリアクリルアミドス ラブゲル上で測定した。（レムリＵ、に：トフエイブル　Ｍ、によるＪ、ｋｌｏ ｌ、　Ｂｉｏｌ、　８四５７５−５９９　（１９７３））。

試料全５分間９０Ｃで熱した後電気泳動ｔした。次の比較蛋白質１［準として使 用した：７オスフォリラーゼ６（９２，５００）、牛血清７／ｌ／ブミｙ（６７ ，０００）、オヴ７／Ｉ／ブミｙ　（４５，０００）、炭酸炭水酵素（３１，０ ００）、大豆トリプシン抑制剤（２１，５００）、およびリゾチーム（１４，４ ００）。

１笑験小ら見られるゲルスラブの密度測定的少１全分子量測定に用いた。ＧＰＫ からえた酵素によって移動される距離で１比較蛋白質の分子量対数に対する相対 移動全プロットしてえた標単曲線上に記録した。

結果ＢＧＰＫｖ−らえた精製酵素がその分子中に２硫物架橋の存在を示して非還 元条件において約５６，０００±２．０００．また還元粂１７　持表昭５９−５ ００３６１（６）件において６２．０００±３．０００　（２メルカプトエタノ ールの付加に工って）の分子貸金もっことを示している。この分子量はセファデ ックスＧ１５０管上ゲル濾過にニジ推定された６５，０００±３．０００の分子 量と工〈一致している。同じ結果がＢＥＢｖ−らえた酵素についてもえられた。

ω　等電焦点 ＬＫＢマルチフォール単位を用いてｐＨ３，５〜９．５範囲内で薄層ＬＫＢアン フォリンポリアクリルアミドゲル板中に等電焦点させた。２０μｔのＧＰＫｅｌ 素試料全ゲルに用いた。初電流２０ｍＡと最大電圧１．１Ａ’Ｖｙ用いて一定電 力８Ｗで焦点させた。焦点温度１０℃で操作時間９０分であった。

３１直径先端全もつ小型組合せ表面電翫（パイニーインゴールド型４０３−３０ −Ｍ３）とｐＨ計（コー二７ｆ型７０３０　）　’に用いて室温で０．５α間隔 においてゲルｔとおしてのｐＨ傾斜を測定した。

ゲルは１０チトＩＪクロロ酢酸ＣＴＣＡ）液で固定された後蛋白質のためクーマ シーブリリアント青Ｒ−５５０（シグマケミカル社）を用いて着色されていた。

結果に図５に示さ九ている。ＧＰＫとＢＥＢからえた精製酵素の等電点ＣｐＩ＞ は４．６とゎ刀為った。

（ｇ）　アミノ酸組成 ＧＰＫとＢＥＢ醇素のアミノ酸組成は真空１１０℃においてたえず沸とうする６ ＭＨＣＩＣアリスター）で蛋白質試料７］１−２０時間加水分解した後ローカー トアミノ酸分析器で用いて測定した。

酵素のアミノ酸組成を表３に示している。比較のため人の悪性黒色腫（ＨＥＰＡ 　）ｚ−らえたプラスミノーゲン活性剤の組成も表に加えた。（リジタノＤ、Ｃ ，とコレｙ　Ｄ、によるＪ　−Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｇｍ。

２５６、７０３５−７０４１　（１９８１））。

ＧＰＫとＢＥＢ酵素は基本的に同じ組成全もつが、２異種（人とギネア豚）の間 に予想される僅かの差違があることがわかる。

ＧＰＫとＢＥＢは共にＨＥＰＡについて公開された組成とちがうアＧＰＫｘｐら えた酵素のアミド分解活性１種々の色素生成基質を使って検ぺた。ヒユーレット バッカードア２２５　Ａグラフィクスプロッターに結合されたギルフ万一ド系２ ６００分光光度計’ａ［って３７℃に２ける１　ａｎ通過長さクヴエット中で活 性全分光測定的に測定した。

部分精製した酵素を表４に示すｐＨと４１７強度における００５Ｍ）ＩＪスーＨ ＣＩ緩衝液中各色素生成性基負の種々の濃度において培養した。表４はＧＰＫか らえた酵素の種々の基質で用いてえた運加ハラメーター値七示している。ｐ−ニ トロアニリンの初めの放出に４０５ｎｍにおいて監視した。ｐ−ニトロアニリン についてモル吸光係数１０．５００１１モル−α全使用した。

Ｇ、）立ジ貼堕毘漬（ ＧＰＫとＢＦＢからえた酵素のＮ避素塊への吸収全プラスミノーゲンのないフィ ブリノーゲン（１，５岬／ｉ）１＋ｎｌ、ＧＰＫ又はＢＥＢＣ２５μり／ゴ）２ ５μｔお工びトロンビン（２ＯＮＩＨ励）５０μｔケ混合して検べた。上記混合 物ｋ　Ｏ，Ｉ　ＡＩ　−ＭａＣｌ　ｆ含みｐＨ９ くり３７℃で３０分培養苧た。塊で遠心分離し緩衝液で洗いＩＭウム緩衝液１ゴ 中に抽出した。腕上澄液と腕軸出液の試料全プラズミノーゲン含有線維素板上で 試験した。結果は添加した酵素の殆んどが線維素塊と結合し上澄液中に活性酵素 が殆んど又は全く残っていないことを示した。し〃）シウロキナーゼに２った同 様の試験は線維素塊への結合があまシないことを示した。

ＧＰＫからえた酵素の全血液塊に結合する能カケ試験的チャンドラーループ循環 系中で試験した。内径３ｍポリエチレン管（予め０．０１％トウィーンで洗った ）中でくえん酸塩化全人血液１づ２　ＬＵ２５ｐＬＯトｃ：、ｙピン（１ｏｏＮ ＩＨＵ　／ｌｒｉ　）と混合して実験的交差剣合した血栓全生成した。回臀台（ ３０ｒｐｍ）上で３７Σで１時Ｉ′ｉ培養後血栓をベトリ皿に注入Ｌ０．２５　 ％　Ｗ／　Ｖセラーｆ−：ｙと０．１ＭＮａＣ１ｆ含む７４　Ｈ７，８（７）０ ．０５Ｍジェチルバルビチュル酸す）　ＩＪウム緩衝液で２回洗った。次いで血 栓を８知プラズマ又は景衝液０．９−と共に管中に吸い戻した。

ＧＰＫ＠”らえた酵素１００μｔ（約５００１Ｕ）−（加えループ全回転台上に 戻し更に３７０で２時間培養した。塊でとシ出し前のとおシ緩衝液で洗った後Ｉ ＭＫＳＣＮ’（含むｐ　Ｈ７，８の０．０５Ｍジェチルバルビチュル酸塩緩衝液 １ｆｆｉｌと４℃で１時間抽出した。腕軸出液および管からの腕上澄液の各５ｏ μを試料でプラズミノーゲン含有線維素板につけ３７℃で１８時間培養した。

えた結果は腕軸出液の線維素分解活性、したがって結合酵素量は塊上澄液工υも 著しく高かったことを示している。インジウム１１−札ｆ１き酵素デ便って実験 全反復した場合同じ結果かえられた。

この結果？考えて放射能札付き酵米ハ生体内血栓局地ｆヒの有効手段として診断 的に使用出来るであろう。

（ｚ）　免疫拡散分析 ＧＰＫとＢＥＢからえた物質お裏び人のウロキナーゼに対する抗皿清老すジケン とコレン（Ｊ、及ｏ１．　Ｃｈａｍ、　２５６．１３．７０３５−７０４１（１ ９８１）　）に工って記載さ扛た方法に工ってうさぎ中にそだてた。抗血清のＩ ｑＧ部分は蛋白貝＝Ａ−でファロース管上親和カクロマトグラフに裏って分離し た。

２１免疫拡散分析はオーチターロングとニルシン（実験免疫学便覧、２１肱　１ ９章、ブラックウェル、オックスフォード）の方法に工って１．５チ寒天ゲル中 で行なった。試料？穴′ｆあけたウェルＣｗｅｌｌ）に加え湿雰囲気中４℃で一 夜拡散させた。

結果はＧＰＫとＢＥＢ’ｊ）”らえた酵素は免疫学的に四じてありまた兎の抗− ＧＰＫ　ＪＵＧと抗−ＢＥＢ　ｈｔＧはウロキナーゼと反応しな刀）つたことｔ 示している。同様に酵素はウロキナーゼに対する抗原に交差反応しな炉つ７ヒ。

０．０１％トウイーン８０ｉ含むｐ　Ｈ７，８の０．０５Ａ（ジエチルバルビチ ュル酸ナトリウム緩衝液中に２−メルカプトエタノール原２１　１１表口ｇ　５ ９−５００３５１（７）液の種々の稀釈液上つくった。ＧＰＫからえた酵素（２ ５μ２／アｌ）全等量の２−メルカプトエタノール稀釈液と混合し混合物音３７ ℃で培養した。対照試料に酵素と同１の緩衝液ヶ含んでいた。１５分後混合物の ５０μを試料全ブラズミノーゲン含有線維素板につけて残留酵素活性を検べた。

酵素活性はまた線維素塊分解時間法によっても定量した。

えた結果は謔素活性の大部分（８０％以上）が１０媚又はそれ以上の濃度の２− メルカプトエタノールとの培養に裏って抑制されたことケ示している。この結果 と分子量測定中にえた結果は分子内２硫化物架橋が酵素活性に重要であることｔ 示している。

（ｋ）　Ｇ’ＰＫからえた酵素の活性に対するボ＋）−Ｄ＝）シンの影響本冥的 にアレンの方法（Ｔｈ、ｒｏｍＬ、　ＩＪｆｌ、ｇｍｏｓｔａｓ　（スタットガ ルト）Ａヱ、４ｌ−４５（１９８２））によって部分精製されたＧＰＫ７）−ら えた酵素のブラズミノーゲン活性剤活性に対するボＩ）−Ｄ−リシンの影響全検 べた。反応混合物は２５μｔトウイーン８０　（０，４ｑＩ））葡含むｐ　Ｈ７ ，５の０．０５Ｍ）リス−ＨＣｌ緩衝液４００μｔ、プラズミノーゲｙ　（２０ ０ｐグ、／ニーｄ　）１２５μｔ、色素生成基質Ｓ−２２５１（３，５ｍＭ）２ ００μｔ１お工びポリ−クーリシン（５μ９／−）又に対照水５０μｔＬ！ｌｌ 成るものであった。＃素２００μｚ７加えて反応全開始させ４０５Ｍ、ｍにおけ る光学密度変化１３７ｃで２０分監視した。

ポリ−クーリシンのない場合、この朱件のもとでポリ−クーリシンの存在でウロ キナーゼによってえもれるものと同じ放物曲線かえられることがわかった。しカ ー１．ＧＰＫたらえた酵素？含む反応混合物にボ＋）−Ｄ−’Ｊシン？加えると 、溶液は濁り時間と共て光学密度に複雑な変ｆヒがおこった。この結果はボ＋） −Ｄ＝）シンがウロキナーゼの場合とちがった形でＧＰＫからえた１′−４素と 相互作用すること？示唆している。

上記明細書７１”ら本発明の酵素は治療、予防および診断の目的に利用できるこ とが認められるであろう。治療と予防用途には酵素ケ製薬組底物、特に非経口投 与に適する各組成物に調合できる。

故に組成□は発熱諒のない無菌生理学的塩溶液の様な普油のどんな非経口和体ｒ 含んでもよい。人に投与するに適当な投薬量は冴時間に対し約１０乃至約８０■ ケ成るべく２又は３回に分は静脈内投与することが好ましい。

診断用には酵素を例えばＩ３又はＩｎ”ｋ使って普通のラベリングにエフ放射ｊ ヒ孔付けできる。放射能札付けした酵素は血管に導入してしらべ増加放射能の位 置ケさがすことができる。

論命媒×　！５．ｔ）００　１，８・）６　５７３００　３６　ｌＤｏ　Ｌ３ ＧＰｉ（ギネア豚角又柚胞　６４３±１０１　７８７±６９ＢＥＢ　人の胸　３ ７６±４３　測定せずＨｅＬａ　人の５＠％　９　’　０　３４±８、［５人） 補線ｄ芽ｍ％　０　３０：！＝８スイス３Ｔ３　ねずみ内皮＃Ｉｌ眉（？’＋　 １７±４　１５３±２１ＲＬＣＷ　ねすみ肝、＠笑實細胞　５６±１３９６±１ ３表３ アミノ酸組成（残留パーセント値として表わした）システィン酸　尚１定ぞず　 ２．１ ノＬ、ｑｐ　９．８　ｉ　０．９　９．８事　リジケｙ　Ｓ−Ｄ−とコレンＤ、 によるＪ、Ｅｉｏｌ、　Ｃｊｃｇ！ｎ、２５６゜７Ｄ３５−７０４ｍ（１９８Ｌ ）刀１らのデータでちる。

５ 浄書（内容（二変更なし） Ｆｔａ、３：　＊−ｙ、ｙ”、、、つ７゜−５゜、〜−、、＝ｐｘ魂蝉遍隻先６ ｍり ３２　１４表口ｇ　５０−５００３５１　（９’）で−汗１鴨傘ガｋｊｌ泗叱 碩０褒？、しら　１１斐、リ一い 憎つえ４１６　１０！、発、しｃｌｌ Ｆｌｃｙ、５　て７７−　？　−Ｉ４　■３−１”ｉ−’宮Ｌ・　デ【・λギ・ リアクｊｊ　ｌＶ行１′沖１・′も吹′寵Ｌ”ｒ？％印、東、東手続補正書（方 式） ％式％ り、事件の表示 ＰＣＴ／ＧＢ８３１０００６７ ２、発明の名称 ３、補正ケする者 事件との関係　特許出願人 名称　パブリック　ヘルス　ラボラトリ−サービス　ポード名称　ユニバーシイ ティ　カレッジ、ロンドン昭和５８伍１１月２２日 ６、補正の対象 国際調杏報弁 ＋ｍ５ｆｌＩａ＋：ｏＩＩａＩＡｕｐ’ｃ”ｔｌａ”ａ、　ＰＣＴ／ＧＢ　８３ １０００６７　２第１頁の続き ０発　明　者　エレクトリフワラ・アスガーイギリス・ウィルドジャー・サリス ブリー・イースト・ゴメルドン・ヒルサイド・ドライブ１６ ０発　明　者　グリフイス・ジョン・ブリアンイギリス・ウィルドジャー・サリ スブリー・ポートン・バーン・ガーデンス５ ＠発　明　者　ラター・アミ− イギリス・ロンドン・ニスイー７チヤールトン・ウニリントン・ガーデンス１９ フラット６ ０発　明　者　リレイ・パトリック・アンソニーイギリス・ロンドン・エフ２０ トツテリツジ・ローレル・ウェイ１５ ０発　明　者　サラトン・ピータ−・モーガンイギリス・ウィルドジャー・サリ スブリー・イドミストン・チャーチ・ロード２８イドミストン・マナー（番地な し） ０出　願　人　ユニバーシイティ・カレッジ・ロンドンイギリス・ロンドン・ダ ブリューシー１イー６ビーテイ・ゴワー・ストリート （番地なし）

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. １．非癌１罎性上皮細胞の確立された細胞線を培襲１．炉つ七養物〃）ら４累き 肩部分１分屋することを替像とする線維素分解活性自体お工び（又は）ブラズミ ノーゲン活性剤としての活性をもつ酵素の契法。 ２、酵素を含む上ζｌ故部分？捕果して酵素含有部分？える請求の範囲第１項に 記載の方法。 ３、細＋Ｊ出ルらｔｊｉ累含有部分全抽出して１素含有部分？える請求の＠囲へ ３１項に記載の方法。 ４、上記−１泡が補乳動物のものである請求の範囲第１項〃・ら３項ｆでのいず ：？′Ｌ炉に記載の方法。 ５、上記−通が人の細胞づ）らえられた確立された郁砲線である請求の範囲第１ 項刀・ら４項までのいずれ〃）に記載の方法。 ６、上記ｊ−送がギネア１隊角又祠施である請求の髭囲第１項刀・ら４項までの いずｎ刀ユに記載の方法。 ７、上記禎、個がＧＰＫとい四りれる確：さｆした細胎蔵である請求の範囲第４ ′５Ａｉ７こ記載の方法。 ８、上記幽鬼が人の胸部上皮、畑ｄ己である請求のｉΣ圀第１項〃５ら５項１で のいず几炉に配車の方法。 ９　上記廁砲がＢＥＢといわれる確立され定細胞葎である請求の範囲第８項て記 載の方法。 １０、鵡話＝Ｉ！１１清含石煤賃上で成長さぞ、血渭百有媒責全血清を含ｌぬ媒 Ａで誕侠して・つ［ｊ素を上記血倉？含ぽぬ好質工υ成る上澄液部分７１為ら回 収し又は細、咽刀為ら直接抽出する請求の範７ 囲第１項から９項までのいずれ刀ユに記載の方法。 １１、請求の範囲第１項力）ら１０項までのいずれ力・に記載の方法に工って製 造された酵素。 １２、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳ｌ法により還元条件のもとで測定し ６２，０００±３．０００．また非還元条件のもとで測定し５６，０００±２． ００　ＣｙＴ＆子ｆ、４．６の等重点および実頁的に表３の縦行ＧＰＫの下に示 すアミノ酸分析値七もつこと奮％徴とするａ維素分解活性自体お工び（又は）ブ ラズミノーゲン活性剤としての活性？もつ酵素。 １３、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法により還元朱件のもとで測定し て６２．０００±２，０００．また非還元条件のもとで測定して５６，０００±
2. ２．０００の分子量、４．６の等電点お工び実質的に表３の縦行ＢＥＢのもとに 示すアミノ酸分析値？もつこと？將徴とする綴維素分解活性ｇ体お工び（又は） ブラズミノーゲン活性剤としての活性ｔもつ酵素。 １４、請求の範囲第１項７０λら４項までと６項と７項のいずれかに記載の方法 で製造された請求の範囲第１２項足記載の酵素。 １５、請求の範囲第１項７０≧ら５項までと８項と９項のいず７′１．刀）に記 載の方法に工り製造さ几た請求の範囲第１３項に記載の酵素つ １６、＠維素分屏活性自体お工び（又は）プラズミノーゲン活性剤としての活性 上もつ請求の範囲第１１項所ら１５項までのいずれかに記載の酵素の化学変性さ れた約導体。 １７、請求の範囲第１１項７１＼ら１６項までのいずれ力・に記載の１孝素お工 び製薬上許容される稀釈剤又は担体工り成る製薬組成物。 １８、横歪する血管系統中に放射性同位元素でラベルした請求の範囲第１１項か ら１６項１てのいずれ刀為に記載の酵素の生理学的に許容される溶液全導入しか つ血管系統の放射能増加範囲で検査することニジ成る血栓症の検査方法。 １９、放射性同位元素が１ｎ５３１又はＩ３である請求の範囲第１８項に記載の 方法。 加、５０乃至５０００ＩＵの酵素を導入する請求の範囲第１８項又は１９項に記 載の方法。 ２１、診断、予防又は治療金目゛的とする請求の範囲第１７項に記載の製薬組成 物の用途。 ２２、診断、予防又は治療金目的とする請求の範囲第１１項から１６項までのい ずｆＬカに記載の酵素の用途。