JPS61502961A - ミナクチビン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ミナクチビン この発明は、ある種の細胞から分離した新しい蛋白質に関するものであり、この 蛋白質は、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲン　アクチベーターの特異的な 不活性化因子として作用するものである。

この発明は、人血の単核細胞、ある種のマクロファージ及び単核細胞由来の変換 細胞を付着単層培養することにより分離、同定された、ウロキナーゼ　タイプの プラスミノーゲン　アクチベーターの特異的不活性化因子に関するものである。

この不活性化因子を「ミナクチビン」と名付け、この物質について当該明細書中 ではこの名前を用いることとする。

プラスミノーゲン　アクチベーターは、多くの動物組織及び分泌液中に存在する 蛋白質分解酵素である。最も広く知られているプラスミノーゲン　アクチベータ ーの機能は、プラスミノーゲンをその活性型であるプラスミンへ転換する触媒作 用である。プラスミンの主な役割は、繊維素の溶解又は凝血腕の溶解作用である 。分子量、アミノ酸配列及び免疫反応性を異にする二つのタイプの咄乳類プラス ミノーゲン　アクチベーターに大別され、ウロキナーゼ　タイプのプラスミノー ゲン　アクチベーターと、組織タイプのプラスミノーゲン　アクチベーターに特 徴付けられる。乳房、肺臓、結腸及び前立腺の癌腫を含む人の主要な癌は、異常 な高レベルでウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクチベーターを生産 することが知られており、また、一連の証拠によって、このことは腫瘍が隣接組 織へ侵入する過程と関係することが分っている。

発明の詳細な説明 この発明は、人血の単核細胞を付着単層培養して得た上澄が、ウロキナーゼ　タ イプのプラスミノーゲン　アクチベーターの有力な不活性化因子であるミナクチ ビンを含有することを発見したことを基礎としている。ミナクチビンは、侵入す る腫瘍と深く関連するプラスミノーゲン　アクチベーターの天然の不活性化因子 であシ、それ故に、腫瘍の侵入及び転移に対する体内の通常の防御に、決定的な 役割を持つものであることが示唆される。ミアクチビンは、更に、医学の領域、 種々のタイプの癌腫の生体内及び生体外診断、そしてそれらの症状の治療などに おける臨床上の試薬として広く応用し得る可能性を有している。

ミアクチビンは、マクロファージ及び単核細胞由来の変換細胞の培養によっても 分離、同定された。

この発明の第一点として、ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクチベ ーターの特異的不活性化因子であるミナクチビンが、著しく精製された形で提供 される。この発明は、また、ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクチ ベーターの特異的不活性化因子であるミナクチビンを含む培養上澄を提供するも のであり、この培養上澄は、ミナクチビン生産細胞を試験管培養することによシ 得られる。この発明は、更に、ミナクチビンを含む培養上澄から得られた、少な くとも部分精製されたミナクチビン生産物を提供するものである。その他のミナ クチビンの特徴については、後に詳しく記述する。

この発明の第二点は、ミナクチビンの生産方法を提供することであり、それは、 ミナクチビン生産細胞の試験管培養と、培養上澄の回収から成る。ミナクチビン は、少なくとも部分精製生産物として培養上澄から回収される。ミナクチビン生 産細胞には、人血の単核細胞、ある種のマクロファージ及び人の変換セルライン が含まれるが、特に詳細に説明する。細胞から分泌されたミナクチビンを含む培 養上澄は、含まれるミナクチビンを濃縮すべくそして、少なくとも部分精製され たミナクチビンを生産すべく処理され、他の培養上澄の成分は除去される。この 濃縮及び＃Ｉ裂は、例えば、フェニル−セファロース　クロマトグラフィー又は ＤＥＡＥ−セファロースを用いたイオン交換クロマトグラフィーを利用し、目的 生産物を溶出させることによシ実施される。この生産物は、更に、アフィニティ ー　クロマトグラフィーによシ稍製され、例えば、Ｃ１ｂａｃｒｏｎ　Ｂ：Ｌｕ ｅ−セファロース又はハイド１０キシル　アパタイトを用いて他の不純物を除去 することによシ実施される。研究によると、ミナクチビンは、分子サイズが約６ Ｏ−７ＱＯＯＯ（ゲル　ろ過クロマトグラフィーによる）であシ、その阻害効果 は、Ｍｒ５２，０００（ＨＰＡｓ２）及び３へ０００（ＨＰＡ３６）のプラスミ ノーゲン　アクチベータ−（ウロキナーゼの如き）に特異的であシ、そのことは 、（１）　プラスミノーゲン依存性の繊維素溶解作用の阻害、ｆＩｌｌ　比色定 量アラを１で見られるプラスミノーゲン賦活レベルでの阻害及び　（１１１１プ ラスミノーゲン賦活化活性の不可逆的消失、によって示されるが、これらは、培 養基で前培養した後、電気泳動させると明白である。ミナクチビンとＨＰＡ３６ 型のプラスミノーゲン　アクチベーターの複合体は、洗浄剤耐性を示し、Ｍｒ　 ７０−７５，０００で特徴付けられる（ミナクチビンーＨＰＡ３６複合体）。

更に、ミナクチビンは、ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクチベー ター全選択的に阻害し、トリプシン、ズラスミン又は組織タイプのプラスミノー ゲン　アクチベータ−（ｄＰＡ６６又は６６．０００Ｍｒアクチベーター）は阻 害しないことが明らかとなった。

ミナクチビンは、人の単核細胞のみならず、ある種のマクロファージ及びマクロ ファージ直系の交換細胞によっても生産されることが見い出きれた。特に、腹膜 マクロファージ及び骨髄質マクロファージは、付着単層培養することにより、相 当量のミナクチビン金生犀し、分泌することが見い出された。人マクロファージ セルラインのＵ９３７は、テキサメタゾン（ｄｅｘａ、ｍ−ｅｔｈａｓｏｎθ） 全添加して培養すると、ミナクチビン全生産することが見い出された。この点に ついては、更に、付着単層培養によってミナクチビン金人血の単核細胞から生産 する場合、ムラミル　ジにプチド（アジュバント　ベプチ）’　）　、バクテリ アのりボボリサツカライビ又は活性化したリンパ球の培養物のリンホカイン含有 上澄、全円いて細胞を活性化することによって、生産を刺激し又は増強すること ができることが分かった。

人結腸の癌腫セルラインのＣ０ＬＯ３９４の培養物に６加すると、ミナクチビン は、特異的にプラスミノーゲン　アクチベータ−（ＨＰＡ　５２）ｋ不活性化す ることが、比色定量アッセイ及び電気泳動によって確認キれた。更に、ミナクテ ビンは、外科的に切除して得た人肺場の組賊ホモジエネートにおけるプラスミノ ーゲン　アクチベーター活性を、特異的に不活性化することができる。プラスミ ノーゲン　アクチベーターのレベルは腫瘍組織においては、相当する結腸の正常 組織と比較して著しく高いことが証明された。同様の観察は、広範囲の充実性腫 瘍に関して、他の研究者によっても実証されている。

それ故に、ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクチベーターに対する ミナクチビンの特異性及び腫瘍組織におけるこのプラスミノーゲン　アクチベー ターの著しく増強されたレベルの観点から、当該生産物は、組織学的標本及び生 体における腫瘍の境界の位ｔｉｆｔ、に定め、特定するための試薬として応用で きる。このように、ミナクテビンは、生体内の腫瘍全仮想するのに使用し得る。

特に、乳房、前立腺、結腸及び肺臓のような、プラスミノーゲン　アクチベータ ーを生産する充実性腫瘍は、ミナクチビンによって標的となり得る。このような σρ腫は一般的に、外科的処置で直るので、そのような腫ａｔ仮想する際のミナ クチビンの利用は、外科的処置の後に生起する小さい転移性癌を確認するのに特 に有用である。ミナクチビンは、天然生産物であるので、抗原性がなく、体内で の排除の問題を回避し得る長所があることももちろん評価されよう。そのような 腫瘍を生体内で仮想する場合、ミナクチビンを、ラベルした形例えば、適当な放 射性同位体（テクネチウム　など）でラベルして、投与した後、ミナクチビンに よシ仮想されるＩｌ！￥瘍の位置と境界は、通常のラジオアイソトープの操作手 段で決定することができる。

組織学的標本における腫瘍の境界の位置の決定と特定において、ミナクチビンは 、上記は放射性同位体と結合するか、又は、標準的な操作手段を用いて、適当な 酵素（又は他の適当な試薬）と結合させてラベル化できる。組織学的標本がミナ クテビンー酵素複合体と接触すると、ミナクチビンは、ウロキナーゼと、それが 分泌されて高濃度である位置において反応し、それによって、腫瘍の境界が確認 される。この高濃度の位置において見い出されるミナクテビンー醪素複合体の検 出は、通常の方法、例えば、酵素の基質全利用して、基質に対する酵素の反応全 検知する指示薬によって実施される。

柿！４を仮想することに加えて、ミナクチビンは、また、腫瘍のプラスミノーゲ ン　アクチベーター活性を減するので直接腫瘍の治療に用いられ、この活性は、 腫瘍が隣接組織に侵入する過程に関連していることから、腫瘍の侵入を規制し、 特に阻害することが可能となる。

ミナクテビンの一般的性質 ミナクテビンは、５６℃以上の温度で不安定であ、Ｄ、−２０℃の冷凍及び解凍 に対しては安定である（−サイクルすると〇−５％の活性を失う）。無菌粂件下 で採取した上＃全台むミナクテビンは、４℃においてゲンタマイシンの存在下で 、著しく活性が低下することなく、２ケ月間保存できる。

プラスミノーゲン　アクテベーターとミナクテビンの相互作用は、イオン強度が プラスミノーゲンの活性化に逆の効果を有するにもかかわらす０！１、イオン強 度に依存しないようである。

ウロキナーゼ活性は、比色定量アッセイにおいて、塩濃度により著しく阻害嘔れ るが、減少したウロキナーゼ活性に対するミナクチビンの効果は、比例的に同じ である。

ミナクチビンは、ｐｉ（５〜９で４℃において比較的安定である。塩の存在下で セファクリルＳ　３　Ｑ　Ｑ　（Ｐｈａｒｍａａｉａ）によるミナクチビン標品 のゲルろ過によると、ミナクチビンの分子サイズは、血清アルブミンを標準とし て、６Ｏ−７ＱＯＯＯ（第１０図）と同定された。このカラムから得た濃縮ミナ クチビン標品の特異性−＠５ＤＳ−ＰＡＧＦニー線維素カラムで分析したところ 、単核細胞培養から得たミナクテビン上澄について第６図で得た結果と同じであ った。しかしながら、ウロキナーゼの不活性化は、以下の点で血清アルブミンの 特性と異なる。すなわち、（α）人血清アルブミンは、ウロキナーゼの比色定量 アッセイに効力を有しない。（ｂｌ　ミナクチビン活性は、Ｂｌｕｅ−セファロ ース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）のアルブミン　アフィニティーカラムにより保持 されない、（Ｃ）人血清アルブミンの培地濃度は、ムラミル　ジペプチド又は前 記の誘導実験における細胞タイツ′で変化し得ない、　（１：／−１アルブミン 又は血清の補充なしで単核細胞はミナクテビンを生産する。

腫瘍の診断及び治療におけるミナクチビンの役割ある種の主要な人癌肺が、ウロ キナーゼ　タイプのプラスミノーゲ／　アクテベータ−（１−［ＰＡ５２）を正 常の組織に見られるレベルより著しく高レベルで生理すること〃工立証された。

Ｍａｒｋｕｓ及び共同研究者らの最近の研究では、酵素の含有量と種類につき、 単期間の組織培養による分泌割合（３４−３５）と同様に留意しており、肺臓、 前立腺、乳房及び結腸の）ＩΦ瘍力；含まれている（３０−３２）。更に、ＨＰ Ａ５２は、異なる遺伝子の生産物であり国、結腸の内皮性食細胞の、ような全て の血管新生組織中に遍在する組織タイプのプラスミノーゲン　アクチベータ−（ ）ＩＰＡ６６）の（ｆ白質分解又は他の修飾によって得られるものではないこと が確認された。違ケミ発現の変化は、人結腸癌の発達の間に上皮細胞で起こρ、 高レベルのＨＰＡ５２が生じることは明らかである。

細胞のプラスミノーゲ／　アクチベーターが関連する生物学的過程は、炎症反応 及び抽瘍の転移のような侵入及び組織破壊と関連するこれらの生理学上の結果を 含んでいる０８１つＮ瘍の侵入の媒介者としての役割に関係するプラスミノーゲ ン　アクチベーターの特異的作用は、細胞分裂を刺激すること０９、細胞表面全 修飾すること顛、細胞転＃全促進すること（イ１）、ＩＩ＊瘍に＠接した線維素 を消化すること（４つ、そし７て、コラゲナーゼを活性化すること０シなどを含 んでいる。

ミナクチビ／は、ウロキナーゼ　タイプのプラスミ／−ゲンアクテベーター（ｆ ｉＰＡ５２及びＨＰＡ３３）の有力な特異的阻害因子でらるので、慢性の炎症及 び種々のタイプの＠腫の診断、臨床試薬として、これらの症状の治療と同様に、 応用される。

ＨＰＡ５２の生体内活性を特異的に調節することによって、ミナクテビンは、組 織タイプのプラスミノーゲン　アクチベータ−（ｆｔＰＡ６６）　の役割に、止 血の維持の点で、影響金持たない。

更に、ミナタテビンは、天然生産物であるので、抗原性が無い長所がわり、また 、体内での排除の問題を回避し得る。

ミナクテビンは、それ故に、炎症的病状の指標として応用できる。最近、慢性的 炎症は、ステロイドで処置されるが、一般的に、治療の経過をモニターすること は困難である。ミナクチビンに対する抗体を用いて、体液又は組織中のマクロフ ァージの活性状態がモニターされ、治療の経過もモニターされる。炎症又は慢性 的潰瘍及び粘膜状の表面細胞層又は上皮に対する損傷は、多量の血液の単核細胞 の損傷領域への浸潤金もたらす。

この際に、単核細胞は、炎症の広がりに応じてミナクチビン全生産すべく刺激さ れる。

更に、ミナクテビンは、組織学的標本及び生体内における腫瘍の境界を確認し、 決定するための試薬として応用される。充実性腫瘍は、一般的に、外科的処置に より除かれるので、ミナクテビンの使用は、外科的処置に続いて生起する小さい 転移性病の確認を可能とする。組織学的標本の分析において、ミナクチビン又は その抗体は、工　のようなアイソトープでラベルされるか、又は、適当な酵素又 は他の化学試薬に結合される。

組織学的標本に接触して、ミカクチビンは、組織タイプのプラスミノーゲン　ア クテベーターと。その分泌位置において結合し、それによって腫瘍の境界が確認 される。複合体のミナクチビンは、公知の操作手段（４４−４７）によって、目 で観察し得る。生体内の腫ＪＪ３ｔ−仮想するために、テクネチウム　のような 適当なアイソトープでミナクテビン金２ベルし、投与した後Ｍ瘍の位置及び境界 が公知の２ジオアイントープ法（４７−５０）によって決定される。更に、ミナ クチビンは、プラスミノーゲン　アクチベーターの活性型とのみ結合するので、 生長又は侵入段階の腫瘍細胞全標的とし得る。

診断上の応用に加えて、ミナクチビンは、腫瘍の直接治療においても使用される 。腫瘍が隣接組織に侵入する過程に関連する酵素の特異的阻害因子として、腫瘍 の生長及び転移を規制し特に、阻害することができる。更く、ミナクテビンは、 生育する腫瘍に直接レクチン又は毒素を運搬する医薬運搬システムとして使用さ れる。このことは、特異的で著しく有力な抗腫瘍効力の見地から、多くの長所を もたらすものであること全認識させる。

ミナクテビンの生産、精製及び同定についての詳細は、以下の実施例により、添 付した図面と関連させて開示するが、これは、この発明の範囲を限定するもので はない。

この発明の好ましい具体例 実施例１ ミナクチビンの生物学的な開底及び特徴方法 １、　プラスミノーゲン　アクテベーターの比色定量アッセイいくつかのタイプ のプラスミノーグ／　アクテベーター酵素金、０，１％トライトンＸ−１００及 び０．１％ゼ２テン全含む５０　ｍＭグリクン緩衝液、Ｉ）Ｈ７，８、中で、Ｃ ＯｌＣｏｌｅ及びＧｒｅｅｎの方法ｆｌ？ｌ’ｉ用いて分析した。２−８　ｙｌ 　Ｐ１ｏｕｇｈ単位（ｍＰＵ）の活性範囲を保つように希釈した。酵素（１０μ μ）プラスミノーゲン（０１■／　ｘｉ、２０μρ）及び分析緩衝液（２０μｎ ）’！−４５分間、３７℃で培養し、次いで、プラスミン分析試薬（１ｄ、参考 分献１２参照）を加え、３０分間、３７℃で培養した。反応全トヲシロー、ｚｌ 加えて停止しくｏ、３〜／ｄで２０１！り、４１２ｎｍの吸収ｔモニターした。

単核細胞培養で補充的に用いた人血精アルブミン（１％）は、この方法では、ウ ロキナーゼの分析に影響しなかった。

人プラスミノーゲンは、リジン−セファロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラム０ ３のアフィニティークロマトグラフィーで、保存新鮮白帯より梢製全２度繰り返 し、最終濃度０．３ｕＭで分析に用いた。

人プラスミノーゲン　アクチベーターの利用可能な市販製品、すなわち、Ｃａｌ ｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ　Ｃｏｒｐ、　Ｌａ　Ｊｏｌｌａ　、　ＣＡ、 のＣａｌｂｏｉｏｃｂｅｍ　の資料の標準品のウロキナーゼ（ｆｌｏｔ　１０３ ２８５．１７００　Ｐｌｏｕｇｈ単位／小ビン）及びＳｉｇｍａウロキナーゼ（ Ｒｏｔ　ｌ０ＩＦ’−０５９９１、約４ＱＯＯＯＰｌｏｕｇｂ単位／■蛋白）全 使用した。これらは、ここでは、ＣＵＫ及びＳＵＫと、各々、する。これらの標 品は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及びそれに線維素を付加して展開させることにより、Ｍ ｒ　５′２．０００（ＨＰＡ５２）のプラスミノ〜ゲ／　アクチベーターとＭｒ 　３へ０００（ＨＰＡ３６）の蛋白質分解生産物の混合物であることが分つ友。

ラットの乳腺癌ライン１３７６２（Ｄｒ工、Ｒａｍｓｈａｗ　、　Ｄｅｐｔ、　 ＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌＰａｔｈ、ｏｌｏｇｙ　、　ＪＣ３ＭＲよシ入手）を 、０．５％トライトンＸ−１００ｔ−含むｐ）１７．８の５０　ｍＭダグリシン 中ホモゲナイズした。牛のトリプシン（ＩＸタイプ）、牛のトロンビン（グレー ド１）及び豚の血漿は、Ｓｉｇｍａから入手した。

２　ミナクテビンの比色定量アッセイ 培養上澄及び細胞溶解實中のミナクテビンの量は、ウロキナーゼ標準品の比色定 量アッセイ（１２１における阻害作用により決定した。試料（２０μｐ）は、プ ラスミノーゲンの添加に先立って４ｍＰＵ　のウロキナーゼと９０分間、２３℃ に前培養した。阻害作用は、プラスミノーゲン活性作用のレベルであってプラス ミンの阻害作用ではないことを実証するために、ミナクチビン金相当するプラス ミンの分析に直接添加することによるコントロールを実施した。１単位のミナク テビンが、ウロキナーゼのｌ　ｐ１ｏｕｇｈ単位を阻害する量であることが判明 した。

３　ラジアル　ディフュージョン　アッセイフィブリノーゲン（Ｓｉｇｍａタイ プＸ）、人プラスミノーゲン及びトロンビン（Ｓｉｇｍａ　１グレート）ｔ−１ ，２５％のアガロース（Ｐｌａｑｕｅ　％Ｆ’ＭＣＣｏｒｐ、、　Ｒｏｃｋｌａ ｎｄ　ＴＩＭＥ　ＵＳＡ）ゲルの１．２ｍ厚の基質に投じた。３７℃で固まった 後、ゲルを４℃で固化させ、ウロキナーゼ／ミナクチビン混合物（５μｍ）全適 用させるために３簡にカットした。

４、　５ＤＧ−ＰＡＧＥ　及び線維率オーバーレイによるプラスミノーゲン　ア クテベーター活性の展開 ＳＤＳ電気泳動ゲルに供する試料は、分析緩衝液中プラスミノーゲン　アクチベ ーター酵素のみか、あるいは、培譬上猷及び／又はプロプアーゼ阻害因子と９０ 分間、２３℃で前培養した酵素を含み、最終体積１１００＃Ｒとすべ（ＳＤＳ試 料試料緩衝液金石。用いたプロテアーゼ阻害因子は、１ラシロール、α　−アン チトリプシン（Ｓｉｇｍａ）　、大豆トリズシン阻害剤（（Ｓｌｇｍａ）、ヨー ド５アセトアミド、ＮＤＴＡ、ＳＤＳ、　トラネキサミン酸（Ａ：Ｌｄｒｉｃｈ 　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｍｉｌｗａｕｌｃｅｅ　ＷＩ）及びペンスアミジンで あった。ゲルの平板は、１１％ポリアクリルアミドであり、垂直に位置させ、ト ライトンＸ−１００で洗浄し、Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ　＆、　Ｒｅ １ｃｈの方法ａ３に従って、線維率／アガロースゲルの接解溶解によ）展開した 。線維率溶解の展開時間は、通常、３７℃で５−８時間であった。酵素的溶解バ ンドの分子量は、市販酵素の場合と比較して、アクリルアミドゲル中の標準蛋白 質の発色位置（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＬＭＷ　Ｋｉｔ）により決定した。

５、形態学及び細胞化学 位相差顕微鏡検出法のために、付着した単核細胞又はアクロファージの単層を２ 回洗浄し、０．１Ｍカコジル酸塩緩衝液（ｐＨ７，４）中で１．５％グルタール アルデヒ）”ｔ９１に実験に先立ち少なくとも室温で３０分間固着した。細胞遠 心分離標品を、５ｈａｎｄｏｎ　５ｏｕｔｈｅｒｎ　遠心機で調装した。詳しく は、１０％牛脂児血梢中に５０，０００細胞を含む０．２　ｒｔｔｌの標品ｔ″ ５００ｒｐｍで３分間回転させた。標品は、続いて、ドライヤーで直ちに乾燥し 、これｆ　Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌ＋ｄ　Ｇｉｅｍｓａ　で発色させた。

非特異的なエステラーゼの存在は、基質としてα−ナフチルアセテート（１０， １１）ｋ用いて評価した。

食細胞活性は、付着単核細胞又は細胞懸濁液ｌＯチ人ＡＢ血梢及び１．１ｕｍラ テックス　ビーズ（Ｓｉｇｍａ）　ｋ細胞当たシ１００ビーズの濃度で含むＲＰ Ｍニー１６４０中にて、３７℃、６０分間培養することにより評価した。非摂取 のビーズは、単層又は細胞懸濁液をＨＰＭＸ−１６４０で３回、２０℃、１５０ ｇにて１０分間洗浄することによシ除去した。２以上のラテックスビーズを摂取 している細胞を食細胞と判定した。

６、単核細胞及びマクロファージ細胞標品ａ）人血の単核細胞 人単核細胞の白血球を、Ｆ’１ｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　（Ｐｈａｒｍａｃｉ ａｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　５ｙａｎｅｙ、　Ａｕｅｔｒａｌｌｉａ） グラジェントにより、Ｗｏｄｅｎ　Ｖａｌｌｅｙ病院の赤十字血液輸血サービス において除去された軟層から分離した。混在する血小板を除去するために、４℃ でＰｉ／Ｎａｃｌ中で４回洗浄した後、細胞ペレットを６０単位／ｒｘｌ！のゲ ンタマイシンを含むＲＰＭニー１６４０（Ｇｉｂｃｏ　、　Ｇｒａｎｄ　ｌ５ｌ ａｎｄ　、　Ｎ　、　Ｙ　）中に懸濁させた。精製単核細胞の単層は、１０　単 核細胞を、人ＡＢ血悄２−を３０分間プレコートした３０調のウェル（Ｌｉｎｂ ｒｏ　ｍｕｌｔｉｗｅｌｌｐｌａｔｅｓ、　Ｃａｔ、　Ｎｏ、　７６０５８０５ ）中、１０％ＡＢ血精とＲＰＭＩ−１６４０にて平板培養することによって得ら れた。単核細胞は、空気中５％のＣＯ２条件で、３７℃にて６０分間付着させた 。非伺着細胞は、３７℃にて、Ｒ）’Ｍエニー６４０で単層を６回洗浄すること によｐ除去した。

付着した単核細胞は、いくつかの基準によジ８５％の単核細胞より多いことが分 った。単核細胞會ホリクローム酸塩で発色することにより、９４±６チの細胞は 、好塩基性細胞質を有する円形又はへこんだ大きな核？有する単核細胞であるこ とが示された。細胞質の酵素の発色により、非特異的エステラーゼは単核細胞の ８５±２％がこの単核細胞マーカーに対して陽性であることを示した。９１チの 付着細胞がラテックスビーズを食したことは、単核食細胞の形態学的、組織学的 外観を示す付着細胞集団がこの特徴的な礪１１シ特性をも表わすこと？Ｉｌ−確 認させるものである。

生体外培養の間に、単核細胞は細胞サイズ及び形態学的に著しい変化金波る。培 養単核細胞の細胞遠心分離標品は、単核細胞が培養期間中そのサイズを増加させ 、７日目の終りには見かけサイズは倍以上になる。時々、三核化した細胞も見ら れる。

単核細胞はサイズを増し、その細胞質は空胞の生じた状態になり、細胞質の顆粒 が顕在化する。更に培養すると多核の大型細胞の形成が増加する。

ｂ）腹膜マクロファージ 慣性の腎不全のため目常的に腹膜透４ｆＴを受けている患者から得た２１の透析 液を、２０℃、３００９にて、１０分間遠心分離した。細胞家レットを５０−の ＲＰＭニー１６４０に再懸濁し２０℃、２００９にて１０分間再遠心した。細胞 ？、次いで、肩６当たり約２×１０の最終′ｆ！に度にすべ（Ｒ１’ＭＩ−１６ ４０中に再懸濁し、腹膜細胞懸濁液６　ｍｆ　Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ　 ３　ｔｄと２０℃、４００９にて２０分間遠心分離した。細胞全１０％人ＡＢ血 棺？含むＲＰＭニー１６４０中にｌＸｌ０／ＩＩＪの濃度まで再懸濁した。

高収率の単核細胞が、腹膜洗浄物のＦ’１ｃｏｌｌ−％ｐａｑｕθグ２ジエント によ）得られた。細胞の４７％は、形態学的基準から判定するとマクロファージ であった。単核細胞フラクションの細胞遠心分離標品は、マクロファージ集団は 不均質であって、豊富な細胞質及び時として三核を持つ成熟細胞？、へこんだ核 及び細胞質の割合に応じた仁？有する単核細胞に特徴的な小さい細胞と１１）」 様に、含んでいることを示した。

腹膜マクロファージは、更に、単核細胞について前記したように、プラスチック の培養トレイに付着させて精製した。非付着性の細胞層を除去した後、培地を２ −３日毎に取り変えて、生存する腹膜マクロファージを、３週間に至るまで培養 維持できた。腹膜マクロファージは、非特異的エステラーゼで発色させて決定し た８７チのマクロファージよりも通常的に大きかった。

Ｃ）骨髄質由来のマクロファージ 新鮮な人腸骨稜及び肋骨髄質を整形外科的処理により得てこれを１０チの巨大細 胞腫瘍（ＯＣＴ）培養上澄（Ｇｉ　ｂｏ−Ｂｉｏｃｕｌｔ。

Ｇｒａｎｄ　工ｅｌａｎｄ、、　ＮＹ、　ＵＳＡ）及び１０チ牛脂児血精？含む ＲＰＭニー１６４０培地中に分散させた。この第一培養は、ゼラチンをコーティ ングしたフラスコ（１）で７日間続けた。その後、血液の単核細胞の場合と同じ 培養皿に付着させて、単核細胞／マクロファージを精製し、ミナクチビン測定の ために、第二付着培養を実施した。得られた細胞は、非特異的エステラーゼの９ ０チ陽性細胞より大きかった。

ｄ）結腸粘膜マクロファージ これらの細胞は、Ｇｏｘａｅｒ及びＤｏｓの方法（２）による結腸粘膜の酵素的 分離によって、切除でれた結腸から得た。これらは、単核細胞として、ＲＰＭニ ー１６４０中で付着単層として生育した。得られた細胞は、８５チの非特異的エ ステラーゼ陽性細胞より大きく、ヒツジ赤面細胞を食する。

７、細胞培養 α）単核細胞及びマクロファージ 単核細胞又はマクロファージ単層は、１チ人血精アルズミン（Ｃｏｍｍｏｎｗｅ ａｌｔｈ　Ｓｅｒｍ　Ｌａｂｓ、　、　Ｍｅｎ−ｂｏｕｒｎｅ％Ａｕ５ｔｒａｌ ｉａ）　ｆ含むＲＰＭニー１６４０中で培養した。前記（αＩ−ｆｄ１起源の細 胞の培養は、３Ｘ１０　ｃθ１１８／−培地の割合まで出来る限ｐ高密度に保っ て行なった。

以下の試剤を、細胞培養実験で用いた。

ｔＱ＋　ムラミル　ジハフチド（１（−アセテルームラミルーＬ−アラニル−Ｄ −イソグルタミン、Ｐｅｎ１ｎｓｕｌａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ。

Ｓａｎ　Ｃａｒｌｏｅ、　ＣＡ、ｔＪＳＡ）ｉ５　μ９／ｒｄ、（ｂｌ　Ｓａ１ ｍｏｎｅｌｌａｍｉｎｎθ５ｏｔａＲ５９５の細胞壁リポポリサッカライド（３ １゜後者は０．１％トリエチルアミン中水溶解性抽出物を超音波処理し、Ｐｉ／ ＮａＣ党に対して透析して調製した。培養物中の最後濃度は０．１μ９／ｍであ る。デキサメタシン及びフォルボール　ミラ　゛ステイト　アセチイト（Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、、Ｓｔ、Ｌｏｕｉｓ。

ＭＯ，ＵＳＡ）　は、最終濃度０．１ｕＭ及び１０μ９７ｍ／で各々用いた。

ｂ）変換セルライン 人マクロファージ様セルライン　Ｕ９３７（４１及びＨＬ６０（５１は、Ｄｒｓ 　ＲＵ１θｖｉｔｃｈ及びＲＧ　Ｐａ１ｎｔｅｒ　（Ｓｃｒｉｐｐｓｅ’１ｕｎ ｉｃ、ａｎａ　Ｒｅｅｅｏｒｃｈ　Ｆ’ｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｌａ　Ｊｏｌｌａ 、ＣＡ　、　ＵＳＡ　）カラ入手しり。ＬＪ９３７　セルラインは、ＡＴＣＣ（ Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ。

Ｍａｒｙｌａｎｄ、　ＵＳＡ）からも入手した。ＲＣ２Ａ（６）は、Ｄｒ　ＮＫ ｒａｆｔ　（Ｐｒｉｎｃｅ　Ｈｅｎｒｙｌｓ　Ｈｏ５ｐｉｔａｘ、Ｍｅｌｂｏｕ ｒｎｅ、Ａｕｅｔｒａｌｌａ）から入手した。ＭＬＡ１４４は、手長ザルのＴ　 １７７２球ライン（７）でおる。人称血球ジインに５６２ｆ８１は、Ｄｒ　Ｈ’ Ｓ　Ｗａｒｒｅｎ−Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｃｈ　Ｕｎｉｔ、Ｗｏｄｅｎ　Ｖ ａｌｌｅｙ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌから入手した。Ｃ０ＬＯ３９４は、人結腸癌腫細 胞セルラインであり、Ｄｒ　ＲＷｈｉｔｅｈｅｎｄ、Ｌｕｄｗｉｇ工ｎ５ｔｉｔ ｕｔｅ　ｏｆ　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ。

Ｒｏｙａｌ　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ　Ｈｏ５ｐｉｔａｌ　Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅよｐ 入手した。これらの細胞は、分桁のための上澄の採取に先立って、全て、血精な しにＲＰＭＩ−１６４０培地で生育した。細胞溶解質は、酵素研究のために０． ５　％　トライトンＸ−１００の存在下で調製した。

ミナクチビンの生物学的特徴 結果 細胞集団におけるミナクテビンの生産 α）人血の単核細胞 ミナクテビンは、　Ｃ０１Ｃ０１ｅ及びＧｒｅｅｎの比色定量アッセイ（１３（ 第４図）におけるウロキナーゼ活性の阻害作用により、付着性の人単核細胞から 血精の存在しない培地条件で生産されることが示された。この阻害作用は、人血 精によって細胞の初期的付着化が促進されるか否かにかかわらず観察される。付 着性単層の調製の間に得られる非付着性単核フラクションは、培養中、全くミナ クナビンを生産しない。

最大限のミナクチビン活性は、単核細胞の培養の最初の２４時間の培養上澄を用 いて得られた。継続する各２４時間の阻害因子生産率は、４日後にわずかＫなる まで減少を示した。このことは、培養上澄及び細胞溶解質の双方に見られた。し かしながら、ムラミル　ジはプテド又はバクテリアのりボポリサツカライドによ って単核細胞の生体外の活性化し、ミナクテビ／の生産及び分泌を促進させた（ 第１Ａ及び１９図）。最初の２４時間の期間の培養土Ｕにおける阻害因子の量は 、細胞数と相関関係を示す（第２図）。ミナクチビンの最大レベルは、細胞濃度 が１０　ｃｅｌｌθ／プより大きい培養条件で生産される。少い量のミナクチビ ンが（細胞当九勺）、高い細胞濃度において生産される。人の線維芽細胞の培養 においてプラスミノーゲン　アクチベーターの阻害因子の合成を誘導することが 以前に示されたデキサメタシンと単核細胞を培養しても（１０−１０Ｍ）ミナク テビンの生産上影響を示さなかった。

ｂ）人腹膜マクロ７アージ 新鮮に分離した血液単核細胞の溶解質は、ミナクテビンを含有していないが（第 １Ｅ図参照）、新鮮に分離した付着性の腹膜マクロファージの溶解質は、全て、 著しいレベルのミナクテビンを含んでおり（約３０％の阻害作用）、続いて培養 中に増加する（第３図）。このミナクテビンの持続的生産は、相当する培養上澄 中で測定される分泌生産物のレベルにも反映される。

コントロールの単核細胞培養と違って、腹膜マクロファージ溶解質のミナクテビ ンのレベルは、３日間の培養期間中高レベルを保持した。この細胞集団は、形態 学的にみて大部分新しく増加した単核細胞から成ると考えられ、繰シ返される透 析によって誘導場れる軽い炎症による生体内での刺激は、腹膜腔内においてミナ クチビンを生産するための単核細胞を増加させ、活性化するに充分なものである ことが示される。腹膜マクロファージは、溶解質又は上澄中でのミナクテビンの 生産に対してムラミル　ジペプチドの温石がＶ／’ｌ＃Ｌないことから、更に活 性作用金高めることはないと考えられた（第３図）。

Ｃ）骨髄質由来マクロファージ 骨髄質マクロファージは、最初の骨髄質培養で生育？刺激してＧＣＴ（６１ａｎ ｔ　ｃｅｌｌの腫瘍培養上澄）の７日後の付着性細胞として得た。この細胞は、 組織の７日商の最初の培養の後の第二培養として研究が行なわれたので、それら の最初のミナクチビン生産及び分泌は、新鮮に分離した血液単核細胞又は腹膜マ クロファージと直接比較できない。

それにもかかわらず、７日間の最初の培養の後、第二培養の間に得た付着性骨髄 質マクロファージの溶解質は、ムラミルジ投プチドの存否にかかわらず減少を示 したミナクチビン活性を高レベルで示した（第４図）。これらの骨髄質細胞は、 上澄に高レベルのミナクチビンを分泌することが見い出され、その影響は受けな かった（第４図）。

ｄ）結腸粘膜マクロファージ 切除した人結腸の酵素的分離粘膜から分離したマクロファージは、培養中きわめ て限られた活性のミナクチビンを生産し、そのレベルは、前記の３塊の場合と比 較するとわずかであった（４つの実験で２４時間の上澄の阻害作用の平均値は４ チ）。

この低レベルは、Ｓａ１ｍｏｎθｌｌａ　ｍｉｎｎｅｇｏｔａ　のりポボリサツ カライドを培養物に添加しても（０，１μ９／ｌ／）　、増加しなかった。

、鴫のマクロファージの反応の不足は、それらの分離に際して用いた分解酵素（ コラゲナーゼ及びＤＮＡ　ａｓｅ　）　Ｋ長くさら、したことによるかどうか確 認するために、正常の人血単核細胞を腸のマクロファージ標品からの上澄培地で 数時間培養させた。

血液単核細胞を処理した酵素は、続く培養中ミナクチビン全生産し、分泌する機 能を保持していた（表１）。

表１ コントロール単核細胞　酵素処理 溶解質　９０％　１００％ 上ｉ　６７チ　７２％ ＤＮＡａｓｅ　及びコラゲナーゼを含む結腸分解物の上澄で培養した前又は後の 人血単核細胞によるミナクチビ／の生産。結果は、単核細胞上澄によるウロキナ ーゼアッセイの阻害チとして示した。

このように、血液単核細胞は、ミナクチビンの分泌を可能とする理想的生育段階 にあることが示される。この可能性は、ムラミル　ジにプチドで生体外で活性化 されるか、又は生体内の炎症部位に対して活性が増加することで実現される。一 方、腸粘膜から分離された成熟組織のマクロファージは、刺激にかかわらず、分 泌ミナクテビン？生産する能力を欠乏しているように見える。

ｅ）入マクロファージ　セルラインＵ９３７ミナクテビン活性は、Ｃｏｄθｍａ ｎ及びＧｒｅｅｎの方法（１２＋によって評価した場合、人マクロファージ　セ ルラインＵ９３７から得た上澄中に見い出すことができなかった。しかしながら 、このセルラインをデキサメタシン（１μＭ）の存在下で培養した場合、著しい レベルのミナクテビンが培養上澄中で測定された。

このことは、生産されたミナクチピンと実際上結合したＵ９３７セルによるプラ スミノーゲン　アクテベーターの生産によって説明され、従って、比色定量アッ セイでは、隠れて探知し得ない。実際に、Ｕ９３７　セルを７２時間培地を含む デキサメタシンで処理すると、高レベルの細胞内のプラスミノーゲン　アクテベ ーター活性が％　０，５％トライトンＸ−１００の細胞抽出物中のプラスミノー ゲン　アクチベーター活性の評価によって測定されるものとして誘導された。デ キサメタシンなしで７日間以上培養したＵ９３７　セルは、完全に、ミナクテビ ン生産能を失った。デキサメタシンに加えて、最終濃度１０μＭに至ると、ミナ クテビン生産を回復しなかった。

Ｕ９３７　セルにより本貞的に分泌されるミナクテビンのレベルは、培養中ムラ ミル　ジにプチドで誘導される単核細胞による生産レベルの約４倍低かった。し かしながら、Ｕ９３７セルにより分泌でれるミナクチビンのレベルは、フォルボ ール　ミラステート　アセテートのようなフォルボール　エステル全培養中のセ ルに添加することによって１６倍に増強でれた。ミナクテビン活性は、人のマク ロファージ様セルラインＲＣ２Ａ又は人（Ｊｕｒｋａｔ）及び手長ザル（ＭＬＡ １４４）由来のＴ−リンパ球セルラインから得た上澄中には見い出せなかっ友。

２　ミナクチビンの特異性 α）繊維素溶解の阻害作用 プロテアーゼのミナクテビ／による阻害作用の特異性は、単核細胞の培養上澄を 含むミナクチビン全フィブリン／アガロース　ゲル中にて種々の酵素と培養する ことによって研究された。プラスミノーゲン（２０μｇ／ｍｌ＞　ｋ、プラスミ ノーゲンアクテベーター活性？発現し得るべくゲル混合物中に含有させ、３７℃ 、２０時間の培養後に比較し得る溶解性を与えるべく適当な酵素濃度が選ばれた （第５図の記載参照）。

ミナクテビンは、明らかにプラスミン又はトリプシンの阻害因子でないことが、 ２３℃、２時間これらの酵素と前培養して判明した（第５線）。人のプラスミノ ーゲン　アクチベーターの内、ミナクチビンで処理した場合、ウロキナーゼの二 種の標品（ＣｔＬＫ及び５ＵＫ）が、全て、線維素溶解能を失った。しかしなが ら、はぼ全てが組織タイプのプラスミノーゲン　アクテベーター（ＨＰＡ６６） Ｃ以下参照）である人メラノーマの培養上澄の線維素溶解活性は、ミナクテビン によっては、前培養の後でも阻害されなかった。トロンビンによるフィブリノー ゲンの凝血化も、ミナクチビンの影響を受けなかった。

ｂ）比色定量アッセイによる阻害作用 Ｃｏ１θｍａｎ及びＧｒｅｅｎ　ｔｉ’ＺＪの評価方法ケ、ミナクテビ／阻害作 用の特異性を研究するために、更に、利用した。プラスミノーゲンの不存在下で プラスミン　アッセイ試薬と培養する方法がｃｌｚ、プラスミンと同様にトリプ シンの高感度の評価法として使用され、プラスミノーゲンの存在下で、数タイプ のプラスミノーゲン　アクチベーターが評価された。しかしながら、記載すべき 例外は、人のメラノーマの培養物中のＨＰＡ６６であり、これは、おそらくフィ ブリ／の欠乏によってａｅ、この評価においては不活性であった。

ミナクテビンは、トリプシン又はプラスミ／のリジン　チオエステラーゼ活性全 阻害しなかった（表２）。しかしながら、ウロキナーゼ　タイプのプラスミノー ゲン　アクテベーター、ＣＵＫ、ＳＵＫ　及び手長ザルのＴ−リンパ球ライン（ ＭＬＡ１４４）のＡＰＡ５２．のプラスミノーゲン依存活性は、ミナクチビンに よって著しく阻害された。更に、ウロキナーゼの阻害は、ミナクテビンが、プラ スミノーゲンと培養する間に存在する場合にのみ観察され、プラスミンアッセイ 段階でミナクチビンを添加しても起こらなかった。

希釈したラツ）　１３７６２６瘍のホモゲネート中に存在するラットプラスミノ ーゲン　アクチベーター活性（ＲＰＡ４８、おそら１ＰＡ５２　と同類体）は、 ミナクチビンに影響されなかった。

トリプシン　６ｎ！ｊ　Ｏ，３２０，３１９７プラスミン　１８０ｎｌＩ　Ｏ， ９４０，９８１０４ＣＵＫ　４ｍＰＵ　Ｏ，７２０，０００ＳＵＫ　８ｍＰＵ　 Ｏ，８８０，０００メラノーマ　２０μ旦上澄　０．０５　０．０７　−ＭＬＡ １４４　２０μ皇上澄　０．６９　０．０８　１２１％才斗 ラット屑用−１３７６２２０ｐｌヶオート０．５３　０．５０　９４ミナクテビ ンによるプロテアーゼ比色定量アッセイの阻害作用。非希釈ミナクナビン培養上 澄（２０μ２）？、最終体積が４０ｔｚｌ）、となるようにして酵素と２３℃、 ２時間前培養し友。

プラスミノーゲン（２０μｆｌ、１００μｇ／五ｇ）？、次いで、アクナベ−タ ーに添加し、プラスミンアッセイ試薬（ｌｄ）ｉ、他のプロテアーゼに添加し、 各々、発色ｌｆｆ１ｌｌＩＩ’を行なった。

Ｃ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ　及Ｕ線ｍ素オーツｚ−Ｌ／（Ｇｒａｎｅｌｌｌ−Ｐｉｐ ｅｒｎｏ　＆　Ｒｅ１ｃｈの線維素オーバーレイ方法（＋４）ｔ、ミナクテビン の阻害作用の特異性を立証し、ミナクチビンによって種々のプラスミノーゲン　 アクテベーターが不可逆的に不活性化されるかどうか確認するために利用した。

酵素のミナクチビンとの前培養は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　によシ行ない、残余の酵 素活性は、プラスミノーゲンを補充したノイズリン／アガロースゲルの溶解領域 として観察した。

アクリルアミド及びタイプリン　ゲルを一緒に５時間培養して、コントロール（ 未処理）のウロキナーゼ（ＣＵＫ）による顕著なバンドが形成された。一つは、 ＨＰＡ５２の特徴を示し、他は、その蛋白質分解生産物、ＨＰＡ３６　の特徴？ 示した（１７）（第９図レーン１）。しかしながら、５ＤＳ−ＰＡＧＥの前に、 ＣＵＫｔミナクチピンと前培養すると、わずかに溶解した一本のバンドが、５時 間後に、オーバーレイしたゲル中に見い出され、これは、ＨＰＡ５２よりも高分 子量の位置に位置していた（第９Ａ図、レーン１０）。ゲル金２０時間培養する と、このバンドは、著しく増加し、ｆ（ＰＡ、３６として観察でれたものよりも 高分子量の位置にバンドが加わった←第６図、レーン２）。これらの結果は、最 終的に残った活性が未処理の酵素のものより高分子量のものを生起させる形で、 ミナクチビンがＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６？不活性化することを示す。このよう に、ミナクチピンとウロキナーゼの相互作用の形態は、複合体の形成又はウロキ ナーゼの構造上のラジカルな変化であり、これが電気泳動の移動度に影響すると 考えられる（３、参照）。ＨＰＡ３６は、ＨＰＡ５２よりも不活性化を受け易い と考えられる。

手長ザル　セルラインＭＬＡ１４４は、血精の存在しない培地中にプラスミノー ゲン　アクチベーターを分泌させるか、５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び線維素で展開する と、この活性は、人ウロキナーゼのＨＰＡ５２と同じ分子量機に二つに分離した ノ２ンドを形成した（第６図、レーン３）。これらのバンドは、いずれも、ＭＬ Ａ１４４　の培養上澄會ミナクチピンと前培養しても影響を受けなかった（第６ 図、レーン４）。人メラノーマの培養上澄のＭｒ６５０００のプラスミノーゲン 　アクチベーター及びラット腫瘍のＭｒ　４８，０００のプラスミノーゲン　ア クチベータは、ミナクチビンで処理しても彰’！ｌｋ受けなかった（第６図、レ ーン７＆８）、これらの結果は、ミナクチビンは、人ウロキナーゼ　タイプのプ ラスミノーゲン　アクチベーター（ＨＰＡ５２及びＨＰＡ３６）′Ｊｋ特異的に 阻害し、大組織タイプのプラスミノーゲンアクチベータ−（ＨＰＡ６６）及び、 他の（少なくともある種の）呻乳動物のプラスミノーゲン　アクチベーターを阻 害しないことを示している。

３、　ミナクテピンとウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲンアクチベーター の相互作用 ミナクチピンとウロキナーゼの相互作用金、プラスミノーゲンの存在下でミナク チビン及びＣＵＫｉ前培讐し、続いて、前記した比色定量アッセイにおける残余 のプラスミノーゲン　アクチベーター活性を評価することにより、分析した。不 活性化は、２３℃で２時間以上の時間を要し、残余のプラスミノーゲン　アクテ ベーター活性の最終レベルは、ウロキナーゼ、ミナクテビン及びプラスミノーゲ ンを混合したゼロ時間の半分以下であった（第７図）。２時間の前培養の間に、 不活性化は、当初、急速で、それ以降、一定となシ、更に、前培養しても残余の ウロキナーゼは不活性化しなかった。この結果は、反応が、例えばウロキナーゼ がプロテアーゼで分解されるというよりも化学量論的に行なわれたことを示唆し た。培養上澄を含むミナクテビンの希釈液でウロキナーゼを滴定して、第８図に 示す相互作用曲線金得た。４ｍＰＵのウロキナーゼ（ＣＵＫ）活性は、この実験 で用いた培養上？Ｖ１．５μ２０等量で、５０％不活性化はれた。

この実験で用いた培養上澄は、前記のＮＭ維系溶解実験におけるコントロールで 示されるように（第５図）、一般的な蛋白質分解活性を、高感度比色定量アッセ イにおけるリジン　チオエステラーゼ活性？欠くことからして、示さなかった。

しかしながら、ミナクテビンによるウロキナーゼの不活性化に、これら二つの分 子のいずれかの蛋白質分解活性が含まれるか否か確認するために、ＣＵＫｅミナ クテビンなしで、広範囲のプロテアーゼ阻害剤の存在下で、前培養した。プロテ アーゼ阻害剤及びその最終濃度は、次の通りであった。上２シノール　０２η／ ゴ、α□−抗トリプシン１６μ９／ｙｔｌ、大豆トリプシン阻害剤０、１６　ｍ ９／１ｒｔｔ、　ヨードアセトアミド３　ｍＭ、　ｈＥＤＴＡ　６　ｍＭ。

５ＤＳ０．６％、トラネキサミン酸３ｍ１ｉ４　及びベンズアミジン３ｍＭ、こ れらの前培養物を次いで５ＤＳ−ＰＡＧＥ　で処理し、ウロキナーゼ活性？、前 記のように線維素溶解により観察した。

ミナクテビンの存在下における各プロテアーゼ阻害剤によるコントロールの前培 養によって、大豆ト＋）−ｊシン阻害剤のみが、電気泳動後に見られる通常のＨ ＰＡ５２及び）［ＰＡ、３６のバンドを消失させることが示された。ミナクチビ ンの存在下で各前培蓋を行なった場合、他のどのプロテアーゼ阻害剤も、ミナク チビンによるウロキナーゼの不活性化を防ぐことはできなかった。

しかしながら、ＳＤＳば、ミナクテビン添加の前後にウロキナーゼに添加すると 、その不活性化を防止した（第９図、レーン８）。このように、ミナクチビンは プラスミノーゲン　アクチベーターの阻害剤というよシも、不活性化因子である といえよう。

更に、これらの結果は、ミナクチピンとウロキナーゼの反応形態として、先ず可 逆的な複合体の形成段階、次いで、酵素とミナクテビンの１：１の複合体の分子 量よりも小さく、酵素自体よりも高分子量の不可逆的生産物金主じる５ＤＳ−感 受性段階（プロテアーゼ阻害剤に対しては非感受性）のあること金示す。このよ うに、前培養のゼロ時間に５ＤＳＩ添加すると、完全に、ミナクテビンの阻害効 果を消失させ、ミナクテビンによる前培養に次いでＳＤＳで処理すると、ＨＰＡ ５２及びＨＰＡ３６を完全に、阻害する。わずかの活性が、長時間展開させると 、高分子量の位置に見られたが、これは、ミナクテビン？添加するとＩＩＷ−Ｊ れた。これらは、少量の一部活性化した酵素か又は当初の可逆的複合体からの解 離によること？示す。

人マクロファージ直系の変換細胞から得た多くのプラスミノーゲン　アクチベー ターについて、比色定量アッセイによシそのミナクテビンの不活性化作用全テス トした。ミナクチビンは人マクロファージ　プレカーサー　セルライン（ＨＬ６ ０）及び人マクロファージ様白血球セルライン（ＲＣ２Ａ）のプラスミノーゲン 　アクチベーター？著しく阻害した（表３）。人界血球セルライン（Ｋ５６２） 及び霊長類のＴ−）ンパ球セルライン（ＭＬＡ１４４）によって分泌されるプラ スミノーゲン　アクテベーターは、阻害されたが、マウスの尿のウロキナーゼは 阻害されなかった。

表３ ＰＡ起源　ウロキナーゼと等価にし几阻害率チウロキナーゼ　９５ 単核細胞　１８ ＲＣ２Ａ　８０ ＨＬ６０　７８ に５６２　７５ ＭＬＡ１４４　６０ マウスの尿　４ 人の変換セルラインを含む、徨々の起源から得たプラスミノーゲン　アクテベー ターの単核細胞ミナクテビンによる阻害。

４、他の細胞集団から得たミナクテビ／の特異性能のマクロファージ構胞集団に よって生産されるミナクチビンは、単核細胞によって生産されるミナクテピンと 同じく、人ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクチベーターに著しい 特異性を示すことが、フィブリン　ラジカル　ディフュージョン　アッセイによ り確認された。

プロテアーゼ、プラスミノーゲン　アクテベーター、プラスミン、トリプシン、 ＨＰＡ６６（人メネローマ培養上澄から得た組織タイプのアクチベーター）及び 入ウロキナーゼ（ＨＰＡ５２及びｆ（ＰＡ３６）’に選択して、各細胞集団で生 産されるミナクチビンによる阻害作用をテノートした。

ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクテベーターの特異的阻害作用は 、腹膜マクロファージ及び血液単核細胞の培養上澄に観察された（第１１図）。

これらの細胞で生産されたミナクチビンは、プラスミン、トリプシン又はＨＰＡ ６６の活性に影４＋を示でなかった。腹膜マクロファージ、血液単核細胞、骨髄 マクロファージのトライトンＸ−１００で溶解した全細胞溶解質は、全て、ウロ キナーゼ　タイプのプラスミノーゲンアクテベーター金阻害し、プラスミン又は トリプシンを阻害しなかった。しかしながら、血液単核細胞及び腹膜マクロファ ージの溶解質は、ＨＰＡ６６に弱い阻害作用を示した（第１１図）。

Ｕ９３７セルにより生産されるミナクテビ／は、その一般的特徴において、単核 細胞由来のミナクテピンと同じであった。

Ｕ９３７及び単核細胞の精製ミナクチビンを用いたフィブリンラジカル　ディフ ュージョン　アッセイによシ特異性を比較して、これらのミナクテビンは、ウロ キナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクテベーター、ＣＵＫ及び５ＵＫ（ｉ ７％異的に阻害し、組織全タイプのズ２スミノーゲ／　アクテベータ−（ＨＰＡ ６６）ｋ阻害しないことが確認された（第１２図）。プラスミン及びマウスのウ ロキナーゼでは、阻害作用が見られなかった。

単核細胞及びＵ９３７セル由来のミナクテビン標品の電気泳動における移動度は 、非変性、不連続性ポリアセチルアミドゲル　システムで比較すると、非常に似 たものであった（第１３図）。Ｕ９３７セルラインのミナクチビン標品は、単核 細胞のミナクチビンより、わずかに大きい電気泳動上の移動度を示した（第１３ 図）。このわずかの差異は、ゲル上の溶解の量的差異又はこの異なる起源のミナ クテビンのグリコシレージョンの差異によろう。

Ｕ９３７セル又は単核細胞から分離したミナクテビンは、フィブリン　ラジアル 　ディフュージョン　アッセイによると、人胎盤から分離したプラスミノーゲン 　アクテベーター阻害因子器と特異性を異にする（第１２図）。人胎盤阻害因子 （ＣａｌｂｉＯＣｈθｍ）は、ウロキナーゼ　タイプ及び組織タイプのプラスミ ノーゲン　アクチベーターの両者を、ミナクテビンの阻害作用は前者に特異的と 考えられるも、不活性化する。

実施例２ ミナクテビンの絹製方法 １゜人単核細胞培養からのミナクチビンの＃製人血ケ、先ず白血球の白い「軟層 」を赤血球層の上部に形成させるべく遠心分離して、単核細胞を分離した。Ｆ’ １ｃａｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ上で層を形成させて、白血球全１顆粒球単核細胞を 含むリンパ球に分離した。単核細胞は、リンパ球より、遠心分離溶出法により分 離した。

精製単核細胞（通常、３−４旦の血液から５−８Ｘ１０　細胞が得られる）は、 ０．２０−０．３４ｘｌＯｅｅｌ：Ｌｓ／ｃ＋＋１　の密度で１５ｃｍのプラス チック皿（ゼラチンで前処理し、人血梢で洗浄する）に付着させ、０．０５μ９ ／Ｉｌｌのムラミル　ジイプチド（アジュバンドイプチド）ヲ含む血精不存在の ＲＰＭニー１６４０（０，５０−０，７５ｍ７１０　ｃｅｌｌｓ）で培養した。

培養を３時間続けた後、培地？採取し、遠心分離により清澄化した。次いでＮａ （Ｊｌ　ｋ上澄に２Ｍまで添加し、これを４℃でフェニル−セファロース　アフ ィニティー（Ｐｈａｒｍａｃｊ、ａ）にかけた。カラム全２ＭＮａＣ１ｋ含む、 ｐＨ７，８の５０　ｍＭグリシンで洗浄して蛋白質全除去し、そして同じ緩衝液 中ＮａＣ１の下降グラジェントにより固着した蛋白質を溶出させた。このグラジ ェントのフラクションを用いて、　Ｃｏｌθｍａｎ及びＧｒｅｅｎ　の方法（１ ２１により、ミナクテビン活性？評価した。蛋白質濃度は、Ｌｏｗ巧・法（２） により決定した。代表的結果？第１４図に示す。最も活性の高いフラクションを 保管し、ｐＨ７，８の５０　ｍＭグリシンで透析し同じ緩衝液で平衡にしたＣ１ ｂａｃｒｏｎ　Ｂｌｕｅ−セファロール（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のアフィニティ 　カラムに、そのまま又はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　（Ａｍｉｃｏ）で濃縮し て、かけた。ミナクチビンは、吸着でれないが、他の不純蛋白質は、カラム中に 残った。

この操作によって得られた精製度合は、蛋白質（Ｌｏｗｒｙ法）及びウロキナー ゼ阻害作用の比色定量アッセイにおけるミナクチビ／活性の滴定全基礎として、 Ｌ０００倍のオーダーであった。

ミナクテビン生産物とウロキナーゼの相互作用は、ミナクテビン培養上澄につい て観察でれたように（第８図）、化学量論的であった。ミナクテビン生産物は、 ２００−５００単位／プのミナクチビｙ金含むが、ぐナクテビ／ｇ分は、５ＤＳ −ポリサッカライド　ゲル電気泳動によっても明確に同定し得なかった。

この方法によるミナクチビンの精製に続いて、培養中生体内にラベルした（　Ｓ −メチオニン）単核細胞標品を用いて５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル電気泳 動を行なった。３日間で多くの蛋白質が血精不存在の培養基中に分泌され、続く フェニル−セファロース　クロマトグラフィーにより、著しく比活性が増加した （第１５図）、他の不純蛋白質は、更に、Ｂｌｕｅ−セファロース　りロマトグ ラフイにより除去した（第１６図）。

ウロキナーゼ（ＨＰＡ３６）ｋ、これらのミナクテビン標品と培蓋したところ、 分子量の移動が観察され、Ｍｒ　７０−７５０００のウロキナーゼーミナクナビ ン複合体が得られた（第１６図）。

電気泳動の移動度におけるこの変化は、ミナクチピンとしての蛋白質の分子量を 同定するために利用可能である。この移動はＭｒ　３９−４ａＯ００のミナクテ ビン標品中の主要な蛋白質バンドの消失と相互に関係する。Ｍｒ６ＱＯＯＯ及び ３２．ｏｏｏのバンドも観察された。単一の蛋白質バンドは、分子量３０−３５ ．０００に相当するものであった。

２　人マクロファージ　セル　ライｙ　Ｕ９３７のミナクチビ／の精製 細胞培養 非付着性の人マクロファージ　セル？（ン　Ｕ９３’ｌ、１０％牛脂児血精及び １μム４プキサメタゾンを含むＲＰＭ工１６４０中で、Ｔ１７５培養フラスコ又 は１０１　Ｂｒａｕｎ　ファーメンタ−を用いて培養した。細胞濃度は、１−３ Ｘ１０　ｃｅｌｌｓ／ゴ　に保持した。生長期の間に、細胞によってミナクテビ ンが分泌されるか、細胞は、ミナクチビン精製のための上澄全書るべく血精不存 在の培地に移した。細胞イレットヲ、洗浄し、１μＭのデキサメタシンを含むＲ ＰＭ工１６４ｏ中に懸濁させ、３日間培養した。細胞の生育力を高めるために、 ０．７％ゼラチンを血精不存在培地に添加した。ゼラチンの添加により、ミナク チビンの活性は、４−８倍に増加した（第１７図）。

細胞を採取し、上澄１に精製の実施例に用いた。実施例は、精製ミナクテビン標 品を得るために、適宜の組み合わせ及び順序で行ない得る。

精製実施例１　ステップｐＨ溶出法によるフェニル−セファロース　りロマトグ ラフイー ０．７％ゼラチンの存在下で培養したＵ９３７セルから得た上澄全周いてミナク テビンを精製した。５０ｔＡ’のフェニルーセフアロース　カラムを、２　Ｍ　 ＮａＣｆ１’ｒ含む、ｐＨ５，５の５０ｍＭクエン醒塩で平衝にした。Ｕ９３７ 培養上澄１．６２について、クエン酸でｐＨ５，５に調節し、カラムにかける前 に、ＮａＣｆＬｆ２Ｍ濃度まで添加した。カラムは、同等の緩衝液で、充分、洗 浄し、次いで、Ｑ、５ＭＮａＣρ？含む、ｐＨ５，５の５０　ｍＭクエン酸塩で 洗浄した。次いで、ミナクテビンに５０ｍＭグリシン、ｐＨ７，８で溶出し、Ｃ ｏｌｅｍａｎ及びＧｒｅｅｎ　（ｒ）比色定量法ａＺにより活性を肝卸した。蛋 白質含有量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（至）により決定した。結果？、第１８図に 示す。

回収率は、ａ３６０　Ｓナフチビン単位、又は、比活性では１４０単位／ηで、 ６６％であった。これは、２１４倍の比活性の増加を意味する。

精製実施例２　塩溶比法によるバッチ式フェニル　セファロース　クロマトグラ フィー Ｕ９３７　セルをゼラチン不存在下゛で培養して得た上澄を用いてミナクチビン を精製した。

ａ）血精不存在ミナクテビ／上澄の濃縮４−５　ｆｉの上澄を、３ＱＯＯＯＭＷ カットオフ　カートリッジを装備したＡｍ１ｃｏｎ　ＤＣ２Ｈｏｌｌｏｗ　Ｆｉ ｂｅｒ　Ｄｉａ’１ｙｓｉｓ　／Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎユニットｅ用いて 、１０倍濃度に濃縮した。

濃縮物は、次いで、全ての着色物を除去するために、ｐＨ７，８の５０　ｍＭグ リシンで透析した。

ｈ）ミナクチビン濃縮物の遠心分離 透析した濃縮物？、ＪＡＬＯロータ中で、残余の細胞の破片及び透析中に沈澱し た蛋白質を除去すべく、４℃、ａＯｏ。

ｒｐｍ　で３０分間遠心分離した。清澄化した上澄７分画し、−２０℃に凍結し て続く精製処理に備えた。この段階では、当初のミナクテビン活性が１００チ回 収され、比活性２０単位／ηでＩ　Ｑ−２０，０００単位のミナクチビンが得ら れ゛た。

Ｃ）バッチ式　フェニル−セファロース　クロマトグラフイーミナクテビンは、 濃縮培養上澄（０７％ゼラチンの存在下で培養した細胞から得た。比活性は、１ 単位／１７）？ｒ用いて、更に、フェニル−セファロース會使用したバッチ式場 溶出法により、精製を行なった。上澄（７５０ｍｌｅ）のイオン強度ｔ。

ＮａＣ４Ｔ　２　Ｍ　Ｋ調節した。２　Ｍ　、ＮａＣ］　ｆ含む、ｐｌ（７，８ の５０　ｍＭグリシンで平衝でせたフェニルーセ７アロースヲ、上澄に対して１ 　：　７．５　（ｗ／ｖ）の割合で添加した。懸濁液を室温で２時間又は４℃で 一夜、撹拌下で培養した。フェニルーセフアロース？、グラスフィルターで除去 し、次いで、同じ緩衝液？用いて完全に洗浄し、不純蛋白質を除去するべく、１ ．４ＭＮａ（４（ｉ＝含むｐＨ７，８の５０　ｍＭグリシンで洗浄した。ミナク チビンは、次いで、ｐＨ７，８，５０ｍＭグリシンによりカラムから溶出した。

この方法によるミナクチビン活性の収量は、、ｉ、ｓｏｏ単位で粂り、これは、 出発物質の３５％収率に相当する。ミナクテビン生産物の比活性は、９６単位／ ■で約１００倍増加した。

精製実施例３　ステップｐＨ溶出法によるＤＥＡＥ−セフ　７　Ｃ’ｌ　−ス　 クロマトグラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ（α〕及び（ｈ）に従っ て、ｐＨ溶出を行なった。濃縮したミナクチビンの上澄（４０ｄ、６．５単位／ ｍｌ）’ｋ、ｐＨ７，８，５０ｍＭグリシンで平価にしたＤＥＡＥ−セファロー ス　カラムにかけた。非吸着の蛋白質？除くために、同等の緩衝液で完全に洗浄 後、ミナクナビンに、ｐｕ　５．０．２５　ｍＭクエン酸−リン酸塩で溶出させ た。次いで、残余の蛋白質全除去するために、２ＭＮａＣρを含む、ｐＨ５，０ ，２５ｍＭクエン酸−リン酸塩で洗浄した。

結果？第１９図に示す。

この方法によって生成されたミナクテビンは、比活性が６３単位／ηで、３５％ の収率で回収され念。これは、比活性で１０倍の増加全意味する。

精製実施例４　予備的な非変性ゲル電気泳動細胞不存在の上澄について、実施例 ２に記載のステップ（α）、（ｂｌ及び（Ｃ）に従って、ミナクテビン（３，５ 単位、比活性２５単位／キ）及び適当な標準蛋白質を電気泳動に先立って、等量 の緩衝液で混合した。緩衝液は、０．０２５％ブロモフェノール　ブルー、０． ０２５％キシレン−シアツール、５０ｍＭ）リスーＨＣ見、ｐＨ７，５，１８チ シユクロース及び１％トライトン：Ｘ−１００から成る。ゲルは、５−１５％直 線ビス−アクリルアミドゞグラジェントで構成され、ゲルシステムは、基本的に は、ナトリウム　ドデシル−サルフェートを無添加として、Ｌａｅｍ−ｍｌｉの 方法（イ）全周いた。緩衝液槽のランニング緩衝液としては０．１５％トライト ンＸ−１００ｉＳＤＳの代用に用いた。サンプルをゲルに供して、１００ｍＡに て電気泳動を行なった。温度は、水冷システムにより２５℃以下に保持した。低 移動性のキシレン−シアツールの発色が、ゲルの全長？移動した後に、グル倉取 シ除いた。ゲル全セクション（約０．５　Ｘ　１　ｃｍ　）　Ｋカットし、ｐｕ ７．ｓ、５０　ｍＭグリシ７１５０μＭ１に添加し、サンプ＃　ｆ　Ｂｒａｎｓ ｏｎ　５ｏｎｉｆｉｅｒ　ｃｅｌｌ　ｄｉｅｒｕｐｔｅｒ　ｔ−用いて、１０− ２０秒間、４℃、ソニック　パワー２０で超音波処理した。蛋白質は、ゲルセク ションよシ撹拌下で一夜溶出させた。サンプル２１４９３０９．１０分間遠心分 離して、ゲルをペレット化し、上澄を分離してミナクチビン活性の評価に用いた 。蛋白質の含有−１ｉｋ発色させて観察させるために、重複してサンプルを処理 した。結果を、第２０図に示す。

ゲルからのミナクテビンの回収率は高く、−回の抽出で、当初活性の６４チが回 収された。更に１３％が第二回の抽出で回収された。銀白色に発色した蛋白質の 状況から、ミナクテビン活性は、標品中の不純蛋白質からなシ分離していること が分つた。得られたミナクテビンの比活性は、２３２３単位／ηで、これは、こ のステップで９３倍精製され几ことを意味する。

精製実施例５　Ｂｌｕｅ−アガロース　クロマトグラフィー細胞不存在の上澄に ついて、実施例２に記載のステップ（α）及び（ｂｌに従って、１０ｄの濃縮上 澄（６００単位、２０．０■、比活性３０．０　）　ｋ、１ｐ）ｉ　’７．ｏ、 １００　ｍＭ　Ｎａ　７オス７エートテ平債にした３、２訓Ｘ２．８ｃ１ｎのＢ ｌｕｅ−アガロース　カラムに供した。カラムを、同じ緩衝液で洗浄し、ａｌｄ の７２クション？集めた。フラクションを７グループに分けて保管し、ｐＨ７， ８，５０ｍＭグリシンで４℃、−夜透析し、次いで、蛋白質含有量及びミナクテ ビン活性につ゛いて評価した。ミナクテビンは、カラムから溶出され、その比活 性は１２０単位／■で、４倍の増加を示した。

精製実施例６　塩グラジェント溶出法によるＤＥＡＥ−セファセル　クロマトグ ラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップｆａｌ及びｆｂ］Ｋ従っ て、１０ａｄの濃縮上澄（６４０単位、２０．０１ｎ？、比活性３２−Ｏ単位／ Ｍｇ＞ｋ、ｐＨ７，８，５０ｍＭグリシンで平衝にした２、６ｃｚＸ６ｍのＤＥ ＡＥ−セファセル　カラムに供した。

カラムラｐＨ７，８，５０ｍＭグリシン５０ｍＪで洗浄し、次いで同じ緩衝液で 、０から０．５Ｍに至るＮａＣ１の直線グラジェントｋ　５００　ｔｄ　ＭａＣ ｌで行なった。完了後、グラジェント　カラム（（，１ＭＮａｆＪｉｉ含むｐＨ ７，８，５０ｍＭグリシン９０ｄで、更に、洗浄した。６１のフラクションを集 めた。１０フラクシヨン全保管し、ＰＨ７，８，５０ｍＭグリシンで４℃、−夜 透析を行ない、ミナクチビン活性及び蛋白質含有量を評価した。

結果を第２１図に示す。ミナクチビンは、０．２４Ｍ　Ｎａ（Ｊ　Ｔ溶出され、 最大活性を示すクラクションは、比活性２１６単位／■で、回収率７９チであっ た。これは、６．７５倍に精製されたこと全意味する。

精製実施例７　ｐＨグラジェント溶出法によるＤＩ２ＡＥＥ−セファセル　クロ マトグラフィー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ（α）及び（ｂｌに従っ て、１ｏＩＩｔｌ）濃縮培地（４００単位、２（１９、比活性２０．０単位／η ）ヲ、ｐＨ６，９，２０ｍＭ　ＮＨ４ＡＣＴ平衝にした２、６ｍＸ６ｃｆｎのＤ ＥＡＥ−セファセル　カラムに供した。カラム’に％ｐＨ６，９，２０ｍＭ　Ｎ Ｈ４Ａｃ　３０　Ｎ　テ洗浄し、次イーｃ”２０ｍＭ　ＮＨ４Ａｃから２０　ｍ Ｍ酢酸に至る５００ｔＡ’のグラジェントによりミナクテビンを溶出てせた。完 了後、カラム’ｌ−２０ｍＭ酢酸で、２７５　ｎｍの吸収がベースラインに至る まで、洗浄した。５．５ｄのフラクショ／１に集めた。１ｏグループのフラクシ ョンを保管し、ＮαＯＨ″′ｃｐＨｔ−７及び８０間に調節した。

５、０　ｇ！／の各保管標品に、ｐＨ７，８，５０ｍＭグリシンで一夜透析し、 次いで、ミナクテビン活性及び蛋白質含有ｔｉ評価した。

結果を第２２図に示す。ｐＨ５，３で溶出嘔れた最大活性？示すフラクションは 、出発材料と比較して７４％の活性を示した。

比活性は、１９６６単位／■で、９８倍に精製されたこと？示した。各保管フラ クションより７０μ９の蛋白質が回収され、８ＤＳ−ＰＡＧＥで評価した。結果 金弟２３図に示す。

精製実施例８　ハイド頴キシル　アパタイト　クロマトグラフイー 細胞不存在の上澄について、実施例２に記載のステップ（α］及び（ｂｌに従っ て、１０１の濃縮上澄（５２０単位、１６．６■、比活性３１．０単位（１ｎ？ ）　ｔ、ｐＨ７，８，５ｏｍＭグリシンで平衝にし九ハイトロキシルアノξタイ ト　カラム（２，６Ｃ１ｎＸ４．５ｃｍ）に供した。カラムを、ｐＨ７，８，５ ０ｍＭグリシンで洗浄し、次いで、５０　ｍＭグリシン、ｐｉ（７，８から０． ５　Ｍナトリウムフォスフニー）、ｐＨ７，０に至る５００ｄのグラジェントヲ 行なった。１０グループの７ラクシヨンに保管し、４℃、−夜透析した。これら のミナクチビン活性及び蛋白質含有量につき評価した。第２４図によると、ミナ クテビンは、グラジェントの最終段階で溶出され、最大活性７ラクシヨンは、５ ０％の回収率を示した。比活性は、６５１単位／ＴＮｉで、２１倍に精製された ことを示す。各フラクションから７０μ９の蛋白質を回収し、５ＤＳ−ＰＡＧＥ 　で評価した。その結果？第２５図に示す。

実施例３ 腫瘍組線のミナクテビ／の効果 この実施例では、結腸腫瘍細胞に対するミナクテビンの効果について検討するに 際して使用した方法について詳しく説明する。

方法 １、組織サンプル及び均質化 人結腸のサンプルは、外科的に切除して入手した。粘膜筋より解剖操作で結腸粘 膜？取り出し、これｆ　Ｈａｎｌｃ　’θ　溶液で洗浄した。肉眼的にみて正常 な粘膜及び直性濾腫を各結腸から採取し、凍結貯蔵した。一部全解凍し、計ｔ１ 、■組織当り（含水型ｔ）１０μｎの緩衝液金剛いて、０．５チトライ）ｙＸ− １００ケ含むｐｕ７．８の５０　ｍＭグリシンで静かにホモゲナイズした。

２、　プラスミノーゲン　アクナベータの比色定量アッセイ組織均質物及び細胞 培養上澄のプラスミノーゲン　アクテベーター含有量を、Ｃｏｄθｍａｎ及びＧ ｒｅｅｎの評価方法Ｏｚによって実施例１と同様にして測定した。前記のように して調製し九均質物は、評価に先立って、１：１０に希釈した。

３、　５ＤＳ−ＰＡＧＥ及び線維素オーバーレイＧｒａｎｅ１１１−Ｐｉｐｅｒ ｎｏ及びＲｅ１ｃｈの方法（１３ｔ−、実施例１に記　′載した如く、当該分離 技術のために利用した。組織均質物を、１１チアクリルアミビ　ゲルに、（α） そのまま未処理で、（ｈ１アフィニティーで精製した人プラスミノーゲンと、３ ７℃、３０分間培養した後、ＦＣ＋　単核細胞ミナクチピンと、２３℃、９０分 間培養した後、又は、（ｄｌ　先ず、プラスミノーゲンと、次いで、ミナクテピ ンと培養した後、通した。上記培養物の未処理サンプル（６０μ旦）ｔ％ＳＤＳ サンプル緩衝液（４０μρ）金柑いて、ゲルに通した。

４、　ラジアル　ディフュージョン　アッセイ実施例１に記載した通りに、ラジ アル　ディフュージョンアッセイを行なった。培養に用いたプロテアーゼは、カ リクレイン（１，５μｇ）、プラスミン（１５０μｇ）、マウス　ウロキナーゼ （１５ｍＰＵ）ＨＰＡ６６　（メラノーマ培養上澄）、人ウロキナーゼ（Ｉ　Ｚ ５　ｍＰＵ　）及びＣ０ＬＩ　３９４上澄（１，３ｍＰＵ　ＨＰＡ５２を含む） である。これらの酵素は、過剰量のミナクチピンと、２３℃で９０分間培養し、 次いで、ゲルに供した。

５、結腸腫瘍細胞の培養 人結腸腫瘍セルラインＣ０ＬＯ３９４（至）を、１０％牛脂児血ｆｊｌ補足した ＲＰＭニー１．６４０　中で培養し、２週間経過させた。

ミナクテビン及び腫瘍細胞の酵素の効果を研究するために、約３　Ｘ　１０　ｃ ｅｌｌＩ３／ｗｅｌｌ　ｆ、６−　ｐｌａｃｅ　ｍｕｌｔｉ−ｗｅｌｌ　ｐｌａ ｔｅ（Ｌｉｎｂｒｏ　Ｎｏ、　７６−０５８−０５）に供した。−夜付着培養さ せた後、細胞を洗浄し、４８時間、血精不存在のＲＰＭニー１６４０で培養した 。三つの実験用培地として、１）人プラスミノーゲン（１５μ！ｉｔ／ｄ）、　 ２）　プラスミノーゲンとミナクテビン（ＩＰＵのウロキナーゼと等価）、３） プラスミン基質／、ミナクテビン及びトラジオール（１８μ９／ｆｆｌ／）、を 更に用いた。

６、　ミナクチビン標品 この実験で用いたミナクテビンは、実施例６に記載された通９、人血単核細胞の 培養上澄から調製した。グラスチック皿上での単核細胞の付着培養は、ムラミル 　ジＲプテド０．０５μ９／コヲ含むＲＰＭ工１６４０　で３日間行なった。

結果 腫瘍組織物質物のミナクテビンの効果 １、正常及び腫瘍結腸組織のプラスミノーゲン　アクテベーター含有量の比較 α）比色定量アッセイ 結腸粘膜の希釈ホモジエネートのプラスミノーゲンアクチベーターについて、Ｃ ｏｌｅｍａｎ及びＧｒｅｅｎの方法（１２１で評価全行なった。この評価では、 用いたプラスミノーゲン基質が前酵素の活性化に充分な量で含まれていることか ら、プラスミノーゲン　アクテベーター酵素（すなわち、前酵素及び活性化酵素 ）の全量を測定した。希釈ホモジエネート中のプラスミノーゲン非依存性の天然 プロテアーゼによるリジン　チオエステル　プラスミン基質の直接的加水分解は 、発色展開に著しい影響を示さなかつ九。癌化した結腸の組織学上の正常領域と 、直性結腸癌組織について、第２６図に示した如くプラスミノーゲン　アクチベ ーター活性を評価した。

正常組織ホモジエネートの活性は、平均値０．５±０．１６の範囲に集中してい た。サンプルの一部が５ＤＳ−ＰＡＧＥ線維索線維フォーバーレイキナーゼ活性 バンドヲ示したが、より高感度の比色定量アッセイでは、正常組織のホモジエネ ートは全てプラスミノーゲン　アクテベーター？含んでいた。これは低レベルの ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクテベータ−（ＨＰＡ５２）によ るものであって、遍在する組織タイプのプラスミノーゲン　アクナベ−ター（Ｈ ＰＡ６６）によるものではないと考えられる器。

しかしながら、腫蕩ホモジエネートは、１０倍の吸収レンジをカバーするプラス ミノーゲン　アクナベ−ター活性の広いスイクトルケ示した。平均吸収値は、１ ．１５±０．５６であり、正常の組織ホモジエネートの平均値の２倍以上であっ た。しかしながら、この割合は、全ての材料サンプル全包含するものであり、腫 瘍サンプルｔ、各結腸の正常組織の相当するサンプルと組み合わせｆｃ場合（第 ２７図）は、５倍以上の組み合わせもちリ、平均値は３倍以上に増加した。

ｂ）　５ＤＳ−ｐＡｃ）ｐ　及び繊維素オーバーレイ癌化した結腸の組織学的に 正常な領域から得た結腸粘膜は、人メラノーマ培養上澄の組織タイプ　プラスミ ノーゲン　アクチベーター（ＨＰＡ６６）に相当ｊる、５ＤＳ−ＰＡ（Ｊｉ：　 ｔＤＭＪ、Ｍｒ素−アガａ−ス　ソイモダラム上での、唯一の主要溶解バンド？ 形成した（第２８Ａ図）。分子量約９ｆ’１０００及びＩＩＱＯＯＯに相当する 他のバンドも形成きれた。しかしながら、正常組織のホモジエネートは、高分子 量のウロキナーゼ、すなわちＨＰＡ５２に相当する溶解バント’に形成した（以 下参照）。代表的な正常な結腸の非希釈ポモジエネート？アッセイ緩衝液中で人 プラスミノーゲンと」８養すると、プラスミノーゲンの活性化が起こり、プラス ミンのバントがソイモダラム上のＭｒＢａＯ００上に形成された（第２８Ａ図、 レーン２）。サンプルを取り除き、プラスミノーゲンと２時間培養すると、ＨＰ Ａ６６　の活性は、消失し友。１０００及びＩＩＱＯＯＯの主要バンドもすみや かに消失し几。

癌組織のホモジエ不一トは、ＨＰＡ５２の主要バンドと、相対強度？異にした第 ２の）ｉＰＡ６６　バンドケ形成した（時として、はとんどわずか−じめる）（ 第２８Ｂ）。前記した副次的なバンドは、通常、きわめてわｒかであるか又は形 成されない。プラスミノーゲンと前培養すると、３７℃、２時間後に消失し之（ 第２８Ｂ図、レーン２−４）。生産でれた７″ラスミン（Ｍｒ８　ａｍ　０００ 　（７）溶解）は、）ｆＰＡ５２１分ｍして約Ｍｒ３３　３ａ０００の活性分解 物？生産した。

２　ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクテベータートミナクナビ／ の結腸粘膜ホモフェネート中での相互作用正常結腸組織ホモジエネー）（５逼気 泳動に先立ってミナクテビンで処理しても、組織タイプのプラスミノーゲン　ア クナベ−ターによって形成される溶解パン）パに影＃？与えないが、副次的３Ｈ ＰＡ５２　バンドは、はとんどすべて消失ちせる（第２９Ａ）。

ホモジエネー）ｆプラスミノーゲンと前培養すると、ＨＰＡ５２バンド？消失畑 せ、その活性分解物のＭｒ　３３−３　ａｏ　００に相当するわずかなバンド？ 形成させる、プラスミンが生産された。プラスミノーゲンと前培養し、ミナクチ ビンで処理すると。

ＨＰＡ５２　バンド及び３３−３　（’ｘｏ　ＯＯのゎずがなバンドは消失した 。

ｌＩ４＋瘍ホモジエネートは、ミナクナビ／と培養することによって消失される 、′ａ著なＨＰＡ５２　の溶解バンド？形成した（第２９Ｂ図）。電気泳動に先 立ってプラスミノーゲンと前培養すると、プラスミンが生産され、これは、正常 組織ホモジェネートでｍａされｆｃＬうＫ、ＨＰＡ５２　ｋＨＰＡ３３−３６Ｋ 、ｌｌｉｉ次、変換をれた。このように、ミナクテビンはＨＰＡ６６に影響を与 え左いが、腫瘍結腸組織及びこれらの正常結腸組繊のホモフェネート中のＭｒ５ ２，０００バ／ドを形成する酵素は、人事核細胞ミナクテビンと培養すると影響 ？受ける。ホモジェネートを、当初、プラスミノーゲンで、次いてミナクテビン で処理すると電気泳動の後に通常見られるＨＰＡ５２バンドは消失し、　Ｊ（Ｐ Ａ３３−３６に相当するバンドも無くなった（第２９Ｂ図）。このように　ＨＰ Ａ５２７にミナクテビンで不活性化も、次いでプラスミノーゲンで処理すると、 未処理ホモジエネートの場合よりも著しく効果的であるように見える。このこと は、組織中のＨＰＡ５２の形は、実際には、前酵素であり、ミナクテビンとの反 応は、おそらくプラスミンによる。活性酵素への変換に関すること全示唆してい る。

３、　ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲン　アクテベーターの前酵素体に ついてのミナクチビンの特異性（比色定量アッセイ） ミナクテビンどウロキナーゼの化学量論的な相関関係は、ウロキナーゼ濃度の広 い範囲、すなわち１，１．ＯｍＰＵから１００１００Ｏにわたって適用される（ 第３０図）。しかしながら、結腸粘膜の希釈ホモフェネート中のプラスミノーゲ ン　アクテベーターのミナクテビンによる阻害作用を滴定定量してみると、この ような特性は示されない（第３１図）。実際には、腫瘍組織ホモフェネート中の 増強された活性を阻害する場合よりも、正常組織中のＨＰＡ５２の低レベルの活 性？阻害する場合は、より多くのミナクテビンが必要とされる。このことは、組 織ホモフェネート中のＨＰＡ５２の前酵素体の存在と矛盾するものではない。

このＨＰＡ５２前酵素体の在住は、結腸腫瘍の変換セルラインＣ０Ｌ０３９４　 ｋ培養して得た血精不存在の上澄音用いて示される。このセルラインにより分泌 妊れるプラスミノーゲン　アクチベーターは、本質的に、わずかのよシ高分子量 のバンドヲ伴ったＨＰＡ５２から成ｐ、これは、腫瘍組織ホモジエネートと非常 に類似したパターンを示す（第３２図）。プラスミノーゲンが培地中に含まれて いると、Ｉ（ＦＡ、５２のＨＰＡ３６への変換全促進するプラスミン（第３３図 、比色定量アッセイで示される）が生産される。培地に、ミナクテビ／とプラス ミノーゲンが加えられると、培養中に生産されるプラスミノーゲン　アクテベー ターは、５ＤＳ−ＰＡＧＥ　及び繊維素オーバーレイ展開（第３２図）、及び比 色定量アッセイ（第３３図）に見られる如く、不活性化される。しかしながら、 プラスミンの有力な阻害剤であるトラシロールｔ１プラスミノーゲン及びミナク チピンと一緒に培地に添加すると、不活性化は起らない（第３２図）。トラシロ ールは、ミナクテピンとウロキナーゼの反応に直接影響を与えないので、これら の結果は、Ｃ０ＬＯ３９４により生産されるＨＰＡ５２は、活性の発現及びミナ クテビンとの反応にプラスミンを必要とする前酵素体であること？示す。５ＤＳ −ＰＡＧＥ線維素オーバーレインステムにおいては、活性化は、プラスミノーゲ ン基質中に存在するわずかのプラスミ／により生じる。

これは、プラスミンがトラシロールにょシ阻害されると生じない。

これらの結果は、主要な人癌腫が、隣接する組織の場合よりも著しく多量のウロ キナーゼタイプのプラスミノーゲン　アクテベーターを生産することを示すもの である。ミナクチビンは、直接、組蛾ホモジエ不−トに添加すると、人ウロキナ ーゼタイプのプラスミノーゲン　アクナベ−ター、ＨＰＡｓｚ２少なくとも部分 的に阻害する。この不活性化作用は、ウロキナーゼ　タイプのプラスミノーゲ／ 　アクテベーター、ＨＰＡ６６に特異的である。ミナクチビンは、ＨＰＡ５２前 酵素体には作用しないこと、ミノクチピンと反応する前にＨＰＡ５２’に活性型 に変換する之めにプロテアーゼ活性が必要とされること（この場合、プラスミン ）、が確認された。

図面の簡単な説明 第１図 血液の単核細胞培養によるミナクテビンの生産。

単核細胞の付着培養において、△−Δは、リポポリサッカライド（０，１μｌｉ ｔ／ｒＩＬｌ）、〇−〇は、ムラミル　ジペプチド（１０μ９／ｍ／）ｋ含むコ ントロール培地。口・・・・・・口は、Ａ：培養上澄をウロキナーゼで評価し、 ２４時間毎に新鮮培地に置き変えた。

Ｂ：細胞溶解質中のミナクテビンのコントロール。

第２図 単核細胞の培養中のミナクテビン活性度合。２４時間培養し元上澄を希釈して評 価した。

△−Δ、１：５希釈、　口・・・・・・口、１：１０、〇−〇　又は　・・・・ ・・　、１：２０第３図 人腹膜マクロファージの培養によるミナクテビンの生産及び分泌。付着マクロフ ァージは、コントロール培地Δ−Δ、又はムラミル　ジにプチト”　（１０μ９ ／ｄ）含有培地ローロで生長した。下の２本の曲線は、溶解質？、上の２本の曲 線は上澄？示す。

第４図 人ｆｌｉ［マクロファージの第２培養におけるミナクテビンの生産及び分泌。条 件は、第３図と同じ。

第５図 繊維素溶解におけるミナクチビンの効果。

プロテアーゼ溶液（１０μＭ）ｖ、ミナクテビン培養上澄（１０μｆ１．）と共 に（上の二列）又は、加えることなく（下の列）と前培養し、混合物（５μｍ） 　’！ｔ、プラスミノーゲン會補足した線維ネ／アガロース　ゲルに供した。２ ０μ旦の前培養当たり用いた酵素とその量は、２．トリプシン１００ル９、プラ スミニ１５ＱＱｎ９．４．　ＣＵ　Ｋ　（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍウロキナーゼ） ５０７７ＬＰＵ、５、　Ｓ　Ｕ　Ｋ　（Ｓｉｇｍａウロキナーゼ）１００ｍＰＵ 、及び　６．メラノーマ培養上澄の希釈物、であシ、コントロール　ウェル　１ 及び７は、緩衝液及びミナクナビン上溌？、各々含有する。ゲルは、３０℃で２ ０時間培養した。

＠６図 ミナクテビン前培養後の５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理。

ＣＵ　Ｋ　（３０ｍＰＵ、　Ｌ／−７１及び２）、ＭＬＡ１４４　（３０μ℃希 駅培養上澄、レーン３及び４）、人メラノーマ（２０μｆ！、培養上澄、レーン ５及び６）、及びラット１３７６２肺瘍（２０μｕ１％ホモジエネート、レーン ７及び８）のプラスミノーゲン　アクナベ−ター葡、ミナクテビン培讐上澄の存 在下（偶数番号）及び不存在下（奇数番号）で５ＤＳ−ＰＡＧＩ処理に先立って 前培養した。３７℃で２０時間培養して線維素オーバーレイ　ゲルで展開した。

第７図 ミノクチピンと前培養することによるＣＵＫの不活性化。

ウロキナーゼ（４ｍＰＵ　）標品ケ、単核細胞培養上徴（６μｌ）と、２３℃で 、種々の時間前培養し、次いで、テストに示した如く比色定量アッセイを行なっ た。上の曲線は、緩衝液で前培養したウロキナーゼである。

第８図 ＣＵＫのミナクチビンによる滴定定量 ウロキナーゼ標品（４ｍＰＵ）ｆ、希釈ミナクテビン上澄（２０μ塁）と前培養 し、次いで、比色定量アッセイ音用なった。

第９Ａ図 ミナクテビンでＣＵＫＩ不活性化するためのプロテアーゼ阻害剤コントロール。

ウロキナーゼ標品（２０ｍＰＵ）’ｚ、以下のプロテアーゼ阻害剤と前培養した 。すなわち、レーン１：コントロール、レーン２：トラシロール（０２η／ｆｆ １ｌ）、レーン３：α１−抗トリプシン（１６μ９／ｙｔｌ）、レー／４：トラ ネキサミン酸（３ｍＭ）、Ｖ−７５：Ｅ−ドアセトアミド（３ｍＭ）、ｖ−７６ ；ＥＤＴＡ（６ｍＭ）、レーン７：大豆トリズシン阻害刑（０，１６１１１９７ ｄ）、レーン８：５ＤＳ（Ｑ、６％）、レーン９：ベンズアミジン（３ｍＭ）及 びレーン１０；ミナクナビン培警上澄（２０μｐ）。

第９Ｂ図 プロテアーゼ１５１１害剤の存在下におけるＣＵＫのミナクテビ／による不活性 化。

第９図Ａの前培養？、各プロテアーゼ阻害剤前培養に含まれるミナクテビン培養 上澄（２０μｉ）で繰り返した（レーン２−９）。

第１０図 ２．５ｄのアルブミンを含まないミナクテビン培養上澄−１及び１．０ＩＩＬｔ の１％血精アルズミンを含む未調整ＲＰＭ工・・・・・・の溶出について、ウロ キナーゼ阻害作用及び蛋白質ヶ評価した。

セファクリル　Ｓ　３００（９５Ｘ１．５ｍ）’！５カラムに詰め、０．１５Ｍ 　ＮａＣ１ｆ含む５０　ｍＭグリン／（ｐＨ７，８）で６ｍ／ｈｒ　の速度で溶 出させ友。矢印は、ボイド　ボリューム及びベッド　ボリュームを示す。

第１１図 プロテアーゼ阻害作用のラジアル　ディフュージョン線維素ゲル　アッセイ。

Ａ列：ＨＰＡ６６　２含む人メラノーマ　セル　ラインの上澄、３列：　）ｉＰ Ａ５２及びＨＰＡ３６　ｋ含むウロキナーゼ、０列ニトリプシン、９列ニブ２ス ミン。カラム１及び２は、人腹膜マクロファージ及び血液単核細胞の上澄を、各 々、含み、カラム４−６は、骨髄質マクロファージの溶解質、腹膜マクロ７アー ジ及び血液単核細胞？、各々、含む。カラム３及び７は、培地及び溶解緩衝液？ 含むコントロール金示す。

第１２図 プロテアーゼ阻害作用のラジアル　ディフュージョン線維素ゲル　アッセイ。

Ａ列：緩衝液コントロール、３列：単核細胞のフェニルーセファロース精製ミナ クテビン、０列：Ｕ９３７　セルのフェニル−セファロース精製ミナクナビン、 ９列：胎盤阻害剤（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、カラム１：豚プラスミン６０μ９ ７ｍ１！（Ｓｉｇｍａ）、カラム２　：　ＨＰＡ５２に含むウロキナーゼ、ＣＵ Ｋ：５ＰＵ／拭カラム３　：　Ｉ（ＰＡ３６に含むウロキナーゼ、ＳＵＫ：５Ｐ Ｕ／ｇ力２ム４：人メラノーマ　セルライン上澄、ＭＭ１７０　：　ＨＰＡ６６ 含有、カラム５：マウス　ウロキナーゼ、１／１０希釈のマウスの尿。

第１３図 ミナクナビンによって生じるＵ９３７及び単核細胞の電気泳動移動度。

サンプル１６−Ｉ６％グラジェントの未変性（非５ＤＳ）ボリアクリルアイド　 ゲルで電気泳動じ、１０！ＬｌのＳＵＫ。

ＩＰＵ／ｄで、２３℃、１時間培養し、線維素／アガロースゲルにオーバーレイ し、−夜展開させた。同一サンプル？、電気泳動じ、Ｃｏｏｍａｅｅｉｅ　Ｂｘ ｕｅで発色させた。レーン４：標準分子量、レーン３：フェニルーセ７アロース 梢製ＬＴ　９３７ミｆクチビン、レーン２：フェニルーセファロース精製単核細 胞ミナクテビン、レーン１：レーン３と同じ。

第１４図 フェニル−セファロースによる単核細胞ミナクナビンの精製状況 フェニル−セファロース　カラムに、　２　Ｍ　ＮａＣｕ　ｋ含ｂｐＨ７，８の ５０　ｍＭグリシン緩衝液で平衝にした。２ＭＮａりに合わせた単核細胞上澄？ 通した後、グリシン−ＮａＣ１？用いて洗浄した。グリシン緩衝液中ＮａＣｌの 下降グラジェントによってミナクテビンが溶出された。□：蛋白質（Ｌｏｗｒｙ アッセイによる、ＯＤ７５０ｎｍ）、・−・−：　ＮａＣ１濃度、・・・・・・ ・・・：ミナクナビンのウロキナーゼ阻害作用（逆ピーク状）。

第１５図 単核細胞ミナクテビンの生体外ラベリング。

付着単核細胞金、ムラミル　ジＲプテト°の存在下で　Ｓ−メチオニン（１ｍＣ １、８００Ｃ１／ｍｍｏ、１１．　Ａｍｅｒｓｈａｍ）　ｙｊ（添加して培養し た。上澄標品を３日経過の時点で取り除いた。

ミナクナビン？フェニルーセファロースを用いて、ｆ＃製した。

各標品１ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ　３０　（Ａｍｉｃｏｎ）　ｋ用いて５０倍に濃縮 し、５−１５％アクリルアミド　グラジェントによる５ＤＳ−ＰＡＧＥで、その ３０μρについて解析した。ラベル化された蛋白質？フルオロ　グラフィー（Ａ ｍｐｌｉｆｙ　１Ａｍｅｒｓｈａｍ　）により探知し、ＫｏｃＬａｌｃ　Ｏ−Ｍ ＡＴ　Ｘ線フィルム上に、ゲルヶ１０日間芒らした。レー／２−６は、示された 時間に取り除いたサンプル、レーン７は、フェニル−セファロース精製ミナクテ ビ／標品、レーン１及び８は、高及び低分子量の標準？、各々、示す。

第１６図 生体内でラベル化した単核細胞ミナクテビン及びウロキナーゼ複合体の精！！！ 。

条件は、基本的には、第１５図及び明細書に記載したのと同様。各サンプルｒ、 ゲルに３０μｐ通す前に、１０倍に濃縮した。１８日間さらした。レーンＡＦｉ 、　フェニル−セファロースｎ製ミナクテビン、レー／ＢＩｄ、Ｂ１ｕｅセファ ロース槍製ミナクテビン、レーンＣは、電気泳動の直前にサンプルに０．１４２ −メルカプトエタノール？添加することを除き、Ｂと同様。各サンプルは、２７ 　ＰＵ　ＳＵＫによる２３℃、９０分間の←）父は（−Ｉ−１前培養で示される う外側のレーンは、欅準分子量？示す。

第１７図 ミナクテビン生産に対するゼラチンの効果Ｕ９３７　セル（１，３Ｘ　１０　ｃ ｅ〕１ｅ／ｒｎｌ）　’＜血精不存在培地でデキサメタゾ／と、０．７％ゼラテ 、ンの存在下（Ｘ−Ｘ　）及び不存在下（・□・）で、培養した。

第１８図 ステップｐＨ溶出法によるフェニル−セファロース　クロマトグラフィー 実施例１記載の如く行なった。Ａ部分は、溶出に５０ｍＭクエン酸塩、ｐ）１５ ．０．０．５　ｂＡ　ＮａＣ１に、Ｂ部分は、５０　ｍＭグリシン、ｐＨ７，８ に変えた。

第１９図 ステップ式Ｉ）Ｈ溶出法によるＤｇＡＥ−セファロース　クロマトグラフィー ミナクテビ／含有上澄ｔ％ＤＥＥＡＦ２−セファロースを用いて、精製実施例３ 記載の如く、フラクションに分画した。ミナクナビン活性は、カラム外に示す。

第２０図 予備的な未変性ゲル電気泳動 フェニル−セファロース精製ミナクテビン標品勿、精製実施例４記載の如く、更 に、未変性ゲル電気泳動で分画した。

ゲル切片から溶出したミナクチビン活性は、カラム外に示す。

下Ｋ、シルバー発色法による発色ゲルのレーンを示す。

第２１図 塩グラジェント溶出法によるＤＥＡＮ−セファロース　りロマトグラフイー ミナクテビン含有上澄’ｔ、ａＭ製実施例６の如く、ＤＥＡＥ−セファセル　カ ラムで分画した。生物活性の単位は、カラム外に示す。・・・・・・・・・二Ａ ２７５、曲・川・：　ＮａＣ１濃度。

第２２図 ｐＨグラジェントによるＤＥＡＥ−セファセル　りロマトグラフイー ミナクチビン含有上澄を精製実施例７の如く分画した。生物活性の単位は、カラ ム外に示す。蛋白質含有量は、カラム内に示す。・・川・・・・：　Ａ２７５、 −−−−−−　”　ｐＨ。

第２３図 １）ｇＡｈｉ−セファセル　フラクションの５ＤＳ−ＰＡＧＥ処理第２２図に示 したＤＥＡＥ−セファセル　りロマトグラフイーの７２クシヨ／から得た蛋白質 ７０μｇ金、Ｌａｅｍｍｌｉ法価により５ＤＳ−）’ＡＧ１ｉＥ　処理した。レ ーン１：分子量マーカー、レーン４：フラクション３０−４０．シー１５：フラ クション４０−５０、レーン６：５Ｏ−６Ｑ、レー／７：６０−７０、レーン８ ニア０−８０．レーン９：８０−９０．し−ン１０：９０−１００゜ 第２４図 ハイドロキシアパタイト　クロマトグラフイーミナクテビン含有上澄？、精製実 施例８の如く、分画した。

生物活性単位は、カラム外に示す。蛋白質含有量は、カラム内に示す。・・・・ ・・・・・：　Ａ２７５、−−−−−−−　：　Ｎａフォスフェート濃度。

第２５図 ハイドロキシアパタイト　クロマトグラフィーのフラクションの５ＤＳ−ＰＡＧ Ｅ処理 第２４図のハイドロキシアパタイト　クロマトグラフィーの７ラクシヨンから得 た蛋白質７０μ９？、Ｌａ　ｅｍｍｌ　ｉ法四の如く、５ＤＳ−ＰＡＧｋ；　で 解析し友。レーン８：フラクション７０−８０、レー／９：フラクション８０− ９０、レーン１０：９０−１００゜ 第２６図 人結腸粘膜ホモジエネート中のプラスミノーゲン　アクチベータの比色定量アッ セイの結果？、ヒストグラムは示す。

プラスミノーゲン基質は、わずかのプラスミン？含んでおり、前酵素と活性酵素 の総和？、結果は示している。活性は、４１２ｎｍの吸収？示す。同じ評価条件 で、４ｍＰＵ　の市販ウロキナーゼは、４１２ｎｍで０．９の吸収會示した。

第２７図 １５の結腸腫標品（斜線の長方形）のプラスミノーゲンアクテベーター活性ｔ１ 同じ結腸由来の正常組織（長方形）の活性と比較した。サンプルは、左から右へ 、腫瘍：正常の割合（Ｔ／Ｎ）値で増加するように並べた。

第２８Ａ図 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　処理後の繊維素アガロース　オーバーレイで示される、正常 結腸粘膜のホモジエネート中に存在するプラスミノーゲ／　アクテベーターの種 類、レーン１は、未処理サンプル、レーン２−４は、ホモジエネート？人プラス ミノーゲンと３７℃で、３０．６０及び１２０分間培養した場合の効果？示す。

溶解ゾーンは、α’）１１０．００のプラスミノーゲン　アクテベーター、ｂ） Ｍｒ９ｆｉＯＯＯのプラスミノーゲン　アクチベーター、Ｃ）プラスミン、Ｍｒ 　８５，０００及びｄ）ＨＰＡ６６、Ｍｒ６ｆｌ）０００゜第２８Ｂ図 ５ＤＳ−ＰＡＧＥ　処理後の繊維素アガロース　オーバーレイで示される代表的 な結腸癌標本ホモジエネート中に存在するプラスミノーゲン　アクテベーターの 種類。

レーン１は、未処理サンプル、レーン２−４は、人プラスミノーゲンと３７℃で 、３０．６０及び１２０分間培養した場合。ゾーンＡ−Ｄは、正常結腸、ゾーン Ｅは、ＨＰＡ５２（Ｍｒ５２０００）　及びゾーンＦは、）ｉＰＡ３３−３５　 （Ｍｒ３３−３へ０００）。

第２９Ａ図 代表的なＨＰＡ５２　活性？示す、組・識学的に正常結腸サンプルのホモジエネ ート中のプラスミノーゲン　アクテベーターに対するミナクテビンの効果。

レーン１は、コントロールの処理したサンプル、し←ン２は、ミナクテピンと２ ３℃で６０分間前培養した場合の効果、レーン３は、ミナクテピンと３７℃で３ ０分間前培養し、次いで、コントロール緩衝液と２３℃で３０分間前培養した場 合の効果、レーン４は、ホモジエネー）ｋプラスミノーゲンと３７℃で３０分間 前培養し、次いで、２３℃で６０分間ミナクテビンにさらした場合。溶解ゾーン は、Ａ−プラスミン、Ｍｒ８５０００、Ｂ−ＨＰＡ６６Ｍｒ６ａ０００、Ｃ−Ｈ ＰＡ５２、Ｍｒ５ｇＯＯＯ及びＤ　−ＨＰＡ３３−３６、Ｍｒ３３−３ａ０００ ゜第２９Ｂ図 結腸腫瘍ホモジエネート？、第２９Ａ図の如く処理した。

第３０図 人ウロキナーゼのミナクテビンによる比色定量滴定アッセイ　ウロキナーゼ？、 適宜の範囲に希釈する前に２３℃で９０分間ミナクチピンと前培養した。三つの 曲線は、左から右へ、１００１００Ｏ，１００ｍＰＵ及び１０ｍＰＵのウロキナ ーゼ倉、各々、示す。

第３１図 結腸細胞及び組織の人プラスミノーゲン・アクナベ−ターのミナクテビ／による 比色定量滴定アッセイ三つの曲線は、左から右へ、正常粘膜抽出物（約Ｑ、　５ 　ｍＰＵ）及び結腸腫瘍抽出物（約１０　ｍＰ［Ｊ　）　ｙｚ示す。後者は、後 に前酵素であることが分った。

第３２図 腫瘍細胞培養プラスミノーゲン　アクテベーターに対するミナクテビ／の効果、 レーン１は、未添加による培養１．レーン２は、プラスミノーゲン添加、レーン ３は、プラスミノーゲン及びミナクテビン添加、レーン４はプラスミノーゲン、 トラシロール及びミナクチビン添加。

第３３図 第３２図と同じ実験で得た培養上澄の比色定量アッセイ。

ＦＩＧ、ＩＡ ＦＩＧ、　１Ｂ 陣答ス ＦＩＣｙ、５ Ｆｌｅ、６ 珀持蚤′ｐＡ間（分） ＦＩ［３，７ 特表昭６１−５０２９６１　（１８） 希　未叉カイ匝 ＦＩＧ、８ ＦＩＧ、９Ａ ＦＩＧ、９Ｂ クロキグーゼ５８）生（０９４１２Ｍ）■　記　お　鈷　困　撃 Ｏｃｇ　■　Ｃコ ンク９最仁笥　（μｇ／ｍｌ） ’ｑ　ｃｏｏ　。

く　ω　０　０ ＬＯＷＲＹ　７５０ｎｍ ９２．５’　、ｔ１％’Ｎ　１ｌＮ１１１、や−　＋１１！１、時間（吟）０３ １６旬４３　斜 Ｉ：／（ｙ　１５″ Ｘ１０００ Φ　〜 会　Ｑ　ム　偽　ト　Ｑ ω　ＯΦ　（ψ　０ ＦＩＧ、１７ ＦＩＧ、２１ マ Ｍ、Ｘ１０００ ワＣ 爬ｌろ〃゛ン ＦＩＧ、２６ ＦＩＧ、２７ Ｆｌｅ、２！３ けフナビンの部子Ｅ　［Ｘ２−ｘ］ ＦＩＧ、３０ ＦＩＧ、３１ Ｆｌｅ、、３２ ＦＩＧ、３３ 国際調査報告

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. １．実質上精製されたミナクチビン。
2. ２．ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチべーターを特異的に阻害し、 ５６℃以上の温度で不安定で、−２０゜での冷凍及びその解凍に対して安定で、 ４℃で５から９のｐＨ範囲で安定で、血精アルブミンを標準としたグルろ過で分 子サイズが６０−７０，０００を示すミナクチビン蛋白質。
3. ３．ウロキナーゼ又はウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベーターと 耐洗浄剤性複合体を形成することによつて特徴づけられる請求項２に記載された ミナクチビン蛋白質。
4. ４．ミナクチビン生産性細胞を生体外培養し、培養上澄からミナクチビンを回収 することから成るミナクチビンの製造方法。
5. ５．培養上澄からの回収を、上澄をハイドロフオービックインターラクシヨンク ロマトグラフイー又はイオン交換クロマトグラフィーにかけ、次いで、アフイニ テイークロマトグラフイーにかけることにより実施する、請求項４に記載のミナ クチビンの製造方法。
6. ６．ミナクチビンを、更に、ゲルろ過又はポリアクリルアミドグル電気泳動によ り精製する、請求項５に記載のミナクチビンの製造方法。
7. ７．ミナクチビン生産性細胞が、人血の単核細胞、ミナクチビン生産性マクロフ ァージ及び単核細胞由来の変換細胞から選択される、請求項５に記載したミナク チビンの製造方法。
8. ８．ムラミルジペプチド、リポポリサッカライド、デキサメタゾン、又はフオル ボールミラステートアセテートの如きフオルボールエステルのような化学試薬を 用いて、生体外で細胞を刺激してミナクチビンを生産させることから成るミナク チビンの製造方法。
9. ９．ミナクチビン生産性細胞を生体外で培養して得られるミナクチビンを含有す る細胞培養上澄。
10. １０．組織学的標本又は生体外で腫瘍の境界の位置を決定し、確認するための、 適宜にラベル化したミナクチビンを含む試薬。
11. １１．ミナクチビンが放射性同位体でラベルされている、請求項１０に記載の試 薬。
12. １２．ラベルが、フルオレスセインの如き化学物質である、請求項１０に記載の 試薬。
13. １３．ミナクチビンが、酵素でラベルされた、請求項１０に記載の試薬。
14. １４．適宜のラベル化されたミナクチビンを患者に投与し、次いで、ラベルの位 置及び濃度を確定することから成る、患者における腫瘍の境界の位置の決定及び 判定方法。
15. １５．適宜のラベル化されたミナクチビンを添加し、次いで、ラベルの位置及び 濃度を確定することから成る、組織学的標本における腫瘍の境界の位置の決定及 び判定方法。
16. １６．テクニチウム９９でラベル化されたミナクチビンを含む、請求項１４又は １５に記載された方法に使用する試薬。
17. １７．腫瘍が直性腫瘍である、請求項１４又は１５に記載された方法。
18. １８．腫瘍が、転移性痛である、請求項１４又は１５に記載された方法。
19. １９．治療上有効量のミナクチビンを患者に投与することから成る、腫瘍の侵入 を阻害し、腫瘍を治療する方法。
20. ２０．治療上有効量のミナクチビンを患者に投与することから成る、リウマチ様 関節炎の如き慢性的炎症を治療する方法。
21. ２１．人体液文は組織のサンプル中のミナクチビンをミナクチビンの抗体を用い て探知することから成る、慢性的炎症をモニターする方法。
22. ２２．請求項２１の方法において使用するためのミナクチビンの抗体標品。
23. ２３．抗体が、酵素、アイソトープ又は他の化学試薬でラベル化されたものであ る、請求項２２に記載された抗体標品。
24. ２４．レクチンヌは毒素の如き薬剤と結合させたミナクチビンから成る、請求項 １９又は２０に記載された方法で使用するための試薬。