KR0135980B1 - 플라스미노겐 액티베이터 및 혈전용해제 - Google Patents

Abstract

없음

Description

플라스미노겐 액티베이터 및 혈전용해제

제1도는 SAK와 SK의 반응기구의 상위를 모식적으로 표시한 설명도

제2A, 2B도는 폐쇄순환(closed circuit) 실험장치의 구성을 표시한 설명도

제3A, 3B도는 SAK와 SK의 피브린(fibrin) 분해도의 경시변화를 표시한 선도

제4도는 피브린 분해도의 농도의존성을 표시한 선도

제5A, 5B도는 SAK와 SK에 의한 피부리노겐양의 경시변화를 표시한 선도

제6A. 6B도는 SAK와 SK의 피브린 특이성의 비교를 표시한 선도

제7도는 혈전(thrombus)용해특성의 농도의존성을 표시한 선도

제8A, 8B도는 SAK와 SK에 의한 플라스키노겐 양의 경시변화를 표시한 선도

제9A, 9B도는 SAK와 SK에 의한 α₂­PI 양의 경시변화를 표시한 선도

제10A, 10B도는 SAK와 SK의 트롬빈(thrombin)의 존재, 비존제하에 있어서의 플라스미노겐 활성화 반응을 표시한 선도

제11도는 반응 40분후에 있어서의 트롬빈 존재, 비존재하에서의 플라스미노겐 활성화반응을 표시한 선도

제12A, 12B도는 SAK와 SK의 α₂­PI존재하에서 트롬빈 존재. 비존재하에서의 플라스미노겐 활성화 반응을 표시한 선도

제13A, 13B 또는 SAK와 SK의 α₂- pI 존재하에서 트롬빈 존재, 비존재하에서의 플라스미노겐 활성화 반응을 표시한 선도, 제14도는 SAK 및 SK의 농도를 변화시킨 경우의 플라스민활성의 저해율을 표시한 선도, 제16도는 SAK ­플라스미노겐 (플라스민)복합체의 선용경시변화의 결과를 표시한 설명도.

제17도는 SAK­플라스미노겐(플라스민) 복합체의 선용 농도의존성의 결과를 표시한 설명도이다.

본 발명은 플라스미노겐 액티베이터(plasminogen activator) 및 혈전(thrombus)용해제에 관한 것이다.

종래에, 혈전용해제로서, 주로 신장에서 합성되고 오줌속으로 배설되는 우로키나제(urokinase) (이하, UK 라고 표기함) 및 β용혈 연쇄구균(β­hemolytic streptococci)의 대사산물로 되어있는 스트렙토키나이제(streptokinase) (이하 SK라고 표기함)등의 플라스미노겐 활성화 인자가 임상적으로 사용되고 있다.

이중에, SK는 UK에 비하여 가격이 저렴하고, 구미(歐美)에서 널리 사용되고 있지만, UK 및 SK는 순환 혈액중(액상)에 있어서 플라스미노겐을 활성화 하기 위해, 본래의 목적인 혈준 중(고상)의 피브린(fibrin) 분해이외에 순환 혈액내의 피브리노겐까지도 분해 하기 때문에, 출혈등의 부작용이 문제로 되어 있었다.

이 때문에, 이들의 물질은 보통 카페테르(katheter)등을 사용하여 혈전부위에 직접 투여 되었고, 상당한 의료설비를 필요로 하였다.

더욱이 SK는 세균유래의 단백질로 되어 있기 때문에, 항원성(antigenicity)이 문제로 되어 있다.

그래서, 종래의 혈액중의 피부린노겐까지도 분해하는 혈전용해제와는 다른, 완전히 새로운 발상에 의거한 피브린을 선택적으로 분해하는 혈전용해제의 개발이 요망되었다.

이때문에 최근에는, 조직성 플라스미노겐 액티베이터(이하, tPA 라고 표기함), 프로우키나아제(prourokinase) (이하, Pro­UK 라고 표기함)가 발견되고, 피브린에 특이성을 지닌 혈전용해제로서 주목되고 있다. 또 최근에 SK를 플라스미노겐과의 복합체형으로 투여하는 시도가 임상의 분야에서 주목을 집중시키고 있다. (U.S.P.NO. 4178368, U.S.P.NO. 4082612).

그 목적의 하나는 높은 농도에서의 억제작용을 피하기 위해서이고. 또하나는 플라스미노겐 과의 결합에 의하여 SK의 항원부위를 마스크(mask)하고, 항우너성을 저하하려고 하는 것이다.

또, SK­플라스미노겐 복합체의 활성중삼을 아실화(acylation)하는 시도도 하고 있지만( E.P.NO. 28489). 이것은 한편으로는 혈전부위에서 탈아실화됨으로써, 피브린의 특이성을 높이는 것이 목적이지만, 그 이외에 복합체의 자기소화(digestion)를 방지하는 효과도 있다.

한편, 최근에 유전자공학적수법에 의하여, 대장균에 의한 스타필로키나아제(staphylokinase) (이하 SAK라고 표기함)의 대량생산이 가능하게 되었다. (E.P.NO. 77664, U.S.P. NO. 4532211, Sako, T.Eur. J. Biochem., 149, 557­63, (1985)).

SAK는 SK와 마찬가지로 플라스미노겐과 결합하여 복합체를 형성하고 그 복합체가 플라스미노겐 액티베이터로서 작용하는 것을 추축되고 있지만, 실제로 복합체를 합성, 단리하고, 활성을 확인한 보고예는 없다.

또. SAK는 SK와는 아미노산 배열 및 항원성이 다르고, 또, 분자량도 SK의 1/3이하인(Nucleic Asid Research, 11, P. 7679­93(1983))혈전용해제이다.

그러나, 전기한 tPA, Pro­UK와 함께, 생체내에서의 반감기가 짧은 것, 플라스미노겐, 액티베이터, 인히비터(inhibitor) (이하 PAI)에 의하여 신속하게 저해되는 것이 문제점으로 되며(collen, D.etal. : Thrombos. Haemostas., 52; 24­26, 84), 당초에 기대한 정도의 성과는 얻지못하였다. (Sherry, S.: New England J. Med., 313, 1014­17, 85).

그래서, 본 발명자들은 전심노력한 결과, SAK와 SK의 작용기구의 상위플 분명하게 하여, SAK는 출혈등의 부작용이 적은 우수한 혈전 용해제인 것을 확인하였다.

또 이것과 동시에, SAK의 선용활성(fibrinolysis)의 효과발현 하기까지 30분정도의 시간지연(lagtime)이나 높은 농도에서는 오히려 피브린의 분해를 억제하는 작용등의 SAK가 갖는 결점도 분명하게 확인하게 되었다.

보통의 혈전용해법에 있어서는, 긴급성이 요구하게 되고, 또 최적투여량을 설정할 필요가 있다.

이러한 점에 관하여, 효과발현에 시간을 필요로하는 것 및 높은 농도에서의 억제작용은 실제로 치료에 사용하여 효과를 얻지못하게 되는 경우, 투여량이 과잉으로 되어있는지, 혹은 부족한지의 판단이 어려워서, 이런 것이 SAK가 갖는 결점의 하나로 생각된다.

그래서 본 발명은 SAK의 작용기구를 분명하게 한뒤에, SAK를 주성분으로 하는 출혈등의 부작용이 적고 혈중 안정성이 뛰어나고, PAI에 의한 저해도 받기 어렵고, 생체내에서 장기간에 걸쳐서 활성이 유지되는 플라스미노켈 액티베이터 및 혈전용해제를 얻는 것을 목적으로 한다.

전기한 목적을 달성하기 위하여, 제1의 발명에 관한 혈전용해제에서는, SAK를 유효성분으로 하는 것을 제공한다.

또. 제2의 발명에 관한 플라스미노겐 액티베이터에서는 SAK­플라스미노겐 (혹은 플라스민) 복합체로 되어 있는 것을 제공한다.

또, 제3의 발명에 관한 혈전용해제에서는 SAK­플라스미노겐(혹은 플라스민) 복합체를 유효성분을 하는 것을 제공한다.

본 발명에서의 SAK는 플라스미노겐과 복합체를 형성하고, 이 복합체가 플라스미노겐 액티베이터로서 작용한다(kowalska­Loth, B. Zakrzewski, K. : Acta Biochem. Pol., 22 ; 327­39 (1975)).

이런점에 있어서 SAK의 작용기구는 SK와 비슷하지만, 몇가지 다른 성질을 본발명자들의 연구에서 나타내었다. 즉,

a. SAK는 피브린의 존재하에서 플라스미노겐의 활성화작용이 크게 증강된다. 즉 SAK는 피부린의 특이성이 높다. 그러나. SK에 있어서는 피부린의 존재하에서의 증강은 약하다.

b. SAK­플라스미노겐 복합체의 반응은, 순환혈액중에서 α₂­플라스민 인히비터(이하, α₂­ PI)에 의하여 저해를 받지만, 피부린 존재하에서는 α₂­PI에 의한 저해를 받기 어렵고, 따라서, 피부린분해 (혈전용해)에 선택적으로 반응이 촉진되는 것이 예상된다.

이에 반해서 SK­플라스미노겐 복합체의 반응은 α₂­PI에 의하여 저해되지 않는다.

그 때문에, 순환혈액내의 피브리노겐 까지도 분해하기 때문에, 출혈등의 부작용이 발생하고 있다.

c. SK는 플라스민에 의하여 신속하게 분해되지만, SAK는 프라스민에 의하여 분해되기 어렵고, 혈장속에서의 안정성도 양호하다.

d. SAK의 분자량은 약 15,000(Nucleic Acids Research, 11,9, 7679­93(1983))으로 SK의 약 1/3이므로 혈전속으로의 침투성은 양호하다고 생각된다.

이들의 성질을 종합해보면. SAK의 작용기구는 제1도에 표시되어 있는 것으로서 본 발명에서 판명되었다.

제1도는, 본 발명자들이 해석한 SAK와 SK의 작용기구의 상위를 모식적으로 표시한 설명도이다.

또한, 도면에 있어서 SAK는 SAK, SK는 SK,α₂­PI는 α₂­플라스민·인히비터, Fn은 피브린. plg는 플라스미노겐, plm은 플라스민을 나타낸다.

즉, 혈류중에서 방생한 SAK­플라스미노겐(혹은 플라스미)복합체는 α₂PI에 의하여 신속하게 저해되어 플라스미노겐은 활성화 되지 않지만, 피브린에 결합된 플라스미노겐(혹은 플라스민)과 SAK의 복합체는 저해를 받지 않아서, 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민으로 되고. 혈전이 용해한다.

한편, SK의 경우는 혈류중에 발생한 SK­플라스미노겐(혹은 플라스민) 복합체는 α₂­PI에 의한 저해를 받지 않아, 그 결과로서 다량의 플라스민이 혈류중에서 발생되고, 그 때문에 피브리노겐(도시 하지 않음)이 분해된다.

이런 것은 SK에서 높은 빈도의 출혈경향을 나타내게 되는 원인으로 생각된다.

또, SAK가 가진 결점인 효과 발현까지의 시간지연(lag time)은, SAK가 플라스미노겐과 결합하여, 플라스미노겐의 구조(conformation)를 변화시켜, 플로테아제(protease) 활성을 발현시키는데 필요한 시간에 기인한다고 생각된다. (Acta Biochemica Polonica 22, P329­31 (1975)).

또, 높은 농도에서의 억제 작용은 혈중의 플라스미노겐 (혹은 플라스민)의 대부분이 SAK와 결합하고, 그 결과, 피브린 분해활성을 갖는 미결합한 플라스민이 고갈하기 때문이라고 생각된다.

이들의 문제점은 이미 SAK를 플라스미노겐과 혼합하고, 일정시간 인큐베이트(incubate)하는 것에 의하여 해결할 수 있다.

즉, 이 조작에 의하여 몰비 = 1 : 1의 SAK­플라스미노겐(혹은 플라스민)복합체를 얻게 되지만, 그 복합체는 임 프로테아제활성을 갖고 있으므로, 그대로 플라스미노겐 액티베이터로서 사용할 수 있다.

또, 이런 경우, SAK는 전부 플라스미노겐(혹은 플라스민)과의 복합체로서 존재하기 때문에, 그이상 혈중의 플라스미노겐 (플라스민)과 결합하지 않고, 높은 농도에서도 억제하지 않는다.

또한 SK­플라스미노겐(플라스민)복합체는 자기 분해를 받기 쉽지만, SAL­플라스미노겐(플라스민) 복합체는, 자기분해를 받기 어렵고, 그 형태대로 장시간 안정하다.

SAK­플라스미노겐(플라스민)복합체는, 플라스미노겐 활성화 작용을 갖는다. 즉, 플라스미노겐을 한정분해 하고, 플라스민으로 변환한다.

플라스민은 혈전속의 피브린을 분해하고, 결과로서 혈전용해한다.

따라서, SAK­플라스미노겐(플라스민) 복합체는, UK나 SK와 마찬가지로 혈전중(thrombosis)을 시초로하는 여러 가지 혈전성질환의 치료에 유효한 것이다.

본 발명은 이하의 실시예에서 상세하게 설명하는 바와 같이 SAK는 SKL에 비하여 피브린 특이성이 높아서, 혈류중에서 발생한 SAK­플라스미노겐(혹은 플라스민) 복합체는 α₂­PI에 의하여 신속하게 저해되어, 플라스미노겐은 활성화 되지 않지만, 피브린에 결합된 플라스미노겐(혹은 플라스민)과 SAK의 복합체는 방해를 받지 않고, 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민으로 되고, 혈전이 용해 한다는 작용기구 때문에 출혈등의 부작용이 적은 혈전용해제로서 이용할 수 있는 것이 분명하게 되었다.

또, SAK는 혈중안정성이 SK등의 플라스미노겐 액티베이터보다도 뛰어나고, 제1도에 표시한 바와 같이, SAK의 작용기구는 tPA나 Pro­UK와는 다르므로 tPA 및 Pro­UK의 저해물질인 PAI에 의한 혈전부분에서의 저해도 받기 어렵고, 생체내에서 장기에 걸쳐서 활성이 유지된다고 생각된다.

따라서, 혈증의 선용활성을 할상높일수가 있게 되고 만성적(chronic)인 혈전성 질환에도 유효하다고 생각된다.

더우기 SAK는, 종래에 상용되었던 다른 혈전용해제에 비하여 분자량이 작고, 혈전내의 침투성의 점에서도 유리하다.

또, SAK­플라스미노겐(플라스민) 복합체는, 그 형태가 활성형의 플라스미노겐 액티베이터로 되어 있으므로, SAK단독으로 사용하는 것보다도 즉효성이 있다. 또, SAK는 전부 플라스미노겐(플라스민)과의 복합체로서 존재하므로 높은 농도에서 사용해도 선용을 억제하지 않는다.

더욱이, SAK의 플라스미노겐(플라스민)의 복합체는 SK­플라스미노겐 복합체보다도 안정하며, 자기분해를 발생하는 일이 적다.

또, SAK의 많은 항원부위가 마스크되므로, SK의 경우와 마찬가지로 항원성의 저하를 기대할 수 있다.

(실시예 1) SAK, SK의 항원성 시험

토끼를 면역하여 SAK에 대한 항체(플라클로날)를 작성하고, 옥텔로니(Ouchterlony)법에 의하여 SK와의 고차시험(cross­reaction)을 실시하였다.

그결과, 항 SAK항체와 SK와의 사이에는 침강선(precipitation­line)이 형성되지 않고, 양쪽 단백질은 항원성이 달리되는 것을 나타내었다.

(실시예 2.) SAK의 반응기구의 해석

제1도는 본 발명자들이 해석한 SAK와 SK의 작용기구의 상위를 모식적으로 나타낸 설명도이다. 또한, 도면에 있어서, SAK는 SAK, SK는 SK, α₂­PI는 α₂­플라스민 인히비터 Fn은 피브린, plg는 플라스미노겐. Plm은 플라스민을 나탄낸다.

즉, 혈류중에서 발생한 SAK를 플라노겐(혹은 플라스민) 복합체는 α₂­PI에 의하여 신속하게 저해되고, 플라스미노겐은 활성화 되지 않지만, 피브린에 결합된 플라스미노겐(혹은 플라스민)과 SAK의 복합체는 저해를 받지 않고, 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민으로 되고, 혈전이 용해한다. 한편 SK의 경우는 혈류중에 발생한 SK­플라스미노겐(혹은 플라스민)복합체는 α₂­PI에 의한 저해를 받지 않고, 결과로서, 다량의 플라스민이 혈류중에서 발생되고 그 때문에 피브리노겐(도시하지 않음)이 분해된다. 이런 것은 SK에서 출혈경향이 높은 빈도로 발생되는 원인으로 생각된다.

이하에 이 SAK의 작용기구의 해석을 차례로 설명한다.

2­1. 폐쇄순환 모델에 의한 피브린 특이성의 검토

혈전용해제(플라스미노겐·액티베이터)의 피브린 특이성을 조사하는 방법으로서, 가장 생체에 가까운 모델로서, 마쓰오 등에 의하여 개발된 폐쇄순환 시스템(Matsuo. O. et al. : Thrombos. Res., 241 ; 347­58, (1981)이 있다.

그래서, 폐쇄순환모델(생체에 가까운 모델)에 의하여 SAK의 피브린 특이성에 대하여 검토하였다.

(방법.)

(1) 피브리노겐의¹²⁵I­레이블(label)인체, 피브리노겐(Plasminogen Free, 시그마 사제품)을 크롤라민 T(Chloramin T)법에 의하여¹²⁵I로 방사레이블(radiolable)하고, 레이블화된 피브리노겐을 겔(gel) 여과법에 의하여 정제하였다.

그결과, 약 3.5×10⁶cpm/ml의¹²⁵I­피브리노겐 1.5ml를 얻게되었다.

(2)¹²⁵I­레이블화혈전의 제작

인체혈장 1ml에¹²⁵I­피브리노겐 용액 20μl를 가하고 25mM 염화칼슘(CaC12) 용액 100μl를 혼합한 뒤, 피브리노겐을 피브린으로 변환하는 효소인 트롬빈(thrombin)용액 (100U/ml : 시그마 사제품) 50μl를 가하고¹²⁵I­레이블화 혈전을 제조하였다.

(3) 폐쇄순환 모델에 의한 혈전 용해 실험

제2A도는 폐쇄순환 실험 장치의 구성을 나타내는 설명도.

제2B도는 제2A도의 요부의 구성을 나타낸 설명도이다.

또한, 도면중, 동일부호는 동일한 것을 나타낸다.

도면에 있어서, 인체혈정(1) (전량 21 ml)을 1.95ml/min의 유속으로 실리콘튜우브(2)에 의하여 각각 접속된 하부의 챔버(chamber) (3). 페리스터펌프(4). 상부의 챔버(5)를 순환시켜, 상부의 챔버(5)에는 레이블화 혈전(6)을 놓아두었다.

피검시료(7) (SAK혹은 SK)는 1㎖를 하부 챔버(3)에 떨어 뜨리고, 나머지 5㎖는 페리스터펌프(8) (유속 0.04㎖/­min)로 연속적으로 첨가하였다.

반응게는 37℃로 보온하고, 1시간마다 하부쳄버(3)로부터 순환혈장을 채취하여, 방사활성 및 혈장성분의 측정에 제공하였다.

(4) 피브린분해도의 측정

혈장중의 방사활성을 감마카운터로 측정하고, 그 값으로부터 전체순환 혈장중의 방사활성을 계산하고, 사용한 테이블화 혈전의 방사활성에 대한 백분율로서 피브린 분해도(%)를 나타내었다.

제3A, 3B도는 SAK와 SK의 각 농도에 있어서의 피브린의 분해도의 경시변화를 나타내는 선도이며, 종축은 피부린 분해도, 횡축은 시간을 표시하고, ●는 0.625μg/㎖, ◆는 1.25/μg/㎖, ■는 2.5μg/ml. ▲는 5.0μg/㎖, ▼는 10μg/㎖. ★sms 20μg/㎖, X는 40μg/㎖, *는 50μg/㎖의 SAK또는 농도를 표시한다.

제4도는 피브린 분해도의 농도의존성을 표시한 선도이며, 50%의 피브린 분해도가 관찰되는 시간(종축)을 농도(횡축)에 대하여 플로드(plot)하였다. 도면에 있어서 ●는 SAK, ○는 SK를 표시한다.

(5) 혈장 피비리노겐의 정량

피검혈장 50μl에 50mM 염화칼슘(CaC12)을 함유하는 바르비탈(barbital)완충액(pH 7.75) 200μl를 가한후에, 그 중의 50μl를 96구멍타이러플레이트(96­Well microtiter plate)에 분취하였다.

트롬빈 용액(100μ/㎖ : 시그마 사제품) 50μl를 가해주고, 37℃에서 10분간 반응시킨 뒤, 파장 405nm에서의 흡광도를 축정하였다.

또한, 피브리노겐 농도(%)는 트롬빈 대신에 물을 가해준것(응고시키지 않음)의 흡광도를 0%, 정상혈장을 응고시킨 것을 100%로 하고, 비례계산으로 구하였다.

제5A, 5B도는 SAK와 SK으 각 농도에 있어서의 피브리노겐 양의 경시변화를 표시한 선도이며. 종축은 혈장중의 피브리노겐 양 (%), 횡축은 시간을 표시하고, ●는 0.625μg/㎖ ◆sms 1.25μg/㎖ , ■는 2.5μg/㎖ , ▲는 5.0μg/㎖ , ▼는 10μg/㎖ ★는 20μg/㎖ 의 SAK 또는 SK의 농도를 표시한다.

제6A, 6B도는 SAK^2.5μg/㎖ 와 SK10μg/㎖ 의 피브린 특이성의 비고를 표시한 선도이며, 종축은 피브린분해도(%)(좌측), (○)와 피브리노겐 양(%)(우측)(△), 횡축은 시간을 표시한다.

제7도는 혈전용해 특성의 농도의존성을 표시한 선도이며, 종축은 6시간 후에 있어서의 혈전용해특성, 횡축은 SAK(●) 및 SK (○)의 농도를 표시한다.

또한, 혈전용해특성은 다음식으로 나타나게 된다.

(혈전용해특성) = (피브린분해도) (%)/ (피브리노겐분해도 (%))

(6). 혈장플라스미노겐의 정량

50mM 트리스­염산완충액(pH7.4)으로 40배 희석한 피검혈장을 96구멍타이터플레이트에 36μl취하고, 우토키나아제(5000Iμ/㎖ )를 14μl가해주고, 37℃에서 15분간 인큐베이트하여 플라스민을 생성시켰다.

더욱이 합성발색기질 CBS 33.08(7.5mM스타고 사제품) 10μl를 가하고, 37℃에서 15분간 인큐베이트한 뒤, 2% 구연산용액 200μl를 가하여 반응을 정지시키고, 파장 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

또한 플라스미노겐 농도(%)는 정상혈장(100%) 및 4배로 희석한 혈장(25%)을 마찬가지 방법으로 측정하고, 비례계산으로 구하였다.

제8A, 8B도는 SAK와 SK의 각 농도에 있어서의 플라스미노겐 양의 경시변화를 표시한 선도이며, 종축은 혈장중의 플라스미노겐 퍼센트량, 횡축은 시간을 표시한다.

(7). 혈장 α₂­플라스민 인히비터(α₂­PI)의 정량 120mM모노메틸아민염산을 함유하는 50mM트리스­염산 완충액(pH7.4)으로 50배 희석한 피검혈장을 96구멍 타이터블레이트에 28μl취하고, 프라스민(16.7 μg/㎖)dmf 22μl가해주고 37℃에서 15분간 인큐베이트하고, 혈장 α₂­PI와의 복합체를 형성시켰다.

더욱이 합성발색기질 CBS 33.08(7.5mM : 스타고 사제품)을 10μl 가해주고, 37℃에서 15분간 인큐베이트한 뒤, 2% 구연산 용액을 180μl가하고 반응을 정지시켜, 파장 405nm에서의 흡광도를 측정하였다.

α₂­PI양(%)은 플라스미노겐의 경우와 마찬가지로 25%와 100%의 값을 측정하고, 비례계산으로 구하였다.

제9A 9B도는 SAK와 SK의 각 농도에 있어서의 혈장 α₂­PI양의 경시변화를 표시한 선도이며, 종축은 혈장중의 α₂­PI양(%), 횡축은 시간을 표시한다.

[결과·고찰]

제3A도에 표시된 바와 같이 SAK는 0.625㎍/㎖로서는 거의 피브린을 분해하지 않지만, 1.25㎍/㎖이상의 농도에서는 농도에 의존한 분해가 생기고 10㎍/㎖에서는 거의 최대의 피브린 분해활성을 나타내었다.

한편 SK는 제3B도에 표시된 바와 같이 1.25㎍/㎖이상의 농도에서 피브린의 분해가 나타나고, 20㎍/㎖에서 최대의 피브린 분해활성이 나타났다.

이와같이 양자모두 농도의 존성의 피브린 분해가 있었지만 비활성은 SAK에서 강하고, 이를테면 SAK에서 강하고, 이를테면 SAK 5㎍/㎖와 SK20㎍/㎖에서 동등하였다.

제4도에서는 SAK는 SK에 비하여 적은양 짧은 시간에 피브린을 분해하는 것을 나타내고, SAK의 유효성이 확인되었다.

또 양자의 반응곡선에서는 명백한 상위점이 확인되었다.

즉 SK에서는 경시 변화가 직선적인데 비하여 SAK에서는 반응 초기에는 거의 피브린 분해를 볼 수 없지만 한번 분해가 일어나면 그 후는 급격힌 반응이 진행되는 것을 알게 되었다.

다음에 순환 혈장중의 피브리노겐의 활동에 대하여 기술한다.

제5B도에 표시된 바와같이 SK에서는 피브리노겐의 분해가 현저한데 비하여 SK에서는 제5A도와 같이 가볍고, 특히 25㎍/㎖의 경유를 보면, 6시간후에 피브린은 100% 분해하고 있는데 피브리노겐은 85% 잔존하여있어 SAK에 간한 피브린 특이성이 나타났다.

제6A, 6B도에서는 SAK는 SK에 비하여 뚜렷하게 피브린 분해가 강하게 피브린노겐의 분해는 약하게 일어난 것으로 보여진다.

또, 제7도에서는 SK에서는 모든 농도에 있어서 1이하의 낮은 값인데 비해 SAK데서는 1.25내지 5㎍/㎖의 범위에서 높은 혈전 용해특성이 인정되고 특히 2.5㎍/㎖에서는 6.6이라는 높은 값을 나타냈다.

같은 실험에 있어서 t­PA나 Pro­UK등의 혈정용해제에서도 혈전용해 특성이 3을 넘는 일은 없어, SAK는 특히 피브린 특이성이 뛰어난 물질임을 알았다.

제8A, 8B, 9A, 9B도에서는 플라스이노겐 및 α₂­PI의 감소는 SK에 비하여 SAK에서 약하고, 순환혈장중에서 플라스미노겐의 활성화가 약함을 표시하였다.

이상과 같이 폐쇄순환 모델(생체에 가까운 모델)에서는 SAK는 SK에 비하여 저농도에서 혈장괴(인고혈전)을 용해하고, 그리고 순환 혈장중의 피브리노겐의 분해도 적고 혈전 용해 특성이 높다는 것이 나타났다.

또 혈장중의 플라스미노겐 및 α₂­PI의 감소도 SAK에서 약하고 혈장에 있어서 플라스미노겐 활성화반응이 약함이 증명되었다.

2­2 인체 혈장에 대한 트럼빈 첨가에 의한 피비른 특이성의 검토.

인체 혈장의 트럼빈을 가하여 피브리노겐을 피브린으로 변환시키고 플라스미노겐 활성화 반응을 해석하였다.

(방법)

96구멍 타이터 프레이트에 0.1M 트리스­임산환충액 (pH7.4) 150㎕를 취하고, 인체혈장(Ci­Trol 미도리쥬우지 사제품)

20㎕ 및 플라스민의 기질인 합성 박색기질 S­2251(5㎍/㎖ 카비­비트럼사제품)10㎕를 가한후 인체­트럼빈용액(1μ/ml : 시그마사제품)혹은 대조로서 물10㎕를 가하여 소정의 농도의 SAK 혹은 SK 용객 10㎕에 의하여 반응을 게시하였다.

반응은 37에서 행하고 파장 405nm에서의 흡광도 변화를 측정하였다.

제10A, 10B도는 SAK (10, 20, 40㎍/ml) 및 SK(2, 5, 5, 10㎍/ml)의 트럼빈존재, 비존제하에서의 플라스미노겐 활성화 반응을 표시하는 1선도이고 그림에서 종축은 파장 405㎜에서의 흡광도 변화, 횡축은 시간(min)SK 그림에서 ○, ● SAK 농도 10㎍/ml △,▲는 20㎍/ml □, ■는 40㎍/㎖ SK 그림에서 ○, ●는 SK 농도 2.5㎍/㎖ △, ▲는 5㎍/㎖ □, ■는 10㎍/㎖ ○, △, □는 트럼빈 비존제하 ●▲■는 트럼빈 존재하를 표시한다.

제11도는 반응 40분후에 SAK 및 SK각 농도의 트럼빈 존재, 비존재하에서의 플라스미노겐 활성화반응을 나타내는 선도이고, 그림에서 종축은 반응 40분후에 파장 405nm에서의 흡광도 변화 횡축은 SAK 및 SK 농도(㎍/㎖) ●, ○는 SAK □, ■는 SK, ○, □는 트럼빈 비존재하 ●, ■는 트럼빈 존재하를 표시한다.

(결과·고찰)

제10A, 10B, 11도에 표시된 바와 같이 트럼빈의 첨가에 의하여 SAK에 의한 플라스미노겐 활성화반응은 현저히 증강되었다.

한편 SK의 반응도 트럼빈에 의하여 증강되지만 SAK에 비하여 약하고 이를테면 SAK 40㎍/㎖와 SK 10㎍/㎖의 경우를 비교하였을 경우 트럼빈 존재하에서의 활성은 거의 같지만 비존재하에서의 SK 활성은 SAK의 10배 정도 있다.

이상과 같이 SAK활성은 SK에 비하여 트럼빈에 의하여 즉, 피브린 존재하) 현저히 증강되고 높은 피브린 특성을 나타내었다.

2­3αPI 존재하에서의 SAK 반응의 피브린에 의한 증강 α₂­PI 및 피브리노겐 의존재하에 SAK 및 SK의 작용을 측정하고 트럼빈에 의한 피브린 형성의 영향을 조사 하였다.

(방법)

작은 시험1관에 SAK 혹은 SK의 용액 10μl를 취하고 인폐­트럼빈용액 (20units/ml : 시그마사제품)10㎕를 가한후 50mM 트리스­염산완충액 (PH 7.4.0.01% 트원 80첨가)140㎕, 인체­피브리노겐 용액 (3.0㎕/㎖ : 플라스미노겐 푸리, 시그마사제품) 10㎕ 인체­플라스미노겐 용액 (0.15㎍/㎖ : 글루파밀 ­형, 카비, 비트럼사제품)10㎕ 인체 α₂­PI 용액(0.06㎍/ml : 프로토겐사제품) 및 합성발색기진 S­2251(10M : 카비. 비트겐사제품) 10㎖의 혼액 180㎕를 가하여 반응을 개시하였다.37℃에서 30분간 인큐베이트한후, 8% 구인산용액 50㎕를 가하여 반응을 정지하고, 그중 200㎕를 96구멍타이터 프레어트에 취하고 파장 405nm에서의 흡광도 변화를 타이터 프레이트 용분광광도계로 측정하였다.

또 트럼빈 첨가에 의하여 반응액이 겔화하는데 구연산 용액을 가하여 흔들어 움직임으로써 용해시켰다.

제 12A, 12B도는 α2­PI 비존재하에서의 SAK 및 SK 각 농도의 트럼빈존재, 비존재하에서 플라스미노겐 활성화반응을 표시하는 선도이고, 제13A, 13B 또는 α2 - PI 존재하에서의 SAK 및 SK 각농도의 트럼빈 존재, 비존재하에서의 폴라스미노겐 활성화 반응을 표시하는 선도이다.

그림에서 종축은 반응 30분후에 파장 405nm에서의 흡광도 변화, 횡축은 SAK와 SK 각 농도(㎍/㎖), ○, □는 트럼빈 비존재하, ●, ■는 트럼빈 존재하를 표시한다.

[결과·고찰]

제12A 12B도에 표시된 바와 같이 PI의 비존재하에 에서의 SAK, SK의 활성은, 트럼빈 첨가에 의하여 거의 영향을 받지 않고 이 반응 조건에서는 양자 모두 피브린에 대하여 특이성을 갖지 않음을 알아내었다.

그런데 제13B도에 표시된 바와 같이 α₂­PI의 존재하에서의 SK에서는 α₂­PI 비존재하에 비하여 약간 약하기는 하나 같은 전도의 활성이 관찰되고, 트럼빈첨가에 의하여 2내지 3배정도의 활성의 회복이 보였다. 이에 대하여 제13A도와 같이 SAK는 트럼빈 비첨가의 조건에서는 5.0㎍/㎖의 농도에서의 활성은 발현하지 않고, α₂­PI에 의한 저해가 인정되었다.

또, 더욱 중요한 변화로서, 이 조건에서 SAK 활성은 트럼빈 첨가에 의하여 SK에 비하여 현저히 증감되어 있고, 예를들면 5.0㎍/㎖의 경우르 보면 트럼빈 비 첨가에 있어서 흡광도 변화는 0인데 비하여 트럼빈 첨가에서는 0.93이라는 높은 값을 표시하였다.

이 사실은 α₂­PI에 의한 SAK 반응의 저해가 피브린 형성에 의하여 회복한 것을 의미한다.

이와같이 SAK는 α₂­PI비존재하에서는 피브린 특이성을 갖지 않고, PI 존재하에서 비로소 피브린 특이성을 발현한다는 사실은, SAK피브린 특이성 발현에 α₂­PI가 깊이 관여하고 있는 것을 나타내고 있다.

2­4

PI의 플라스민 저해 반응에 미치는 SAK 및 SK의 영향 2­3장에서 보여준 SAK의 피브린 특이성 발현에서의 α₂­PI의 관이를 더욱 자세히 해석할 목적으로 α2­PI의 플라스민 저해 반응에 미치는 SAK 및 SK의 영향에 대하여 조사하였다.

[방법]

96구멍 아세이 플레이트(96well assay plate)에 인체­플라스민 용액(0.05C.μ/㎖ : 시그마사제품)50㎕를 취하고 SAK 혹은 SK의 용액(각각 0내지 50㎍/㎖)10Ul를 가하여 실온에서 5분간 방치한후 α₂­PI(0내지 5I.μ./㎖ : 프로토겐 사제품)10㎕를 가하여, 50mM 트리스­염산완충액 (PH 7.4) 120㎕와 활성발색기진 S­2251 (10mM : 카비. 비이트럼사제품) 10㎕의 혼액(계 130㎕)을 가하여 반응을 게시하였다.

반응은 37℃에서 행하고, 30분후에 파장 405nm에서의 흡광도 변화를 아세이 플레이트 용 분광 광도게로서 측정하였다.

저해율은 α₂­PI비첨가시의 플라스민 활성을 A 첨사지의 활성을 B화하고 이하의 식에 따라서 계산하였다.

저해율(%) = (A­B)/A × 100

제14도는 α₂­PI농도를 일정 (5I.μ/㎖)하게 하였을때의 SAK 및 SK의 농도을 변화시킨 경우의 플라스민 활성이 저해율을 표시하는 선도이다.

그림에서 종축은 저해율(%) 횡축은 SAK 및 SK의 농도(㎍/㎖) ○는 SAK, ●는 SK를 표시한다.

제15도는 α₂­PI농도를 변화시킨 경우의 플라스민 활성의 저해율을 표시하는 선도이다.

그림에서 종축은 저해율(%) 횡축은 α2­PI 농도(I.μ/㎖) ○는 컨트롤 ■는 SAK(농도 50㎍/㎖) ○는 컨트롤 ■는 SAK(농도 50㎍/㎖) △는 (농도 ㎍/㎖)를 표시한다.

[결과·고찰]

제14도에서 알수 있는 바와 같이 α₂­PI(5I.μ/㎖)첨가사이에 80%저해가 일어나는데, SAK, SK 농도를 상승시키면 플라스민 활성저해율이 낮아져 플라스민 활성의 회복이 나타난다.

이 경우 활성의 회복은 SK에서는 강하고 SK 50㎍/㎎의 첨가로서는 전해 저해되지 않는데 비하여 동농도의 SAK에서는 60%의 저해가 확인되고 SAK 에서는 플라스민 활성의혹 회복이 약하다는 것을 알 수 있다.

또 제15도는 반대로 SAK 및 SK의 농도를 일정(50㎍/㎎)하게 하고, α₂­PI 농도를 변화시킨 경우의 플라스민 활성의 저해율을 표시하는데 SK 첨가시에 α2­PI에 의한 저해는 전혀 볼 수 없는데 비하여 SAK에서는 α₂­PI농도에 따른 저해가 인정되어 제14도의 결과가 확인되었다.

SK에 의하여 α₂­PI의 플라스민 활성 저해반응이 억제되는 것에 대하여 몇가지 보고가 있었지만(S.A.Cederholm­Willians et al. Eur. J. Biochem.100.P. 125­132, 79), SAK or α₂­PI의 관련을 조사한 연구보고는 없다.

SK에 의한 플라스민 활성회복의 메카니즘에 관하여 분명하지 않지만, 플라스민의 L(B) 사슬에 결합하고, 입체장해적으로 α₂­PI의 활성중심으로의 결합을 저해하고 있을 가능성이 크다.

SK는 분자량이 SK의 약 3/1이고, SK와 마찬가지로 L(B) 사슬에 결합은 하지만 입체장해는 적다고 생각된다.

α₂­PI는 플라스민에 특이성을 갖는 단백성의 저해 인자이고, 혈류 중에 생긴 플라스민을 신속히 저해하지만 피브린에 결합한 플라스민은 리신결합부위(이하 LBS라고 표기함)가 포화하여 있어 LBS를 개입한 α₂- PI와의 결합이 생기지 않아서, 그 결과로서 저해를 받지 않는다(B. WIman at al Biochem Biophys, Acta, 142­154, 79외)

이와같은 성질때문에α₂­PI의 역할의 하나로서 혈전상에 생긴 플라스민은 저해되지 않고, 혈류중에 생긴 플라스민은 저해하여 결과로서 피브린을 선택으로 분해한다는 제어기능이 있다.

따라서 제1도에 표시한 작용기구에서 설명한 바와 같이 SAK는 α₂­PI의 제어기능에 합치한 피브린 특이성을 획득하고 있는 것을 알게 되었다.

즉, 혈류중에 생긴 SAK­플라스미노겐(또는 플라스민)복합체는 α₂­PI에 의하여 신속히 저해되어 플라스미노겐은 활성화 되지 않지만, 피브린에 합한 플라스미노겐(혹은 플라스민)과 SAK의 복합체는 저해를 받지 않아, 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민으로 되고, 혈전을 용해한다.

한편 SK의 경우는 혈류중에 생긴 SK­프라스미노겐 (혹은 플라스민)복합체는 α₂­PI에 의한 저해를 받지 않고, 결과로서 다량의 플라스민이 생겨 피브린노겐(도시하지 않음)까지도 분해하는 것으로 생각된다.

따라서 이작용기구(제1도)에 의하여 SAK반응을 혈류중에는α₂­PI에 의하여 저해되지만 피브린 상태에서는 α₂­PI가 작용하기 어렵기 때문에 작용이 선택적으로 진행하는 것을 알게 되고, SAK는 SK에 비하여 보다 높은 피브린 특이성을 획득하고 있는 것을 알게 되었다.

따라서 SAK반응은 플라스미노겐 이 유리상태인 경우에는 α₂­PI에 의하여 저해되지만, 피브린에 결합한 플라스미노겐에서는 LBS가 표화하여있어, α₂­PI가 작용할 수 없기 때문에(Wiman, B.et al : Biochem. Biophys. Acta, 579 : 142­54, 79)

SAK 반응은 선택적으로 진행한다는 것을 알게 되었다.

이상의 사실로부터 SAK는 SK에 비하여 피브린 특이성이 늘고 순환혈액내의 피브리노겐의 분해는 저해되기 때문에 문제가 되었던 출혈등의 부작용이 적은 혈전 용해제로서 이용할 수 있는 것이 명백하게 되었다.

실시예3

혈장주에서의 SAK의 안정성

인체 혈장에 SAK 또는 SK을 가하여 37℃에서 인큐배이트하고, 그 일부를 SDS­폴리아크릴아이드겔 전기영동을 걸어 피브린 오토그래피로 선용활성을 조사하였다.

그 결과 SAK는 20시간의 인큐베이션에 의해서도 활성이 저하되지 않았지만 SK에서는 완전히 소실되고 있었다.

또 혈장대신에 인체­플라스미노겐을 사용한 경우도 마찬가지 결과가 얻어지고, SAK의 안정성이 나타났다.

실시예 4. SAK­플라스미노겐(플라스민)복합체.

전기 제3A, 3B도에 표시된 바와같이 활성에 이르기까지의 시간지연의 개선을 위하여, 미리 SAK­플라스미노겐 (플라스민)복합체를 형성시킨 경우의 반응을 검색하였다.

4­1 SAK­플라스미노겐(플라스민) 복합체의 형성

0.1M 인산­나트륨 완충액(pH 7.4)에 용해한 인체­플라스미노겐 용액(세이카가뀨 고오교오, 0.6㎎/㎖)2m에 대하여 몰비=1:1이 되도록 같은 완충액에 용해한 SAK 용액(농도 2.4㎎/㎖)을 86㎍가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트 하였다.

이 조작에 의하여 활성중심을 갖는 SAK­플라스미노겐(플라스민) 복합체가 형성되었다.

이를 슈퍼로스(Superose) 12H/R 10/30컬럼(FPLC 시스템)에 의하여 겔 여과 하였다.

SAK­플라스미노겐 복합체는 고분자 영역으로 용출되고, 플라스미노겐에 결합하고 있지 않는 SAK와 분리, 정제되었다.

4­2 SAK­플라스미노겐(플라스민)복합체에 의한 피브린 용해의 경시 변화.

전기 형성 방법에서 얻어진 복합체의 피브린 용해 활성을 표준 피브린 평판법에 의하여 측정하였다.

즉 80㎎의 인체­피브리노겐(카바사제품 그레이드 L)을 20m의 생리적 식염수(바르비탈­초산 완충액으로 pH를 7.4로 조정)에 조정하고, 원심 분리에 의하여 불용 물을 제거하였다.

이 용액 8m를 직경 8㎝의 프렛트 샤아레에 취하고 인체­트러빈(3.3IU/m)을 0.3m 가하여 피브리노겐을 응고시켰다.

이렇게 하여 작성한 피브린 평판상에, 마이크로 피펫으로 시료를 적하한후 37℃로 인큐베이트하고 피브린의 관찰하였다.

제16도는 피브린 평판의 경시변화를 표시하는 설명도이다.

그림에서 A는 SAK 0.2㎍ 단독, B는 SAK 0.2μM + 플라스미노겐 0.2μM의 복합체 C는 SAK 0.2㎛단독, D는 SK 0.2μM + 플라스미노겐 0.2㎛의 복합체를 표시하고, 5㎕적하된 피브린 평판의 5분, 15분, 30분, 60분 그 후의 상태를 각각 표시하고 있다.

16도에 표시하는 바와 같이 SAK 단독(A)에서는, 반응 개시 60분에 겨우 용해반점이 관찰되는데 대하여, SAK­플라스미노겐 복합체(B)에서는 15분에 이미 용해 활성이 확인되고, 30분 에서는 덩욱 명료해지고, 특효성이 나타났다.

한편 SK단독(C) 및 SK­플라스미노겐 복합체(D)의 모두 30분에 용해 반점이 확인되고 거의 동등의 활성을 나타냈다. 이와같이 SAK는 플라스미노겐과 복합체를 형성함으로써 지연 시간이 단축되고 SK와 동등 혹은 그 이상으로 촉효성의 플라스미노겐 액리베이터로 되는 것이 명백하게 되었다.

실시예 5. SAK­플라스미노겐(플라스민)복합체에 의한 피브린 용해의 농도변화.

SAK, SK 단독과 플라스미노겐­SAK, 플라스미노겐­SK 복합체의 농도변화에 의한 용해반응을 비교하였다.

제17도는 SAK­플라스미노겐(플라스민)복합체의 신용농도 의존성의 결과를 표시하는 설명도이다.

그림에서 A는 SAK단독 B는 SAK+플라스미노겐 등 몰의 복합체, C는 SK 단독, D는 SK+플라스미노겐등 몰의 복합체를 나타내고, 0.04㎛, 0.02㎛, 1.0㎛, 5.0㎛의 각 농도에 대하여, 5㎕적하하고, 120분후의 상태를 표시하고 있다.

제17도에 표시된 바와 같이 SAK, SK 단독(A, C)에서는 고농도(5μM)의 경우 용해반점이 뱀의 눈모양으로 되고, 중심부(즉, 고농도의 부위)에서는 용해반응이 억제되고 있는 것이 표시되어 있다.

한편 플라스미노겐과의 복합체(B, D)에서는 용해반응의 제억제는 확인되지 않고, 중심부까지 용해되었다.

또, 저농도(0.04㎛)에 있어서는 SAK 단독(A) 으로는 용해활성이 약한데 비하여, 플라스미노겐 복합체(B)로는 고농도에 거의 대등할 용해활성을 보이고, 특히, SAK의 경우에 플라스미노겐과의 복합체에 의하여 넓은 농도 범위에서의 유효성이 나타나게 되었다.

한편 SK에서는 단독(C)으로 저농도에 있어서 명료한 용해반점이 보이고 플라스모노겐 복합체로 인한 유효범위에 확대는 확인 되지 않았다.

6. 독성시험.

마우스(ICR 숫컷 28∼35g 10마리)를 사용하여, 각 마우스에 SAK 1㎎/㎏을 정맥으로 투여한 독성 시험의 결과 죽음에 이른 마우스는 없었다.

본 발명은 이상 설명한 바와 같이, SAK는 혈중 안정성이 SK 등의 플라스미노겐 액티베이터 보다도 뛰어나고, 프라스미노겐 또는 플라스민과의 복합체가 플라스미노겐을 활성화 한다고 하는 작용 에카니즘으로부터 유추하여, PAI에 의한 저해도 받기 어렵고, 생체내에서 장기간에 걸쳐서 활성이 유지 된다고 생각된다.

따라서, 혈중의 신용활성을 향상높이는 것이 가능하고, 만성적인 혈전성의 질환에도 유효한 것을 기대할 수 있다.

또 실시에 4에 표시된 바와같이 SAK는 플라스미노겐과의 브레이크 인큐베이터에 의하여 지연시간이 단축되고, SK보다도 즉효성으로 되었다.

또, 실시에 5에서 표시된 바와 같이 플라스미노겐과 몰비 1:1로 혼합함으로써, 고농도에서의 억제 작용이 없어지고, 또 저농도에는 활성이 증강되고, SAK 단독에 비하여 넓은 농도 범위에서 유효하게 되는 것이 확인되었다.

따라서, SAK를 미리 플라스미노겐과 인큐베이트한 형태의 혈전용해제로서 사용하면, 즉효성으로 국소적으로 유효하고, 넓은 농도 범위에서의 투여의 가능한 약물로서 사용할 수 있는 것이 명백하게 되었다.

더욱 이들의 성질은 인 비보(in vivo)에서도 반영 한다고 생각되어진다.

그런데, SK를 플라스미노겐과의 복합체의 형태로 투여하는 시도가 임상분야에서 행하여지고 있는데, 그 목적의 하나는 고농도 에서의 억제작용을 피하기 위해서이고, 또 하나는 플라스미노겐과의 결합에 의한 SK의 항원부위를 마스크하고, 항원성을 저하하려고 하는 것이다.

따라서 SAK­플라스미노겐 복합체의 경우도 마찬가지로 항원성의 저하도 기대할 수 있다.

또, SK를 플라스미노겐과 인큐베이트(몰비=약 1:1)하면, 조속히 분해되고 플라스미노겐(플라스민)도 서서히 자기분해를 받아, 이 형태대로는 투여할 수 없다는 것이 알려져 있다.

그리하여, 혈전부위에서 탈 아실화됨으로서 피브린 특이성을 높이는것 및 복합체의 자기소화를 방지하는 것을 목적으로 하여 SK­플라스미노겐 복합체의 활성중심을 아실화하는 시도도 행해지고 있다.

그런데, 본 발명에 관한 SAK­플라스미노겐 복합체의 활성은 37℃에서 24시간 인큐베이트하여도 전혀 저하되지 않고, 또 플라스미노겐(플라스민)도 SAK와의 결합에 의하여 자기 소화를 받기 어렵게 되어 있다는 데이터가 얻어지고 있어, SAK의 경우는 특히 활성중심을 아실화 하지 않더라도 충분히 한정하다.

이와같이 SAK­플라스미노겐 복합체는 SAK가 갖는 결점을 극복할 뿐만아니라, SK­플라스미노겐 복합체와 비교해도 안정성이라는 점에서 유리하다.

또, SAK를 0.002㎎ 부여함으로써 개의 혈전용해가 관찰되며, 이 값을 인체로 환산하면 0.1내지 0.2㎎의 투여로 충분하다고 생각된다.

이 양은 몰환산으로 약 1㎎의 플라스미노겐에 해당한다.

또, SAK는, 종래사용되었던 다른 혈전 용해제에 비하여 분자량이 작고, 혈전내로의 침투성의 면에서도 유리하다.

또 이전에는 SAK의 생산에 황색 포도구균을 사용하였기 때문에 생산성이 나쁘고도 협잡하는 독소의 문제도 있었지만, 현재는 대장균으로의 크로닝에 성공하고, 쉽게 대량생산이 가능하게 되었다(Sako, T. : Eur.J.Biochem., 149 ; 557­63, (1985)).

따라서, 가격적으로도 다른 혈전용해제와 비교하여 유리하다.

Claims (5)

1. 스타피로키나아제와 플라스미노겐을 혼합하는 단계; 및

   상기 혼합물을 인큐베이션하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 스타피로 키나아제­플라스미노겐 복합체의 제조방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 스타피로키나아제와 플라스미노겐은 1:1의 몰비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 스타피로키나아제­플라스미노겐 복합체의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 인큐베인션은 상온에서 1시간 가량 실시되는 것을 특징으로 하는 스타피로키나이제­플라스미노겐 복합체의 제조방법.
4. 제1항에 의해 제조된 스타피로키나아제­플라스미노겐 복합체를 유효성분으로 하는 혈전용해제.
5. 제4항에 있어서, 제약학적 또는 수의학적으로 수용가능한 담체를 더포함하는 것을 특징으로 하는 혈전용해제.

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