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Diese Erfindung bezieht sich auf einen Plasminogenaktivator und
ein thrombolytisches Mittel.
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Herkömmlicherweise sind Plasminogenaktivatoren, wie etwa
Urokinase, die in erster Linie in der Niere synthetisiert und im
Urin ausgeschieden wird (nachfolgend als UK bezeichnet), und
Streptokinase, die ein Metabolit β-hämolytischer Streptokokken
ist (nachfolgend als SK bezeichnet), klinisch verwendet worden.
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SK ist weniger teuer als UK und wird gewöhnlich in Europa und
USA verwendet. Da UK und SK Plasminogen im Blutkreislauf (in
der flüssigen Phase) sowohl unter Abbauen von Fibrinogen als
auch Abbauen von Fibrin in den Thromben (feste Phase) als ihrem
Hauptziel aktivieren, verursachen Nebenwirkungen wie etwa
Apoplexie Probleme. Daher werden diese Substanzen im allgemeinen
durch einen Katheter direkt an die Stelle verabfolgt, wo sich
der Thrombus gebildet hat, und aus diesem Grund sind
umfangreiche klinische Einrichtungen erforderlich.
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Die Antigenität von SK verursacht ferner Probleme, da SK ein
Protein aus einem Bakterium ist.
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Daher ist die Entwicklung neuer thrombolytischer Mittel, welche
den selektiven Fibrinabbau erlauben, erwartet worden. Diese
Mittel können sich von herkömmlichen thrombolytischen Mitteln
in ihrer Fähigkeit, Fibrinogen im Blut abzubauen,
unterscheiden.
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Kürzlich sind ein Gewebe-Plasmogeninaktivator (nachfolgend als
tPA bezeichnet) und Prourokinase (nachfolgend als Pro-UK
bezeichnet) als Antwort auf das vorgenannte Bedürfnis entdeckt
worden und sie haben Aufmerksamkeit als thrombolytische Mittel,
welche eine Fibrinspezifität besitzen, erlangt.
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Andererseits haben Versuche zur Verabreichung des Komplexes
Zwischen SK und Plasminogen ebenfalls die Aufmerksamkeit auf
klinischem Gebiet auf sich gezogen (US-A-4 178 368, US-A-4 082
612). Der Komplex wirkt, indem er zuerst die Hemmwirkungen von
SK in hoher Konzentration verhindert und zweitens die
Antigenstelle von SK unter Erniedrigen seiner Antigenität durch Binden
von SK an Plasminogen maskiert. Ein weiterer Versuch, das
aktive Zentrum des SK-Plasminogenkomplexes zu acylieren (EP-A-0
028 489) wurde zum Erhöhen der Fibrinspezifität des Komplexes
durch Entacylieren am Ort des Thrombus durchgeführt. Der
Versuch war ferner beim Verhindern der Selbstverdauung des
Komplexes erfolgreich.
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Weiter haben kürzliche Techniken mit rekombinanter DNA die
Herstellung von Staphylokinase (nachfolgend als SAK bezeichnet)
mittels Escherichia coli in großem Maßstab ermöglicht (EP-A-0
077 664, US-A-4 532 211, Sato, T., Eur. J Biochem., 149; 557-
63 (1985)).
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Von SAK kann wie von SK angenommen werden, daß sie an
Plasminogen unter Bilden eines Komplexes bindet, der als
Plasminogenaktivator wirkt. Die Synthese und Isolierung des Komplexes und
seine Aktivität sind jedoch noch nicht berichtet worden.
Außerdem ist SAK, ein thrombolytisches Mittel, von SK in seiner
Aminosäurensequenz und Antigenität verschieden und besitZt ein
Drittel oder weniger des Molekulargewichts von SK (Nucleic Acid
Research, 11, S. 7679-93 (1983)).
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SAK aber verursacht wie die vorstehend beschriebenen PA und
Pro-UK dadurch Probleme, daß es eine kurze Halbwertszeit in
lebenden Organismen besitzt und rasch durch einen
Plasminogenaktivator-Inhibitor (nachfolgend als PAI bezeichnet) gehemmt
wird (Collen, D. et al., Thrombos. Haemostas., 52; 24-26, 84)
und sie daher nicht die fruchtbaren Ergebnisse liefern kann,
welche anfänglich erwartet wurden (Sherry, S., New England J.
Med., 313; 1014-17, '85).
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Die gegenwärtigen Erfinder haben den Unterschied im
Wirkungsmechanismus zwischen SAK und SK als Ergebnis ausgedehnter
Bemühungen aufgeklärt und haben bestätigt, daß SAK ein
überlegeneres
thrombolytisches Mittel mit weniger Nebenwirkungen
wie etwa Apoplexie ist.
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Die Nachteile von SAK, insofern als SAK eine Zeitverzögerung
von etwa 30 Minuten zum Zeigen seiner fibrinolytischen
Aktivität erfordert und SAK in hoher Konzentration Hemmwirkungen
auf die Fibrinolyse besitzt, wurden zu jener Zeit
offensichtlich.
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Thromboseroutinebehandlungen sollten im Notfall durchgeführt
werden können und optimale Dosen thrombolytischer Mittel
sollten ebenfalls festgelegt werden. Diese Bedürfnisse legen nahe,
daß die Zeitverzögerung von SAK beim Entfalten seiner Wirkungen
und die Schwierigkeit des Feststellen des Grundes für das
Erkennen keiner klinischer Wirkungen (ob es entweder durch einen
Überschuß oder durch einen Mangel in der Dosierung wegen
Hemmwirkungen der SAK in hoher Konzentration verursacht wird)
Nachteile von SAK sind.
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Die vorliegende Erfindung stellt einen Plasminogenaktivator und
ein thrombolytisches Mittel zu Verfügung, die SAK als
Hauptbestandteil enthalten, welche weniger Nebenwirkungen (wie etwa
Apoplexie) besitzen, welche eine verbesserte Stabilität
besitzen und welche nicht leicht durch PAI gehemmt werden, was auf
diese Weise zu einer verlängerten Aktivität in lebenden
Organismen führt.
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Um das vorgenannte Ziel zu erreichen, stellt ein erster Aspekt
der Erfindung ein thrombolytisches Mittel zur Verfügung, das
SAK als wirksamen Bestandteil enthält.
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Ein zweiter Aspekt der Erfindung stellt ein thrombolytisches
Mittel, nämlich einen SAK-Plasminogen (oder Plasmin-) Komplex
bereit, der als Plasminogenaktivator wirkt.
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Ein dritter Aspekt der Erfindung stellt ein thrombolytisches
Mittel bereit, das einen SAK-Plasminogenkomplex als wirksamen
Bestandteil enthält.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung bildet SAK mit Plasminogen
einen Komplex und der Komplex wirkt als Plasminogenaktivator
(Kowalska-Loth, B. und Zakrzewski, K., Acta Biochim. Pol., 22;
327-39 (1975)).
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Der Wirkungsmechanismus von SAK ist demjenigen von SK in diesen
Punkten ähnlich, aber die Studien der Erfinder wiesen mehrere
verschiedene Punkte in den Eigenschaften zwischen SAK und SK
nach; und zwar
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a) wird das Plasminogenaktivator-Potential von SAK in
Anwesenheit von Fibrin verstärkt. Somit besitzt SAK eine hohe
Spezifität auf Fibrin. Andererseits ist die Verstärkung des
Plasminogenaktivator-Potentials von SK in Gegenwart von Fibrin
schwach;
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b) wird im Blutkreislauf die Reaktion des SAK-Plasminogen
komplexes durch einen α&sub2;-Plasminhemmer (α&sub2;-Antiplasmin,
nachfolgend als α&sub2;-PI bezeichnet) gehemmt, während die Reaktion
auf Fibrin durch einen a&sub2;-Plasminhemmer wahrscheinlich nicht
gehemmt wird. Es wird daher nicht erwartet, daß sich die
Reaktion auf Fibrin selektiv auf eine Fibrinolyse (Thrombolyse)
zubewegt. Im Gegensatz dazu wird die Reaktion des
SK-Plasminogenkomplexes durch α&sub2;-PI nicht gehemmt wird. Dies führt zum
Fibrinabbau im Blutkreislauf unter Hervorrufen solcher
Nebenwirkungen wie Apoplexie;
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c) wird SK durch Plasmin rasch abgebaut, während SAK durch
Plasmin nicht so leicht abgebaut wird, dies führt zu der guten
Stabilität von SAK im Plasma;
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d) scheint, da das Molekulargewicht von SAK ungefähr 15 000
beträgt (Nucleic Acid Research, 11, S. 7679-93 (1983)), etwa
ein Drittel desjenigen von SK, das Durchdringungsvermögen von
SAK in Thromben gut zu sein.
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Die vorliegende Erfindung weist nach, daß der Wirkungsmechanis
mus von SAK auf der Grundlage allgemeiner Überlegungen seiner
oben beschriebenen Eigenschaft wie in Fig. 1 dargestellt werden
sollte.
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Figur 1 ist eine erläuternde Zeichnung, welche den Unterschied
der Wirkungsmechanismen zwischen SAK und SK, der durch die
Erfinder analysiert wurde, veranschaulicht. In der Abbildung
stellt SAK SAK dar, SK SK, α&sub2;-PI α&sub2;-Plasminhemmer, Fn Fibrin,
Plg Plasminogen und Plm Plasmin.
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Der im Blutstrom gebildete SAK-Plasminogenkomplex wird durch
α&sub2;-PI rasch unter verursachen einer Inaktivierung des
Plasminogens (oder Plasmins) gehemmt und SAK wird nicht gehemmt und
das Plasminogen darin wird zu Plasmin aktiviert, was zu
Fibrinolyse führt. Umgekehrt wird im Fall von SK der im Blutstrom
gebildete SK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex nicht durch
α&sub2;-PI unter Hervorrufen einer großen Plasminmenge gehemmt, was
zum Fibrinogenabbau führt (nicht in der Abbildung dargestellt).
Dies ist der Grund, weshalb SK von einem hohen Auftreten von
Apoplexie begleitet ist.
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Die zum Ausüben der SAK-Aktivität benötigte Zeitverzögerung,
die als ein Nachteil von SAK angesehen wird, kann auf die Zeit
Zurückgeführt werden, welche zum Ausüben der Proteaseaktivität
benötigt wird, die aus der Veränderung der
Plasminogenkonformation folgt, nachdem SAK an das Plasminogen bindet (Acta
Biochimica Polonica 212, S. 329-31 (1975)).
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Die Hemmwirkung von SAK bei hoher Konzentration scheint durch
das Binden des meisten Plasminogens (oder Plasmins) im
Blutstrom an SAK verursacht zu werden, was zur Verarmung an
ungebundenem Plasmin mit Fibrinolyseaktivität führt.
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Diese Probleme können durch Vormischen und Inkubieren von SAK
und Plasminogen über eine vorgegebene Zeit gelöst werden. Das
heißt, der SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex in einem
Molverhältnis von 1:1 wird durch dieses Verfahren hergestellt
und da der Komplex Proteaseaktivität besitzt, ist er als
Plasminogenaktivator, so wie er ist, nützlich. Da außerdem alles
SAK als ein Komplex mit Plasminogen (oder Plasmin) vorliegt,
bindet er kein weiteres Plasminogen (oder Plasmin) und hemmt
deshalb den Fibrinabbau selbst bei hohen SAK-Konzentrationen
nicht. Der SK-Plasminogen-Komplex zersetzt sich wahrscheinlich
selbst, während der SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex
sich nicht leicht selbst zersetzt, und auf diese Weise ist er,
so wie er ist, über einen langen Zeitraum stabil.
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Der SAK-Plasminogen (oder Plasmin-) Komplex besitzt eine
Plasminogen aktivierende Aktivität. Das heißt, der Komplex baut
Plasminogen restriktiv ab, um es in Plasmin zu verändern.
Plasmin baut Fibrin in Thromben ab, was zu Fibrinolyse führt. Auf
diese Weise ist der SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex
wie UK und SK beim Behandeln verschiedener thrombotischer
Erkrankungen einschließlich Thrombose selbst wirksam.
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Diese Erfindung wird im einzelnen in den folgenden Beispielen
veranschaulicht und weist nach, daß SAK als thrombolytisches
Mittel mit weniger Nebenwirkungen wie etwa Apoplexie wegen
seines Wirkungsmechanismus brauchbar ist: SAK besitzt
verglichen mit SK eine hohe Spezifität auf Fibrin und der im
Blutstrom gebildete SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex wird
rasch durch α&sub2;-PI gehemmt, so daß das Plasminogen nicht
aktiviert wird, wogegen der an Fibrin und SAK gebundene Komplex
zwischen Plasminogen (oder Plasmin) nicht gehemmt wird, so daß
das Plasminogen unter Verursachen einer Thrombolyse zu Plasmin
aktiviert wird.
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Außerdem ist die Stabilität von SAK im Blut besser, als
diejenige anderer Plasminogenaktivatoren, wie etwa SK, und der
Wirkungsmechanismus von SAK weicht von demjenigen von tPA oder
pro-UK ab, wie in Figur 1 gezeigt wird. Auf diese Weise wird
SAK durch PAI, ein Hemmer gegenüber tPA und pro-UK, an den
Thrombusstellen nicht so leicht gehemmt und behält seine
Aktivität in lebenden Organismen über einen langen Zeitraum.
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Auf diese Weise ermöglicht es SAK, daß die fibrinolytische
Aktivität im Blut erhöht wird, so daß es bei der Behandlung
chronischer thrombotischer Erkrankungen wirksam zu sein
scheint.
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Weiter besitzt SAK solch ein kleineres Molekulargewicht als
andere herkömmliche thrombolytische Mittel, daß es besser in
die Thromben eindringt.
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Andererseits ist der SAK-Plasminogen (oder Plasmin-) Aktivator
selbst ein aktivierter Plasminogenaktivator und wirkt daher
viel rascher als SAK allein. Da ferner alles SAK als Komplex
mit Plasminogen (oder Plasmin) vorliegt, hemmt selbst seine
Verwendung in hohem Konzentrationen die Fibrinolyse nicht.
Außerdem ist der Komplex zwischen SAK und Plasminogen (oder
Plasmin) stabiler als der entsprechende SK-Plasminogenkomplex,
so daß es sich weniger selbst abbaut. Da die meisten antigenen
Stellen von SAK maskiert sind, kann von seiner Antigenität
erwartet werden, daß sie geringer als SK ist.
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Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele
veranschaulicht.
Beispiel 1. Antigenitätstest von SAK und SK
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Kaninchen wurden unter Herstellen polyklonaler Antikörper auf
SAK immunisiert. Die Kreuzreaktivität zwischen den Antikörpern
und SK wurde nach der Ouchterlony-Methode getestet.
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Das Ergebnis war, daß sich keine Fällungslinie zwischen dem
Anti-SAK-Antikörper und SK bildete, was Zeigte, daß die
Antigenitäten der beiden Proteine verschieden waren.
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Der im Blut gebildete SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex
wird rasch durch α&sub2;-PI gehemmt, so daß das Plasminogen nicht
aktiviert wird, wogegen der an Fibrin gebundene Komplex
zwischen SAK und Plasminogen (oder Plasmin) nicht gehemmt wird,
so daß das Plasminogen unter Hervorrufen einer Thrombolyse zu
Plasmin aktiviert wird. Umgekehrt wird im Fall von SK der im
Blutstrom gebildete SK-Plasminogen (oder Plasmin-) Komplex
durch α&sub2;-PI nicht gehemmt, so daß eine große Menge Plasmin im
Blutstrom gebildet wird und dadurch der Abbau von Fibrinogen
bewirkt wird. Dies wird als Grund für die hohe Häufigkeit von
Apoplexie, die mit der Behandlung durch SK verbundenen ist,
angenommen. Der analysierte SAK-Wirkungsmechanismus wird
nacheinander in den folgenden Abschnitten erklärt.
2-1. Studien zur Fibrin-Spezifität in einem Modell eines
geschlossenen Kreislaufs
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Das System des geschlossenen Kreislaufs, das den lebenden
Organismen nächste System zum Untersuchen der Fibrinspezifität
thrombolytischer Mittel (oder eines Plasminogen-Aktivators)
wurde von Matsuo et al. (Matsuo O. et al.: Thrombos. Res., 24;
347-58 (1981)) entwickelt.
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Die Fibrinspezifität von SAK wurde in dem Modell des
geschlossenen Kreislaufs untersucht (ein lebenden Organismen
nahestehendes Modell).
Verfahren
(1) ¹²&sup5;I-Markierung von Fibrinogen
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Human-Fibrinogen (plasminogenfrei, hergestellt von Sigma Co.
Ltd.) wurde mit ¹²&sup5;I durch das Chloramin T-Verfahren
radiomarkiert und das markierte Fibrinogen wurde durch Gelfiltration
gereinigt. 1,5 ml ¹²&sup5;I-markiertes Fibrinogen mit etwa 3,5 x
10&supmin;&sup6; cpm/ml wurden erhalten.
(2) Herstellung eines ¹²&sup5;I-markierten Thrombus
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¹²&sup5;I-Fibrinogen (20 ul) wurde 1 ml Humanplasma zugesetzt und
mit 100 ul 25 mM Calciumchlorid vermischt und anschließend
wurden 50 ul der Lösung von Thrombin (100 E/ml; Sigma Co.
Ltd.), ein Fibrinogen zu Fibrin umwandelndes Enzym, unter
Bilden eines ¹²&sup5;I-markierten Thrombus Zugesetzt.
(3) Thrombolytische Versuche in einem Modell eines
geschlossenen Kreislaufs
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Humanplasma 1 (Gesamtvolumen 21 ml) wurde in einer
Fließgeschwindigkeit von 1,95 ml/min innerhalb einer unteren Kammer 3,
einer peristaltischen Pumpe 4 und einer oberen Kammer 5, in
welche ein markierter Thrombus 6 verbracht wurde, im Kreislauf
geführt. Alle Kammern waren durch einen Silikonschlauch
verbunden. 1 ml der im Test befindlichen Probe 7 (SAK oder SK)
wurde in die untere Kammer 3 getropft und der verbleibende
Anteil von 5 ml wurde mittels der peristaltischen Pumpe 8
(Fließgeschwindigkeit 0,04 ml/min) fortlaufend zugesetzt. Das
Reaktionssystem wurde bei 37ºC gehalten und jede Stunde wurde
im Kreislauf befindliches Plasma aus der unteren Kammer 3 für
Bestimmungen der Radioaktivität und der Plasmabestandteile
entnommen.
(4) Messung des fibrinolytischen Verhältnisses
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Die Radioaktivität des Plasmas wurde durch einen Gammazähler
gemessen und die gemessenen Werte wurden zum Berechnen der
Radioaktivität des gesamten, im Kreislauf befindlichen Plasmas
verwendet. Das Verhältnis der Radioaktivität verglichen mit
derjenigen des markierten Thrombus wurde als fibrinolytisches
Verhältnis in Prozenten dargestellt.
(5) Quantitative Bestimmung von Plasma-Fibrinogen
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Einer Plasmaprobe von 50 ul wurden 200 ul Barbitalpuffer (pH
7,75) zugesetzt, der 50 mM Calciumchlorid enthielt. Eine
aliquote Menge (50 ul) der sich daraus ergebenden Lösung wurde in
eine Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen übernommen. 50 ul
Thrombinlösung (100 E/ml; Sigma Co. Ltd.) wurden der Probenlösung
zugesetzt und 10 min bei 37ºC reagieren lassen. Es wurde die
Absorption bei 405 nm gemessen. Die Fibrinkonzentrationen (%)
wurden durch Ansetzen der absorption der Lösung, welcher Wasser
anstelle von Thrombin zugesetzt wurde, als 0% und der
Absorption der Lösung, in welcher normales Plasma koaguliert wurde,
als 100% proportional berechnet.
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Die fibrinolytische Spezifität wird hier durch die folgende
Formel dargestellt:
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(Fibrinolytische Spezifität) = (fibrinolytisches Verhältnis (%))/ (Fibrinogen-Abbauverhältnis (%))
(6) Quantitative Bestimmung von Plasma-Fibrinogen
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Eine 40-fach mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4) verdünnte Probe
(36 ul) wurde in die Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen
übernommen und 14 ul Urokinase (5000 IE/ml) wurden jedem Näpfchen
zugesetzt und 15 min bei 37ºC unter Bilden von Plasmin inkubiert.
Anschließend wurden 10 ul des synthetischen Chromogen CBS 33.08
(7,5 mM; Stago, Co. Ltd.) zugesetzt und das Gemisch wurde 15
min bei 37ºC inkubiert. Dies wurde vom Zusatz 2%iger
Citratlösung (200 ul) zum Beenden der Reaktion gefolgt. Die
Absorption bei 405 nm wurde gemessen.
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Die Plasmakonzentrationen von Plasmin wurden proportional auf
der Grundlage der gemessenen Absorption normalen Plasmas (100%)
und 4-fach verdünntem Plasma (25%) bestimmt.
(7) Quantitative Plasmabestimmung
α&sub2;-Plasminhemmer (α&sub2;-PI)
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Eine 40-fach mit 50 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,4), der 120 mM
Monomethylaminhydrochlorid enthielt, verdünnte Probe (28 ul)
wurde in die Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen übernommen und 22
ul Plasmin (16,7 ul/ml) wurden jedem Näpfchen zugesetzt und 15
min bei 37ºC unter Bilden eines Komplexes mit Plasma-α&sub2;-PI
inkubiert. Anschließend wurden 10 ul des synthetischen Chromogen
CBS 33.08 (7,7 mM; Stago, Co. Ltd.) dazugesetzt, 15 min bei
37ºC inkubiert und die wurde von der Zugabe von 2%iger
Citratlösung (200 ul) zum Beenden der Reaktion gefolgt. Die
Absorption bei 405 nm wurde gemessen.
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Die Konzentrationen von α&sub2;-PI (%) wurden proportional auf der
Grundlage der gemessenen Absorption normalen Plasmas (100%) und
4-fach verdünntem Plasma (25%) auf ähnliche Weise wie im Fall
von Plasminogen bestimmt.
Ergebnisse und Diskussion
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SAK baut Fibrin bei 0,625 ug/ml kaum ab, während es bei 1,25
ug/ml oder mehr Fibrin dosisabhängig abbaute. Bei 10 ug/ml war
fast die höchste Aktivität zum Abbauen von Fibrin erreicht.
Andererseits baute SK Fibrin bei 1,25 ug/ml oder mehr ab und bei
10 ug/ml war die höchste Aktivität zum Abbauen von Fibrin
erreicht. Die beiden Enzyme bauten Fibrin dosisabhängig ab,
aber die spezifische Aktivität von SAK war höher als diejenige
von SK. Zum Beispiel waren 5 ug/ml SAK 20 ug/ml SK in der
spezifischen Aktivität gleichwertig.
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Außerdem wurde ein augenfälliger Unterschied bei den
Reaktionskurven der beiden Systeme beobachtet. Der zeitliche Verlauf ist
bei SK linear, während bei der Reaktion von SAK in einer frühen
Phase kaum eine Fibrinolyse beobachtet wurde, die Reaktion aber
rasch ablief, sobald der Abbau eingeleitet wurde.
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Der Metabolismus von Fibrinogen im Blutkreislauf wird nun
beschrieben. SK baut Fibrinogen merklich ab, während der Abbau
von Fibrinogen durch SAK geringfügig ist und insbesondere bei
einer Konzentration von 2,5 ul/mg wurde beobachtet, daß nach 6
Stunden Reaktion trotz 85% verbliebenen Fibrinogens 100% Fibrin
abgebaut waren. Dies zeigt, daß SAK eine hohe Spezifität auf
Fibrin besitzt.
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Es ist offensichtlich, daß SAK eine höhere Wirksamkeit zum
Fibrinabbau und eine geringere Wirksamkeit zum Fibrinogenabbau
als SAK besitzt.
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In den selben Experimenten zeigten andere fibrinolytische
Mittel wie etwa t-PA und pro-UK keine 3 überschreitende
fibrinolytische Spezifität und diese Ergebnisse zeigen, daß SAK eine
Substanz mit überlegener Fibrinspezifität ist.
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Somit wird von SAK angezeigt, daß sie eine hohe fibrinolytische
Spezifität im Modell des geschlossenen Kreislaufs (ein lebenden
Organismen ähnliches Modell) besitzt, da es einen Plasmaklumpen
(künstlicher Thrombus) bei einer niedrigeren Konzentration als
SK lysierte und weniger Fibrinogen abbaute. Weiter Zeigt das
Modell auch, daß SAK einer geringere Wirksamkeit zum Reduzieren
von Plasminogen und α&sub2;-P1 besitzt und daß die
Plasminogenaktivierungsreaktion durch SAK im Plasma schwach ist.
2-2. Bewertung der durch Zusatz von Thrombin zu Humanplasma
hervorgerufenen Fibrinspezifität
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Fibrinogen wurde durch Zusatz von Thrombin zu Humanplasma in
Fibrin überführt und dadurch wurde der Mechanismus der
Plasminogenaktivierung analysiert.
Verfahren
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Tris-HCl-Puffer (0,1 M, 150 ul; pH 7,4) wurde in eine
Mikrotiterplatte mit 96 Näpfchen aufgenommen und 20 pl Humanplasma
(Ci-Trol, hergestellt von Midori Juji Co. Ltd.) und 10 ul des
synthetischen Chromogens S-2251 (5 mg/ml; hergestellt von Kabi-
Vitrum Co. Ltd.) wurden dazugesetzt, gefolgt von der Zugabe von
10 ul der Human-Thrombinlösung oder Wasser als Kontrolle. SAK
oder SK (10 ul) wurden in einer vorgegebenen Konzentration zum
Auslösen der Reaktion zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 37ºC
durchgeführt und Änderungen in der Absorption bei 405 nm wurden
gemessen.
Ergebnisse und Diskussion
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Die Plasminogenaktivierungsreaktion von SAK wurde durch Zugabe
von Thrombin stark verstärkt. Auf der anderen Seite wurde die
Reaktion von SK auch durch Thrombin verstärkt, aber der
Verstärkungsgrad durch SK war schwach; zum Beispiel waren im
Vergleich zwischen der Aktivität von 40 ug/ml SAK und der von 10
g/ml SK die beiden Aktivitäten in Anwesenheit von Thrombin
nahezu gleich, während in seiner Abwesenheit die Aktivität von
SAK ungefähr das zehnfache derjenigen von SAK betrug.
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Somit wurde von der SAK-Aktivität gezeigt, daß sie durch
Thrombin (z.B. in Anwesenheit von Fibrin) stark verstärkt wird und
daß sie eine hohe Fibrinspezifität besitzt.
2-3. Verstärkung der SAK-Reaktion durch Fibrin in Anwesenheit
von α&sub2;-PI
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Die Wirkungen von SAK und SK wurden in Anwesenheit von α&sub2;-PI
und Fibrinogen gemessen und die Wirkungen von Thrombin auf die
Fibrinbildung wurden untersucht.
Verfahren
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Eine SAK- oder SK-Lösung (10 pl) wurde in ein Mikroreagenzglas
aufgenommen und 10 ul der Human-Thrombinlösung (20
Einheiten/ml;
Sigma Co. Ltd.) wurden dazugesetzt, gefolgt vom
Zusatz der gemischten Lösung, welche aus 50 mM Tris-HCl-Puffer
(140 ul, pH 7,4, 0,01% Tween 80 zugesetzt), Human-Fibrinogen
(10 ul, 3,0 mg/ml; plasminogenfrei, hergestellt von Sigma Co.
Ltd.), Human-Plasminogenlösung (10 ul, 0,15 mg/ml; Glutamyltyp,
hergestellt von Kabi-Vitrum Co. Ltd.), Human-α&sub2;-PI-Lösung (10
ul, 0,06 mg/ml; hergestellt von Protogen Co. Ltd.) und dem
synthetischen Chromogen S-2251 (10 ul, 10 mM; hergestellt von
Kabi-Vitrum Co. Ltd.) bestand, um die Reaktion auszulösen. Nach
30 min Inkubation bei 37ºC wurde die Reaktion durch Zusatz von
8% Citratlösung (50 ul) beendet. Eine aliquote Menge (200 ul)
der sich daraus ergebenden Lösung wurde in jedes Näpfchen einer
Titerplatte mit 96 Näpfchen aufgenommen und die Änderung der
Absorption der Titerplatte bei 405 nm wurde durch ein
Photometer gemessen.
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Im Fall der Gelierung der Reaktionslösung durch Zugabe von
Thrombin wurde das sich daraus ergebende Gel durch Zusatz von
Citratlösung und Schütteln aufgelöst.
Ergebnisse und Diskussion
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Die Aktivitäten von SAK und SK wurden durch den Zusatz von
Thrombin in Abwesenheit von α&sub2;-PI nicht beeinflußt und es
wurde daher gezeigt, daß die beiden unter diesen
Reaktionsbedingungen keine Fibrinspezifität besitzen.
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Von SK wurde jedoch beobachtet, daß es in Anwesenheit von α&sub2;-
PI nahezu gleiche Aktivitäten besitzt, obschon sie verglichen
mit denjenigen in Abwesenheit von α&sub2;-PI ziemlich schwach
waren. Durch Zugabe von Thrombin wurden die Aktivitäten auf
etwa das 2-3fache nach der Thrombinzugabe wiederhergestellt.
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Umgekehrt zeigte SAK selbst bei einer so hohen Konzentration
wie 5,0 ug/ml ohne Thrombin nicht die Aktivität und eine
Hemmung durch α&sub2;-PI wurde beobachtet.
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Eine wichtigere Änderung ist, daß die Aktivität von SAK durch
Zusatz von Thrombin viel stärker erhöht wurde als diejenige von
SK. Zum Beispiel zeigten 5,0 ug/ml SAK keine
Absorptionsänderung ohne Thrombin, während sie mit zugesetztem
Thrombin eine bis zu 0,93 große Absorptionsänderung zeigte.
Dies zeigt, daß die Hemmung der SAK-Reaktion durch α&sub2;-PI durch
die Fibrinbildung wiederhergestellt wird.
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So zeigt der Befund, daß SAK in Abwesenheit von α&sub2;-PI keine
Fibrinspezifität besitzt und Fibrinspezifität nur in
Anwesenheit von α&sub2;-PI zeigt, daß α&sub2;-PI bei der Expression einer
Fibrinspezifität von SAK stark beteiligt ist.
2-4. Wirkungen von SAK und SK auf die Plasminhemmreaktion durch
α&sub2;-PI
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Um die Beteiligung von α&sub2;-PI bei der Expression der in
Abschnitt 2.3 gezeigten Fibrinspezifität von SAK ausführlicher zu
untersuchen, wurden die Wirkungen von SAK und SK auf die
Plasminhemmreaktion durch α&sub2;-PI untersucht.
Verfahren
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Jeweils 10 ul einer SAK- oder SK-Lösung (jeweils 0-50 ug/ml)
wurden 50 ul einer Human-Plasminlösung (0,05 C.U./ml;
hergestellt von Sigma Co. Ltd.) in einer Testplatte mit 96 Näpfchen
zugesetzt. Nachdem man das Gemisch 5 min bei Raumtemperatur
stehen ließ, wurden 10 ul α&sub2;-PI (0-5 IE/ml; hergestellt von
Protogen Co. Ltd.) dazugesetzt, gefolgt von der Zugabe der
Mischlösungen (130 ul) von 50 mM Tris-HCl-Puffer (120 ul, pH
7,4) und dem synthetischen Chromogen S-2251 (10 ul, 10 mM;
hergestellt von Kabi-Vitrum Co. Ltd.) zum Auslösen der
Reaktion. Die Reaktion wurde 30 min bei 37ºC ausgeführt und die
Absorptionsänderungen bei 405 nm wurden durch ein Photometer
für Testplatten gemessen.
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Die Hemmrate wurde gemäß der folgenden Formel berechnet. Darin
wird die Plasminaktivität ohne α&sub2;-PI durch A dargestellt und
diejenige mit α&sub2;-PI wird durch B dargestellt.
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Hemmrate (%) = (A-B) / A x 100
Ergebnisse und Diskussion
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80% der Hemmrate wurden zum Zeitpunkt der Zugabe von α&sub2;-PI (5
IE/ml) beobachtet und die Hemmrate nach ab, wobei sie von der
Wiederherstellung der Plasminaktivität begleitet wurde, wenn
sich die SAK- und SK-Konzentration erhöhte. In diesem Fall
wurde bei SK eine starke Wiederherstellung der Aktivität
beobachtet und weiter wurde nach Zusatz von SK in einer
Konzentration von 50 ug/ml keine Hemmung beobachtet. Andererseits zeigte
SAK bei der gleichen Konzentration eine Hemmrate von 60%, was
anzeigte, daß SAK die Hemmwirkung auf Plasmin schwach
wiederherstellt.
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Es hat einige Berichte über die Hemmung der Plasminhemmreaktion
von SK durch α&sub2;-PI gegeben (S.A. Cederholm-Williams et al.,
Eur. J. Biochem. 100, S. 125-132, '79), aber es sind keine
Berichte über die Beziehung zwischen SAK und α&sub2;-PI
veröffentlicht worden.
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Obschon der Mechanismus der Wiederherstellung der
Plasminaktivität durch SK nicht sicher ist, besteht eine Möglichkeit, daß
SK an die L(B)-Kette bindet, was zu einer sterischen Hinderung
der Bindung von Plasmin an das aktive Zentrum von α&sub2;-PI führt.
SAK mit einem Molekulargewicht von etwa einem Drittel
desjenigen von SK kann geringe sterische Wirkungen hervorrufen, obwohl
es in ähnlicher Weise an die L(B)-Kette bindet.
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α&sub2;-PI ist ein proteinartiger Hemmfaktor mit Plasminspezifität
und es hemmt das im Blutstrom gebildete Plasmin rasch. Das an
Fibrin gebundene Plasmin ist jedoch an dessen
Lysinbindungsstelle (nachstehend als LBS bezeichnet) gesättigt und es kann
deshalb nicht über die LBS an α&sub2;-PI binden, was zu keiner
Hemmung führt (B. Wiman et al., Biochem. Biophys. Acta, 579, 142-
154, '79 usw.).
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Dies legt nahe, daß α&sub2;-PI nicht auf dem Thrombus gebildetes
Plasmin, sondern das im Blutstrom gebildete Plasmin hemmt, was
zum selektiven Abbau von Fibrin führt.
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Dementsprechend ist aufgeklärt worden, daß SAK eine der
Regelfunktion von α&sub2;-PI entsprechende Fibrinspezifität besitzt.
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So wird der im Blutstrom gebildete SAK-Plasminogen- (Plasmin-)
Komplex rasch durch α&sub2;-PI gehemmt und das Plasminogen wird
nicht aktiviert, da aber der Komplex zwischen dem an Fibrin
gebundenen Plasminogen (oder Plasmin) und SAK nicht aktiviert
wird, ruft die Aktivierung von Plasminogen in Plasmin
Thrombolyse hervor. Umgekehrt wird angenommen, daß im Fall von SK der
im Blutstrom gebildete SK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex
durch α&sub2;-PI nicht gehemmt wird, was zur Bildung einer großen
Plasminmenge unter Abbauen selbst von Fibrinogen führt (in den
Zeichnungen nicht gezeigt).
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Somit zeigt der Wirkungsmechanismus, daß die SAK-Reaktion durch
α&sub2;-PI gehemmt wird, während die Reaktion selektiv an Fibrin
ablief, da α&sub2;-PI die Reaktion damit nicht leicht beeinflußte,
und daß SAK eine höhere Spezifität auf Fibrin als SK erworben
hat.
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In anderen Worten wird bestätigt, daß die SAK-Reaktion durch
α&sub2;-PI in Plasminogen in freier Form gehemmt wird, sie aber
selektiv abläuft, wenn das Plasminogen an Fibrin gebunden ist,
da die LBS in dem Plasminogen gesättigt ist und α&sub2;-PI nicht
reagieren kann (Wiman, B. et al., Biochem. Biophys. Acta, 579,
142-154, '79).
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Wie vorstehend beschrieben worden ist, besitzt SAK eine höhere
Spezifität auf Fibrin und der Fibrinogenabbau im Blutkreislauf
wird gehemmt und es kann offensichtlich als thrombolytisches
Mittel mit geringeren Nebenwirkungen (wie etwa Apoplexie), die
ein Problem bei herkömmlichen thrombolytischen Mitteln gewesen
sind, eingesetzt werden.
Beispiel 3. Stabilität von SAK in Plasma
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SAK oder SK wurde Humanplasma zugesetzt und bei 37ºC inkubiert
und eine aliquote Menge der sich daraus ergebenden Lösung wurde
der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese unterzogen, um die
fibrinolytische Aktivität durch Fibrinautographie zu
untersuchen.
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Als Ergebnis verlor SAK seine Aktivität selbst nach Inkubation
von 20 Stunden nicht, aber SK verlor seine Aktivität
vollständig. Ähnliche Ergebnisse wurden durch die Verwendung von Human-
Plasminogen anstelle von Plasma erhalten, was die Stabilität
von SAK zeigte.
Beispiel 4. Der SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex
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Die Reaktion des vorgebildeten SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-)
Komplexes wurde untersucht, um die zur Expression der Aktivität
erforderlichen Verzögerungszeit zu verbessern.
4-1. Die Bildung des SAK-Plasminogen (Plasmin-) Komplexes
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2 ml in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4) gelöster Human-
Plasminogenlösung (Seikagaku Kogyo Co. Ltd., 0,6 mg/ml) wurden
86 pl der in demselben Puffer im Molverhältnis 1:1 gelösten
(2,4 mg/ml) SAK-Lösung unter Inkubieren bei Raumtemperatur
zugesetzt. Durch dieses Verfahren wurde der ein aktives Zentrum
besitzende SAK-Plasminogen- (Plasmin-) Komplex gebildet, auf
welchen darauffolgend eine Gelfiltration an einer SUPEROSE 12
H/R 10/30-Säule (FPLC-System) angewandt wurde. Der
SAK-Plasminogen-Komplex wurde im hochmolekularen Bereich eluiert und
dadurch von dem SAK, welches nicht an Plasminogen gebunden ist,
abgetrennt und gereinigt.
4.2. Zeitlicher Verlauf der Fibrinolyse durch den SAK-
Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex
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Die fibrinolytische Aktivität des durch das vorgenannte
Verfahren erhaltenen Komplexes wurde durch die
Standard-Fibrinplattenmethode gemessen. Das heißt, daß 80 mg Humanfibrinogen (Kabi
Co. Ltd., L-Qualität) in 20 ml physiologischer Kochsalzlösung
(mit Barbital-Acetatpuffer auf pH 7,4 eingestellt) gelöst und
zum Entfernen des ungelösten Anteils Zentrifugiert wurden. Die
sich daraus ergebende Lösung (8 ml) wurde in eine Schale von 8
cm Durchmesser aufgenommen und 0,3 ml Humanthrombin (3,3 IE/ml)
wurden zum Gerinnen des Fibrinogens dazugesetzt. Die Probe
wurde der auf diese Weise hergestellten Fibrinplatte mit einer
Mikropipette tropfenweise zugesetzt, bei 37ºC inkubiert und auf
Fibrinolyse beobachtet.
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Lytische Flecken wurden bis 60 min nach Beginn der Reaktion mit
SAK allein (A) beobachtet. Im Fall des
SAK-Plasminogen-Komplexes (B) wurde eine lytische Aktivität 15 min später
beobachtet und die Aktivität wurde 30 min später eindeutig beobachtet.
Diese Ergebnisse zeigen die rasche Wirkung von SAK an.
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Auf der anderen Seite wurden lytische Flecke 30 min später im
Fall von SK allein und im Fall des SK-Plasminogenkomplexes
beobachtet und die beiden zeigten fast gleiche Aktivitäten.
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Auf diese Weise wurde gezeigt, daß durch Komplexieren mit
Plasminogen die Verzögerungszeit von SAK ausgelöst werden kann und
die Schnelligkeit der Wirkung von SAK gleich der oder besser
als die von SK sein kann.
Beispiel 5. Anderungen bei der Fibrinolyse durch die
Konzentrationen des SAK-Plasminogen- (Plasmin-) Komplexes
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Fibrinolytische Reaktionen wurden zwischen Konzentraten von SAK
allein, SK allein, dem Plasminogen-SAK-Komplex und dem
Plasminogen-SK-Komplex verglichen.
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Lytische Flecken wurden in einem Doppelring mit SAK und SK (A,
C) bei hohen Konzentrationen von 5 pm beobachtet. Dies zeigt,
daß die lytische Reaktion im Zentrum der Flecken, das heißt in
den Bereichen der hohen Konzentration, gehemmt wurde. Auf der
anderen Seite gab es kein Zeichen irgendeiner Hemmung der
lytischen Reaktion im Fall der als B und D dargestellten
Plasminogenkomplexe und selbst die Zentren aller Flecken der beiden
wurden lysiert.
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Außerdem Zeigte die Aktivität von SAK allein (A) bei der
niedrigen Konzentration von 0,04 uM eine schwache lytische
Aktivität, während diejenige des Plasminogenkomplexes (B) bei
gleicher Konzentration eine Aktivität zeigte, welche derjenigen
bei höheren Konzentrationen vergleichbar war. Insbesondere
zeigte im Fall von SAK dessen Komplex mit Plasminogen in einem
breiten Konzentrationsbereich Wirksamkeit.
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Die Aktivität von SK allein (C) zeigte bei niedriger
Konzentration einen deutlichen lytischen Fleck und dessen Komplex mit
Plasminogen führte nicht zur Vergrößerung des wirksamen
Konzentrationsbereichs.
6. Toxizitätstest
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Ein toxikologischer Test wurde durchgeführt. SAK wurde in einer
Dosis von 1 mg/kg 10 männlichen, jeweils 28-35 g wiegenden ICR-
Mäusen intravenös verabreicht. Als Ergebnis starb keine Maus.
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Wie vorstehend beschrieben, besitzt SAK im Blut eine verglichen
mit Plasminogenaktivatoren wie etwa SK überlegene Stabilität
und wird in Analogie zum Wirkungsmechanismus, wonach sein
Komplex mit Plasminogen oder Plasmin Plasminogen aktivieren kann,
durch PAI kaum gehemmt, was zu einem verlängerten
Aktivitätserhalt in lebenden Organismen führt. Dementsprechend kann die
fibrinolytische Aktivität von SAK gleichmäßig zunehmen und es
wird daher erwartet, daß sie bei chronischen thrombotischen
Erkrankungen wirksam ist.
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Wie in Beispiel 4 gezeigt, verkürzt mit Plasminogen
vorinkubiertes SAK außerdem die Verzögerungszeit und führt zu einer
Reaktionsbeschleunigung. Mit Plasminogen im äquimolaren
Verhältnis 1:1 gemischtes SAK zeigt bei hohen Konzentrationen
keine derartige Hemmwirkung. Der Komplex mit SAK erhöht die
Aktivität bei niedrigeren Konzentrationen und von ihm wird
gezeigt, daß er in einem breiteren Konzentrationsbereich als
SAK allein wirksam ist. Auf diese Weise wurde gezeigt, daß sich
SAK als fibrinolytisches Mittel als ein rasch und topisch
wirksames Arzneimittel mit einem breiten Dosierungsbereich erweist,
wenn es in mit Plasminogen vorinkubierter Form verwendet wird.
Diese Merkmale können sich in vivo wiederspiegeln.
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Es haben klinische Untersuchungen zur Dosierung von mit
Plasminogen komplexiertem SK stattgefunden. Ein Ziel ist es, die
Hemmung von SK bei hohen Konzentrationen zu vermeiden. Ein
weiteres
Ziel ist es, die Antigenstelle von SK durcn Binden mit
Plasminogen zu maskieren, um die Antigenität zu verringern.
Daher wird eine Verringerung der Antigenität von SAK auch im
Fall des SAK-Plasminogenkomplexes erwartet.
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SK wird rasch abgebaut, sobald es mit Plasminogen (das
Molverhältnis beträgt etwa 1:1) inkubiert wird und das Plasminogen
(oder Plasmin) baut sich allmählich selbst ab und daher ist es
bekannt, daß SK nicht in der vorstehend beschriebenen Form
verabreicht werden kann. Einige Experimente sind zum Acylieren des
aktiven Zentrums des SK-Plasminogenkomplexes mit dem Ziel
durchgeführt worden, seine Fibrinspezifität durch Entacylieren
des aktiven Zentrums am Ort des Thrombus zu erhöhen und den
Selbstabbau des Komplexes zu verhindern. Auf der anderen Seite
erhöht sich die Aktivität des SAK-Plasminogen (oder Plasmin-)
Komplexes gemäß der vorliegenden Erfindung selbst nach 24
Stunden Inkubation bei 37ºC überhaupt nicht und einige Daten sind
erhalten worden, die anzeigen, daß an SAK gebundenes
Plasminogen auch gegenüber einem Selbstabbau widerstandsfähig ist. Der
Komplex, den SAK mit Plasminogen bildet, ist ausreichend
stabil, selbst wenn er an seinem aktiven Zentrum nicht acyliert
ist.
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So deckt der SAK-Plasminogen- (oder Plasmin-) Komplex nicht nur
die Fehler von SAK ab, sondern besitzt auch den Vorteil der
Stabilität verglichen mit dem SK-Plasminogenkomplex.
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Weiter ist bei Hunden, denen 0,002 mg SAK verabreicht wurden,
eine Thrombolyse beobachtet worden, und im Fall einer
Humantherapie können 0,1-0,2 mg eine ausreichende Dosis sein, wenn
die vorstehende Dosis bei Hunden näherungsweise umgerechnet
wird. Diese Dosis ist mit etwa 1 mg Plasminogen bei molarer
Umrechnung vergleichbar.
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Außerdem besitzt SK ein kleineres Molekulargewicht als das
herkömmlicher thrombolytischer Mittel und besitzt daher einen
Vorteil bei seiner Durchlässigkeit in die Thromben.
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Staphylococcus aureus ist bei der Herstellung von SAK
herkömmlicherweise verwendet worden und die Produktionsausbeute war
schlecht, begleitet von einer Toxizität durch Verunreinigung.
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Derzeit wird das Klonen in Escherichia coli zum Ermöglichen der
Produktion von SAK in industriellem MaBstab verwendet (Sato, T:
Eur. J. Biochem., 149, 557-63 (1985)). Auf diese Weise besitzt
SAK verglichen mit anderen thrombolytischen Mitteln einen
ökonomischen Vorteil.