JPS5867181A - スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 - Google Patents
スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌Info
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- JPS5867181A JPS5867181A JP56164064A JP16406481A JPS5867181A JP S5867181 A JPS5867181 A JP S5867181A JP 56164064 A JP56164064 A JP 56164064A JP 16406481 A JP16406481 A JP 16406481A JP S5867181 A JPS5867181 A JP S5867181A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明はスタフィロキナーゼ産生遺伝子を含有する新規
な大腸菌およびスタフィロキナーゼの製造法に関する。
な大腸菌およびスタフィロキナーゼの製造法に関する。
スタフィロキナーゼ（以下ＳＡＫと略記する）とは、ス
タフィロコッカス・アウレウお（以下Ｓ・アウレウスと
記す）が産生ずる繊維素溶解酵素であって、血中のプラ
スミノーゲンをプラスミンに変える機能を有する。この
プラスミンがフィブリンに作用してこれを溶解するもの
である。同様の作用を有するものとしてヒトの尿中に存
在するウロキナーゼや連鎖球菌が産生するストレプトキ
ナーゼが知られているが、これらはいずれも血液凝固防
止剤、血栓治療剤などのいわゆる線溶剤として医療に供
し得るものである。そのため、これらの物質の生産方法
や抽出・精製方法が種々検討されている。
タフィロコッカス・アウレウお（以下Ｓ・アウレウスと
記す）が産生ずる繊維素溶解酵素であって、血中のプラ
スミノーゲンをプラスミンに変える機能を有する。この
プラスミンがフィブリンに作用してこれを溶解するもの
である。同様の作用を有するものとしてヒトの尿中に存
在するウロキナーゼや連鎖球菌が産生するストレプトキ
ナーゼが知られているが、これらはいずれも血液凝固防
止剤、血栓治療剤などのいわゆる線溶剤として医療に供
し得るものである。そのため、これらの物質の生産方法
や抽出・精製方法が種々検討されている。
ＳＡＫの生産に関しては、これまでに、ＳＡＫ産生能は
Ｓ・アウレウスを宿主とする溶原ファージの溶原化に伴
って、宿主に賦与される（これを溶原変換という）形質
であることが知られており、従来、Ｓ・アウレウスの中
からＳＡＫ産生能を有する株を選択するか、あるいはＳ
ＡＫを溶原変換するファージでＳＡＫ非産生のＳ・アウ
レウス株を溶原化し、それらの株を培養することによっ
て、その培養液よりＳＡＫを採取するという方法が行わ
れている。
Ｓ・アウレウスを宿主とする溶原ファージの溶原化に伴
って、宿主に賦与される（これを溶原変換という）形質
であることが知られており、従来、Ｓ・アウレウスの中
からＳＡＫ産生能を有する株を選択するか、あるいはＳ
ＡＫを溶原変換するファージでＳＡＫ非産生のＳ・アウ
レウス株を溶原化し、それらの株を培養することによっ
て、その培養液よりＳＡＫを採取するという方法が行わ
れている。
しかしながら、Ｓ・アウレウスは強い病原性を有する細
菌であり、その取扱いには、極めて慎重な配慮が必要で
あるためかかる方法は、本来工業的なＳＡＫの生産方法
に適さず、しかも、ＳＡＫの収量を上げるためには長時
間の培養が必要であるため、その意味からも工業的方法
としては適性を欠いているものである。
菌であり、その取扱いには、極めて慎重な配慮が必要で
あるためかかる方法は、本来工業的なＳＡＫの生産方法
に適さず、しかも、ＳＡＫの収量を上げるためには長時
間の培養が必要であるため、その意味からも工業的方法
としては適性を欠いているものである。
本発明者らは、安全性、効率性の面から、ＳＡＫを工業
的に生産し得る適切な方法について鋭意研究した結果、
ＳＡＫ産生情報を担う遺伝子が７アージＤＮＡ上に存在
することを究明し、Ｓ・アウレウスの溶原ファージＤＮ
Ａの断片をベクターを介して大腸菌に導入させることに
成功した。
的に生産し得る適切な方法について鋭意研究した結果、
ＳＡＫ産生情報を担う遺伝子が７アージＤＮＡ上に存在
することを究明し、Ｓ・アウレウスの溶原ファージＤＮ
Ａの断片をベクターを介して大腸菌に導入させることに
成功した。
本発明は、かかる成果によるものであり、したがって、
本発明はＳＡＫ産生遺伝子を含有する新規な大腸菌なら
びにその大腸菌を培養することによるＳＡＫの製造法を
提供するものである。
本発明はＳＡＫ産生遺伝子を含有する新規な大腸菌なら
びにその大腸菌を培養することによるＳＡＫの製造法を
提供するものである。
以下に、本発明の詳細な説明する。
本発明に係る新規な大腸菌は、下記■〜■の工程により
得られるものである。
得られるものである。
■ ＤＮＡ供与体であるＳ・アウレウスの溶原ファージ
ＤＮＡを制限酵素で切断する。
ＤＮＡを制限酵素で切断する。
■ ＳＡＫ産生遺伝情報を有するＤＮＡ断片をとり出す
。（この工程は省略することもできる） ■ ベクタ’ −ＤＮＡを制限酵素によって開裂させる
。
。（この工程は省略することもできる） ■ ベクタ’ −ＤＮＡを制限酵素によって開裂させる
。
■ ベクターＤＮＡの開裂部位に■又は■で得たＤＮＡ
断片を組み込ませる。
断片を組み込ませる。
■ この組み換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に導入する０
■、■によりＳＡＫ産生能を有することとなった大腸菌
を選択分離する。
を選択分離する。
上記のＤＮＡ供与体としての溶原ファージはＳＡＫ生産
能を有するＳ・アウレウス清涼株から分離された溶原フ
ァージで、かつ、そのファージが清涼変換能を有するフ
ァージであれば、すべて使用可能である。その例として
は４２Ｄ、 Ｌ４２Ｅ。
能を有するＳ・アウレウス清涼株から分離された溶原フ
ァージで、かつ、そのファージが清涼変換能を有するフ
ァージであれば、すべて使用可能である。その例として
は４２Ｄ、 Ｌ４２Ｅ。
７７（文献： ＭａＳｏｎ、Ｒ，Ｅ、ａｎｄ Ａ１１ｅ
ｎ、Ｗ、Ｅ、（１９７５）Ｃａｎ、Ｊ、Ｍ、１ｃｒｏｂ
ｉｏ１．２１．１１１３−１１１６）、Ｐφ１．Ｐφ２
゜Ｔφ−４２Ｄ、 Ｐφ−４０６（文献： Ｋｏｎｄｏ
、 １．ａｎｄ Ｆｕｊｉｓｅ。
ｎ、Ｗ、Ｅ、（１９７５）Ｃａｎ、Ｊ、Ｍ、１ｃｒｏｂ
ｉｏ１．２１．１１１３−１１１６）、Ｐφ１．Ｐφ２
゜Ｔφ−４２Ｄ、 Ｐφ−４０６（文献： Ｋｏｎｄｏ
、 １．ａｎｄ Ｆｕｊｉｓｅ。
Ｋ、（１９７７） Ｉｎｆｅｃｔ、 Ｉｍｍｕｎ 、
１８．２６６−２７２ ）、Ｒφ１９門ＳφＣ（文献：
近藤勇ら（１９８０）東京慈恵会医科大学雑誌９５．１
２０３−１２０６ ）などがある。溶原ファージＤＮＡ
の調製に使用される手段は、常用の手段である。すなわ
ち、清涼７アージをその宿主菌であるＳ・アウレウスに
感染させ、°この感染菌を培養する（この方法は例えば
文献： Ｂｌａｉｒ、Ｊ。
１８．２６６−２７２ ）、Ｒφ１９門ＳφＣ（文献：
近藤勇ら（１９８０）東京慈恵会医科大学雑誌９５．１
２０３−１２０６ ）などがある。溶原ファージＤＮＡ
の調製に使用される手段は、常用の手段である。すなわ
ち、清涼７アージをその宿主菌であるＳ・アウレウスに
感染させ、°この感染菌を培養する（この方法は例えば
文献： Ｂｌａｉｒ、Ｊ。
Ｅ、ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａｍｓ、ＲｏＥ、Ｏ，（１９６
１） Ｂｕｌｌ、Ｗ、Ｈｏｏ、２４゜７７１−７８４に
記載されている）。これによってファージは培地中に出
てくる（菌は溶菌する）ので、このファージを適当な方
法（例えば塩化セシウム平衡密度勾配遠心法９文献：
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ。
１） Ｂｕｌｌ、Ｗ、Ｈｏｏ、２４゜７７１−７８４に
記載されている）。これによってファージは培地中に出
てくる（菌は溶菌する）ので、このファージを適当な方
法（例えば塩化セシウム平衡密度勾配遠心法９文献：
Ｒｏｓｅｎｂｌｕｍ。
Ｅ、Ｄ、 ａｎｄ Ｔｙｒｏｎｅ、Ｓ、（１９６４）
Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８８．１７３７−１７４２
）で集め、このファージからさらに公知の方法（例え
ばフェノール抽出法など）によりファージＤＮＡを抽出
することができる。
Ｊ 、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、８８．１７３７−１７４２
）で集め、このファージからさらに公知の方法（例え
ばフェノール抽出法など）によりファージＤＮＡを抽出
することができる。
溶原ファージＤＮＡの制限酵素による切断は次嘩−
のようにして行う。
ファージＤＮＡに適当な制限酵素を加え、適当な反応条
件で反応を行うことによって、ファージＤＮＡは加えら
れた制限酵素によって種々の断片に切断される。
件で反応を行うことによって、ファージＤＮＡは加えら
れた制限酵素によって種々の断片に切断される。
このファージＤＮＡの切断に使用しうる制限酵素は、１
）ファージＤＮＡを切断しうるものであり、かつ２）
ＳＡＫ生産に関する遺伝情報を担うＤＮＡ部分を切断し
ないものでなければならない。これに適する制限酵素と
しては、Ｈｌｎｄｌｌ、、 Ｐ、ｓ ｔ Ｉ ＨＡ Ｃ
ＣＩ ＋Ａｖａｌｌ、 ＥｃｏＲＩ、 Ｈｐａｌ、 Ｈ
ｐａｌｌ、 Ｈｉｎｄｌｒ、 ５ｓｔｌ、 Ｃ１ａｒ。
）ファージＤＮＡを切断しうるものであり、かつ２）
ＳＡＫ生産に関する遺伝情報を担うＤＮＡ部分を切断し
ないものでなければならない。これに適する制限酵素と
しては、Ｈｌｎｄｌｌ、、 Ｐ、ｓ ｔ Ｉ ＨＡ Ｃ
ＣＩ ＋Ａｖａｌｌ、 ＥｃｏＲＩ、 Ｈｐａｌ、 Ｈ
ｐａｌｌ、 Ｈｉｎｄｌｒ、 ５ｓｔｌ、 Ｃ１ａｒ。
ＢＳｔＥＩｌ、 ５ｓｔＩｌ、 Ｘｈｏｌ、 Ｂｃｌｌ
、 ＢｇｌＩ［、Ｐｖｕ■、 Ｘｏｒｌｌ。
、 ＢｇｌＩ［、Ｐｖｕ■、 Ｘｏｒｌｌ。
Ｋｐｎｌ、 Ｓｍａｌ、 Ｘｂａｌなどがある。
次に、ファージＤＮＡを制限酵素で切断した切断群の中
からＳＡＫ産生情報を含むＤＮＡ断片を各種の公知の方
法（例えばアガロースゲル電気泳動法すど）により分離
する。このためには、ファージＤＮＡの断片群のうち、
どの断片がＳＡＫ産生情報を有しているかを前もって判
定しておがねばならない。この判定方法については後述
する。上記のＤＮＡ断片の分離操作は場合により省略す
ることもできる。
からＳＡＫ産生情報を含むＤＮＡ断片を各種の公知の方
法（例えばアガロースゲル電気泳動法すど）により分離
する。このためには、ファージＤＮＡの断片群のうち、
どの断片がＳＡＫ産生情報を有しているかを前もって判
定しておがねばならない。この判定方法については後述
する。上記のＤＮＡ断片の分離操作は場合により省略す
ることもできる。
一方、ベクターＤＮＡの開裂は、ベクターＤＮＡに適当
な制限酵素を加え、適当な反応条件下で反応を行うこと
によりベクターＤＮＡを開裂させることができる。
な制限酵素を加え、適当な反応条件下で反応を行うこと
によりベクターＤＮＡを開裂させることができる。
ベクターＤＮＡとしては公知のものが使用できる。それ
に（ま」えばＣ０ＩＥ１． ｐＭＢ９． ｐｓｃｌｏｌ
、 ｐ１５Ａおよびその誘導体（例えばｐＢＲ３２２，
ｐＡＣＹＣ１８４など）やλフアージ由来のシャロンベ
クターなどがある。なお、ベクターの複製能を損なわな
い限り、上記のファージＤＮＡ断片を挿入する方向及び
部位は問わない。
に（ま」えばＣ０ＩＥ１． ｐＭＢ９． ｐｓｃｌｏｌ
、 ｐ１５Ａおよびその誘導体（例えばｐＢＲ３２２，
ｐＡＣＹＣ１８４など）やλフアージ由来のシャロンベ
クターなどがある。なお、ベクターの複製能を損なわな
い限り、上記のファージＤＮＡ断片を挿入する方向及び
部位は問わない。
次に、（フタ−ＤＮＡの開裂部位に上述のＤＮＡ断片を
組み込ませるが、その手段自体は、常法によるものであ
り、使用したファージＤＮＡの種類、ベクターＤＮＡの
種類および制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が選
択される。
組み込ませるが、その手段自体は、常法によるものであ
り、使用したファージＤＮＡの種類、ベクターＤＮＡの
種類および制限酵素の種類に応じて適当な反応条件が選
択される。
次いで組み換え体ＤＮＡを宿主大腸菌に導入させるが、
宿主大腸菌としては大腸菌に特異な制限・修飾系のうち
制限能を欠損した大腸菌株はすべて使用可能であるが、
いったん修飾をうけたＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ
を組み込んだプラスミドは制限能を有する大腸菌株に対
しても使用することができる。宿主大腸菌は、用いたベ
クターの種類によって限定される場合がある。
宿主大腸菌としては大腸菌に特異な制限・修飾系のうち
制限能を欠損した大腸菌株はすべて使用可能であるが、
いったん修飾をうけたＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ
を組み込んだプラスミドは制限能を有する大腸菌株に対
しても使用することができる。宿主大腸菌は、用いたベ
クターの種類によって限定される場合がある。
使用した犬腸菌原株のうちのｒＰ７とは制限能を欠損し
た株を、またｍＫ−とは修飾能をもたない株を示す。
た株を、またｍＫ−とは修飾能をもたない株を示す。
導入の手段、自体は公知の方法（例えばＣａｍｅｒｏｎ
らの方法：文献Ｃａｍｅｒｏｎ 、Ｊ 、Ｒ８ｅｔａ１
．（１９７５） Ｐｒｏｃ。
らの方法：文献Ｃａｍｅｒｏｎ 、Ｊ 、Ｒ８ｅｔａ１
．（１９７５） Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ 、 ７
２ 、３４１６−３４２０ ）を用いることができる。
２ 、３４１６−３４２０ ）を用いることができる。
前述の■の工程を行った場合においても、溶原ファージ
のＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込まない
場合があり、また、■の工程を省略した場合には、組み
込まない場合の他に５ＡＤ（産生能に関するものでない
ＤＮＡ断片を組み込む場合がある。そのためにＳＡＫ産
生能を有することとなった大腸菌を選択分離することが
必要である。この大腸菌の選択分離には、Ｓ・アウレウ
スについて用いられている公知の方法（例えば文献：
Ｋｏｎｄｏ、 Ｉ ａｎｄ Ｆｕｊｉｓｅ、に、（１９
７７） Ｉｎｆｅｃｔ。
のＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡ断片を組み込まない
場合があり、また、■の工程を省略した場合には、組み
込まない場合の他に５ＡＤ（産生能に関するものでない
ＤＮＡ断片を組み込む場合がある。そのためにＳＡＫ産
生能を有することとなった大腸菌を選択分離することが
必要である。この大腸菌の選択分離には、Ｓ・アウレウ
スについて用いられている公知の方法（例えば文献：
Ｋｏｎｄｏ、 Ｉ ａｎｄ Ｆｕｊｉｓｅ、に、（１９
７７） Ｉｎｆｅｃｔ。
Ｉｍｍｕｎ 、１８．２６６−２７２ ）を使用するこ
とができる。
とができる。
すなわち、この方法によシ、加熱血漿寒天培地を作成し
、その上に試験菌を置き、一定期間培養することにより
フィブリン分解能をみる。フィブリン分解能を有するも
のは集落の周辺をとかして、透明なゾーンができるので
、この菌だけをとり出すことができる。かくしてＳＡＫ
産生能を有する大腸菌が分離されるが、ＳＡＫ産生能を
有する大腸菌からのＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡの
解析は次の如くして行う。すなわち、ＳＡＫ産生能を有
する大腸菌から組換え体プラスミドまたは組換え体ファ
ージを取り出し、ファージＤＮＡの切断およびベクター
ＤＮＡの開裂に用いた制限酵素でこの組換え体プラスミ
ドまたは組換え体ファージを切断する。この切断された
ＤＮＡ断片の分子量（すなわちＤＮＡとしての長さ）を
公知方法（例えば、アガロースゲル電気泳動なと）によ
って測定することによってＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片のファー’、； ＤＮＡ上での位置を知ること
ができる。
、その上に試験菌を置き、一定期間培養することにより
フィブリン分解能をみる。フィブリン分解能を有するも
のは集落の周辺をとかして、透明なゾーンができるので
、この菌だけをとり出すことができる。かくしてＳＡＫ
産生能を有する大腸菌が分離されるが、ＳＡＫ産生能を
有する大腸菌からのＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡの
解析は次の如くして行う。すなわち、ＳＡＫ産生能を有
する大腸菌から組換え体プラスミドまたは組換え体ファ
ージを取り出し、ファージＤＮＡの切断およびベクター
ＤＮＡの開裂に用いた制限酵素でこの組換え体プラスミ
ドまたは組換え体ファージを切断する。この切断された
ＤＮＡ断片の分子量（すなわちＤＮＡとしての長さ）を
公知方法（例えば、アガロースゲル電気泳動なと）によ
って測定することによってＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤ
ＮＡ断片のファー’、； ＤＮＡ上での位置を知ること
ができる。
解析実験の一例を次に示す。
実験例二ファーｕＤＮＡとしてＳφＣを用いた場合１）
制限酵素Ｐ８ｔ Ｉで切断した時 １５．８ Ｋ ｂ
２） ｔｔ Ｈｉｎｄｌｌｌ
４．９Ｋｂ３） ＃ Ｈｉｎｄｌ［を及びＡｖ
ａｉｌ ｔｒ ２．０Ｋｂ４）
ｓ Ａｖａｌｌ及びＡｃｃ Ｉ ｔｒ
１．３−Ｋｂ部分にＳＡＫ産生遺伝情報が存在す
ることが判明した。
制限酵素Ｐ８ｔ Ｉで切断した時 １５．８ Ｋ ｂ
２） ｔｔ Ｈｉｎｄｌｌｌ
４．９Ｋｂ３） ＃ Ｈｉｎｄｌ［を及びＡｖ
ａｉｌ ｔｒ ２．０Ｋｂ４）
ｓ Ａｖａｌｌ及びＡｃｃ Ｉ ｔｒ
１．３−Ｋｂ部分にＳＡＫ産生遺伝情報が存在す
ることが判明した。
以上述べた如くして得られるＳＡＫ産生能を有する大腸
菌は、その菌学的性質はもとの大腸菌とくらべ、ＳＡＫ
産生能を有していること以外変わるところがない。その
一般的菌学的性質は、後掲別表に示す。（後記実施例に
より得られたものを例示）本発明により、上記の如くし
て得られた新規な大腸菌を用いて、その大腸菌を培養し
培養菌体に蓄積したＳＡＫを採取することにより、工業
的なＳＡＫの製造法が捉供される。
菌は、その菌学的性質はもとの大腸菌とくらべ、ＳＡＫ
産生能を有していること以外変わるところがない。その
一般的菌学的性質は、後掲別表に示す。（後記実施例に
より得られたものを例示）本発明により、上記の如くし
て得られた新規な大腸菌を用いて、その大腸菌を培養し
培養菌体に蓄積したＳＡＫを採取することにより、工業
的なＳＡＫの製造法が捉供される。
本発明によろＳＡＫの製造法は、上記の如くして得られ
たＳＡＫ産生能を有する大腸菌を常法により培養し、集
菌した後、公知の方法（例えば、文献Ｔａ１ｍａｄｇｅ
、 Ｋ、ａｔ ａｌ （１９８０） Ｐｒ６ｃ 、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ。
たＳＡＫ産生能を有する大腸菌を常法により培養し、集
菌した後、公知の方法（例えば、文献Ｔａ１ｍａｄｇｅ
、 Ｋ、ａｔ ａｌ （１９８０） Ｐｒ６ｃ 、Ｎ
ａｔｌ、Ａｃａｄ。
Ｓｃｉ、Ｕ、Ｓ人７７．３３６９−３３７３ ）でペリ
プラズム画分をすることにより行われるが、このぼりプ
ラズム画分にＳＡＫ活性大部分が回収される。この方法
は、従来β・アウレウスで行われている培養上清を集め
る方法とは異なり、新規かつ有効な方法である。’ＳＡ
Ｋをはリプラズムから採取する方法は、ＳＡＫを大腸菌
によシ産生せしめることによってはじめて可能となった
ものであシ、本発明方法の一特徴的利点をなすものであ
る。
プラズム画分をすることにより行われるが、このぼりプ
ラズム画分にＳＡＫ活性大部分が回収される。この方法
は、従来β・アウレウスで行われている培養上清を集め
る方法とは異なり、新規かつ有効な方法である。’ＳＡ
Ｋをはリプラズムから採取する方法は、ＳＡＫを大腸菌
によシ産生せしめることによってはじめて可能となった
ものであシ、本発明方法の一特徴的利点をなすものであ
る。
かくして得られたＳＡＫの精製は、通常のタンパク質の
精製法、例えば、塩析、ゲル濾過、吸着クロマトグラ、
フィーなどの方法により行われ４る。
精製法、例えば、塩析、ゲル濾過、吸着クロマトグラ、
フィーなどの方法により行われ４る。
上記の如き本発明方法により、大腸菌を用いてＳＡＫを
生産することが可能となったが、このように１大腸菌に
ＳＡＫを産生せしめることによ。
生産することが可能となったが、このように１大腸菌に
ＳＡＫを産生せしめることによ。
つて従来技術であるＳ・アウレウスによる場合と異り、
安全性、増殖速度、大量培養（大量生産）等の驚くべき
利点がもたらされる。しかも大腸菌の場合には、ＳＡＫ
がぼりプラズムに蓄積するので、上清タンノξり質の場
合に比べて１００倍以上という高濃度が得られ、細胞全
体を破砕して抽出する方法に比べ共雑するタンノξり質
が少いので、その分離精製が容易に行われると（・う格
別の利点が得られる。
安全性、増殖速度、大量培養（大量生産）等の驚くべき
利点がもたらされる。しかも大腸菌の場合には、ＳＡＫ
がぼりプラズムに蓄積するので、上清タンノξり質の場
合に比べて１００倍以上という高濃度が得られ、細胞全
体を破砕して抽出する方法に比べ共雑するタンノξり質
が少いので、その分離精製が容易に行われると（・う格
別の利点が得られる。
上記のペリプラズムに蓄積する現象は、例えば後に掲げ
る実施例１忙より得られた大腸菌、エシェリヒア・コリ
に１２ｃ６０ｑｒｉｍｘ （ｐＳＡＫ ３５？）を２０
０−のＬ−ブロスにて３７℃で５時間培養した時のＳＡ
Ｋ活性の分布とその割合を例示すると下表のとおりであ
り、この場合、ＳＡＫの約６０チがペリプラズム画分に
存在することがわかる。
る実施例１忙より得られた大腸菌、エシェリヒア・コリ
に１２ｃ６０ｑｒｉｍｘ （ｐＳＡＫ ３５？）を２０
０−のＬ−ブロスにて３７℃で５時間培養した時のＳＡ
Ｋ活性の分布とその割合を例示すると下表のとおりであ
り、この場合、ＳＡＫの約６０チがペリプラズム画分に
存在することがわかる。
総括性（ｕ） チ
上清画分 ９５０ ２３
ペリプラズム画分 ２４００ ５８サイトプラ
ズム画分 ８００ １９以下に本発明の
実施例を掲げる。
ズム画分 ８００ １９以下に本発明の
実施例を掲げる。
実施例 １
本実施例はＤＮＡ供与体としてＳφＣを、ベクター Ｄ
ＮＡとしてｐＢＲ３２２を、制限酵素としてＨｉｎｄｆ
ｆｆを、宿主犬腸菌原株としてエシェリヒア・コリに１
２ ｃ６００ｒＭｍｉまたはエシェリヒア−ｍｌすに１
２ＷＡ５０２ｒｉｒＪを用いて行なった例である。
ＮＡとしてｐＢＲ３２２を、制限酵素としてＨｉｎｄｆ
ｆｆを、宿主犬腸菌原株としてエシェリヒア・コリに１
２ ｃ６００ｒＭｍｉまたはエシェリヒア−ｍｌすに１
２ＷＡ５０２ｒｉｒＪを用いて行なった例である。
ａ） ＳφＣＤＮＡの調製と切断
文献（Ｂｌａｉｒ、 、Ｔ、Ｅ、ａｎｄ Ｗｉｌｌｉａ
ｍｓ、 Ｒ，Ｅ、Ｏ。
ｍｓ、 Ｒ，Ｅ、Ｏ。
（１９６１） Ｂｕｌｌ、Ｗ、Ｈ，０，２４，７７１−
７８４）の方法に従ってファージＳφＣを増殖し、得ら
れたファージｆＬ１ｔに対し、５Ｍ−Ｎａｉｌ １００
−を加え、さらに３０％（ｗ／ｗ）４リエチレングリコ
ール３００−を加え、よく攪拌し、０℃で数時間放置し
た。その後１０．００ Ｏｒｐｍで１５分間遠心して沈
殿を集め。
７８４）の方法に従ってファージＳφＣを増殖し、得ら
れたファージｆＬ１ｔに対し、５Ｍ−Ｎａｉｌ １００
−を加え、さらに３０％（ｗ／ｗ）４リエチレングリコ
ール３００−を加え、よく攪拌し、０℃で数時間放置し
た。その後１０．００ Ｏｒｐｍで１５分間遠心して沈
殿を集め。
これを２０−の緩衝液（Ｉ Ｑ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｔ、 １０ｍＭ ＭｇＳＯ４，５ｍＭ ＣａＣｌ２．０
．０１％ゼラチン： ｐＨ７，ｔ４）に溶かし、これに
ＤＮＡ ａθθおよびＲＮａ ｓθをそれぞれ最終濃度
で１μｍ／−となるように加え、３７℃にて２０分間反
応させた。反応終了後１０．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠
心し、その上清をさらに５０，０００ ｒｐｍで６０分
間遠心して得られる沈殿を上記と同じ緩衝液２．５艷に
溶かし、これに約１．７ｇの塩化セシウムを加え、２７
．００Ｏｒｐｍで１８時間平衡密度勾配遠心にかける。
ｔ、 １０ｍＭ ＭｇＳＯ４，５ｍＭ ＣａＣｌ２．０
．０１％ゼラチン： ｐＨ７，ｔ４）に溶かし、これに
ＤＮＡ ａθθおよびＲＮａ ｓθをそれぞれ最終濃度
で１μｍ／−となるように加え、３７℃にて２０分間反
応させた。反応終了後１０．ＯＯＯｒｐｍで１０分間遠
心し、その上清をさらに５０，０００ ｒｐｍで６０分
間遠心して得られる沈殿を上記と同じ緩衝液２．５艷に
溶かし、これに約１．７ｇの塩化セシウムを加え、２７
．００Ｏｒｐｍで１８時間平衡密度勾配遠心にかける。
このようにして得られるファージのバンドを集め、１ｔ
の緩衝液に対して透析する。得られたファージ液０．５
ｍｌに５０μｔの１．５Ｍ ＮａＣｔ−０，１５Ｍク
エン酸ナトリウム、５μｔの２５０ ｍＭ ＥＤＴＡ（
ｐＨ７，０）および５μｔの１０ ％ ＳＤＳを加え、
３７℃に５分間放置後、α６−の０．１５Ｍ ＮａＣ１
−１５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液飽和フェノールを加
え、室温でおだやかに約１０分間混合する。これを３．
０００ ｒｐｍで１０分間遠心し、上層（水層）を集め
る。このフェノール処理を繰シ返した後、等量のエーテ
ルによる洗浄を３回行ない、得られた水層を０．１５Ｍ
ＮａＣｔ−１５ｍＭクエン酸ナトリウム−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡの２００−に対して３回透析する。
の緩衝液に対して透析する。得られたファージ液０．５
ｍｌに５０μｔの１．５Ｍ ＮａＣｔ−０，１５Ｍク
エン酸ナトリウム、５μｔの２５０ ｍＭ ＥＤＴＡ（
ｐＨ７，０）および５μｔの１０ ％ ＳＤＳを加え、
３７℃に５分間放置後、α６−の０．１５Ｍ ＮａＣ１
−１５ｍＭクエン酸ナトリウム溶液飽和フェノールを加
え、室温でおだやかに約１０分間混合する。これを３．
０００ ｒｐｍで１０分間遠心し、上層（水層）を集め
る。このフェノール処理を繰シ返した後、等量のエーテ
ルによる洗浄を３回行ない、得られた水層を０．１５Ｍ
ＮａＣｔ−１５ｍＭクエン酸ナトリウム−１ｍＭ ＥＤ
ＴＡの２００−に対して３回透析する。
ファージＤＮＡを切断するため、１μｇのＤＮＡに対し
３ｕのＨｌｎｄ［ｌを加え、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ−７ｍＭＭｇＣｔ２−７ｍＭβ−メルカプトエタノ
−／ｌ／−５０ｍＭＮａｃｌ （ｐＨ７，６）の緩衝液
２０ ｔｔｌ中で３７℃にて３時間反応を行わせ、反応
終了時に１μｔの２５０ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨａｏ
）を加える。
３ｕのＨｌｎｄ［ｌを加え、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ−７ｍＭＭｇＣｔ２−７ｍＭβ−メルカプトエタノ
−／ｌ／−５０ｍＭＮａｃｌ （ｐＨ７，６）の緩衝液
２０ ｔｔｌ中で３７℃にて３時間反応を行わせ、反応
終了時に１μｔの２５０ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨａｏ
）を加える。
ｂ）プラスミドｐＢＲ３２２の開裂
１μｓのｐＢＲ３２２に対し１ｕのＨｉｎａ ｍを加え
、上と同一の緩衝液２０μを中で３７℃にて５時間反応
させ、反応終了時に１μｔの２５０ ｍＭ ＥＤＴＡ（
ｐＨ８，０）を加える。
、上と同一の緩衝液２０μを中で３７℃にて５時間反応
させ、反応終了時に１μｔの２５０ ｍＭ ＥＤＴＡ（
ｐＨ８，０）を加える。
Ｃ）再結合反応
制限酵素で処理したＤＮＡ溶液２０μｔに５μｔの１．
５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，０）を加え、さらに６０
μｔの９５チエタノールを加え、−７５℃にて１０分間
放置した後、１’ ２．０ ’ＯＯｒｐｍで５分間遠心
し沈殿を集め、９５％エタノールで１％＆洗浄する。こ
れを減圧乾燥させ、１０μｔのｊ （ｌ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｔ−１ｍＭ ＫＤＴＡ （ｐＨ８，０，ＴＥバッ
ファ）に溶解する。結合反応は５０ ｎ、ｌｉｔ ｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡ、 １．５μ、！ＦＳφＣＤＮＡ、 ３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯｔ（ｐＨ７，６）、 １０ｍＭ
Ｍｇ、Ｃ１２，１０ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍ
Ｍ ＡＴＰおよび０．１ ｕ Ｔ４１Ｊガーゼを含む２
０μ４の反応液中で４℃にて４８時間または２０℃にて
数時間反応させ、１μｔの０．２５ Ｍ ＫＤＴＡ （
ｐＨ８，０）を加えて反応を止める。その後リガーゼを
失活させるために６５℃にて５分間加熱し、１８０μｔ
のＴＥバッファを加えて一２０℃に保存する。
５Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ７，０）を加え、さらに６０
μｔの９５チエタノールを加え、−７５℃にて１０分間
放置した後、１’ ２．０ ’ＯＯｒｐｍで５分間遠心
し沈殿を集め、９５％エタノールで１％＆洗浄する。こ
れを減圧乾燥させ、１０μｔのｊ （ｌ ｍＭＴｒｉｓ
−ＨＣｔ−１ｍＭ ＫＤＴＡ （ｐＨ８，０，ＴＥバッ
ファ）に溶解する。結合反応は５０ ｎ、ｌｉｔ ｐＢ
Ｒ３２２ＤＮＡ、 １．５μ、！ＦＳφＣＤＮＡ、 ３
０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＯｔ（ｐＨ７，６）、 １０ｍＭ
Ｍｇ、Ｃ１２，１０ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍ
Ｍ ＡＴＰおよび０．１ ｕ Ｔ４１Ｊガーゼを含む２
０μ４の反応液中で４℃にて４８時間または２０℃にて
数時間反応させ、１μｔの０．２５ Ｍ ＫＤＴＡ （
ｐＨ８，０）を加えて反応を止める。その後リガーゼを
失活させるために６５℃にて５分間加熱し、１８０μｔ
のＴＥバッファを加えて一２０℃に保存する。
ｄ）組換え体プラスミドの大腸菌への導入各大腸菌をグ
ルコースを含まないＬ−ブロス（ポリベゾトン１０１／
／ｌ、イーストエキストラクトｒ４／ｌ、、Ｎａｃｔ
５ｆｊ／ｌ）の１０ｍ１に接種して５Ｘ１０８／−に増
殖させた後、４°Ｃにて遠心集菌する。この菌を５−の
冷やした５ ０ ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁し、氷水浴中
に５分間放置後再び遠心集菌し、さらに０．６７−の冷
やした５ ０ ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁し、氷水浴中に
５分間放置する。この大腸菌の懸濁液に再結合したプラ
スミドＤＮＡ溶液を０、３５ ｍｌ混合し、氷水浴中に
５分間保持する。
ルコースを含まないＬ−ブロス（ポリベゾトン１０１／
／ｌ、イーストエキストラクトｒ４／ｌ、、Ｎａｃｔ
５ｆｊ／ｌ）の１０ｍ１に接種して５Ｘ１０８／−に増
殖させた後、４°Ｃにて遠心集菌する。この菌を５−の
冷やした５ ０ ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁し、氷水浴中
に５分間放置後再び遠心集菌し、さらに０．６７−の冷
やした５ ０ ｍＭ ＣａＣｌ２に懸濁し、氷水浴中に
５分間放置する。この大腸菌の懸濁液に再結合したプラ
スミドＤＮＡ溶液を０、３５ ｍｌ混合し、氷水浴中に
５分間保持する。
その後この反応液を４２℃にて２分間保持することによ
り大腸菌への組換え体プラスミドの導入を止める。この
懸濁液をそのまままたは１゜倍、１００倍に希釈し、ア
ンピシリン（４０μ９鷹）を含むＬ−プロス寒天培地に
塗布し、３７℃に一夜培養し、アンピシリン耐性となっ
た大腸菌組換え体を分離する。
り大腸菌への組換え体プラスミドの導入を止める。この
懸濁液をそのまままたは１゜倍、１００倍に希釈し、ア
ンピシリン（４０μ９鷹）を含むＬ−プロス寒天培地に
塗布し、３７℃に一夜培養し、アンピシリン耐性となっ
た大腸菌組換え体を分離する。
１１３） ＳＡＫ産生能を有する大腸菌の選択分離ヒ
ト血漿を５ｒｎｌづつ試験管に分注し、５６℃で２０分
間加熱し、別に、溶かした２チ寒天入シ普通寒天培地を
１０−づつ分注し、５６℃に温めておく。この両者をす
ばやくシャーレ上で混合し、固まるまで放置する。この
寒天培地上に上記操作で得られた大腸菌試験菌液を置き
、３７℃にて培養する。ＳＡＫ産生能を有する大腸菌は
フィブリンを分解し、集落の周辺をとがすので透明なゾ
ーンが出来る。この時得られた新規大腸菌のそれぞれを
エシェリヒア・コｌＪＫ１２Ｃ６００ｒｉｍｉ４ （ｐ
ｓＡＫ３６１ ）およびエシェリヒア・コリに１２ Ｗ
Ａ８０２ｒｘＪｃ （ｐｓＡＫ３６１）と名付けた。
ト血漿を５ｒｎｌづつ試験管に分注し、５６℃で２０分
間加熱し、別に、溶かした２チ寒天入シ普通寒天培地を
１０−づつ分注し、５６℃に温めておく。この両者をす
ばやくシャーレ上で混合し、固まるまで放置する。この
寒天培地上に上記操作で得られた大腸菌試験菌液を置き
、３７℃にて培養する。ＳＡＫ産生能を有する大腸菌は
フィブリンを分解し、集落の周辺をとがすので透明なゾ
ーンが出来る。この時得られた新規大腸菌のそれぞれを
エシェリヒア・コｌＪＫ１２Ｃ６００ｒｉｍｉ４ （ｐ
ｓＡＫ３６１ ）およびエシェリヒア・コリに１２ Ｗ
Ａ８０２ｒｘＪｃ （ｐｓＡＫ３６１）と名付けた。
ｆ）大腸菌シラスミドの解析
得られた各大腸菌をアンピシリン（４０μＦ１／ｄ）を
含み、グルコースを含まないＬ−プロス４０〇−にて３
７℃で約４ Ｘ １Ｑ８ｃｅｌｌｓ／ｄ ’！で増殖さ
せ、培養液にクロラムフェニコー＃５ ＱμＥ／ｍｌ！
トなるように加え、さらに３７℃で１５時間で培養した
後遠心集菌する。５０−の１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｔ（ｐＨａＣｌ）−０，１５ＭＮａＣｔ−１５ｍＭクエ
ン酸ナトリウムで菌体を洗浄し、３．２−の２５％蔗糖
−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨａＬ （ｐＨ８，０）に懸濁
する。これに１．６−の２５ ｏ ｍＭＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，ｏ ）、１−の５Ｗ１ｇ／−リゾチーム、６−の
２チブリツジ５８−６２．５ ｍＭＥＤＴＡ −５０ｍ
ＭＴｒＩＢ−Ｈｃｔ （ｐＨａ Ｄ ）を加え、３［１
’Ｃで１５分間イ、ンキュベー卜し、細胞壁をおだやか
に溶解し、高速遠心分離（４℃にて３０．００Ｏｒｐｍ
、３０分間）により菌体を沈殿させ、上清を得る。これ
をエチジウムブロマイド−塩化−１＝シウム平衡密変勾
配遠心（１０℃にて３６．００ Ｏｒｐｍ、４８時間）
にかけプラスミドＤＮＡを精製する。これをｂ）と同様
の方法でＨｉｎｄ ｌｉｔで切断Ｕ断片の長さを１チア
ガロースを用いたアガロース電気泳動法で測定したとこ
ろ４．９Ｋｂであることが判明した。
含み、グルコースを含まないＬ−プロス４０〇−にて３
７℃で約４ Ｘ １Ｑ８ｃｅｌｌｓ／ｄ ’！で増殖さ
せ、培養液にクロラムフェニコー＃５ ＱμＥ／ｍｌ！
トなるように加え、さらに３７℃で１５時間で培養した
後遠心集菌する。５０−の１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｔ（ｐＨａＣｌ）−０，１５ＭＮａＣｔ−１５ｍＭクエ
ン酸ナトリウムで菌体を洗浄し、３．２−の２５％蔗糖
−５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨａＬ （ｐＨ８，０）に懸濁
する。これに１．６−の２５ ｏ ｍＭＥＤＴＡ （ｐ
Ｈ８，ｏ ）、１−の５Ｗ１ｇ／−リゾチーム、６−の
２チブリツジ５８−６２．５ ｍＭＥＤＴＡ −５０ｍ
ＭＴｒＩＢ−Ｈｃｔ （ｐＨａ Ｄ ）を加え、３［１
’Ｃで１５分間イ、ンキュベー卜し、細胞壁をおだやか
に溶解し、高速遠心分離（４℃にて３０．００Ｏｒｐｍ
、３０分間）により菌体を沈殿させ、上清を得る。これ
をエチジウムブロマイド−塩化−１＝シウム平衡密変勾
配遠心（１０℃にて３６．００ Ｏｒｐｍ、４８時間）
にかけプラスミドＤＮＡを精製する。これをｂ）と同様
の方法でＨｉｎｄ ｌｉｔで切断Ｕ断片の長さを１チア
ガロースを用いたアガロース電気泳動法で測定したとこ
ろ４．９Ｋｂであることが判明した。
ｇ） ４．９Ｋｂ断片の分離
１００μＩのＳφＣＤＮＡを０．２−の反応液（１（１
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，６） −７ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２−７ ｍＭβ−メルカプトエタノール−５［］
ｍＭ ＮａＣｔ−１００ｕＨｌｎｄｌ［ｌを含む）中に
３７°Ｃで２００時間反応ることにより切断し、これを
１チアガロースを用いてアガロースゲル電気泳動にかけ
る。エチジウムブロマイドによってＤＮＡを染色し、目
的とする４、９ＫｂのＤＮＡ断片のある部分のみをゲ゛
ルがら切シ出す。切り出したゲル断片はガラスカラムに
入れ、電気泳動法によって透析チューブの中゛に溶出さ
せる。溶出させたＤＮＡ溶液はＴＥバッファで飽和した
フェノールで処理し、水層をさらにエーテルで処理した
後、エタノール沈殿法によってＤＮＡを集め、ベクター
ＤＮＡとの再結合反応に供することができる。
ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，６） −７ｍＭ Ｍｇ
Ｃｌ２−７ ｍＭβ−メルカプトエタノール−５［］
ｍＭ ＮａＣｔ−１００ｕＨｌｎｄｌ［ｌを含む）中に
３７°Ｃで２００時間反応ることにより切断し、これを
１チアガロースを用いてアガロースゲル電気泳動にかけ
る。エチジウムブロマイドによってＤＮＡを染色し、目
的とする４、９ＫｂのＤＮＡ断片のある部分のみをゲ゛
ルがら切シ出す。切り出したゲル断片はガラスカラムに
入れ、電気泳動法によって透析チューブの中゛に溶出さ
せる。溶出させたＤＮＡ溶液はＴＥバッファで飽和した
フェノールで処理し、水層をさらにエーテルで処理した
後、エタノール沈殿法によってＤＮＡを集め、ベクター
ＤＮＡとの再結合反応に供することができる。
ｈ） ＳＡＫの生産・抽出・精製
上で得たＳＡＫ産寥産金能する大腸菌をＬ−プロス（ポ
リはプトン１チ、イーストエキストラクト０．５％、Ｎ
ａＣｔｏ、 ５％、グルコース０．１チ、ｐＨ７，０）
５０−に接種し、−夜６７℃で振とう培養する。この
菌液を同一ブロス５ｔに接種し、６７℃で１２時間振と
り培養し、遠心して集菌する。この菌体を１００ ｍＭ
Ｔｒｉｅ−ＨＣＩ −２０％蔗ｍ（ｐＨ８，０）２０
０−に懸濁し、再び遠心して集菌する。これを４５−の
１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ −２０％蔗糖（ｐ
Ｈ８，０）に懸濁し、５−のリゾチーム溶液（５■／−
リゾチーム−２０ｍＭ ＫＤＴＡ、 ｐＨ８，０）を加
え、氷水浴中に１時間放置する。これを遠心して上清を
集め、ここへ８０チ飽和になるように硫安を加え、４℃
で一夜放置する。遠心によシ沈殿を集め、１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５） Ｉ Ｏ−にとかし、
同バッファに対して透析する。これをセファデックスロ
ーフ５ゲルクロマトグラフイーにかけ、１０ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）で溶出し、ＳＡＫ活性
画分を集め、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，
５）で平衡化したＣＭ−セルロースカラムに吸着させ、
Ｏ−０，５ｂＭＭＮＭＣＭ （Ｄ直線濃度勾配で溶出さ
せ、０．６〜０，６２モルＮａＣｔによって溶出される
ＳＡＫ活性画分を集める。
リはプトン１チ、イーストエキストラクト０．５％、Ｎ
ａＣｔｏ、 ５％、グルコース０．１チ、ｐＨ７，０）
５０−に接種し、−夜６７℃で振とう培養する。この
菌液を同一ブロス５ｔに接種し、６７℃で１２時間振と
り培養し、遠心して集菌する。この菌体を１００ ｍＭ
Ｔｒｉｅ−ＨＣＩ −２０％蔗ｍ（ｐＨ８，０）２０
０−に懸濁し、再び遠心して集菌する。これを４５−の
１００ ｍＭ Ｔｒｉｓ −ＨＣｌ −２０％蔗糖（ｐ
Ｈ８，０）に懸濁し、５−のリゾチーム溶液（５■／−
リゾチーム−２０ｍＭ ＫＤＴＡ、 ｐＨ８，０）を加
え、氷水浴中に１時間放置する。これを遠心して上清を
集め、ここへ８０チ飽和になるように硫安を加え、４℃
で一夜放置する。遠心によシ沈殿を集め、１０ ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，５） Ｉ Ｏ−にとかし、
同バッファに対して透析する。これをセファデックスロ
ーフ５ゲルクロマトグラフイーにかけ、１０ ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣＩ （ｐＨ７，５）で溶出し、ＳＡＫ活性
画分を集め、１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｔ（ｐＨ７，
５）で平衡化したＣＭ−セルロースカラムに吸着させ、
Ｏ−０，５ｂＭＭＮＭＣＭ （Ｄ直線濃度勾配で溶出さ
せ、０．６〜０，６２モルＮａＣｔによって溶出される
ＳＡＫ活性画分を集める。
実施例 ２
本実施例はＤＮＡ供与体としてＳφＣを、ＳφＣ切断用
制限酵素としてＨｉｎｄ ［［とＰｓｔ ｌを、ベクタ
ーＤＮＡとしてｐＢＲ３２２を、ｐＢＲ３２２切断用制
限酵素としてＥｃｏＲｌとＰｓｔｌを、太腸菌原株とし
て、エシェリヒア・コリに１２ Ｃ６Ｃ６００ｒｉ ’
またはエシェリヒア・コリに１２ ＷＡ８０２ｒｉｍＩ
ｔを用いて行った例である。
制限酵素としてＨｉｎｄ ［［とＰｓｔ ｌを、ベクタ
ーＤＮＡとしてｐＢＲ３２２を、ｐＢＲ３２２切断用制
限酵素としてＥｃｏＲｌとＰｓｔｌを、太腸菌原株とし
て、エシェリヒア・コリに１２ Ｃ６Ｃ６００ｒｉ ’
またはエシェリヒア・コリに１２ ＷＡ８０２ｒｉｍＩ
ｔを用いて行った例である。
ａ）ファージＳφＣＤＮＡの切断
実施例１のａ）〜ｆ）に記した方法でＳφＣＤＮＡから
Ｈｉｎａ［ｌｌで切断した時の４．９Ｋｂ断片を分離す
る。
Ｈｉｎａ［ｌｌで切断した時の４．９Ｋｂ断片を分離す
る。
この断片の両端にはそれぞれ４塩基から成る一本鎖部分
があるため、この部分を１ｕのＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼと４種のデオキシリ−ボスクレオシド−３リン酸（各
２５μＭ）によって６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ
Ｈ８，０’）、６．７ ｍＭ ＭｇＣｌ２．６．７ｍＭ
β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（２０μｔ）中
で１８°Ｃにて４時間反応させて二本鎖とした。これに
５μｔの１，５Ｍ酢酸ナトリウム（１）Ｉ（７，０）と
７５μｔのエタノールを加え、−７０°Ｃに１０分間保
持した後、１２．００ Ｏｒｐｍで５分間遠心し、沈殿
をエタノールで洗浄する。これを１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｔ（ｐＨ７，６） −７ｍＭ ’Ｍｇ０ｔ２−７
ｍＭβ−メルカプトエタノール−５０ｍＭ Ｎａ０ｔ
から成る緩衝液にとかしり、５ｕのＰｓｔｌを加え、３
７℃で６時間反応させることによシ、さらに２つの断片
に切断する。
があるため、この部分を１ｕのＴ４ ＤＮＡポリメラー
ゼと４種のデオキシリ−ボスクレオシド−３リン酸（各
２５μＭ）によって６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ
Ｈ８，０’）、６．７ ｍＭ ＭｇＣｌ２．６．７ｍＭ
β−メルカプトエタノールを含む緩衝液（２０μｔ）中
で１８°Ｃにて４時間反応させて二本鎖とした。これに
５μｔの１，５Ｍ酢酸ナトリウム（１）Ｉ（７，０）と
７５μｔのエタノールを加え、−７０°Ｃに１０分間保
持した後、１２．００ Ｏｒｐｍで５分間遠心し、沈殿
をエタノールで洗浄する。これを１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ
−ＨＣｔ（ｐＨ７，６） −７ｍＭ ’Ｍｇ０ｔ２−７
ｍＭβ−メルカプトエタノール−５０ｍＭ Ｎａ０ｔ
から成る緩衝液にとかしり、５ｕのＰｓｔｌを加え、３
７℃で６時間反応させることによシ、さらに２つの断片
に切断する。
これを再結合反応に供する。
ｂ）プラスミドｐＢＲ３２２の開裂
１μＩのｐＢＲ３２２ＤＮＡに１ｕのＥｃｏＲＩを加え
て実施例１のｂ）と同様に反応させ開裂する。この開裂
したＤＮＡの両端も４塩基からなる一本鎖部分があるの
で、ａ）の場合と同様にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと４
種めデオキシリボヌクレオシド−６リン酸によって二本
鎖にする。これをさらにａ）におけると同様に１ｌｌｌ
ｓｔｌで切断して再結合反応に供する。
て実施例１のｂ）と同様に反応させ開裂する。この開裂
したＤＮＡの両端も４塩基からなる一本鎖部分があるの
で、ａ）の場合と同様にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼと４
種めデオキシリボヌクレオシド−６リン酸によって二本
鎖にする。これをさらにａ）におけると同様に１ｌｌｌ
ｓｔｌで切断して再結合反応に供する。
Ｃ）再結合反応
ａ）、ｂ）で得られたＤＮＡ断片とベクターＤＮＡを混
合し、実施例１のＣ）と同様にして再結合反応を行なわ
せる。ただしＴ４ ＤＮＡ ＩＪガーゼば１ｕを用いた
。
合し、実施例１のＣ）と同様にして再結合反応を行なわ
せる。ただしＴ４ ＤＮＡ ＩＪガーゼば１ｕを用いた
。
ｄ）以下実施例１と同様に新規な大腸菌〔エシエリヒア
・コリに１２ Ｃ６００ｒｉｍＭ（ｐｓＡＣ６００ｒｉ
’ｌ、たはエシェリヒア・コリに１２ ｗＡ８０２ｒ
ｉｍｉ（ｐｓＡＫ−Ｈｐ２）と命名〕を得、プラスミド
解析の結果、各大腸菌は、約２．５Ｋｋ＋のＳφＣ由来
のＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡを有していた。
・コリに１２ Ｃ６００ｒｉｍＭ（ｐｓＡＣ６００ｒｉ
’ｌ、たはエシェリヒア・コリに１２ ｗＡ８０２ｒ
ｉｍｉ（ｐｓＡＫ−Ｈｐ２）と命名〕を得、プラスミド
解析の結果、各大腸菌は、約２．５Ｋｋ＋のＳφＣ由来
のＳＡＫ産生遺伝情報を担うＤＮＡを有していた。
実施例 ６
本実施例はＤＮＡ供与体としてＰφ１を、〈フタ−とし
てｐＢＲ３２２を、制限酵素として１（ｉｎａｌｌを犬
腸菌原株としてエシェリヒア・コリに１２ Ｃ６Ｃ６０
０ｒｉを用いて行なつ゛た例である。
てｐＢＲ３２２を、制限酵素として１（ｉｎａｌｌを犬
腸菌原株としてエシェリヒア・コリに１２ Ｃ６Ｃ６０
０ｒｉを用いて行なつ゛た例である。
ａ）実施例１と同様の方法でファージＰφ１ＤＮＡを調
製し、Ｈｉｎｄ［［ｌにて切断する。（フタ−ＤＮＡも
同様にして切断する。
製し、Ｈｉｎｄ［［ｌにて切断する。（フタ−ＤＮＡも
同様にして切断する。
ｂ）再結合反応、大腸菌への導入、組換え体大腸菌の選
択は実施例１と同様に行なう。
択は実施例１と同様に行なう。
Ｃ）この結果Ｐφ１に由来するＳＡＫ産生遺伝情報を担
うＤＮＡ領域を大腸菌に導入させることができた。この
新規な大腸菌をエシェリヒア・フリに１２ ｃ６００ｒ
ｉｍｉ’（ｐｓＡＫ６０１）と命名した。
うＤＮＡ領域を大腸菌に導入させることができた。この
新規な大腸菌をエシェリヒア・フリに１２ ｃ６００ｒ
ｉｍｉ’（ｐｓＡＫ６０１）と命名した。
別表 宿主菌およびＳＡＫ生産能を幻、写した大腸菌の
菌学的性質 ※ Ａはエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００ｒｉ ｍｉ
を表わす。
菌学的性質 ※ Ａはエシェリヒア・コリに１２Ｃ６００ｒｉ ｍｉ
を表わす。
※※Ｂはエンエ’Ｊ ヒフ −：＋すＫ ’ｌ ２ Ｃ
６Ｑｏｒ”ｘ ｍｉ （ｐＳＡＫ ＨＰ ２ ）を表わ
す。
６Ｑｏｒ”ｘ ｍｉ （ｐＳＡＫ ＨＰ ２ ）を表わ
す。
※※＊Ｃはｚシ、＋Ｊヒフ・コ’ＪＫ１２Ｃ６００ｒｉ
ｍｉ’（ｐｓＡＫ５６ｊ）を表わす。
ｍｉ’（ｐｓＡＫ５６ｊ）を表わす。
特許出願人 株式会社ヤクルト本社
老補
へ鋼
手 続 補 正 書昭和５ｇ年７月
７７日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和左乙年特許願第１６１１θ乙グ号 ２発明の名称 スタフィロキナーゼ産生遺伝子を含有する新規な大腸菌
およびスタフィロキナーゼの製造法３補正をする者 事件との関係 ′ 特許出願人 住所 東京都港区東新橋／丁目７番／ｑ号６、補正に
より増加する発明の数 コＺ補正の対象
明細書の特許請求の範囲及び発明の詳細な説明の項 ８、補正の内容 １、特許請求の範囲 別紙のとおシ ■１発明の詳細な説明 １）明細書６頁下かも６〜５行の「切断群」の記載を「
断片群」と訂正する。
７７日 特許庁長官 若 杉 和 夫 殿 １、事件の表示 昭和左乙年特許願第１６１１θ乙グ号 ２発明の名称 スタフィロキナーゼ産生遺伝子を含有する新規な大腸菌
およびスタフィロキナーゼの製造法３補正をする者 事件との関係 ′ 特許出願人 住所 東京都港区東新橋／丁目７番／ｑ号６、補正に
より増加する発明の数 コＺ補正の対象
明細書の特許請求の範囲及び発明の詳細な説明の項 ８、補正の内容 １、特許請求の範囲 別紙のとおシ ■１発明の詳細な説明 １）明細書６頁下かも６〜５行の「切断群」の記載を「
断片群」と訂正する。
２）同７貞上から１２〜１４行の「なお、ベクターの・
・・・・・問わない。」の記載を削除する。
・・・・・問わない。」の記載を削除する。
３）同頁下から２行の「選択される。・」の記載の後に
以下のとおシ加入する。
以下のとおシ加入する。
「なお、ベクターの複製能を損なわない限り、上記のフ
ァージＤＮＡ断片を挿入する方向及び部位は問わない。
ァージＤＮＡ断片を挿入する方向及び部位は問わない。
」
４）同８頁３行の「可能であるが、いったん修飾を」の
記載を「可能である。また、いったん修飾を」と訂正す
る。
記載を「可能である。また、いったん修飾を」と訂正す
る。
５）同９頁７行の「試験菌を置き、」の記載を「試験菌
をスポットし、」と訂正する。
をスポットし、」と訂正する。
６）同１２頁６行の「上清タン・ξり質の」の記載を「
従来法によシＳ、アウレウスを使用して上清両分から取
得する」と訂正する。
従来法によシＳ、アウレウスを使用して上清両分から取
得する」と訂正する。
７）同頁１４行の゛「Ｌ−ブロス」の記載の後に「（ポ
リイブトン１０ ｔ／ｌ、イーストエキストラクト５２
μ、グルコース１２μ、ＮａＣｌ３２μ）」を挿入する
。
リイブトン１０ ｔ／ｌ、イーストエキストラクト５２
μ、グルコース１２μ、ＮａＣｌ３２μ）」を挿入する
。
８）同１３頁１３行の「ポリエチレングリコール」の記
載の後に「（平均分子量７０００〜８０００）Ｊを挿入
する。
載の後に「（平均分子量７０００〜８０００）Ｊを挿入
する。
９）同頁下から３行のＦＤＮＡａｓｅ Ｊの記載を「Ｄ
Ｎａｓｅ Ｊと訂正する。
Ｎａｓｅ Ｊと訂正する。
１０）同頁下から２行の「１μ号匂」の記載を「１μ？
肩」と訂正する。
肩」と訂正する。
１１）同１４頁６行の「１ｔ−の」の記載の後に「上記
と同じ」を挿入する。
と同じ」を挿入する。
１２）同１５頁３〜１８行の「ｍＭ ＥＤＴＡ （１）
Ｈ８，０）を加える。・−・・・・・・・１０ｍＭＪの
記載を以下のとおシ訂正する。
Ｈ８，０）を加える。・−・・・・・・・１０ｍＭＪの
記載を以下のとおシ訂正する。
［ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨａｏ ）を加える。この制限
酵素で処理したＤＮＡ溶液に５μｔの１５−Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ７Ｏ）を加え、さらに６０μｔのエタノー
ルを加え、−７０℃にて１０分間放置した後、１２．Ｄ
Ｑ Ｏｒｐｍで５分間遠心し沈殿を集め、エタノール
で再度洗浄する。これを減圧乾燥させ、１０μｔの１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ６ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ
ａＯ、ＴＥバッファ）に溶解する。
酵素で処理したＤＮＡ溶液に５μｔの１５−Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ７Ｏ）を加え、さらに６０μｔのエタノー
ルを加え、−７０℃にて１０分間放置した後、１２．Ｄ
Ｑ Ｏｒｐｍで５分間遠心し沈殿を集め、エタノール
で再度洗浄する。これを減圧乾燥させ、１０μｔの１０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ６ｌ ｍＭ ＥＤＴＡ （ｐＨ
ａＯ、ＴＥバッファ）に溶解する。
ｂ）シラスミドｐＢＲ３２２の開裂
１μ２のｐＢＲ３２２に対し１ｕのＨｉｎｄ ｍを加え
、前述の緩衝液と同一の緩衝液２０μを中で３７℃にて
３時間反応させ、反応終了時に１１ｄの２５０ｍＭＥＤ
ＴＡ （ｐＨ８，０）を加える。以下、前記ａ）におけ
る反応終了後のＤＮＡ溶液の処理と同様にしてＤＮＡ溶
液を洗浄する。
、前述の緩衝液と同一の緩衝液２０μを中で３７℃にて
３時間反応させ、反応終了時に１１ｄの２５０ｍＭＥＤ
ＴＡ （ｐＨ８，０）を加える。以下、前記ａ）におけ
る反応終了後のＤＮＡ溶液の処理と同様にしてＤＮＡ溶
液を洗浄する。
Ｃ）再結合反応（Ｌｉｇａｔｉｏｎ ）結合反応（Ｌｉ
ｇａｔｉｏｎ ）は５０ ｎ？ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ
（上記ｂ）で得られたもの）、１．５μ？！ＪＣＤＮＡ
（上記ａ）で得られたもの）、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７，６） 、 １０ ｍＭ Ｊ１３
）同１６真下から６行の「プラスミドＤＮＡ溶液」の記
載の後に「（上記Ｃで得られた月を挿入する。
ｇａｔｉｏｎ ）は５０ ｎ？ ｐＢＲ３２２ＤＮＡ
（上記ｂ）で得られたもの）、１．５μ？！ＪＣＤＮＡ
（上記ａ）で得られたもの）、３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣｌ（ｐＨ７，６） 、 １０ ｍＭ Ｊ１３
）同１６真下から６行の「プラスミドＤＮＡ溶液」の記
載の後に「（上記Ｃで得られた月を挿入する。
１４）同１７頁１行の「寒天培地」の記載の後に「（寒
天濃度１６５％）」を挿入する。
天濃度１６５％）」を挿入する。
１５）同頁５行の「５−づつ」の記載の後に「複数の」
を挿入する。
を挿入する。
１６）同頁７行の「１０ｔｎ！、づつ」の記載の後に「
複数の容器に」を挿入する。
複数の容器に」を挿入する。
１７）同頁９行の「この寒天培地上」の記載を「この複
数の寒天培地上」と訂正する。
数の寒天培地上」と訂正する。
１８）同頁１０行の「上記操作で・・・・・・を置き、
」の記載を「上記ｄ）で得られた大腸菌試験菌の菌懸濁
液をスポットし、」と訂正する。
」の記載を「上記ｄ）で得られた大腸菌試験菌の菌懸濁
液をスポットし、」と訂正する。
１９）同頁１４行の「それぞれを」の記載の後に「宿主
大腸菌原株に応じて」を挿入する。
大腸菌原株に応じて」を挿入する。
２０）同頁下から３行の１得られた」の記載を「上記θ
）で得られた」と訂正する。
）で得られた」と訂正する。
２１）同１８頁４行のｒ−０，１５Ｍ ＮａＣｔ−１５
ｍＭＪの記載を「−０，０１５Ｍ ＮａＣ１−１，５ｍ
ＭＪと訂正する。
ｍＭＪの記載を「−０，０１５Ｍ ＮａＣ１−１，５ｍ
ＭＪと訂正する。
２２）同頁下から４行の「断片の長さ」の記載をｆ”
ＳＡＫ遺伝子を有する断片の長さ」と訂正する。
ＳＡＫ遺伝子を有する断片の長さ」と訂正する。
２６）同頁下から４〜３行の「アガロース電気泳動法」
の記載を「アガロースゲル電気泳動法」と訂正する。
の記載を「アガロースゲル電気泳動法」と訂正する。
２４）同１９頁９行の「ガラスカラムに入れ」の記載を
削除する。
削除する。
２５）同２０頁下から３行の「モル」の記載なｒＭＪと
訂正する。
訂正する。
２６）同２２頁５行の「ＮａＣ１から成る」の記載を「
？ＪａＣ１を含む」と訂正する。
？ＪａＣ１を含む」と訂正する。
以上
２、特許請求の範囲
ＮＡ ０
５）スタフィロコッカス・アウレウスの清涼フ進法。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）スタフィロコッカス・アウレウスの溶原ファーｕＤ
ＮＡを切断して得たスタフィロキナーゼ産生遺伝情報を
担うＤＮＡを組み込んだベクターを導入させた新規な大
腸菌 ２）スタフィロコッカス・アウレウスの溶原ファージＤ
ＮＡを切断して得たスタフィロキナーゼ産生遺伝情報を
担うＤＮＡを組み込んだベクターを導入させた大腸菌を
培養し、その培養菌体に蓄積したスタフィロキナーゼを
採取することを特徴とするスタフィロキナーゼの製造法
Priority Applications (8)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56164064A JPS5867181A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 |
| KR8204582A KR910001807B1 (ko) | 1981-10-16 | 1982-10-12 | 스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법 |
| US06/434,503 US4532211A (en) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | Coliform bacillus having a gene for the production of staphylokinase and a process for production of staphylokinase therewith |
| DK460182A DK164001C (da) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | Rekombinant-dna, der kan udtrykke staphylokinase og er afledt fra en temperat phag af staphylococcus aureus, fremgangsmaade til fremstilling af rekominant-dna samt fremgangsmaade til fremstilling af staphylokinase |
| CA000413486A CA1206109A (en) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | E. coli having gene for production of staphylokinase and process for production of staphylokinase therewith |
| EP82305508A EP0077664B1 (en) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | Recombinant dna and coliform bacillus having genetic material for the production of staphylokinase, and the production of staphylokinase |
| DE8282305508T DE3280175D1 (de) | 1981-10-16 | 1982-10-15 | Rekombinante dns und coliformer bazillus genetisches material enthaltend zur herstellung von staphylokinase und die herstellung von staphylokinase. |
| JP2295382A JPH03198775A (ja) | 1981-10-16 | 1990-11-02 | スタフイロキナーゼの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP56164064A JPS5867181A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2295382A Division JPH03198775A (ja) | 1981-10-16 | 1990-11-02 | スタフイロキナーゼの製造法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS5867181A true JPS5867181A (ja) | 1983-04-21 |
| JPH0478276B2 JPH0478276B2 (ja) | 1992-12-10 |
Family
ID=15786090
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP56164064A Granted JPS5867181A (ja) | 1981-10-16 | 1981-10-16 | スタフイロキナーゼ産生遺伝情報を担うｄｎａ断片組み換え体ｄｎａおよびそれを導入した大腸菌 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4532211A (ja) |
| EP (1) | EP0077664B1 (ja) |
| JP (1) | JPS5867181A (ja) |
| KR (1) | KR910001807B1 (ja) |
| CA (1) | CA1206109A (ja) |
| DE (1) | DE3280175D1 (ja) |
| DK (1) | DK164001C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US4764469A (en) * | 1984-03-02 | 1988-08-16 | Board Of Regents For The University Of Oklahoma | Streptokinase-coding recombinant vectors |
| AU561372B2 (en) * | 1983-10-10 | 1987-05-07 | Board Of Regents Of The University Of Oklahoma, The | Streptokinase-coding recombinant vectors |
| US5066589A (en) * | 1984-03-02 | 1991-11-19 | Board Of Regents Of The University Of Okla. | Streptokinase-coding recombinant vectors |
| US5683909A (en) * | 1984-03-02 | 1997-11-04 | Van Den Bergh Foods Company, Division Of Conopco, Inc. | Plasmids replicatable in Bacillus subtilis, E. coli and lactic acid streptococcus bacteria |
| DE3578852D1 (de) * | 1984-09-26 | 1990-08-30 | Lilly Co Eli | Verfahren zur expression und sekretion in bacillus. |
| IT1176997B (it) * | 1984-10-17 | 1987-08-26 | Anic Spa | Procedimento per la produzione di proteasi neutra |
| EP0337817B2 (en) * | 1988-04-14 | 1998-12-16 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | Plasminogen activator and thrombolytic agent |
| AU669149B2 (en) * | 1991-12-30 | 1996-05-30 | Thromb-X N.V. | Expression signal-peptide-free staphylokinases |
| CN1035192C (zh) * | 1994-04-04 | 1997-06-18 | 上海医科大学 | 一种重组葡激酶的制备方法 |
| US5951980A (en) * | 1995-01-06 | 1999-09-14 | Leuven Research & Development Vzw | Identification, production and use of new staphylokinase derivatives with reduced immunogenicity |
| US6383483B1 (en) | 1995-01-06 | 2002-05-07 | Désiré José Collen | Staphylokinase derivatives with cysteine substitutions |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54107589A (en) * | 1978-02-09 | 1979-08-23 | Ajinomoto Co Inc | Separation and purification of staphylokinase |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4366246A (en) * | 1977-11-08 | 1982-12-28 | Genentech, Inc. | Method for microbial polypeptide expression |
-
1981
- 1981-10-16 JP JP56164064A patent/JPS5867181A/ja active Granted
-
1982
- 1982-10-12 KR KR8204582A patent/KR910001807B1/ko active
- 1982-10-15 CA CA000413486A patent/CA1206109A/en not_active Expired
- 1982-10-15 US US06/434,503 patent/US4532211A/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-10-15 EP EP82305508A patent/EP0077664B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1982-10-15 DK DK460182A patent/DK164001C/da active
- 1982-10-15 DE DE8282305508T patent/DE3280175D1/de not_active Expired - Lifetime
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS54107589A (en) * | 1978-02-09 | 1979-08-23 | Ajinomoto Co Inc | Separation and purification of staphylokinase |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CA1206109A (en) | 1986-06-17 |
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| KR910001807B1 (ko) | 1991-03-26 |
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| DK460182A (da) | 1983-04-17 |
| DK164001B (da) | 1992-04-27 |
| DE3280175D1 (de) | 1990-06-21 |
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