JPS62265983A - ヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子の微生物学的製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、微生物学的経路によるヒト酵素の製造、及び
その活性形態への転化に関する。

史に特定的には、本発明は、生体外遺伝子孫作技術によ
って、大腸菌（Ｅｓｃｂｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）の
如き微生物において“ヒトＡｌｊａプラスミノーデン活
デミ囚子″（ｈｕｍａｎ　ｔｉｓｓｕｅ　ｐｌａｓｍｉ
ｎｏｇｅｎ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（“ｔ−ＰＡ″）を
生産すること、及びこのようにして生産された酵素を、
化学的変性（ｄｅｒ＋ａＬｕｒｕｔｉｏｎ）及び再生（
ｒｅｎａＬｕｒａｔ　１ｏｎ）方法によりその活性形態
に転化する方法に関する。

先進国のヒト死亡率のおもな原因の１つは、クロット（
ｄｌｏｔｓ）の形成〔血栓症（ｔｌ＋ｒｏａ＋ｂｏｓｃ
ｓ）］による血管の閉塞である。咄乳乳動物の血漿にお
ける血餅（ｂｌｏｏｄ　ｃｌｏｔｓ）の合成及び分解に
は多数の酵素が参加する非常に精密に制御された機構が
関与する。クロット合或は出血の防止にとって必須のプ
ロセスである。出血が一度止まれば、正常な血液循環を
再び始めるために、クロットは分解されなければならな
い。主としてフィブリンから戊るクロットの分解は、普
通は、不活性前駆体であるプラスミノーゲンから誘導さ
れる強力なＭＪＩ素溶素性解性ｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ
）酵素であるプラスミンによって行なわれる。ｔ−ＰＡ
の８１能は、チモーゲン（プラスミ／−デミ）の限定タ
ンパク分解を行って活性酵素（プラスミン）を生成する
ことである〔ティ、アストラップ、（編＠）イー、ライ
ヒ、ディ、ビー、ＩＪ７キン及びイー、シャオ、“プロ
テアーゼ及び生物学的制御”、スプリングハーバ−ラボ
ラトリ−プレス、ニューヨーク、３４３頁以ド（１９’
／　５）　　Ｉ　’Ｉ’、八５ｔへｕｐ　　ｉｎ　Ｅ、
Ｉｔｅｉｃｈ、　　Ｄ、Ｂ。

ＲｉｆｋｉｎａｎｄＥ、Ｓｂａｗ（ｅｄ）、Ｐｒｏｔｅ
ａｓｅａｎｄＢｉｏｌｏＨｉｃａｌ　Ｃｏｎｔｒｏｌ、
　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ
ｌａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ、　ＮＹ、　ｐ、　３４３　ｅ
ｔ　ｓｅｑ　（１９’７５））；ノエー、ケー、クリス
マン及び共同研究者、（編者）ニー。

ノエ−６パレット＋　　ｌｌ＋ｌｉ乳動物の細胞及び、
ｌＬ織におけるプロテア−ゼ、　エルゼビール／／−ス
オランダ　バイオメディカルフ゛レス、二ニーヨーク、
９１真以下（１９７７）　（Ｊ、に、　Ｃｈｒｉｓｔｍ
ｎｎ　ｅｔｅｏｌｌ、　　ｉｏ　　＾、Ｊ、　　Ｂａｒ
ｒｅｔ　　（ｅｄ）＋　　Ｐｒｏｔｉｎａｓｅｓ　　ｉ
ｎ　　Ｍａｍ＋＋＋ｕｌｉａｎ　Ｃｅ１ｌｓ　ａｎｄ　
’ｒｉｓｓｕｅｓ＋　Ｅｌｓｅｖｉｅｒ／Ｎｏｒｔｈ　
Ｉｌ。

１１ａｎｄ　Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ　Ｐｒｅｓｓ、　Ｎ
Ｙ、　ｐ、６１　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９７７））；　イ
ー、ライヒ、（編者）７−ル、ディー。

バーリン、　エイチ、バーマン、ジエー、エイチ。

レボツ及びノエー、エム、タウイー、　生物学的５７解
プロセスの分子的基礎、　アカデミツクプレス、ニュー
ヨーク、１５５頁以ド（１９７８）（Ｅ。

Ｒｅ１ｃｈ　ｉｎ　Ｒ＋Ｄ、ｌ１ｅｒｌｉｒ＋＋　１１
．Ｉｌｅｒｍａｎ＋　Ｌ、Ｈ，Ｌｅｐｏｗ　ａｎｄＪ、
Ｍ、Ｔａｕｚｅｒ　（ｅｄ）ｙ　Ｍｏ１ｅｅｕｌａｒ　
Ｂａ５ｉｓ　ｏｆ　１３ｉｏ１ｏＦｌｉｃａｌ　Ｄｅｇ
ｒａｄａｔｉｖｅ　Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ＋　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ＋ＮＹ、　ｐ、　１５５　ｅｔ　ｓ
ｅｑ　（１９７８）ン；　テ゛４−、ニアＬ／ン、トロ
ンボシス　アンド　へモスタシス　４３．７７頁以下（
１９８０）　（Ｄ、Ｃｏ１１ｅｎ、　’ｒｈｒｏａ＋ｂ
ｏｓｉｓ１１ａｅｍｏｓＬａｓｉｓ　４３ｔ　）１．７
７ｅｔ　ｓｅａ　（１９８０））　Ｊ　。

血液、ヒト子宮、ブタ心臓及び腫腸細胞培文物の如き種
々のソースからのｔ　−ＰＡの単離は知られている〔ニ
ス、ニス、７サイン及び共同研究者、。

プロシーディング、オブ、ザ、ナシａナル、アカデミ−
、イブ。サイエンス、オプ、ザ、ニー。

ニス、ニー、　Ｌｌ、４２６４頁以ド（１９８１）（Ｓ
、Ｓ、ｌ１ｕｓａｉｎ　ｅｔ　ｃｏｌｔ、＋　Ｐｒｏｃ
、Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓａｉ。

ＵＳＡ″７Ｌ　ｐ、　４２６４　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９
８１））：　　ディー、シー、シーケン及び共同研究者
６．バイオヒミカ。

工、バイオフイノカ、アクタ、５８０，１４０頁以下（
１’］　７９　）　（Ｄ、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ　ｃ
ｏｌｌ、、　Ｂｉｏｃｌ＋ｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、＾
ｅｔａ　５８０ｔ　ｐ、　１４０　ｅｔ　ｓｅｑ　（１
９７９））；イー、７−ル、コール及びエフ、グブリエ
、バシハマン、ジャーナル、イブ。バイオロジカル、ケ
ミストリー、２５２．３７２９頁以下（１９７７）（Ｅ
、ｌ（、Ｃｏ１ｅ　ａｎｄ　ＦＪ、ｌｌａｅｈｍａｎ、
　Ｊ、旧ｏｆ、　Ｃｈｃ＋＊、　２５２９　ｐ、　３７
２９　ｅｔ　、ｓｅｑ　（１９７７））：ディー、シー
、シーケン及びテ゛イー、コレン、ジャーナル、オブ。

バイオロジカル。ケミストリー、２５６．７０３５頁以
下（１９８１）　（Ｄ、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ　ａｎｄ　Ｄ
、Ｃｏ１１ｅｎ＋Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｓ、２５６
．　ｐ、７０３５　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８１））］　
。

ｔ−ＰＡは他のブラスミノーデミ活性化因子であるウロ
キナーゼと比較された：それはその活性の増加をもたら
す、フィブリンに対する商い親和性と共に、異なる免疫
学的性質を有している（ディー、シー、シーケン及び共
同研究者、、ジャーナル。

イブ。バイオロジカル、ケミストリー、２５７．２９２
０頁以下（１９８２）（υ、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ　　ｅｔ
ｃｏｌｌｌ　）、　　Ｄｉａｌ、　Ｃ）ｔｅｆｆｌ、　
　ζ５７．　　ｐ、　　２９２０　　ｅｔ　　５ｅｔ２
　　（１９８２））；エム、ランバイ及び共同研究者、
、トロンボ、リサーチ、２７，１７５頁以ド（１９８２
）（Ｍ、１ｌａｎｂｙ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、＋　Ｔｂｒｏ
ｍｂ、　１（ｅｓ、　２７．　ｐ、　１７５ｅｔ　ｓｅ
ｑ　（１９８２）］　、　ｔ　−Ｐ　Ａのこれらの性質
は、それに相当な治療学的利点を付与する６例数ならば
、フイブリノーゲンの一般的溶解（ｇｅｎｅｒａｌＩｙ
ｓｉｓ）は起こりそうもなくそして出血の危険は限定さ
れるからである。

ｔ　−ＰＡを生産する多数の天然の細胞株が１−ＰＡの
人手経路として文献に記載されている〔ディー、シー、
シーケン及びディー、コレン、オプ。

シ　ト　、　　（Ｄ、Ｃ，Ｒｉｊｋｅｎ　　ａｎｄ　　
ｌ）、Ｃｏ１１ｅｎ＋　　ｏｐ、　　ｃｉＬ、）；エフ
、エル、ウィルソン及び共同研究者、、カンサー、リサ
ーチ６土１．９３３頁以下（１９８０）（Ｆ、Ｌ、１１
ｉ１ｓｏｎ　ｅｔ　ｃｏｉｌ、、　Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅ
ｓ、４０　ｔ　ｏｐ。

ｃｉｔ、Ｌ　エム、プロノウ及びアール、ブリーム、ト
レンズ　バイオチク、１，２６頁以下（１９８３）　（
Ｍ、にｒｏｎｏｗ　ａｎｄ　Ｒ１［１ｌｉｅ＋ｍ、　ｌ
’ｒｅｎｄｓ　Ｂｉｏｔｃｃｈ、　１゜ｐ、２６　ｅｔ
　ｓｅｑ　（１９８３））”、ディ、ペターライン及び
共同研究者、、クヤーナル、オブ、バイオロジカル、ケ
ミストリー、２５５．３６６５頁以下（１９８０）　（
Ｄ、ＶｅｔＬｅｒｌｅｉｎ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、＋　Ｊ、
　Ｂｉｏｌ、　ＣＩ＋ｅ麺、亜旦、　ｐ、　３８６５　
ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８０））：ダブリュ、ベイマー及
び共同研究者、Ｉザ、ランセット、Ｌ、１０１８頁以下
（１９８１）　（ＬＷｅｉｍｅｒ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、。

’ｒｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ　２．　ｐ、　１０１８　ｅｔ
　ｓｅｑ　（１９８１＞）が、これらのどれも潜在的世
界市場の要求を満足させることができるｔ　−ＰＡ生産
のレベルに至らなかった。更に、これらの天然ソースの
内設も高い生産性の細胞株は腫瘍起源のものである。

生体外遺伝子組換え技術は、微生物、例えば、バクテリ
ア大ＩＩ４＆菌（ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　Ｅｓｃｂｅｒ
ｉｃｈｉｕ　ｃｏｌｉ）によって、タンパク質又はポリ
ペプチドの合成を付う可能性及び理論的には、無制限の
量でこれを行うｑ相性を与える〔例えば、エフ、プロ及
び共同研究者、、シ７ンセ、デ、う、ビー、工、ソシエ
テ、ドキュメンタシオン　７ランセーズ　出版。

１９７９　（Ｆ、Ｇｒｏｓ　ｅＬ　ｃｏｌｌ、　５ｃｉ
ｅｎｃｅ　ｄｅ　Ｉａ　ｖｉｅｅｔＳｏｃｉｅｔｅ＋Ｄ
ｏｃｕｍｅｎｔａｔｉｏｎＦｒａｎｃａｉｓｅｐｕｂ１
．１９７９）１゜ エフ、ヤニ＋ブ及び’）ｓ−、モ／ド（Ｆ、Ｊａｃｏｂ
　ａｎｄＪ、Ｎｏｎｏｃｌ）の古典的実験から、ＤＮＡ
は、いわゆる″構造”遺伝子、即ち、所定のタンパク質
をコードしている遺伝子の組と、いわゆるｍ　＊　”　
遺伝子、即ち、ｖｔ造遺伝子の発現を制御することがで
きる遺伝子と含有しており、これら２つの型の組み合わ
せによって“オペロン”として知られている統一体（ｅ
ｎｔｉｔｙ）を形成していることが知られている。

分子生物学の研究及びＤＮＡ配列決定法（１）Ｎ＾ｓｅ
ｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）の発展（エ
フ、サンガー及ヒニー、アール、クールンン、ツヤ−ナ
ル、オア。モレキュラー、バイオロノー、９４．４４１
頁以下（１９７５）　（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ　ａｎｄ＾、
ｌ（、Ｃｏｕｌｓｏｎ＋Ｊ、Ｍｏｌ、Ｂｉｏｌ、　　９
４ｗ　　ｐ、　　４４１　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９７５）
）；　　ニー。

エム、マクサム及びグブリュ、ギルバート、プロシーデ
ィング、イブ、ザ、ナショナル、アカデミ−、イブ。サ
イエンス、イブ、ザ、ニー、ニス。

ニー、Ｌ支、５６０頁以下（１９７７）（＾、Ｈ０Ｍａ
ｘａｍ　ａｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ＋　Ｐｒｏｃ、　
Ｎａ１１．＾ｅａｄ、　Ｓｃｉ。

（ＵＳＡ）　７４．　ｐ、　５６０　ｅｔ　ｓｅｑ　（
１９７７））］は、エフ。

ヤコブ及び７エー、モ／ドの最初の概念に一致したオヘ
ロンの構Ｊ＆（ｏｒｇｕｎｉｚａｔｉｏｎ）の詳細な説
明を与えること〔エフ、ヤコブ及び）ニー、モノド、コ
ールド　スプリング　ハーバ−シンポジウム。

フォント。パイオル、４彰、１９３頁以下（１９６１）
　（Ｆ、Ｊａｃｏｂ　ａｎｄ　Ｊ、Ｍｏｎｏｄ、　Ｃｏ
１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１ｌａｒｂｏｒ　　Ｓｙｍｐ、　
　ＱｕａｎＬ、　　１ｌｉｏ１．　２１Ｌ　　ｐ、　　
１９３　　ｅｔ　　ｓｅｑ　　（１９Ｂ１））；　　エ
フ、ヤコブ及びジェー、モノド、ツヤ−ナル、イブ。モ
レキュラー、バイオロノー、Ｌ１３１８頁以下（１９６
１）　（Ｆ、Ｊａｃｏｂ　ａｎｄ　Ｊ　、Ｍｏｎ。

ｄ、　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、３＊　ｐ、　３１８
　ｅｔ　ｓｅａ　（１９６１）］及び２つの型の遺伝子
の一次構造の個々の特性を同定することを可能とした。

かくして、構造遺伝子は、“翻訳開始”コドン（ＡＴＧ
）及び“終結”コドンにより枠決めされる（ｔ’ｒａＩ
ＩＩｅｄ）。開始コドンの役割は、ホルミルメチオニン
を有する開始転位ＲＮ　Ａ　（ｉｎｉｔｉａｔｏｒ　ｔ
ｒａｎｓｆｅｒＨＮ＾）を固定することである。タンパ
ク質類は、構造遺伝子によりコードされたアミノ酸の引
き続く結合によってこのホルミルメチオニンから延長さ
れ、そして“終結”コドンは新たに形成されたタンパク
質の伸長を最後に停止させそしてｙ！Ｌｍさせる。

調節遺伝子（プロモーター、リプレッサー）に関する限
り、これらが、例えば、ＲＮＡポリメラーゼが結合する
ＤＮＡ７ラグメントの如きプロモーターを定義する場合
には、最も保存されたＤＮＡ塩基配列（ｍｏｓｔ　ｃｏ
ｎ！３ｅｒｖｅｄ　ＤＮＡ　５ｅｑｕｅｎｃｅｓ）を同
定することが可能となり、同様に、リボソーム結合部位
（ＲＢ　Ｓ　）の最も保存されたＤＮＡを定義すること
が可能となった〔ノエー、シャイン及びエル、グルガル
ノ、ネイチャー　２５４．３４真以下（１９７５）　（
Ｊ、５ｈｉｎｅ　ａｎｄ　Ｌ、Ｄａｌｌ（ａｒｎｏ、　
Ｎａｔｕｒｅ　２５４＋　ｐ、　３４　ｅｔ　ｓｅｑ　
（１９７５）］　、　　リボソーム結合部位は伝令ＲＮ
Ａのタンパク質への翻訳において役割を演する部位であ
る。

故に、バクテリアの調節遺伝子はそれらの機能的性質及
び−次配列（ｐｒｉｍａｒｙ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ）に
より定義することができ、そして生体外遺伝子組換え技
術において、構造遺伝子をそれらの制御下に置くのにこ
れが利用され、これは特定の息でＤＮＡを切断する“制
限酵素゛の存在によって可能となる〔　エイチ、オー、
スミス及びケイ、グプリュ。

ウィルコックス、ジャーナル、オプ、モレキュラー、バ
イオロジー、５１，３７９頁以下（１９７０）　　（１
１，ｏ、５ｍ１Ｌｈ　ａｎｄ　Ｋ、Ｗ、Ｗｉｌｃｏｘ、
　　ｊ、　　Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、５１、ｐ、　３’７９
　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９’７０））：　Ｘ−ム、メセル
ソン。

及びアール、ユアン、ネイチャー　２１７．１１０頁以
下（１９Ｇ　８　）　（Ｍ、Ｍｅｓｅｌｓｏｎ　ａｎｄ
　Ｒ，Ｙｕａｎ。

Ｎａｔｕｒｅ　２１Ｌ　ｐ、　１１１０　ｅｔ　ｓｅｑ
　（１９６８）；　アール。

ノエー、ロバート、核酸研究、１，１３５頁以下（１９
８２）　（Ｈ，Ｊ、１ｌｏｂｃｒｔｓ、　Ｎｕｃｌｅｉ
ｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ。

１、　ｐ、１３５　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８２）Ｊ　。

利用される技術は、所定の点で１）ＮＡを切断するため
のこれらの酵素及び７ラグメントを相互にスプライする
ためのいわゆる“す〃−ゼ゛を協奏的に使用する（ビー
、イー、ロバン及びニー、ディ、カイザー、ツヤ−ナル
、イブ。モレキュラー。

バイオロノー、７８，４５３頁以下（１９７３）（Ｐ、
Ｅ、Ｌｏｂａｎ　ａｎｄ　Ｋａｉｓｅｒ＋　Ｊ、Ｍｏ１
．Ｂｉｏｌ、　７Ｌ　ｐ、　４５３　ｅｔ　ｓｅｑ　（
１９７３）］　、全体は、既知の方法を使用して大腸［
１（ＥＬｃｏｌｉ）の如きバクテリアに導入することが
できそして宿主バクテリアの増抽期間宿主内に保存され
うる“ベクター”（プフスミド又はバクテリオファー）
）により運ばれる〔エム、マンデル及びニー、ヒ〃、ツ
ヤ−ナル、イブ。モレキュラー、バイオロジー、１影、
１５４Ｑ以下（１９７０）　　（Ｍ、Ｍａｎｄｅｌ　　
ａｎｄ　　＾、ＩＩｉｇａ＋　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　
ロｉｏ１゜餞、　ｐ、　１５４　ａｔ　ｓｅｑ　（１９
７０）］。

大腸萌におけるヒト組織プラスミノーゲン活性化囚子遺
伝子の低レベル発現は、ディ、ペニカ及び共同研究者、
、ネイチャー　３０１．２１４頁以−）’（１９８３）
　（Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ｃｏｌｔ、、　Ｎａｔ
ｕｒｅ　３Ｏｆ、　ｐ、　２１４　ｅｔ　ｓｅｑ　（１
９８３））により既に記＠されている。使用される発現
シグナルによって、１−ＰＡは培養物１１当たり且つ光
学密度１単位当たり５０−８０マイクログラムに相当す
るレベルで生産される。

本発明は、ディ、ベニ力及び共同研究者により記載され
たレベルよりも約１５０倍も高いレベルで、大腸菌にお
けるヒト組織プラスミ／−デミ活性化因子遺伝子の発現
を可能とする方法を提供する。

本発明の方法は、λバクテリオ、７アーノのＰＬプロモ
ーター及び大腸菌（Ｅ、ｃｏｌｉ）のトリプトフアンオ
ペロンのｔｒｐＰプロモーターから選ばれたプロモータ
ーと、転写終結配列（ｔｒａｎｓｃｒｉｐＬｉｏｎｔｅ
ｒＩＩＩｉｎａｌ　　５ｅｑｕｅｎｃｅ）ｔ　Ｒ１を持
っているか又は持っていないλバクテリオ７Ｔ−ノ遺伝
子ｃ［のリボソーム結合部位と、５′にＡＴＧ開始コド
ンを含有するヒトＬＰＡ遺伝子と、所望により、バクテ
リオファーノ゛１’　７のプレコシアスＩｆｆ城（ｐｒ
ｅｃ。

ｃｉｏｕｓ　ｒｅｇｉｏｎ）の終結部位（ｔｅｒｍｉｎ
ａｌ　　５ｉｔｅ）とを含有するプラスミドの、安定な
保存を確保することができるバクテリアを培養すること
を含む。

本発明は、最初にヒト組線ブフスミノーデミ活性化因子
を微生物により生産させ、次いで女性及び再生により線
雑索溶Ｍ、活性を有する活性形態に転化することを含む
方法も提供する。

本発明の方法においては、１Ｍ１始コドンのそばにヒト
ｔＰＡｆｊ造遺伝子全遺伝子ている構造を生成し、この
ようにして改変された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）補遺遺伝子
を誘導可能なプロモーター（ｉｎｄｕｅｉｂｌｅ　ｐｒ
ｏｍ。

ｔｏｒ）にスプライシングする。

改変された遺伝子を含有する大腸ｍの如き宿主バクテリ
アは、特定の条件ドの誘導の後歯レベル（約細胞タンパ
ク質の５％）でｔＰＡを上肢する。

以ドの説明において、分子生物学で使用される技術用語
の意味は公知であるものとみなす〔例えば、ノヱイ、ワ
トソンによる“遺伝子の分子生物学”、フランス版、イ
ンターエディシラン　１９７８（“ｌｌｉｏｌｏｇｉｅ
　Ｍｏ１ｒｃｕｌａｉｒｅ　ｄｅ　Ｇｅｎｅ”、ｂｙ　
Ｊ、ＷａＬｓｏｎ、　Ｆｒｅｎｃｈ　Ｅｄｉｔｉｏｎ、
　Ｉｎｔｅｒｅｄｉｔｉｏｎｓ　１９７８）参照１以下
の説明は、引き続いて、ＬＰＡＪ伝子の楕築及び発現方
法及びこのようにして生成されたｔＰＡの活性形態に変
性及び再生する方法を説明するであろう。

ヒト組織プラスミ／−デミ活性化因子の特異的伝令１（
ＮＡの調製のために“ボウニス”メラノーマ細胞株（“
１ｌｏｕｉｅｓ”　ｍｅｌａｎｏｍａ　ｃｅｌｌ　５ｔ
ｒａｉｎ）　Ｃディ。

シー、シーケン及びディ、コレン、ツヤ−ナル。

イブ。バイオロジカル、ケミストリー、２５６．７Ｏ３
Ｓ頁以下（１９８１）　（Ｄ、Ｃ，１ｔｉｊｋｅｎ　ａ
ｎｄ　Ｄ。

Ｃｏ１１ｅｎ、　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２５６
．　ｐ、７０３５　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８１＞）Ｉ　
を使用した。

伝令ＲＮ　Ａは、“尿素−ＬｉＣｌ”法を使用して、ウ
シ胎児血清の存在下に、グルベツフ（Ｄｕｌｂｅｅｅｏ
）により変成されたイーグル培地（Ｅａｇｌｅ　ｍｅｄ
ｉｕＩｌｌ）で単一／１として培養されたボウニス細胞
から調製された〔シー、アラフレイ及び協同研究者、Ｉ
核酸研究、８．２：３１頁以ド（１９８０）（Ｃ，＾ｕ
ｊゴ「ａｙｅむｃａｌｌ、、　　Ｎｕｃｌ、＾Ｃ１ｄｓ
　Ｈｅｓ、　　Ｌ　　ｐ、　　２３１　ｅｔ　！１ｅｑ
　（１９８０））］。調製物は、エイチ、アビブ及びビ
ー、レグ−（１１，八ｖｉｖ　ａｎｄ　Ｐ、　Ｌｅｄｅ
ｒ）ｌこより記載された方法に従って、オリゴ（ｄ゛１
”）−セルロースカラムによる数サイクルの７フイニテ
イークロマトグラフイーによって伝令ＲＮ　Ａ　ｌ：富
んでいた〔プロシーディング、イブ、ザ、ナシ３ナル、
アカデミ−、イブ。サイエンス、オプ、す、ニー、ニス
。

ニー、６９．１４０８ｆ’を以下（１９７２）　（Ｐｒ
ｏｃ。

Ｎａｔｌ、　　Ａｃｕｄ、　　Ｓｃｉ、　　（ＵＳ＾）
　６９＋　　ｐ、　　１４０８　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９
７２））］。

ヒト岨維ブラスミノーデミ活性化因子にｖｊ異的な伝令
ＲＮ　Ａの調製は、“／ザン”ハイブリ・７ド形成法（
Ｎｏｒｔｈｅｒｎ″ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｔｅ
ｃｈｎｉｑｕｅ）により制御した〔ビー、ニス、トーツ
ス、プロシーディング、イブ、ザ、ナショナル、アカデ
ミ−。

イブ。サイエンス、イブ、ザ、ニー、ニス、ニー。

１コニ４−１　　ｓ　　２　０　１　　ｔＬ　　以−ト
　（１９８０）　　　（Ｐ、Ｓ、ｉ’ｈｏｍａｑ。

ｌ”ｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃｕｄ、　　Ｓｃｉ、　
　（ＩＪｓ八）　　７Ｌ　　ｐ、　５２０１　　ｅＬｓ
ｅｑ　（１９８０）））　−この目的に対して、テ゛−
６べ二カ及び協同研究者、、ネイチャー、３０１．２１
４頁以下（１９８３）　（Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　
ｃｏｌｔ、　Ｎａｔｕｒｅ可、　ｐ、　２１４　ｅｔ　
ｓｅｑ　（１９８３））により公表された配列に従うア
ミノｆｇｔ１１−１７をフードする合成オリゴヌクレオ
チドを利用した。バンドの放射性を測定した後、ヒト組
繊プラスミノーゲン活性化因子に特異的なＲＮＡの濃度
は全ＲＮＡの０．０３％を示すことが、計算により決定
された。

このようにしてｙ′４製された伝令ＲＮＡを、ニー。

エフ、ストラチ７ノス及び協同研究者、、ジャーナル、
イブ。バイオロジカル、ケミストリー、７゜２７９頁以
下（１９７（ｉ＞（＾、Ｅｆｓｔｒａｔｉａｄｉｓ　ｅ
ｔ　ｃｏｌｌ、＋　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｌｌｌ、Ｌ
　ｐ、２７９　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９７６））及びエム
、ビー、ウイッケンス及び１Δ同研究者、いツヤ−ナル
、オプ、バイオロノカル、ケミストリー、２５３．２４
８３頁以下（１９７８）　（Ｍ、Ｐ、ｌ＋１ｉｃｋｅｒ
＋ｓ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、＋　　Ｊ、　　Ｂｉｏｌ、　　
Ｃｈｅｗ、　　２５Ｌ　　ｐ、　　２４８３ｅｔ　ｓｅ
ｑ　（１！＋１７８））により記載された方法を使用し
て、生体外で相補的ＤＮＡ（ｃ　ＤＮＡ）を合成するの
に使用する。

使用されるｃ　ＤＮＡリーダー（ｃＤＮＡ　Ｌｅａｄｅ
ｒ）は、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子のアミノ
酸５１１−５２７に特異的なオリゴヌクレオチド〔デー
、ベニ力及び協同研究者１．ネイチャー。

３０１．２１４Ｗ以下（１９８３）　（Ｄ、Ｐｅｎ旧ｃ
ａｅｔ　ｃｏｌｌ、、　Ｎａｔｕｒｅ　３０上ｔ　ｐ、
２１４　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８３））により公表され
た配列に従い１及びオリゴ−（ｄ′１゛）である。

ヌクレアーゼＳ１によるｃ　ＤＮＡのンＹＩ化（ｄｉｃ
ｅｓＬｉｏｎ）（：工−１工７ストラチアノス及び協同
研死者、、ツヤ−ナル、イブ、バイオロノカル、ケミス
トリー、Ｌ、２７９頁以下（１９７６）（＾、Ｅｆｓｔ
ｒａｔｉａｄｉｓ　ｅｔ　ｅｏｌｌ、ｔ　Ｊ、　１ｌｉ
ｏ１．ｃｈｅｍ、７．　ｐ、　２７９　ｅＬｓｅｑ　（
１９７６））Ｊの後、ティ、マニアチス及び協同研究者
１．セル、Ｙ影、６８７真以ド（１９７Ｂ）（１°、Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、、　Ｃｅ１ｌ　１５
ｗ　ｐ、　６８７　ｅｔ　５ｅｑ（１９７８））により
記載された方法を使用して、潜在的に存在する部位をメ
チル化する。

ＥｃｏＲ１アゲブタ−の添加の後、このようにして修飾
されたｃ　ＤＮＡを、ＥｃｏＲ１制限酵素で消化し、次
いで入−ｇｔｌＯベクターのＥｅ。

Ｒ１部位に挿入する〔ティ、ブイ、ヒュイヌ及び協同研
究者、、ＤＮＡクローニング、ディ、エム。

グローバー、ＩＲＬブレス出版、、４９真以下（１９８
５）　（Ｔ、Ｖ、Ｇｌｏｖｅｒ、　Ｉｔ（Ｌ　Ｐｒｅｓ
ｓ　ｐｕｂｌｌｐ、’　４９ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８５
））　］　−約２１３．０００のクローンのライブラリ
ー（７ラグメントから成るユニット）が０．６マイクａ
グラムの二本１ｃＤＮＡから確立される。

ヒト組織プフスミノーデミ活性化因子遺伝子を担ってい
るクローンのサーチは、３つのオリゴヌクレオチドプロ
ーブにより行う。これらの３つのプローブの配列〔デー
、ベニ力及び協同研究者、。

ネイチャー、３０１．２１４真以下（１９８３）（Ｄ、
Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、　Ｎａｔｕｒｅ　３
０１＋　ｐ、　２１４　ｅｔｓｅｑ　（１９８３））］
は下記の特異性に相当するニブローブ　　　フードされ
たアミノ酸 ３　　　　　　　　５１１−５２°７ ニトロセルロースフイルター上に移されるブロン）　（
ｂｌｏｔｓＪに対するこれらのプローブのハイブリッｒ
形成〔ティ、マニアチス及び協同研究者、１分子クロー
ニング、コールドスプリングハーバ−ラボラトリ−１３
０９頁以下（１９８２）　（Ｌ、Ｍａｎｉａｔｉｓ　ｅ
ｔ　ｃｏｌｌ、、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　ＣＬｏｎｉｎ
ｇ、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌｕｒｂｏｒ　Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ＋　ｐ、　３０９　ｃｔ　ｓｅｑ　（１
９８２））］によって、ヒト組繊プラスミノーデデミ性
化因子をコードしている可能性のある幾つかのクローン
を、！１１離する。

制限酵素分析（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ａｎｌｙｓｅ
ｓ）は、一般的構造が１１図に示されている遺伝子の全
体をコードしているｃ　ＤＮＡクローンで終わることを
可能とする。

単ａされたクローンの確実性を確かめるために、上記遺
伝子のヌクレオチド配列を決定する。Ｅｃｏ　Ｒ１−Ｅ
ｅ　ｏ　Ｒ１挿入７ラグメントの配列は、ニー、マクサ
ム及びダプリュ、ギルバート（＾、　ＭａｘａＩＩｌａ
ｎｄ　Ｗ、Ｇ１１ｂｅｒｔ）　（プロシーディング、オ
ブ。

ザ、ナショナル、アカデミ−、イブ。サイエンス。

イブ、ザ、ニー、ニス、ニー、Ｌ支、５６０頁以下（１
９７７）　（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、Ｓｃｉ、
　（ＵＳＡ）υ−，ＩＬ　５６０　ｅｔ　ｓｅｑ　（１
９７７））　］　により記載された部分的化学分解法及
１エフ、サングー及びニー。

アール、クールリン、ジャーナル、イブ８モレキユラー
、バイオロジー、１支、４４１頁以下（１９７５）　　
（Ｆ、Ｓａｎｇｅｒ　　ａｎｄ　　八、Ｒ，Ｃｏｕｌｓ
ｏｎｔ　　Ｊ、　　Ｍｏ１．　　Ｂｉ。

１、　！１４．　ｐ、　４４１　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９
７５））により記＠された“ジデオキシ”法を使用して
決定される。

これらの２つの方法を使用して得られる配列は、第２図
に示されている。コードしている部分は、ディ、ベニ力
及び協同研究者により公表された配列との差がないこと
を示す。しかしながら、非コード領域（ｎｏｎｃｏｄｉ
ｎｇ　ｒｅｇｉｏｎ）には差が見出だされるが、これら
は大腸ガでのヒト組繊プラスミノーゲン活性化因子遺伝
子の異種発現（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓｅｘｐｒｅｓ
ｓｉｏｎ）に関係しない。

デー、ベニ力及び協同研究者、、ネイチャー、１丈１．
２１４頁以下（１９８３）　（Ｄ、Ｐｅｎｎ１ｃａ　ｅ
ｌ：ｃｏｌｌ、＋　Ｎａｔｕｒｅ　３０１＋　ｐ、　２
１４　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８３））に従う翻訳生成物
はｔｊＳ３図に示されている。

１）発現シグナルの単離（ｔ５４図） 本発明に記載された発現シグナルは： １）ＮＡの伝令ＲＮＡへの有効な転与を可能とするλバ
クテリオフアーノＰＬレフトプロモーター（Ｌａｍｂｄ
ａ　　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｔ＋ａｇｅ　　ＰＩ　Ｌｅｆ
ｔ　　ｐｒｏｍｏｔｅｒ）及び 伝令ＲＮＡの有効な転写を可能とするλバクテリオファ
ージａｌｌ遺伝子すポソーム結合部位（Ｌａｍｂｄａ　
　ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ　　ｃ［ｇｅｎｅ　　ｒ
ｉｂｏｓｏｍｅ　　ｂｉｎｄｉＢ　　５ｉｔｅ）である
。

λバクテリオファージ“ＰＬ”プロモーターは、Ｂｇ　
Ｌ１１部位とＢａｍＨＩＤ位の間のバクテリオファージ
染色体上に位置しており〔イー、スチバルスキー及びダ
ブリュ、スチバルスキー、ノエネ。

Ｌ、２ｉ’ｒ真以ド（１９８２）　　（Ｅ、５ｚｙｂａ
ｌｓｋｉ　　ａｎｄＪＳｚｙｂａｌｓｋｉ＋　Ｇｅｎｅ
″７　ｐ、　２１７　ｅｔ　ｓｅｑ＜１９７９）Ｎ、そ
のヌクレオチド配列は知られている〔エフ、サン〃−及
び協同研究者、、ツヤ−ナル、イブ。モレキュラー、バ
イオロジー、１６２．２′１９真以下（１９８２）　（
Ｆ、５ａｎＨｅｒ　ｃｔ　ｃｏｌｔ、＋　Ｊ、　Ｍｏｌ
、　ｌ１ｉｏｌ。

Ｕ銘工＋　ｐ、　２７９　ｅｔ　ｓｅａ　（１９８２）
月。この７ラグメントはクローニングすることができ、
そしてその制限部位は公知の方法を使用して修飾するこ
とができる。

ＰＬを担っているプラスミドは、このプロモーターが構
成的に（ｃｏｎｓｔｉｔｕＬｉｖｅ　　＋５ａｎｎｅｒ
）発現されるのを回避するために、リプレッ°サー遺伝
子ｃｌを担っている大腸菌の菌株において増殖させる必
要があることに留意されたい。

ｆ５１の構造ｔこおいては、Ｐ　はｐＰＬ−人”（“ｐ
　Ｐ　Ｌ−Ｌ　ｎｖａｂｄｕ”）プラスミドからのＢａ
ｍＨＩ７ラグメントの形態で入手可能である〔７アーマ
シア　ピー、エル、バイオケミカルス（Ｐｂａｒｍａｃ
ｉａｌｌ、１１．ｌｌｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）Ｊ　、
このプラスミドから、ＰＬを含有するＩ（ａｅＬ■−Ｈ
ａ　ｅ　Ｌｌｌ　７ラグメントを単離しそしてこの７ラ
グメントを“ｐＵｃ８″のＳｍａ１部位に挿入して［）
ニー、ベイラ及びノエー、メシング、ジェネ　７９．２
５０１以下（１９８２）　（Ｊ、Ｖｅｉｒａ　ａｎｄ　
Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｇｅｎｅυ−、ｐ、２５０　ｅ
ｔ　ｓｅｑ　（１９８２））　Ｊ　、ｐＵＣ８−ＰＬ″
を得ることが可能である。

上記プロモーター配列は多くの制限部位の各側に配置さ
れているので、このプロモーターを持っている７ラグメ
ントは切り出したり、他の１）ＮＡ７ラグメントと適当
に組み合わせることができる。

例えば、ｐＵＣ８−ＰＬ″のＢａ１ＩＩＨ１＆ｌＳ位を
酵素Ｓｌ（ポーリンＷ−（Ｂｏｅｈｒ　ｉ　ｎｇｅｒ　
）　Ｊ　により分解した後、ＰＬプロモーターを含有す
るＥｃ。

Ｒ１−１−１ｉ　ｎ　ｄ　Ｉｌ［７ラグメントを単離し
、次いでこの７ラグメントを“ｐＤｓ２０″プラスミド
の大きい方のＥｃｏ　Ｒ［−Ｈｉ　ｎｄ　ｌｌ［７ラグ
メントとスプライシングして〔シー、デュエスター及び
協同研究者、、セル　３０．８５５頁以下（１９８２）
　（Ｇ、Ｄｕｅｓｔｅｒ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、＋　Ｃｅ１
ｌ　３０＋　ｐ、　ｅｔ　５ｅｑ（１９８２）Ｎ　、プ
ラスミド”ＬＩＸＬ７３″を得ることができる。

配列及び開始部位が知られているλバクテリオファージ
遺伝子ａｌｌは有効に翻訳されることがでさる〔イー、
シュバルツ及び協同研究者、ネイチャー２７２．４１０
ｔｘ以下（１９７８）　（Ｅ、Ｓｃｈｗａｒｚｅｔ　ｃ
ｏｌｌ、、ＮａＬｕｒｅ　２７２＋　ｐ、　４１０　ｅ
Ｌ　ｓｅｑ　（１９７８））］　。

この遺伝子のＲｆ３Ｓ（リボソーム結合部位又はリボソ
ーム固定部位）は、発現系”、ＰＬプロモーター−ｃ　
ＩＩＲＢｓ−ＡＴＧ−制限部位”を含有するプラスミド
を構築するのに使用される。遺伝子ＣＩＩＲＢＳは、“
ｐｐｓｌ”プラスミドから取り出される〔ビー、サルミ
エントス及びｔＩＪＩ同研究者、。

セル　３２．１３３７頁以下（１９８３）　（Ｐ、Ｓａ
ｒｍｉｅｎｔｏｓ　ｅｔ　ｅｏｌｌ、、　Ｃｅ１ｌ　３
２＋　ｐ、　１３３７　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８：Ｊ）
Ｌｌ　、このプラスミドはＮｄｅｌで消化され、そして
ＢａｎＨＩアダプターがプラント末１（ｂｌｕｎｔ　ｅ
ｎｄｓ）を形成した後挿入される０次いでＲＢＳはＨｉ
　ｎｄ　ｉｌｌ−Ｈａｍ　ＨＩフフグメントの形態で切
り出される。

次いで、このＨｉ　ｎ　ｄ　ｌ［１−Ｂａ　ｍ　Ｈｌ　
７ラグメントが″ｐＸＬ７３″プラスミドの大きい方の
■４ｉ　ｎｄ　ｉｌｌ−Ｂａｍ　Ｈ１７ラグメントとス
プライシングされている“ｐＸＬ８８″プラスミドを形
成する。新たなプラスミド″ｐＸＬ８８”において、ｃ
　［［ＲＢＳはＰ　Ｉ−プロモーターに対して正しい方
位（ｃｏｒｒｅｃＬ　ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に挿入
されており、全体はアッセンブリーＰ　ｔ　−ｃ　ｕ　
ＲＢ　ｂが１本のＤＮＡ７ラグメント上に担われるよう
に多虫部位系（ｍｕｌｔｉｓｉｔｃ　５ｙｓｔｅＩ１１
）においてである。

２）Ｌ　−ＰＡ”　ｃ　ＤＮＡ’遺伝子と発現シグナル
との融合（第５図） ｔ　−ＰＡ遺伝子のフードされている部分の配列が決定
された後、成ｆｉｔ　−ＰＡ（ｍａｔｕｒｅ　　ｔ　　
ＰＡ）の最初の７個のアミノ酸（ｆｉｒｓＬ７　　ａｍ
ｉｎｏ　　ａｃｉｄｓ）ヲコードしている２つの相補的
合成オリゴヌクレオチドを調製する（第３図、位置１４
０がら位置１６０まで）、この短い合成りＮＡのフラグ
メントは、それがＮｄｅ　Ｉ−Ｂａｍ　１（１７’２グ
／ント、例えば、 ５　　′　１’八’ｌ’［ＴＣＴＴＡＣＣ八ＡＧ’ｒＧ
へＴＣＴＧ（：ＡＧ八　　　　　　　　　　　　′３　
　’　　　　ＡＣＡＣ：ＡＡＴＧ［；ＴＴＣＡＣＴＡＧ
ＡＣＣＴＣＴＣ’ｒ八Ｃ５’としてりへ−ニングされる
ことができるように作ることができる。

このＮｄ　ｅ　ｌ−Ｂａ　ｍ　ＨＩ　７ラグメントは下
記のＤＮＡ７ラグメントとスプライシングされる：ａ　
）　Ｐ　Ｌプロモーターとｃｌ遺伝子翻訳開始部位（■
ｚＢＳ）を持っている″ｐＸＬ８８″′プラスミドのＥ
ｃｏ　Ｒ［−Ｎｄｅ　　１７ラグメント；ｂ）抗生物ｆ
ｆ耐性遺伝子と、複！！！開始部位と、β−〃ラクトシ
トーゼ遺伝子の３′末端を持っている、プラスミド“ｐ
Ｍｃ１４０３”のＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨＩフラグメント
〔エム、ジエー、カサグバン及び協同研究者、、ツヤ−
ナル、オプ、バクテリオコノ−３１４３，９７１頁以下
（１９８０）　　（Ｍ、Ｊ、Ｃａ５ａｄａｂａｎ　　ｅ
ｔ　　ｃｏｌｌ、＋　　Ｊ、Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　　
１４３、　　ｐ、　９７１　　ｅｔ　　ｓｅｑ　　（１
９８０））］　　。

成ｉ％ｔ−ＰＡの最初の７個のアミノ酸と大腸菌のβ−
〃ラクトシトーゼとの融合体（ｆｕｓｉｏｎ）に相当す
るプラスミド″、ＸＬ１０４”が単離される。上流では
、“ｐＸＬ１０４″は、成熟ｔ　−ＰＡの最初の７個の
アミノ酸に相当するコドンとＣＨＲＢＳとの融合体を担
っている。

成熟ｔ−ＰＡの６番目のアミノ酸の位置におけるＰｓｔ
ｌｉｌ１位の存在は、成熟ｔ　−ＰＡノ始？（ｂｅｇｉ
ｎｎｉｎｇ）が続いている、ｃｌＲＢｓを含有するＨｉ
　ｎｄ　１１Ｉ−Ｐｓ　ｔ　　１７ラグメントの切り出
しを可ｆｆｆｉとする。この７ラグメントは、プラスミ
ド“ｐ　ＵＯ３”のＨｉ　ｎ　ｄ　ｌｌ１ｇ位とＰｓｔ
１部位間に挿入されて〔ノエー、ベイラ及びノエー、メ
シング１．ｔ　７’、　ｋ　）　、　（Ｊ、Ｖｅｉｒａ
　ａｎｄ　Ｊ、Ｍｅｓｓｉｎｇ＋　ｏＪＬ。

色、）１、プラスミド“ｐＸＬ９９”　を生成する６Ｌ
　−ＰＡ”　ｃ　ＤＮＡ″遺伝子がλバクテリオファー
ジデノム（第１図）においてクローニングされたとき、
このｍ換えバクチリオフ７−ノのＤＮＡは、酵素ＢｇＬ
■によりｔｌＹ化されて、成１７ＩＩｔ　−ＰＡをコー
ドしている配列を含む１９７４塩基討から成る７ラグメ
ントが単離される。

部位Ｂｉｒ　ＬｌｌとＢａｍＨｌとの通合性（ｃｏｍｐ
ａＬｉｈｉｌｉＬｙ）を利用することによって、このＢ
ｇＬＩＩ−ＢｇＬｌ１７ラグメントは、プラスミド“ｐ
Ｂ　Ｒ３２２”（７アーマシア、ビー、エル、バイオケ
ミカルス（ＰｈａｒＩＩＩａＣｉａ、　Ｐ、　Ｌ、　Ｂ
ｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）］のＢａｍＨＩ部位に挿入さ
れて、プラスミド“ｐＸＬ１２１”を生成する。

プラスミドへのｔ　−ＰＡ”　ｃ　ＤＮＡ″遺伝子の挿
入は、λバクテリオ７フーノデノムにおいて非常に頻度
の高い他の制限部位の使用な可能とする。

プラスミド“ｐＸＬ１２１″で出発することによって、
例えば、遺伝子７ラグメント又は全遺伝子（ＩｉＩｈｏ
ｌｅ　ｇｅｎｅ）が発現シグナルに融合されている他の
プラスミドを形成することが可能である。

第１の構造においては、”ｐＸＬ１２ｉ″プラスミドＤ
ＮＡは酵素ＨｉｎｄＩ［［及びＢａＬＩで消化されそし
て、コード化配列の全体を含むＤＮＡ７ラグメントが得
られる。このようにして得られたＨｉ　ｎｄ　ｌ１ｌ−
Ｂａ　Ｌ［７ラグメントはｐＸＬ７３″の大きい方のＨ
ｉ　ｎ　ｄ　ｌ１ｌ−Ｈｐ　ａ　１７ラグメントとスプ
ライシングされる。このスプライシングは可能である。

その理由は、切断の後、酵素ＢａＬｌ及びＨｐａｌがプ
ラント末端を形成するからである１次いでこれは、ｔ　
−ＰＡ遺伝子がＰＬプロモーターに融合しているプラス
ミド“ｐＸＬ１２６に導＜が、プラスミド”ｐＸＬ１２
６″は（＜　Ｂ　Ｓを含まない。

１ｑ記したプラスミド“ｐＸＬ９９″は、ｔ　−ｐＡの
最初の６個のアミノ酸に相当するコドンにスプライシン
グされたｃ　ＩＩＲＢＳを含む、６番目のコドンにおけ
るＰｓｔｉ部位の存在はＬ　−ＰＡ配列に続いてカップ
リングすることを可能とする。

ｔ　−ＰＡ遺伝子には多数の部位が存在しているので、
単一の構造を達成することはできない。

ｔ−ＰＡのアミノ酸７−１４４をコードしている４１４
塩基討のＰｓ　ｔ　　１−Ｐｓ　Ｌ　ｌ　７ラグメント
は、プラスミド″ｐＸＬ１２１”　を酵″ＪＰ９ＬＩで
切断することなよって単離できる。このＤＮＡ７ラグメ
ントはプラスミド“ｐＸＬ９９″のＰｓｔ１部位に挿入
され、そして、この７ラグメントの方位を点検した後、
今やｃｌｌＲＢｓｆＪ’ｔ　　ＰＡの最初の１４４個の
アミノ酸をコードしている配列にスプライシングされて
いる新しいプラスミド”ｐＸＬ１２８″が得られる。

Ｍａｒ１部位はｔ−ＰＡ遺伝子の１１０番目のコドンに
存在している。その結果、プラスミドｐＸＬ、１２８”
　から、ｃ　ｆｆＲＢｓと、ｔ　−ＰＡ遺伝子の５′末
端を含有するＨｉ　ｎｄ　［［−Ｎａｒ　１７ラグメン
トを切り出すことが可能である。ｃ［ＲＢＳを持たない
同等なＨｉ　ｎｄ　ＩＩＩ−Ｎａｒ　１７ラグメントの
代わりに、この７ラグメントがｐＸＬ１２６″に挿入さ
れる。

この構成は、ＰＬプロモーターと、ｃｌｌＲＢｓリボソ
ーム結合部位と、ＡＴＧ開始コドンと、七−ＰＡ構造遺
伝子を含みそして大腸菌においてＬ−ＰＡの発現を可能
とするプラスミド“ｐＸＬ１３０″をもたらす６ ド記の方法を使用することによって、大腸菌の）　＋７
　フ）　７アンオペロンのプロモーター（ｔｒｐＰ）の
制御下に大腸菌内でｔ　−ＰＡの発現を許容する構造を
作ることも可能である。

ターミネータ−ＬＲＩから削除された（ｄｅｌｅｔｅｄ
）ｃ　ＩＲＢｓを含む４７塩基灯のＨｉ　ｎ　ｄ　ＩＩ
−Ｎｄｅｌ”）ｔグメントは、ＨｉｎｄＤｌ及びＮｄｅ
ＩによるプラスミドｐＸＬ２７６の消化から単離するこ
とができる。このプラスミドはヨーロッパ特許出［ＥＰ
１９８，７４５に記載されている。この７ラグメントを
、ｔＰａの最初の１４４残基をコードしている配列を含
むプラスミドｐＸＬ１２１ＪのＮｄｅ　　Ｉ−ＢａｍＨ
Ｉ７ラグメントと組み合わせることができ、全体はプラ
スミドｐ　ＵＣ８Ｃ）ニー、ベイラ及びノエー、メシン
グ、参照、オプ。

ン　ト　、　　（Ｊ、Ｖｅｉｒａ　　ａｎｄ　　Ｊ、Ｍ
ｅ　ｓｓｉｎｇ＋ｃｆ　、　　ｏｐ、　　　ｃｉｔ、）
］の部位Ｈｉｎｄｌｌ［とＢａｌｌｌＨＩ間に挿入され
て、プラスミドｐＸＬ３０１が得られる。

次いで、ターミネータ−ＩＩ（１がら削除されたｃ　　
ＩＩＲＢｓ（ｃ　　１１　　　　ＲＢＳ　　　ΔＬＲＩ
）　　とし　−ＰＡの５′末端を含むＤＸＬ３０１のＨ
ｉｎｄｌｌｌ−Ｎａｒ１７ラグメントが、ｃｌｌＲＢＳ
を含まない同等なＨｉ　ｎｄ　ＩＩＩ−Ｎａｒ　　［７
ラグメントの代わりに、プラスミドｐＸＬ１２６の部位
ＨｉｎｄｌｌｌとＮａｒｆ間に挿入されているプラスミ
ドｐ、ＸＬ３２１が次いで構築される。かくして完全な
１−ＰＡ遺伝子が再構築される。

他の方法においては、ＰＬプロモーターを含むｐＸＬ７
３のＥｃｏＲＩ−８ａＬＩ７ラグメントを、プラスミド
ｐ　ＤＲ７２０（７フーマシア）から得られ且つプロモ
ーターｔｒｐＰを含む５９塩基討のＥｃｏＲＩ−８ａＬ
Ｉ７ラグメントで置換することによって、プラスミドｐ
ＸＬ３０５が構築される。

次いでｔ−ＰＡ遺伝子は、大腸菌のがラクトキナーゼ遺
伝子ｇａＬＫを含むＨｉ　ｎ　ｄ　ｌ１ｌ−Ｂａ　ｍ。

Ｈ１７ラグメントの代替としてｐＸＬ３０５のＨｉｎｄ
ｌｌｌ−ＢａｍＨ１７ラグメントを挿入することによっ
て、プロモーターｔｒｐＰの制御ドに置くことができる
。かくしてプラスミドｐＸＬ３４８が得られる。

更に、転写終結のための効果的なシグナルをＬ−ＰＡ構
造遺伝子の下流で挿入することは、トリプトファンプロ
モーターからのｔ　−ＰＡの発現に対して有利な効果を
持っているらしいことが観察された。

例えば、バクテリオファージ′Ｉ゛７のプレフシアス領
域（ｐｒｅｃｏｃｉｏｕｓ　　ｒｅｇｉｏｎ）の末端（
ｅｎｄ）の転写終結部位（ｔｒａｎｓ　　ｃｒｉｐｔｉ
ｏｎ　　ｔｅｒａ＋１ｎａｌ　　５ｉｔｅ）（“Ｔ７タ
ーミネーター″）〔ジェー、ノエー。

ダン及びエフ、グブリュ、スタディール、核酸研究、８
．２１１９ｇ以ド（１９８０）　（Ｊ、Ｊ、５ｔｕｄｉ
ｅｒ、　　Ｎｕｃｌｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　１（ｅｓ
、８＋　　ｐ、　　２１１９　　ｅｔ　　ｓｅｑ　　（
１９８０）月を使用することが１１能である。′１゛７
ターミネーターは、プラスミドｐＡＲ−４（イムレ　ボ
ロス博士、生化学学会、バイオロアカルリサーチセンタ
ー、ビー、オー、ビー、５２１、Ｈ−５’？０１スゼデ
ー、ハン〃リー（Ｄｒ　１ｍｒｅ　Ｂｏｒｏｓｖ　Ｉｒ
＋５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ＋
　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　１（ｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔ
ｅｒ、　Ｐ、　Ｏ，Ｂ、　５２１．　Ｉドロア０１５ｚ
ｅＨｅｄ、　ｌｌｕｎｇａｒｙ）により提供された］の
１６６塩基対ＢａｍＨ１７ラグメントにより人手ｎｊ°
能である。

萌把したｐＡＲ−４のＢａｍＨ１７ラグメントをｐＸＬ
３４８の准−のＢａｍ日１部位に止しい方位で挿入する
ことによって、ｏＸＬ３８２が最終的に得られる。かく
してプラスミド９ＸＬ３８２は、配列’　ｔ　ｒ　ｐ　
Ｐ−ｃ　ＩＩＲＢｓΔｔＲ１−ＡＴ　Ｇコドンｔ　−Ｐ
Ａ構造遺伝子−ターミネータ−′ｌ゛７”を有する。

Ｄ、　　　″　でのヒトｔ　−ＰＡｊ　伝−のプラスミ
ドｐＸＬ１３０”におけるｔ　−ＰＡ遺伝子の転写はプ
ロモーターＰＬにより指示される（ｄｉｒｅｃＬｃｄ）
。プラスミドが増殖するときに、このプロモーターによ
る不利な転写を回避するために、λバクテリオファージ
ｃｌリプレッサーをフードする宿主バクテリアを使用す
ることが必要である。この方法において、プラスミド”
ｐＸＬ１３０゛を含有する菌株を、プロモーターＰＬを
抑制する条件下にｔＵｔすることがでかる。この予防手
段を講じないと、ｔ　−ＰＡの構成的発現（ｃｏｎｓｔ
ｉｔｕｔｉｖｅ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）は細胞を＃４
気にしそして再生できなくし、培養物におけるｔ　−Ｐ
Ａの生産率（ｒａｔｅ　ｏｆ　ｐｒｏｄｕｃＬｉ＋＋）
は比較的低くなる。

感熱性リプレッサー遺伝子（ｃｌ−ｔｓ）を含む大腸菌
の菌株は“ｐＸＬ１３０”のための条件的透導ｊ％（ｃ
ｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ　１ｎｄｕｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔ
ｅｍ）として使用することができる。バクテリアが対数
増殖期にあるとき、プラスミドプロモーターＰＬは、イ
ンキュベーション温度を非常に急速に４２゛Ｃに上げる
ことにより誘導される。

これらの条件下では、Ｌ−ＰＡは４２°Ｃで合成され、
この温度はＰＬを活性に保つために保持されなければな
らない。

インキュベーションはＮ４８３０（７アーマシア、ビー
、エル、バイオケミカルス）の如き大腸菌の菌株におい
て９０分間行なわれる。培養物の試験サンプルを採収し
、バクテリアを音波処理により溶解する。不溶性分画に
存在するｔ　−ＰＡは大腸菌により製造された全タンパ
ク質の約１％を示す。

ヒト組織ブラスミノーデミ活性化因子の生産は、λバク
テリオファージタンパク賓″ｅｒｏ’をコードしている
大腸前の菌株を使用することによって相当改良されるこ
とが見出だされた。これは本発明の他の主題を構成する
。

これは、特に、ｃｌ’Ｊプレッサーの熱不活性化の後“
ｃｒｏ”遺伝子が発現されるＣ　１−ｓｔ菌株を含む。

例えば、０Ｒ１３１９（オー、レイニス、ピロロノー　
１２３．３５７頁以下（１９８２）　（０，Ｒｅｙｅｓ
＊　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　１２３．　ｐ、３５７　Ｃｔ　
ｓｅｑ　（１９８２））　Ｊの如き菌株の場合には、バ
クテリアは３０°Ｃで増殖させる。この温度ではｔ−Ｐ
ＡもＣｒＯ”も発現しない、バクテリアが対数増殖期に
あるとさ、インキュベーション温度を非常に急速に４２
℃に上げる。リプレッサーは今や不活性化され、“ｃｒ
ｏ″遺伝子は発現することができる。

４２℃で３０分間のインキュベーションの後、温度を３
０°Ｃに戻す、“ｅｒｏ“タンパク質の存在は、リプレ
ッサーａｌのドウノボ合成（ｄｅ　ｎｏｖａ　５ｙｎｔ
ｂｅｓｉｓ）を防止しそしてＰＬを活性に保つ〔シー、
エヌ、グフシン及び協同研究者、、（編者）アール、グ
ブリュ、ヘントリックス、ノエー、ダブリュ、ロパート
、エフ、ダブリュ、スタール及びアール、ニー、ワイス
バーブ、ラムダ■、コールスプリングドハーバーラボラ
トリープレス、９３頁以下（１９８３）　（Ｇ、Ｎ、Ｇ
ｕ９ｓｉｎ　ｃｔ　ｃｏｌｌ、＋　ｉｎ　ＲｌＷ、ｌ１
ｅｎｄｒｉｘ、　　ＪＪ、１（ｏｂｅｒｔｓ、　　Ｆ、
ｌｉｔ、５ｔａｈｌ　　ａｎｄ　　Ｉｔ、＾、Ｗｅｉｓ
ｂｅｒｇ　（ｅｄｓ）＋　Ｌａｍｂｄａ　ｌ　、　Ｃｏ
１ｄ　５ｐｒｉｎ１１ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒ
ｙ　Ｐｒｅｓｓ＋　ｐ、９３　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９８
３））　］。

イインキュページンを９０分間続ける。これらの条件の
下では１．生成したｔ　−ＰＡは大腸菌の全タンパク質
の約５％を示し、培養物１１当たり且つ光学密度１単位
当たり約１０ｍｇの収率でそれを回収することができる
。

プラスミドｐＸＬ３８２は大腸菌のトリプト７７ンオベ
ロンプロモーター（ｔｒｐＰ）の制御下ニｔ　−ＰＡｆ
ｉｔＷＡ的遺伝子（ＬＩ’Ａ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　
）Ｉｅｏｅ）を含む。

かくして、ｔ−ＰＡの発現は、この場合には、バクテリ
アがトリプトファンの不存在下に培養されるときに誘導
される。更に、プラスミドｐＸＬ３８２のために使用さ
れる宿主は、大腸菌のＬ「ｐｐ＋菌株、即ち、少なくと
も野性味（ｗｉｌｄ　５ｔｒａｉｎ）のレベルに等しい
レベルでトリプトフアンオペロンリプレツサーを発現す
る菌株であることが必須である〔ビー、ビー、ニコルス
及びシー、ヤノ７スキー、メソッド　エンザイモル、（
１９８３）、１０１．１５５頁以下（Ｂ、Ｐ、Ｎ１ｃｈ
ｏｌｓ　ａｎｄ　Ｃ。

Ｙａｎｏｆｓｋｙ＋　ＭｅｔｈｏｄｓＥｎｚｙｍｏｌ、
　（１９８３Ｌ　１０上ｒ　ｐ−１５５ｅｔ　ｓｅｑ　
）］　、例えば、大腸菌菌株Ｂ５４１２５〔パスツール
　インスチチュート　コレクンタン（Ｐａｓｔｅｕｒ　
Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）Ｊ　を使
用することができる。使用される方法は、例えば、下記
のとおりである：アンピシリン１００μｇ／ｃｍ”を含
有する、寒天デルをベースとするＬＢ培地（ｌ　ＩＩｌ
ｅｄｉｕｍ−ｂａｓｅｄ　ａｇａｒ　ｇｅｌ）（ノエー
、エイチ。

ミラー、“分子生物学における実験゛°、コールドスプ
リングハーバ−ラボラトリ−、ニューヨーク、（１９７
２）、４３１頁以下（Ｊ、ＩｆｏＭｉｌｌｅｒ、“Ｅｘ
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉ
ｏｌｏｇｙ″、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｌｌａｒｂｏ
ｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙｓ　Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ＋　（
１９）１２Ｌ　ｐ、　４３１ｅＬ　５ｅｑ）を有するベ
トリ皿における大腸１［株Ｂ（ｐＸＬ３８２）の最近の
再単難から出発して、トリプトファン１００μ４１　／
　６　ＩＩＩｊを含有する合成培地〔例えば、ジェー、
エイチ、ミラー、カフ。

オプ、ント、　（Ｊ、１１．Ｍｉｌｌｅｒｔ　ｃｆ、Ｏ
ｐ、　ｃｉｔ）に従う０．４％カザミノ酸を含有するグ
ルコース含有Ｍ９培地ｌ中のプレカルチＡ−−（Ｂｅｃ
ｕｌｔｕｒｅ）を、３７℃で１６時の間攪拌により調製
する。次いで、このプレカルチャーを、トリプトファン
２μＦＩ７ｃｍ’Ｌか含有していない同じ培地の１／１
００倍接種のために使用する。生産増殖を攪拌しながら
３７°Ｃで行う、実験室条件（コニカル７ラスフ内で）
の下で、細胞を約６時間の増殖後の対数増殖期の終わり
近くに回収する。その場合、濁度（ヒｕｒｂｉｄｉｔｙ
）は、６１０ｎｍで２乃至３単位の光学密度（ｏｐｔｉ
ｃａｌ　ｄｅｎｃｉｔｙ）であった。

得られた収率は、前記した収率に匹敵する、即ち、培養
物１１当たり且つ６１０ｎｍでの光学密度１単位あたり
ｔ−ＰＡＡｓ２至１０Ｉａｇのオーダーであり、これは
大腸菌の全タンパク質の約５％に相当する。

Ｅ、−゛で製゛４されたｔ　−ＰＡの再Ｉ゛大腸菌で高
レベルで合成された異種タンパク質（１＋ｅｔｅｒｏｌ
ｏｇｏｕｓ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ）は、しばしば、不溶性
の凝集体（ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ）の形態で存在する〔
アール。

シー、ショナー及び協同研究者、、バイオテクノロジー
　影、１５１頁以下（１９８５）　（Ｒ，Ｇ、　５ｈｏ
ｎｅｒ　ｅｔ　ｃｏｌｌ、＋　ｌｌｉｏｔｅｃｈｎｏｌ
ｏｇｙ　３ｖ　ｐ、　１５１　ｅｔ　５ｅｑ（１９８５
））　］　、＾レベルで発現されたＬ　−ＰＡについて
もそうであることが見出だされた。この！ｉ！遣方法に
おいて、ｔ　−ＰＡの大部分は低速での遠心分離の後ベ
レットに存在しており、これに対して、Ｌ−ＰＡは普通
は水性溶液に可溶である。大腸直で製造されたｔ　−Ｐ
Ａの不溶性についてのＩＩｊ′能な説明は、このタンパ
ク質が天然の形態で合成されていないということである
。事実、不十分に折りたたまれたタンパク質は凝集しそ
して沈でんする傾向があることが、他の系において示さ
れた〔ノエー、ロンドン及び協同研究者、、　ヨーロピ
アン。

ジャーナル、オア。バイオケミストリー、４７゜４０９
頁以下（１９７４）　（Ｊ、Ｌｏｎｄｏｎ　ｅｔ　ｃｏ
ｌｌ、。

Ｅｕｒ、Ｊ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　４７．　ｐ、　４０９
　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９７４））　：ノー、オルシニ及
びエム、イー、ゴールドバーガ、ジャーナル、イブ。バ
イオロジカル、ケミストリー、２５２．３４５３頁以下
（１９７８）　（Ｇ、０ｒｑｉｎｉ　ａｎｄ　Ｍ、Ｅ、
Ｇｏｌｄｂｅｒｇ＋　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　２
５２＋　ｐ。

３４５３　ｅｔ　５ｅｑ（１９７８）］　、酵素タンパ
ク質は自然でない形態（ｕｎｎａｔｕｒａｌ　ｆｏｒｍ
）では活性ではなく、従って、大腸菌で合成されたｔ　
−ＰＡはその活性な形態にないことが合理的に予想され
うる。

多くのタンパク質は、生体外で弐性及び制御された還元
（ｒｅｄｕｃｔ　ｉｏｎ　）の後、天然の形態に戻るこ
とができる。これは、特に、大腸菌′トリプトファナー
ゼ、キモトリプンノーデミ、カルボニツクアンハイドフ
ーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ）、リボ
ヌクレアーゼ、リゾチーム及びウシ膵臓のトリプシンイ
ンヒビターにおいて証明された〔ノエー、ロンドン及び
協同研究者、ｌオプ、ン）　、　（Ｊ、Ｌｏｎｄｏｎ　
ｅＬｃｏｌｌ、＋　ｏｐ、ｃｉｔ、）：　ジー、オルシ
ニ及びエム、イー、ゴールドバーガ、オア。シト、　（
Ｇ　、Ｏｒ＋ｚｉｎｉ　ａｎｄ　Ｍ、Ｅ、　Ｇｏｌｃｌ
ｂｅｒｇ、　ｏｐ、ｃｉｔ、）；　ニー、カリソン及Ｖ
　ｍ　同＋ｔｔ　究者、　＋　　ヨーロピアン、ジャー
ナル、オア。バイオケミストリー、５２．２５頁以ド（
１９７５）　　（Ｕ、Ｃａｒｉｓｓｏｎ　ｅＬ　ｃｏｌ
ｌ、、　　Ｅｕｒ、　　Ｊ、　　Ｂｉｏｅｈｅｖａ、　
５Ｌ　ｐ、　２５　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９７５）Ｇ　７
−ル、エフ。

ゴールドバーガー及び協同研究者、、ジャーナル。

イブ、バイオロノカル、ケミストリー、２３９．１４０
６頁以ド（１９６４）　　（ＨｏＦ、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ
ｅｒ　ｅｔｃｏｌｌ、ｔ　Ｊ、Ｂｉｏｌ、　　Ｃｈｅｗ
、　　２３９＋　ｐ、　　１４０８　ｅｔ　ｓｅｃ＋　
（１９６４））　：ブイ、ビー、サクセナ及びデー、ビ
ー。

ウエットラウ７アー、バイオケミストリー　１１５０１
５１以ド（１９７０）　　（Ｖ、Ｐ、５ａｘｅｎａ　ａ
＋＋ｄ　Ｄ。

１１、　Ｗｅｔｌａｕｆｅｒ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ　９．　ｐ、　５０１５　ｅｔ　ｓｅｃ＋（１９７
０））；　ティ、イー、クレイトン、ジャーナル。

イブ。モレキュラー、バイオロン−。８７，５６３λ以
〆（１９７４）　　（’Ｉ’、Ｅ、　　Ｃｒｅｉｇｂｔ
ｏｎｔ　　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、　８７．　ｐ、　５
６３　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９７４））　Ｊ　、大多数の
場合に、完全な再生の最も鋭敏なインディケータ−は酵
素活性である。所定のタンパク質が２つの活性を持つ場
合には、両活性が同時に再発見されるが、これは、分子
の集団の成る例会のものは一部分のみが正しい構造で存
在しうる可能性から外れているように思われる。

ヒトｔ　−ＰＡは容易に測定することができる２つの性
質を持っている：成るレベルでブラスミノーデミを活性
化する能力及びｔ　−ＰＡ自体の活性化により示される
フィブリンに討する親和性。

大腸直により生産されたｔ−ＰＡは、ポリペプチド鎖が
完全に変性されそして還元された後、生体外で活性なフ
ンフォーメーションに再生されうろことが見出だされた
。これも又本発明の主題である。

バクテリアは、例えば、Ｐ、Ｂ、Ｓ（０，２゜／１Ｋｃ
Ｉ　、０．２ｇ　／ＩＫＨｚＰＯ４，８，／ＮＮａｃＬ
ｓ及び１　、２　Ｓｉｒ　／ｌＮａ　２ＨＰ　Ｏ−）の
如き等張賎中での音波処理により溶解された後、ｔ−Ｐ
Ａは不溶性分画に存在している。それ故、このレベルで
は、細胞溶解物（ｃｅｌｌ　１ｙｓａヒｅ）を遠心分離
しそして遠心分離されたベレットのみを回収することに
よって、この酵素の相当な精製を達成することが可能で
ある。その場合は、ｔ　−ＰＡはベレット中に存在する
不溶性タンパク質の２０−２５％を示す。

ポリペプチド鎖の還元及び再酸化を伴う、二次及び三次
構造の転位は、活性な且つ可溶な形態のｔ　−ＰＡを製
造するのに必要であることが見出だされた。

ｔ−ＰＡは、最初に、 ７ＭグアニジンＨＣｌ ０．ＩＭβ−フルカプトエタノール ０．１ＭＫＨｚＰＱ４１）Ｈ７，５ のＳａで不溶性分画を処理することによって変性及び還
元条件下に可溶化される（下記Ｆ゛節参照）。

変性及び還元剤の濃度は、分子を再生することを可能と
するように除去又は減少されなければならない、これら
の剤の効果は、例えば、再生が起こることを可能とする
Ａｔ衝液中で変性／還元された分画を希釈することによ
って除去することができる。更に特定的には、一連の最
適化の後に得られた例である下記溶液中で希釈すること
によって、ｔ　−ＰＡの再生を行うことができる：２．
５Ｍ　尿素 ５０陥Ｍ　トリスＨＣＩ　　　ｐ　Ｈ８，７５１０＋ｓ
Ｍ　　　ＮａＣｌ ３＋ｏ　　Ｍ　　　ＥＤＴＡ １ｍＭ　　還元グルタチオン ０．３如Ｍ　酸化グルタチオン １０醜Ｍ　リジン （及び下記Ｆ節に記載の方法に従って）。

ニー、グラネリービベルノ及びイー、ライヒ、ジャーナ
ル、イブ。エクスベリメンタル、メデイシン、１４８．
２２３頁以下（１９７８）（＾、Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐ
ｉｐｅｒｎｏ　ａｎｄ　Ｅ、Ｒｅ１ｃｈ、　Ｊ、　Ｅｘ
ｐｏＭｅｄ、　１４８＋ｐ、２２３　ｅｔ　ｓｅｑ　（
１９７８））により記＠された方法を使用して、フィブ
リン−寒天デルプレート上でｔ　−ＰＡ活性を測定する
ことにより再生効率を定量化した。この活性を、標準一
本領ｔ　−ＰＡ［バイオプール、スエーデミ（口１ｏｐ
ｏｏｌ、　５ＬＩＩｅｄｃｎ）で得られた活性と比較し
た後、バクテリア培養物１１当たり且つバクテリア坩禿
物の光学密度１単位当たり約３＋＋＋ｇの収率を測定す
ることができる。

ｔ−ＰＡの活性は、合成基質の加水分解によっても測定
することができる〔ジェー、エイチ、ベルハイエツト及
び協同研究者、、トロンボシス、アンド、ヘモスタシス
、（スツット〃ル））４８゜２５６頁以下（１９８２）
　（Ｊ、Ｉｌ、　ＶｅｒｈｅｉｊｅＬ　ｅＬｃｏｌｌ、
＋　　’ｌ’ｈｒｏｍｂ、　　Ｈａｅｍｏｓｔａｓ、　
　（Ｓｔｕｔｔｌ？ａｒｔ）　　４Ｌ　　９゜２５６　
ｅｔ　５ｅｑ（１９８２））　］　、特にｔ　−ＰＡに
よるプラスミノーゲンのプラスミンへの軟化速度が測定
される。プラスミノーゲン活性化因子に特徴的な、指数
型の速度１１１（第７図）は、精製したヒトプラスミノ
ーゲン及び合成プラスミン基質（Ｓ−２２５１：　Ｖａ
　ｌ　−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−パラニトロアニリン、カビ　
ビトルム、スエーデミ（Ｋａｂｉ　Ｖｉしｒｕｌｌ　Ｓ
ｗｅｄｅｎ）Ｊの存在ドにインキュベージ３ンを使用し
てボすことができる。プラスミノーゲンの不存在ドの対
照インキュベーションは、抽出物が偽陽性反応（ｆａｌ
ｓｅ　ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｒｅｓｐｏｎｓｅ）を生じる
ことができるタンパク分解活性を２−まないと結論する
ことを可能とする。

プラスミノーゲン活性化因子遺伝子を含有せずそして同
じ再生処理に付された、バクテリアから得られたタンパ
ク質は、プラスミノーゲン及びＳ−２２５１合成基質の
存在下のインキュベージタンの後完全に不活性であるこ
とが見出だされた。

ｔ　−ＰＡ遺伝子を持つバクテリアから得られた抽出物
のみは、プラスミノーゲン活性化因子型の酵素活性を示
す。

同じ方法を使用して、プラスミノーゲンのプラスミンへ
の触媒作用においてフィブリンが果たす潜在的役割を試
験することが−ｎｌ能である。咄乳動物細胞により合成
される組織プラスミ／−デミ活性化因子は、フィブリン
又はその誘導体により相当刺′ｆ１１される。この性質
は治療に有利である。事実、フィブリンの不存在下では
、酵素の基質に対する親和性は低い、池方、フィブリン
の存在下では、酵素の基質に対する親和性は増加する。

これは、プラスミノーゲンを切断して、フィブリンクロ
ットを分解するフィブリンにする十分に活性な酵素をも
たらす。

遺伝子組換え及び再生により得られた分子に対するフィ
ブリンのこの刺激効果は、精製したヒトプラスミノーゲ
ンの存在ドでの、Ｓ−２２５１合成基質及びフィブリン
又はその誘導体（フィブリノペプチド類）の酵素反応速
度論（ｅｎｚｙｍａｔｉｅ　ｋｉｎｃｔｉｃｓ）を決定
することによって証明することができる。触媒作用の速
度の非常に商い刺激が観察され、触媒作用の速度は約４
０の係数増加する（第７図）。

更に、大ｗＪ菌から誘導されそして本発明の方法に従っ
て再生された組換えＬ−ＰＡは、順乳動物細胞により合
成されたプラスミノーゲン活性化因子に特異的な抗体に
より認識することができる。

このために、ヒト組織ブラスミノーデミ活性化因子に特
異的な精製した免疫グロブリン（バイオプール、スエー
デミ）の増加していく量をバクテリアＬ　−［’Ａの存
在ドにインキュベージジンし、そして酵素活性に対する
効果をりｒ析する。ｔｊＳ８図に示された結果はバクテ
リアｔ　−ＰＡの活性がヒト活性化因子に特異的な抗体
によって阻害されることを示す。この阻害は、特異的で
ある。何故ならば、ヒト起源のプラスミノーゲン活性化
因子と同様に、バクテリア起源のプラスミノーゲン活性
化因子は、免疫されていない動物又はウロキナーゼ特異
的免疫グロブリン（ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｓｐｅｃｉｆ
ｉｃｉ＋ａｆｆｉｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎｓ）のいずれ
によっても阻害されないからである。

これらの結果を組み合わせると、ヒト組織プラスミノー
ゲン活性化因子遺伝子を持つバクテリアは対応するタン
パク質を合成することが示される。

このタンパク質は慣用の緩衝液に可溶ではなく、そして
多分その自然のコンホーメーションをとっていない、し
かしながら、抽出、変性及び制ａＩ！された再生の後、
ブラスミノーデミに向けての触媒活性及びフィブリン親
和性の原因となる立体化学的部位をこのタンパク質に回
復させることをＩＩＩ’　ｆｆｆｉとする。更に、再生
された分子はヒト活性化因子に対する抗体によって認ａ
される。このことから、得られたタンパク質の二次及び
三次ｖｔ造が天然タンパク質のそれに近いということに
なる。

１・゛、イ用する方゛の１明 制限酵素は供給者〔ニューイングランドラボラトリーズ
（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）］　　によ
り示唆されたとおりに使用する。ＤＮＡ７ラグメントの
スプライシングは、５０１６Ｍ）リスＭＣＩ　　ｐＨ７
゜４．１０＋＋＋　ＭＭｇ　Ｃ１□、１ｍＭＡ”ｌ”Ｐ
及び１５＋ｎ　Ｍ　Ｄ　’Ｉ’　ｉ’を含有する緩衝欣
中で行う。

大腸直の菌株の形質転換は、チー、マニアチス及び共同
研究者（ＴｏＭａｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ｃｏｌｌ）によ
り記＠された方法〔分子クローニング、コールドスプリ
ングハーバ−ラボラトリ−プレス（１９８２）Ｊを使用
して行う。

ヌクレアーゼ８１″は供給者（ポーリンが−）により示
唆されたとおりに使用する。

ＤＮＡをプラントにするためのＤＮＡの付着端の充てん
は、５０ｍ　ＭＮａ　Ｃ１、１０ｍ　Ｍ　）リスＨｅ１
ｐＨ７、５、１ｍＭＭｇ５Ｏｎ及　び°　１ｍＭＤ　Ｔ
　１’から成るａｍ液中で且つ１ｍＭ　　の濃度の４ａ
のトリホス７エートデオキシヌクレオチドの存在下に、
酵素“ＤＮＡポリメラーゼ（大きい７ラグメント）″（
ボーリン〃−）を使用して訂う。

オリゴヌクレオチドは、エム、ノエー、〃イト及び共同
研究者、（編者）エイチ、ノー、ガラセン及びニー、ラ
ング、遺伝子７ラグメントの化学的及び酵素的合成、７
エルフーグヘミープレス、１頁以ｈ’（１９８２）　（
Ｍ、Ｊ、Ｃａ１ｔ　ｅｔ　ｃｏｌｔ、　ｉｎ　Ｉｔ。

Ｇ、Ｇａ５５ｅｎ　ａｎｄ＾、Ｌａｎｇ　（ｅｄｓ）＊
　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　ａｎｄビｎｚｙｍａｔｉｃ　５ｙ
ｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｖ　Ｖｅｒｌａ）ＨＣｈｅｍｉｅ　Ｐｒｅｓｓ＋　ｐ＋
　１　ｅＬ　ｓｅｑ　（１９８２））により記＠された
方法を使用して１ｌｌｌ製する。

バクテリアの音波処理は、バクテリアがＰ、Ｂ。

Ｓ、緩衝液（０，２ｇ　／／！ＫＣＩ　、０．２ｇ　／
１ＫＨｚＰＯ，，８ｇ　／ｌＮａ　Ｃ１及び１．２５ｇ
／ＩＮａ、ＨＰＯ，）中で２０倍に濃縮された後、プラ
ンソンソニケーター（プロシアンス、フランス、Ｂ　３
０　）　　［ｌ１ｒａｎｓｏｎ　５ｏｎｉｃａＬｏｒ（
Ｐｒｏｓｅｉｅｎｃ＋ｇＦｒａｎｃｅ、Ｍｏｄｅｌ　８
３０月により行う。゛６°波処理時間は６分である。手
番性分画は、２．３％ＳＤＳ、５％βメルカプトエタノ
ール、１０％グリセロール及ｃ１０．０６Ｍ）すＸＨＣ
ｌ　ｐ　Ｈ６，８中ニ’ｆｉ）溶化し、そしてニー、ケ
ー、レムリ、ネイチャー２２７．６８０頁以ド（１９７
０）　　（１１，に、ＬａｅｆｆＩｌｉＩＮａｔｕｒｅ
　２２７＋　ｐ、　６８０　ｅｔ　ｓｅｑ　（１９７０
））に従うアクリルアミド−３ＤＳデルでの１ｔＣ気泳
動により分析する。

ｔ−ＰＡの変性／還元は、１（Ａｇ＋ａ）の光学密度の
培養物１１に相当する不溶性分画を、７ＭグアニジンＨ
ＣＩ　、０．ＩＭβメルカプトエタノール及１１０．Ｉ
ＭＫＨｚＰＯ−ｐ、７．ｓの溶＠５０ＩＩＩＪで、４℃
にて２４時闇攪拌しながら処理することによって行う１
次いで、βメルカプトエタノールの濃度を、７Ｍグアニ
ノンＨＣＩ　、０．００５Ｍβメルカプトエタノール及
び０．１ＭＫＨ２Ｐ０４ｐ、７．５を含有する７８液１
１に討する透析により減少させる０次いで、２．５Ｍ尿
素、Ｂ０鎗Ｍ　トリスＨＣＩ　ｐ　Ｈ８，７５，１０ｍ
ＭＮａ　Ｃ１，５ｍ　Ｍ　　ＥＤＴＡ、１ｍ　Ｍ　　還
元グルタチオン、０．３ｍＭ　　酸化グルタチオン及び
１０＋ａＭ　　リシンを含有する緩衝液中に前記溶液を
希釈することにより、再生を行う。

この希釈の後、溶液を４℃で２４時間インキエベーシッ
ンし、次いで遠心分離する。ツイーン８０　（Ｔｗｅｅ
ｎ　８０）０．０１％を含有するＰ、Ｂ、Ｓ。

緩衝液中の上澄液の希釈（１／１００）の後１−ＰＡ活
性を測定する。

ブタベスト条約の規定に従い、１９８７年２月２日に、
オランダ国、パーン市、オーステルストラ　−　ト　１
　３　７　４　０　　Ａ　Ｇ　（Ｏｏｓｔｃｒｓｔｒａ
ａｔ　　１３７４０　　ＡＧ＊１１ａａｒｎ＋　Ｎｅｔ
ｂｅｒｌａｎｄｓ）の、セントラールビューロープール
シンメルカルチャーズ（（：ｅｎｔｒａａｌ口ｕｒｅａ
ｕｖｏｏｒ　ＳｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌＬｕｒｅｓ　（Ｃ
１）Ｓ））にド記の寄託をした： Ｎｏ、ＣＢ８１４７．８７として、プラスミドｐＸＬ１
３０を含有する大腸菌０Ｒ１３１９（恥！ｈｅｒｉｅｈ
ｉａ　ｅｏｌｉ　ＯＲ１３１９）Ｃｍ株Ｇ−６８０）の
見本。

Ｎｏ、ＣＢ５１４８．８７として、プラスミドｐＸＬ３
８２を含有する大腸菌Ｂ（Ｅ、　ｃｏｌｉ　Ｂ）（’ｔ
ｒｉ株Ｇ−１５１４）の見本。

【図面の簡単な説明】

第１図はｔ　−ＰＡのｃ　ＤＮＡクローンの一般的構造
を示す。 第２図はｔ　−ＰＡのｅ　ＤＮＡ塩基配列を示す。 第３図は第２図の配列の翻訳生成物を示す。 第４図はバクテリオファーノＰＬプロモーターの単離及
び正しい方位でｅ　ｌｌ（１３Ｓと共にプラスミドｐＸ
Ｌ８８にそれを組み込むことを示す。 第５図は、ｔ　−ＰＡをフードしているｃ　ＤＮＡのプ
ラスミドｐＸＬ１３０への融合を示す。 第６図は、ｔ　−ＰＡをコードしているｃ　ＤＮＡのプ
ラスミドｐＸＬ３８２への融合を示す。 第７図は、本発明に従って製造されたｔ　−ＰＡの存在
下にプラスミノーゲンによる合成基質分解を示す。 ！＠８図は、ヒト組朧プラスミノーゲン活性化因子に特
異的な抗体による、本発明に従って＃Ｊｌ遺されたｔ　
−ＰＡの活性の阻害を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、λバクテリオファージのＰ＿Ｌプロモーター及び大
   腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）のトリプトフアンオペロンの
   ｔｒｐＰプロモーターから選ばれたプロモーターと、転
   写終結配列ｔＲ１を持つか又は持たないλバクテリオフ
   ァージ遺伝子ｃIIのリボソーム結合部位と、５′にＡＴ
   Ｇ開始コドンを含むヒトｔ−ＰＡ遺伝子と、所望により
   、バクテリオファージＴ７のプレコシアス領域の終結部
   位を含むプラスミドの安定な保存を確保することができ
   るバクテリアを培養することを含むことを特徴とする、
   ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子又はｔ−ＰＡを微
   生物学的に製造する方法。 ２、該プラスミドが、λバクテリオファージのＰ＿Ｌプ
   ロモーターと、λバクテリオファージ遺伝子ｃIIのリボ
   ソーム結合部位と、５′にＡＴＧ開始コドンを含むヒト
   ｔ−ＰＡ遺伝子を含有する、特許請求の範囲第１項記載
   の方法。 ３、該プラスミドが、大腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）のト
   リプトフアンオペロンのプロモーターｔｒｐＰと、転写
   終結配列ｔＲ１を持たないλバクテリオファージ遺伝子
   ｃIIのリボソーム結合部位と、５′位置にＡＴＧ開始コ
   ドンを含むヒトｔ−ＰＡ遺伝子と、バクテリオファージ
   Ｔ７のプレコシアス領域の終結部位を含有する特許請求
   の範囲第１項記載の方法。 ４、特許請求の範囲第１項記載の方法により得られた不
   活性な且つ不溶性の生成物を、ポリペプチド鎖の二次及
   び三次構造の再配列を可能とするように変性及び再生す
   ることによって、前記生成物を活性な且つ可溶性の生成
   物に転化することを含むことを特徴とする、ヒト組織プ
   ラスミノーゲン活性化因子の活性形態の製造方法。 ５、該プラスミドの安定な保存を確保することができる
   バクテリアが大腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）の菌株である
   特許請求の範囲第１項記載の方法。 ６、λバクテリオファージの“ｃｒｏ”遺伝子を含有す
   る大腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）の菌株を使用する特許請
   求の範囲第５項記載の方法。 ７、λバクテリオファージプロモーターＰ＿Ｌと、λバ
   クテリオファージ遺伝子ｃIIのリボソーム結合部位と、
   ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の構造遺伝子と融
   合されているＡＴＧ開始コドンとを含有することを特徴
   とするプラスミド“ｐＸＬ１３０”。 ８、大腸菌（￥Ｅ．ｃｏｌｉ￥）のトリプトフアンオペ
   ロンのプロモーターｔｒｐＰと、転写終結部位ｔＲ１を
   持たないλバクテリオファージ遺伝子ｃIIのリボソーム
   結合部位と、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の構
   造遺伝子と融合されているＡＴＧ開始コドンと、バクテ
   リオファージＴ７のプレコシアス領域の終結部位とを含
   有することを特徴とするプラスミド“ｐＸＬ３８２”。 ９、特許請求の範囲第１項記載の方法により製造された
   ものであるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子。 １０、特許請求の範囲第４項記載の方法により製造され
   たものであるヒト組織プラスミノーゲン活性化因子の活
   性形態。