JPH02227090A - 遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明線遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現し７
を生物学的に活性の蛋白質の活性化法に関する。

〔従来の技術〕 蛋白質例えば、非相同宿主組織中での抗体の遺伝子工学
による製造は、不活性でａ溶性の蛋白質凝集物いわゆる
「封入体（１ｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏａ１ｅｓ　）　Ｊχ
もたらす。このような封入体の形成線、特に、貴男時に
生じる細胞内での高い蛋白質濃度の結果であると思われ
る。生物学的に活性の蛋白質馨得るためには、この封入
体ン変性及び還元により溶解させ、次いで、その本来の
形のこの蛋白質の三次元構造を適当な溶解条件の調整に
より再び製造しなければならない（Ｍ、　８ｅｌａ等に
よる１　９５７．５ｃｉｅｎｃｅ　　１２５．６９１参
照）。完全な７１ｔみ込み除去（ｇｎｔｆａｌｔｕｎｇ
　）は、高濃度のカオトロぎツク剤例えば尿素及びグア
ニジンの添加により達成される（　Ｒ，Ｊａｓｎｉｃｋ
ｅ　　（１９８７）　、Ｐｒｏｇ。

Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｍｏ１ｅｃ、　Ｂｉｏｌ、　　４９
．１１７−２３７滲照）。ジスルフィド橋の還元のため
に、強力な還元剤例えばβ−メルカプトエタノール又ｈ
１．４〜ジチオエリスリットが使用される。

しかしながら、変性状態からの復元 （Ｒｅｎａｔｕｒｉｅｒｕｎｇ　）の際には２つの競争
反応が現われる。本来の状態への所望の７’ｔ７ｔみ込
みと共に、凝集物形成も認められる（　Ｇ。

Ｚｅｌｔｔ１ｍ＠１５１８１等による阻ｏｃｈｅｍｉａ
ｔｒｙ　　１ｉ、５５６７参照）。本来の分子の側への
平衡を大きくする几めには、一方では、誤ｌ′）九九ｔ
み込みの、従って不安定な分子χ創製し、凝集へのその
非特異的な交換作用χ阻止するが、他方でな、本来の状
態への笑９ｆｃたみ込みχ阻止しない条件ケ選択する。

これは、不安定化濃度（１ａｂｉｌｉｓｉａｒｅｎｄｅ
　ｋｏｎｚｅｎｔｒａｔｔｏｎ　）でのカオ）ａぎツク
剤の添加により達成している。付加的に、この蛋白質濃
度線厳密に復元収率に作用を及ぼ丁ように注意丁べきで
ある（欧州轡許第０２４１０２２号）。本来の状態でジ
スルフィド架橋され九蛋白質においては、復元の間に付
加的に、誤１って架橋され九システインン再び還元し、
正しい対に集団化することのできるレドックス条件ン与
えることが重要である。還元され、酸化され友チオール
試薬からのいわゆるオキシドシャ７りング溶液（Ｏｘｉ
４ｏ−ｓｈｕｆｆｌｉｎｇｓｏｌｕｔｉｏｎ　）は、本
来の構造のジスルフィド架橋された蛋白質Ｏ収率χ高め
る。

完全な変性及び還元後の抗体の復元が可能である仁とは
１．ハーバ−（Ｈａｂｅｒ　）により、はじめて、ｔａ
ｂ−７ラグメントの例で示された（ｌ　Ｈａｂｅｒ、　
　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　　５２、Ｉ　Ｑ　９９〜
１１０６（１９６４）参照）。その収率は１．１２〜１
４１であり九。これは、ホイットニイ（Ｗｈｉｔｎ＠ｙ
　）及びタン７オード（Ｔａｎｆｏｒｄ　）により、Ｆ
ａｂ−７ラグメントの復元の結果により追ｍ嘔れ九。彼
ら框８憾の収率ｌ得九（Ｐ、　Ｌ。

Ｔｈ１ｔｎｅｙ、　Ｃ，Ｔａｎｆｏｒｄ、　Ｐｒｏｃ＊
　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ。

８ｃｉ、　Ｕ８Ａ　　５３　（１９６５）参照）。完全
な抗体は、７リードＷ　ｙ　（Ｆｒｅｅｄｍａｎ　）及
びセラ（８ａｌａ　）によりはじめて有効に復元もれ几
。

その収率は、２Ｏ−２ｓ＊−ｅあり７ｅ（Ｍ、Ｈ。

Ｆｒａｅａｍａｎ、Ｍ、５ｅｌａ、　　Ｊ、Ｂｉｏｌ、
Ｃｈｅｗｓ　　２４１．２３８３〜２３９６（１９６６
）、Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、２４１．５２２５−５２３２（１９６６）参
照）。本来の出発分子ｖｇ解時特性改良のために、ボリ
ア２エル化し九〇とな注目に値する。

ここ忙挙げ次操作でな、これは、ポリクローナル抗体も
しくは抗体７ラグメント即ち種々異碌るパラトープ（ｐ
ａｒａｔｏｐｅｎ　）及び種々異なる親和定数Ｙ有する
抗体の混合物に関することに注目丁べきである。

この非相同ポぎニレ−ジョンの′Ｎ−及び軽い鎖が復元
の際に純粋に統計的に会合するので、ここでは、本来の
関連結合特異性及び親和性と一致しない復元分子が得ら
れる。

Ｅ、コリー（Ｃｏ１１　）中でクローニングされ、発現
され几他の真核生物蛋白質におけるように、Ｅ、コリー
中でも、不溶性封入体の形の抗体の表現され九重い及び
軽い鎖が住じる（　Ｓ。

Ｃａｂｉｌｌｙ等、ＰｒｏＣＯ　Ｎａ１ｌｓ　ＡＣａｄ
ｅ　８ｃｉ、υ８Ａ８１．３２７３〜５１２７７（１９
８４）、Ｍ、　Ｙ。

ＢＯ３１ａ等１９８４、Ｎ６ｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ１２．３７９１〜３８０６参照）。形
質転換された微生物からの抗体ン得るために、Ｃａｂｉ
ｌｌｙ等及びＢｏｓｓ等は、官能性抗体の復元を可能に
する方法を記載している。しかしながら、この方法では
モノクローナル抗体に関して、約０．２−〇、！Ｍの収
率のみｔ与え九。

〔２発明が解決しようとする課題〕 従って、本発明は、原核生物中に発現した生物学的に活
性の蛋白質の再活性化の方法を得る仁とを課題とし、こ
の際、表現くより封入体の胤で得られる蛋白質を良好な
収率でその活性の復元形に変じることができる・ 〔課題を解決するｔめの手段〕 この課題は、変性及び還元性条件下での可溶化による細
胞溶解及び引続く酸化性及び復元性条件下での再活性化
により、原核生物中に発現しｔ生物学的活性の蛋白質を
活性化する方法により解決され、これな、１〜１０００
μｇ／ＷＬｔの蛋白質濃度で操作し、可溶化と再活性化
との間に、Ｐ）１１〜４χ有し、塩酸グアニジン４〜８
モル／ｌ又は尿素６〜１０４ニル／ｌン含有する緩衝液
に対する透析を実施することよりなる。

意外にも、尿素又は殊に塩酸グアニジンの存在における
透析の後に、再活性化の後の活性蛋白質の極めて高い収
率が得られることが確認され九〇 本発明は、遺伝子工学によシ原核生物中で製造され九す
べての生物学的活性蛋白質での使用、特に抗体及びその
フラグメント及びｔ−ＰＡ及びｔ−ｐＡ＠似蛋白質もし
くは類縁体ン得る丸めの使用に、好適である。

本発明の有利な実施形では、透析緩衝液は、塩酸グアニ
ジノ５〜フ 再活性化の際に％−値９〜１２、（）８Ｂ−濃度０、１
　−　２　０　ｍモル／ｌで、３８８（）−濃度０．０
１〜５ｍモル／１で、かつ非変性性濃度の変性剤を用い
て操作し、この再活性化ｔ１〜３００時間の時間にわ九
りて実施するのが有利である。

％Ｋ、Ｇ（Ｄ際、０８Ｈ−濃度は０．２−１０ｍモル／
！及び／又ｄ　０８８Ｇ−濃度は０−０５−１ｍモル／
ｌであるのが有利である。

本発明のもう１つの有利な実施形では、再活性化の工程
で、１ず変性条件下でＧＳＳＧの添加によシ抗体のチオ
ール基な抗体の混合ジスルフィド及びグルタチオンに変
じ、改めて、塩酸グアニジン又は尿素を含有する緩衝液
に対して透析させ、次いで、６〜１０のμ値、０．１〜
５ｍモル／ｌの０８Ｆ！濃度で、かつ非変性性濃度の変
性剤を用いて、１〜３００時間にわ几って再活性化させ
る・ 変性剤として扛、一般に、酸化条件下での活性化の几め
に通例使用されている変性剤又はアルギニンを使用する
ことができる。変性剤として、アルギニン、塩酸グアニ
ジン及び／又扛少なくとも１１１１の一般式： ％式％（１） 〔式中Ｒ及びＲ１はＨ又ｇｃ−原子数１〜４のアルキル
を宍わし、ＵＳはＨ又はＮＲＲＩ又はＣ−原子数１〜３
のアルキルＹ：＊わ丁〕の化合物を使用するのが有利で
ある。これらの変性剤は、更に混合物として使用できる
。アルギニン及び／又は塩酸グアニジンの濃度は、０．
１〜１．０モル／ｌ殊Ｋ　Ｏ，２５−０，８モル／！で
あるのが有利である。−紋穴Ｉの化合物の濃度は０．５
−４モル／ｌ１殊に１〜３．５モル／ｌである。本発明
のもう１つの有利な実施形において裸、再活性化工程ｔ
１異種蛋白質の存在で実施する。そのものとしてな、一
般に、蛋白質分解作用Ｗしない任意の異種蛋白質が好適
であり、特に牛血清アルブミン（ＢＡＡ　）　＠例えば
１〜３ｍｐ／―の量で使用するのが有利である。ＢＳＡ
の添加は、蛋白質の収率χ高め安定化させる作用をする
（おそらく、表面変性及び／又は蛋白質分解の前の保護
による）。

慣用の方法条件嫁、再活性化工程の丸めの技術水準から
公知で慣用の条件に一致しうる。この再活性化は、有利
に、約５−３０℃、特に１０℃で実施される。透析及び
再活性化工程（再酸化／活性化）ン先行し、後続の工程
例えば細胞崩壊、可溶化（可溶化、還元）Ｆｓ、、例え
ば欧州特許（ＥＰ−Ａ）第０１１４５０６号、同第００
９３６１９号の技術水準から非相同貴男蛋白質もしくは
ｔ−ＦＡの再活性化の九めに公知かつ慣用の方法で実施
することができ、収率及び活性化に関して最適な結果ン
得るためには、個々の又な全ての工程ｔ１ここに説明し
九１以上の方法形式の考慮のもとに実施するのが有利で
ある。

細胞崩壊は、この九めに慣用の方法により、例えば超音
波、高圧分散又はリンチームγ用い上行なうことができ
る。ＦＩＷ！濁媒体としての、中性−弱酸性の出値の調
節の沈めに好適な緩衝液ｆＩＩ液中で、例えばトリス／
Ｈσ０．１モル／ｌ中で実施するのが有利である。細胞
崩壊の後に、不溶成分（封入体）を常法で、特に、遠心
分離又は濾過により分離する。蛋白質Ｙ：害しないが、
異種細胞蛋白質ンできるだけ溶解する薬剤例えば水、燐
酸塩緩衝溶液での洗浄（場合によりては温和な変性剤例
えばトリトンの添加のもとに）の後に、沈殿（ペレット
）′％：可溶化（可溶化／還元）させる。

この可溶化は、有利に、アルカリ性−領域で、殊にｐＨ
８，６±０．４で、メルカプタン群からの還元剤及び変
性剤の存在で行なうのが有利である・変性剤としては、
技術水準例えば欧州特許（ＩＣＰ−Ａ）第０１１４５０
６号明細書から公知で慣用・の変性剤殊に塩酸グアニジ
ン又は−紋穴Ｉの化合物を使用することができるみ゛こ
れは、塩酸グアニジン６−ｔ−ル／ｌの濃度でもしく扛
−紋穴の化合物８モル／！の濃度で行なうのが有利であ
る。

メルカプタン群からの還元剤としては、例えば還元グル
タチオン（Ｇ８Ｈ）又は２−メルカプトエタノールを例
えば約５０〜４００ｍモル／ｌの濃度でかつ／又は殊Ｋ
　ＤＴＥ　（ジチオエリスリトール）もしく　ａ　Ｄ’
ｒ’Ｉ’　（ジチオスレイトール）を例えば約８０−４
００ｍモル／ｌの濃度で、もしくはシスティンＹ使用す
るこ仁ができる。

可溶化は、室温で、０．５−数時間、有利に２時間の間
忙行なうのが有利である。空気酸素による還元剤の酸化
χ阻止するために、ＢＤＴＡｇ、有利に１〜１０ｍモル
／ｌの量で添加するのも有利でありうる。可溶化／還元
と並んで、この可溶化工程は、精製作用Ｙ４有する。そ
れというのも、異種蛋白質の大部分は溶解しないからで
ある。

本発明の他の実施形は、再活性化の工程の前の原核生物
中で発現した生物学的活性蛋白質の混合ジスルスイドと
グルタチオンの形成に基づく。この混合ジスルスイドの
形成のために、透析され、還元されて、還元剤から精製
され几蛋白質ｔ１変性剤含’［３８８Ｇの稀溶液例えば
０．２屹ル／Ｉｌト共にインキュベートする。酸化剤の
分離の後に、０ＢＦＩ濃度０．１〜５ｍモル／ｌ及び非
変性性濃度の変性剤′１に一有するグアニジン／塩酸又
は原票含有緩衝液（ｐ）１６〜１０）Ｋ対して１〜３０
０時間にわｔって透析することにより、活性化馨行なう
。

他の丁べての反応１稚において、０８８Ｇとの混合ジサ
ルファイドの形成を介する蛋白質の活性化は、この発明
の先に記載の部分の蛋白質の活性化の几めの実施形に一
致する。この冥施形において、至適ｐＨは６〜８であり
、活性化され九蛋白質は、復元緩衝液中で長時間にわ九
り安定である。

本発明によれば、例えば原核生物中で発現され几再活性
化丁ぺＩＪ白質としての抗体の場合に、免疫反応性の３
０憾１での収率で再活性化することが成功する。このこ
とは、技術水準により公知の方法の約１０倍の収率に相
当する。

本発明の意味における抗体とは、その通常の７２グメン
トとも理解される。

〔実施例〕

次の実施例につき、図面と関連させて本発明を更に説明
する。他に記載の危いかぎり、「憾」扛「重量係」であ
り、温度線「℃」である。

第１図はＭＡＫ　５５のに一鎖（ｋａｐｐａ−ｋｅｔｔ
ｅ　：ヌクレオチド位ａ７〜６６３）の表現の九めのプ
ラスミドｐＢＴ　１１１の配列ン示す図であり、第２図
は、ＭＡＫ　３５のＩＰ（１〜鎖（ヌクレオチド位置２
４０〜９１７）の表現の九めのプラスミドｐ１０１６９
の配列ン示す図である。

例１ Ｅ、コリー中の抗体フラグメントの表現１．１．　　Ｌ
コリー中のＭＡＫ　５５のに一鎖の表現の九めのプラス
ミドの構成 ｐＢＲ３２２中のＰｓｔＩ−７ラグメントとしてのＭＡ
Ｋ　５５のに−ｃＤＮＡのクローニングは文献に記載賂
れている（　Ｂｕｃｋｅｌ、　Ｐ、等（１９８７）、Ｇ
ｅｎ５５１．１５−１９参照）。制限ヌクレアーゼＭｎ
１ｌ　を用いて、ｃＤＮＡＶ、成熟に一鎖の第１アミノ
酸コドンの直接ラー隣接で切断し、ＥＣＯＲＩ　−Ｐｓ
ｔＩ−フラグメントとしてのアダプｐ　−（５’　ＣＡ
ＴＧ　５’　Ｉａ、　５’　ＣＡＴＧＡＡＴＴ　３’　
とハイブリット形成する・）を用いて、同様Ｋ　ｋＯＲ
Ｉ及びＰｔ　Ｉ　Ｋより切断され几ベクターｐｋＫ２２
５−３　、ＤＢＭ　５６９４　Ｐ　（Ｂｒｏａｉｕａ等
（１９８１）、Ｆ１ａ１ｌ！ＥＩｉｌ１６．１１２−１
１８参照）中でクローニングし九。ｃＤＮＡの３′−非
翻訳領域の短縮のｋめに１生じるプ２スミトン、Ｐｓｔ
Ｉで開き、Ｂａ１３１に用いて核分解的に短縮させ、引
続き、に−ｅＤＮＡに相応するＥｅＯＲＩ　−Ｂａｌ　
３１〜フラグメｙ　）　’ｉｔ：　Ｈｌｎｌ　［［−リ
ンカ−を用いて、ＥＣＯＲＩ　Ｈｌｎｄ　ｌ［中で切断
されたベクターｐＫＫ　２２３−３中に逆クローニング
させ九生ずるプラスミド’ｇｐＢＴ　１１１と称する（
第１図は、辰現プラスミドの配列を示して−る；ヌクレ
オチド７〜６６３のカッパ）。

１．２１　コリ中ＯＭＡＫ　３５のｒ−鎖０Ｆ（１〜フ
ラグメントの表現の几めのプラス ミドの構成 ｐＢＲ５２２中のＰｓｔＩ−７ラグメントとしてのＭＡ
ＫＫ　３５　　ｒ　−ＣＤＮＡのクローニングは、同様
に文献に記載されていｆｔ　（Ｂｕｃｋｅ１等１９８７
）。

表現の九めに、成熟ｒ−鎖の第１７ミノ識の直前に、オ
リジヌクレオチド指向突然変異形ｇＫより　ＸｍａｘＩ
−切断位置を導入した。ｒ−Ｆ（１〜７２グメントは、
アミノ酸位置２２５の後にストップ−コドンを導入する
Ｃとにより、同じ技術で得られ、この際、付加的Ｋ　Ｂ
ｃｌ　Ｉ−及び８ａｌ　Ｉ−切断位置が導入され九〇生
じるＸｍａ　ｒ−８ａｌｌ−７ラグメント（これは、ｒ
−Ｆ（１〜７ラグメントに関してコードする）　ｙｔ　
ｐｖｃ　Ｂ（Ｖｉｅｉｒａ　＋　Ｍｅｓｓｉｎｇ　（１
９８２）　Ｇｅｍ５１９．２５９〜２６８）中でクロー
ニングしｔ、第２図は、生じた表現プラスミドｐ１０１
６９（ヌクレオチド位ｆ：１２４０−９１９０ｒ−Ｆｄ
）の配列ン示す・ １．３　　１　コリー中の抗体連鎖の貴男表現プラスミ
ドｐＢ’ｌ’　１１１及びｐｌ　０１６９ン、それぞれ
個々に１更に１ａｃ−リプレッサー（１ａｃＩＱ　）の
表現の丸めのプラスばドｔトランスに含有するＥ、コリ
ーＣＤＢＭ　５６８９　）中にトランｘ７オームさ−Ｖ
：丸。仁のＥ、コリー細胞”Ｊｌｌ、Ｂ−培地上で光学
密度ｏＤ５ＩＩＳｏｎｍ−〇、５Ｉ／ｃなる１で培養し
、次いでイソプロピル−β−〇−チオガラクトシド（Ｉ
Ｐ’ｌ’Ｇ　）　Ｉｇ　／　Ｉ　’Ｉｔ導入し、３７℃
で更ＶＣ４時間インキュベートした。最後くい細胞馨遠
心分離した。

１．４　封入体の製造 この九めに、免疫グロブリン鎖１個当夕、８゜コリー（
例１．３参照）細胞湿潤物質約２５ＩｉＹ、）リスＦｉ
ｃＬＯ−１モ”　／　ｊ　、ｐ’　６−５　、ＩＤＴＡ
２０ｍ４ル／ｌ　５８０ＩＩｊ中に入れ、この細胞を剪
断棒（ｔ７１ｚｒａｔｕｒａｘ　）　ン用いてホモｒナ
イズした。次いで、リソチーム０．２５Ｆ／ＩＩＪを添
加し、室温で３０分間インキユベートシ、引続きＮａＣ
Ｊ　ｏ、ｓ　モ”　／　Ｉ　、５　Ｖ／Ｖ　％　）リド
ｙ−ｚ−１００中に懸濁させ、剪断棒（Ｕｌｉｒａｔｕ
ｒａｘ　）を用いてホモｒナイズし、更に、室温で３０
分間撹拌し九。その後、８ｏｒｖａｌｌ　Ｇ８Ａ−ロー
ター中、４℃及び１３０００　ｕｅｐ＋＋ｍｓで５０分
間遠心分離した。ペレットントリスＨ（Ｊ　Ｑ、１モル
／ｌ、ｐＨ６，５、ｇＤＴＡ２０ｍモル／）、２５　Ｖ
／Ｖ係トジトリトン−１００３００鱈中に入れ、ホモｒ
ナイズした。七の後、４℃、１３０００ｕ、ｐ、ｍｓで
８ｏｒｖａｌｌ　Ｇ８Ａ−ローター中で３０分間宛２回
更に遠心分離し友。ベレットントリスＥｌ（Ｊ　Ｏ，１
４ル／Ｉ、ｐＨ６，５、ｇｏＴ人　２００ｍ４ル／　Ｉ
　、　　Ｑ、５　ｖ／ｖ　％　）リドｙｘ−１００３０
０ｍ１Ｊ中に入れ、ホモｒナイズし友。その後４℃及び
１３０００　ｕ、ｐ、ｍ、で８ｏｒｖａｌｌ　Ｇ８Ａ　
−ローター中で３０分間２回遠心分離し、その都屓、そ
の後、ベレットｔトリスＨＣｊＯ，１七ル／！、ｐＨ６
−５ｓ　ＥＤＴＡ　２０　ｍモル／ｌ各々３００―もし
くは２５０１中に入れ、ホモゲナイズしｔ。

例２ 抗体の変性 ハイプリドーマ細胞系（ＥＣＡＣＣ８８０９１４０４）
から得られたＭＡＫ　３５のもしくはそのＦａｂ−７ラ
グメントのりオフイリゼー）　（Ｆａｂ−７ツグメント
の製造の几めＩｌｃは、Ａ、　Ｊｏｈｎｓｔｏｎ及びＲ
＃　Ｔｈｏｒｐｅ　ＯＩｍｍｕｎＯＣｈ６ｍｉａ％ｒ７
　ｉｎ　ｐｒａｃｔｌｃｅ　。

Ｂｌａｃｋｖｒｅｌｌ　８ｃｉｅｎｔｉｆｉｃ　Ｐｕｂ
ｌｉｃａｔｉｏｎｓ　（１９８２）、５２〜５３頁参照
）並びに例１による封入体製剤のベレットχ、トリスＨ
（ｊ　Ｑ、１モル／）、−８，５ニゲ７＝シフＨ（Ｊ、
　　６％に／Ｉｔ　；　ｇＤＴＡ　２４ル／ｌ％Ｄ’ｒ
ｌ　Ｏ，３モル／ｌ中で室温で３時間インキュベートし
た。蛋白質濃度は、４〜６ダ／−であった。連鎖分離は
、非還元性条件下で８ＤＢ　−ＰＡＧＩ　Ｖ用いて検査
し友。ジスルフィド橋の完全な還元は、Ｇ、Ｌ、　ｌｌ
ｌｍａｎ　（１９５９）のＡｒｃｈ、　Ｂｉｏｃｈ＠ｍ
＊　Ｂｉｏｐｈｙｓｅ　　ｆＬＬｓ　７０　Ｋよる遊離
８Ｈ基の測定によりｉ１ｉ％！した。引続き、溶液のμ
値を濃塩酸を用いてｐＨ３に鳴節し友。

復元のための次の例は、例２に記載のように完全に変性
され、還元されたＭＡＫ　５３もしく扛ＭＡＫ　５３　
Ｆａｂ又は封入体からの抗体連鎖を用い、再酸化緩衝液
中での１：１００の稀釈率で、塩酸グアニジン６七ル／
ｌ％ｐＨ２に対する透析により実施し九〇復元パッチを
、２０℃で恒温保持した。

例３ Ｗ区３５−　ｔａｂ−７ツグメントの復元酸化還元緩衝
液は、トリスＥｌ（ＪＱ、１モル／１１゜ｐＨ８−５％
　Ｌ−フルギニン０．５モル／ｌ％ＩＣＤ’ｌ’Ａ２ｍ
モル／１１を含Ｍした・ 蛋白質濃度線３０〜６０μｇ７ｒｔｒｔであった。

復元時間は２００時間１でであり九。再酸化は、配座特
異的なＥＬＩ８Ａ−テスト系（例８）ｙ！ｌ−用いて、
受動免疫活性で検査した。

第１Ａ−１ｃ＊ｈ、活性ＭＡＸ　３３　Ｆａｂ−７ラグ
メントの収率と次の変動数との関係を示している： １人ニ一定３８８Ｇ−濃度（０８８０５ｍモル／ｌ）に
おけるＤＴＡ−濃度； １Ｂニ一定ＤＴＲ濃度（ＤＴＢ３ｍモル／ｌ　）におけ
るＧＩ３８Ｇ濃度： １Ｃニ一定Ｇ８Ｈ濃度（１ｍモル／りにおける０８８Ｇ
濃度。

第１Ａ表 ０８８Ｇ Ｇａ２Ｏ 第１ Ｂ表 （ｍモル／ｌ） 第１ ０表 ｍモル／り 収率（９１ 収率（− ゛例４ 完全に変性され、還元され７ｔ　ＭＡＫ　３５　Ｆａｂ
　−７ラグメントを塩酸グアニジン６モル／ｌ％−２に
対して透析させ、引続き、トリスＨＣＩ　Ｏ，１４＃　
／　Ｊ　ｓ　ｐＨ８，５、ｋｌｌ’ｌＲ／　７　＝　シ
ｙ　Ｏ，３モＡ／　／ｌ　ｓ　　Ｇ８ＢＧ　Ｏ−２４ｋ
　／　Ｊ　ｓ　　Ｇ８Ｈ２ｍ　４　”　／　ｊ及びｇＤ
ＴＡ　２　ｍ　４ル／ｌ中で、２０’Ｏの温度で、約２
００時間の復元時間で再酸化する。第２表は、活性ＭＡ
Ｋ　５３　Ｆａｂの収率と復元時の蛋白質濃度の変化と
の関係を示す。再酸化は、ＥＬＩ８Ａ−テスト系を用い
て能動免疫反応体（ａｋｚｉｖＩｊｍｕｎｒｅａｋｔ＋
１ｖｉｔ５Ｌ＠％　）　（例８）で検査し九〇第 表 ｔａｂ−濃度 （μｍ１．ｈｌｌ） 収率 ＜’Ａ） 例５ 完全に変性され、還元され７ｔＭＡＫ　５３抗体ン塩酸
グアニジン６−１ニル／ｌ％ｐＨ２に対して透析させ、
引続きトリスＨ但０．１４ル／ｌ、ｐＨ８，５、Ｌ−フ
ルーエン０．５４ル／　ｊ　ｓ　ＩＣＤＴＡ　２　ｍ　
％　”／ｌ、Ｇ８Ｈ１ｍモル／！中で２０℃の温度でか
つ約２００時間の復元時間で再酸化する。この再ＩＩ　
化Ｂ　、ＷＬＩ　８Ａ−テスト系（例８）ｖ用いて能動
免疫反応性で検査した。第３表は、一定Ｇ８Ｆ！濃度（
１ｍモル／１）ｆｃおける活性抗体の収率と０８８Ｇ濃
−度の変動との関係を示す。

第　　３　　表 （）８８Ｇ （ｍモル／ｌ） 収率（１） ２．０ ３・５ ４．７ ４．８ ４・２ ３．９ ６・４ ２・７ 例６ 混合ジスルフィドへの誘導体化後の復元ＭＡＫ　Ｓ　３
もしくはＭＡＫ　３３　Ｆａｂの変性７１例２の記載の
ように実施しｔ０次いで、塩酸グアニジン６モル／ｌ％
ｐＨ８に対して透析させ、引続き、塩酸グアニジン６モ
ル／ｌ％（）８８Ｇ　Ｏ，２モ５ｚ７１．　　）　＋）
ｘｎｃｊＯ＊１５ｅｓｐ／１％ｐＨ８，５を用い、室温
で約５時間にわたって誘導体化し几。塩酸グアニジン６
モル／ｌ％ｐＨ２，４Ｋ対する新友な透析の後に、種々
の変法で復元を実施する：第４Ａ貴はＭＡＫ　５５　Ｆ
ａｂ　’ｒ　）リスＨ（ＪＯ６１モル／ｌ％ｐＨ７、Ｌ
−フルギニン０．５モル／Ｉ　％ＥＤＴＡ　２　ｍモル
／）中で、２０℃で約２００時間にわ九る復元χ示して
いる。この変性は、配座特異性ＢＬＩ　８Ａ−テスト系
を用いて、受動免疫反応性（例Ｆ３　）　Ｙ　Ｇ８Ｈ−
濃度との関連で試験した。

第４Ｂ表は、０８Ｈ２ｍモル／ｌｔ有する前記緩衝液中
の活性ＭＡＫ　３３Ｆａｂの収率と緩衝液の−との関係
χ示している。

第５Ａ費は、トリｘ　ｎａｊＯ，１４＃　／ｌ、　ｐＨ
７、Ｌ−アルギニン０．５モル／ｌ％ＥＤＴＡ２ｔ１ｍ
モル／ｌ中、２０℃の温度における、約２００時間の変
性時間にわ危るＭＡＫ　３５　ＩｇＧの復元と０８Ｈ濃
度との関係を示している。配座特異性！！：ＬＩ８Ａ−
テスト系ン用いて、受動免疫反応性（例８）で、この復
元ン検査した。

第５Ｂ表は、Ｇ８Ｈ２ｍモル／１ｗ：有すル前記緩衝液
中での活性抗体の収率とβ値の関係ヶ示している。

第４Ａ表 ０８Ｈ（ｍモル／り　　　　　　　収率（＊）０．１ ０．５ 第４Ｂ狭 収率幡） 第５Ｂ景 ３．９ ３．８ ２．９ １．５ ０．８ ０．６ 第５Ａ費 Ｇ８Ｈ（ｍモル／ｌ） 収率（憾） ０．１ ０・２ ０．５ ０．３ ３．０ ４．０ ３．８ ３．１ ２．５ ２．０ １．４ １・４ 例７ Ｅ、コリー中で表現され次抗体連鎖の復元相補的−本領
の封入体（に及びＦ（１、例１）を例２の記載と同様に
可溶化さＪｔた。引続き、塩酸グアニジン６モル／ｌ、
ｐＨ２に対して透析さ４ｔ７ｔｏ可溶化及び透析χ双方
の鎖に、対して側割に行なり九。

再酸化の九めに１当モル量の還元された一本鎖を同時に
、１００倍量のトリス−Ｈα０．１モル／ｌ、ｐＨ８−
５、Ｌ−フルギニｙ０．６モル／ｌ、０８８Ｇ　Ｏ，１
！Ｉｎモ”／１％Ｇ８Ｈ１！ＩＩ七ル／ｌ及びｇＤＴＡ
　２　ｍ　４ル／ｌ中で稀釈し次。復元は、２０℃で２
００時間にわするイ／中ユペーションにより行なつ九◎ 自然の生物学的活性蛋白質の収率は、１８１であり九。

本来の抗体分ｔ１受動免疫反応性の測定（例８）Ｋより
測定し穴。

例８ 受動及び能動免疫反応性並びに阻害活性の立証 ８．１　　　モノクローナル抗体のヒ）　−ＣＫ　−Ｍ
Ｎ（ヒトクレアチンキナーゼの骨格筋イ ソ酵素）Ｋ対する受動免疫反応性の立 証 ここで「受動免疫反応性」とは、本来のもしくは変性さ
れ九抗体上での天然構造の工ｆ）−プの形成と解される
。この二１’トープの探索は、他の株属の動物（Ｃ仁で
は羊）から得られる配座骨異性抗−マウスー抗体によ５
　ＢＬＩ８Ａ−テスト系で行なう。

配座特異性ポリクローナル羊−抗−マウス−ＩＰａｂ−
抗体の製造。

ポリクローナルマウス−免疫グロブリンに対する抗血清
ＹＡ、ジョンストン（Ｊｏｈｎｓｉｏｎ　）及びＲ，）
ルペ（Ｔｈｏｒｐｅ　）によるイムノケミストリイ・イ
ｙ−プラクテイス（Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｉ
ｎ　Ｐｒａｃｔｉｃｅ　、　　Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ　５
ｃｉｅｎｔｉｆｉｃＰｕｂｌｉｃａｔｉｏｎａ　、　　
０ｘｆｏｒｔ、　　１９８２．２７−３１頁）により、
羊中で製造し次。

この抗血清のＩｇＧ−７ラクシヨンン、ジョン＜（トン
及びトルペの文献４４〜４６頁により、硫酸アンモニウ
ム分画及びＤｇＡ３−イオン交換体クロマドグ２フイに
よシ単離し几。

このＩｇＧ−フラクション５００■ン、マウス−キャッ
プ連鎖−ス７エロシル免疫吸層剤（マウス−に−鎖１．
５ダ／スフエロシルＩＬｔ）２０ＭＫ、酵素免疫試験で
抗−マウス−に−活性が検出不能になる１で繰り返し吸
着させ九。次いで、このＩｇＧ　−７２クションχマウ
ス−Ｆａｂ−ス７ェロシルー充填体２０ｄ（マウス−Ｆ
ａｂ　１５ダ／スフエロシルＩＬｔ）ン有するカラムン
通し、特異的に吸着され＊Ｘｇ（）−フラクション分ン
グリシン０．２モル／ｌ％ｐＨ２，８で溶離させ比。酢
酸１ｍｍシルｊに対する透析の後に、この部分フラクタ
ヨｙｔ凍結乾燥させた。

免疫試験により、このようＶＣ１！！透されｇＩｇＧは
、遊離のＭ−＆−Ｍ−ｒ−Ｍ−Ｆ（１〜鎖とは反応しな
いか又は不完全に折りｔ几１れｔＭ−に７Ｍ−Ｆ（１〜
錯体と反応することが確認された。代りにＭ　−Ｆａｂ
ＳＭ　−ＺｇＧ及び完全に折り７ｔ７ｔｌｔＬ７ｔＭ　
−＆／Ｍ　−Ｆ（ｌもしくはＭ−に７Ｍ−ｒの錯体と結
合する。

復元抗体及び本来の標準試料ン配座特異性抗−マウス−
Ｆａｂ−抗体と共に前イノキュベートし几。天然で形成
された配座工ｔトープの数に応じて、配座特異性抗−マ
ウスーＦａｂ−抗体の種々の多数の結合位置は飽和され
九〇前インキュペーショｙＭ液ンマウス抗体−酵素一接
合体（抗体−ペルオキシダーゼ−接合体）と共Ｋ。

壁がマウス抗体で被覆されｔ試験管内に入れ九。

羊からの不飽和配座骨異性抗マウスー抗体な、次いで壁
結合され九マウス抗体χマウス抗体−酵素−接合体と架
橋させ、この際、結合し几接合体の量は、前インキュベ
ーション溶液中の天然もしく拡変性抗体の量に間接的に
比例する。

分光学的立ｆ、は、抗体−接合酵素による色原性基質入
ＢＴ８■（、２、２’−７ジノービスー（３−エチルベ
ンψチアψす／−６−スルホネート）の変換の後に、４
０５ｎｍでの吸収測定くより行なり７ｊ（Ｆｌ、υｍ　
Ｂｅｒｇｍｅｙｅｒ　Ｉ　１１　Ｍｅ　ｔｈ　ＩＩ　１
ｎＢＫＩ！＋７１１０１．第３版、第９巻　１５−３７
頁）。

８．２　４ツクロ一ナル抗体の能動免疫反応性の立証 ＭＡＫ　５５１ＫＧは、特異的にヒトクレアチンキナー
ゼの骨格筋−イソ酵素ｖｉＩ識する（　ＣＫ　−ＭＭ　
：　Ｐ、　Ｂｕｃｋｅｌ等のＧｏｎｅ　５１　（１９・
８７　）、１３〜１９） ここで、能動免疫反応性とは、本来のもしくは復元され
次抗体と特異抗原（この場合ヒト−ＣＫ　−ＭＭ　）と
の反応である。

ＥＬＩ８Ａ−テスト系中で、この反応ン、酵素−接合さ
れｔポリクローナル抗−マウス−抗体を用いて色原性基
質ＡＢ’Ｉ’８の変換ン介して比色計により定量的に測
定し几。

８．３　　モノクローナル抗体の抑制活性の立証ＭＡＫ
　３３　ＩｇＧは、骨格筋特異性のイソ酵素ＣＫ　−Ｍ
ＭのＭ下位単位上にのみ形成される工ｆトープ’ｔ’ｇ
識する。このエピトープへの結合により、酵素活性は８
０憾だけ抑制される（Ｐ。

Ｂｕｃｋｅ１等１９８９）、従って、このＣＫ　−ＭＭ
−抑制テストナ、完全な変性及び還元後のＷＳ２の再構
成χ立証する九めの非常に有効なテストである。それと
いうのも、完全に復元され九抗原結合位蓋のみｔこの酵
素嫁抑制できるからである。

クレアテｙΦナーぜの活性ｔ、ペーリンガー社（Ｆｉｒ
ｍａ　Ｂｏｅｈｒｉｎｇｓｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　）の
カップリングされ次酵素テストｖ用いて測定した（　Ｈ
。

Ｕ、　Ｂｓｒｇｍｅｙｅｒ　、　Ｍ＠ｔｈ、　ｏｆ　Ｅ
ｎｚｙｍ、　Ａｎａｌｙａｉｓｓ　。

第３版、■巻　５１０“〜５４０頁）。この場合、クレ
アチンキナーゼは、クレアチンホスフェート及びＡＤＰ
　Ｙクレアチン及びＡ’Ｉ’Ｐ　Ｋ変換する。

比色法で立証可能な反応ン得る究めに、生じたＡＴＰ　
Ｙグルコースｔホスホリル化するヘキソキナーゼにより
消化させてグルコース−６−ホス７！−）Ｋする。グル
コース−６−ホスフェ−）Ｙ／グルコース６−ホスフエ
ートテヒドロｒナーゼによりＮＡＤＰ◆からのＮＡＤＰ
Ｈ＋　Ｈ＋の形成下に酸化して、グルコネート−６−ホ
スフェートとする。１分間歯シの吸光度変化から、クレ
アチンキナ−ぜの活性を計算することができる。

ＯＫ　−ＭＭに対する天然抗体を用いる較正曲線から、
復元パッチ中の抑制作用に相当する本来の物質の量を測
定することができる。復元パッチ中の全蛋白質に対する
抑制活性蛋白質分は抑制活性抗体の収率（憾）ン示す。

８．４　　　受動／能動免疫反応性及び抑制活性を用い
る復元収率の比較測定 完全に変性され、還元され＆　ＭＡＫ　５３−　Ｆａｂ
−フラグメントを塩酸グアニジン６モル／ｌ１ｐＨ２に
対して透析させ、引続きトリス−ＨＣＪＯ６１モル／ｌ
％ｐＨ８，５、Ｌ−アルギニン０．５モル／　ｊ　、　
０８８Ｇ　Ｏ，２ｍモル／ｌ、ＧＥｌｆｉ２ｍモル／ｌ
及びＴＢＤＴ）、　２ｍモル／ノ中の１：１００の稀釈
、２０℃の温度、かつ約２００時間の復元時間で再酸化
する。

抑制活性の測定時に使用されるべき比較的高い抗体濃度
に基づき、この復元パッチを濃縮し友。更に、この復元
溶液ン酢酸１ｍモル／ｌに対して透析させ、−引続き凍
結乾燥させた。この凍緒乾燥物ＹＨ雪０中に入れ（ＨＩ
Ｏ：復元量−１：２００）、燐酸カリウム５０ｍ４ル／
　ｌ　５Ｎａ（ｊ　Ｏ，１５４ル／ｌ、ｐＨ７，５に：
対して透析さＪｔ九〇 第６表扛、受動／能動免疫反応性により測定された透析
液中の活性Ｆａｂ−７２グメントの収率を示す・ 第　　６　　表 テスト法 収　率（（転） 受動免疫反応性 能動免疫反応性 抑制活性 例９ Ｅ、コリーからのｔ−ＦＡの活性化 ・Ｅ、コリー（ＤＢＭ　５６８９　）からの細胞湿潤物
質から、プラスミド１）ＩＰＡ　１３３　（欧州特許第
０２４２８５５号）９１：用いて形質転換させ、例１．
４に記載のように封入体ｔペレットとして調製する。

仁の封入体製剤のベレツｌ’、）す、スーＨＣｊＯ０１
モル／ｌ％ｐＨ８，５、グアニジンＨα０．６そＡｓ／
　Ｉ　％ＩＤＴＡ　２　ｍモル／ノ、ＭＩ　Ｑ、３モル
／１中、室温で、蛋白質濃度４〜６１１９／１ｊでイン
キュベートしｔ、この可溶化に引続き、濃塩酸を用いて
、この溶液の出値′％：５に調節し丸。還元剤及び緩衝
剤成分馨、グアニジン−ＨＣＪ、　６モル／ｌ％ｐ）１
２．４°ＯＫ対する透析により分離し’ｆｌ−。

ｔ−ＰＡの復元 こうして得られ比変性され、還元され７を蛋白質の復元
は、トリス−ＨＣｊ　Ｏ，１七ル／ｌ１〜１０．５、Ｌ
−フルギニン０．５モル／ＪＳｇｐｒＡ１ｍモル／！及
び牛血清アルブミン１　ｍｙｌＩＩＬｔ中での稀釈によ
り行なりｉ０蛋白質濃度は１０〜３０μｍ１７Ｎ％温度
は２０℃及び再結合時間は２４時間であり九。

再活性化ｔ１ペーリｙｔｒ−社（ＦｉｒｍａＢｏｓｈｒ
ｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）のｔ、ＰＡ
−標準（整理番号１０８０９５４）に関する試験法で測
定し几。第７Ａｌｔ及び第７Ｂｆｉ！は、活性ＳＰＡの
収率と次の変数との関係を示すニ アＡニ一定り’Ｉ’Ｅ濃度（２ｍｍシル／１ＩＩＣおけ
るＧ３８Ｇ−濃度 ７Ｂニ一定Ｇ３１（濃度（１ｎモに／１）ＩＩＣおける
Ｇ８ＢＧ−濃度 第７Ａ表 ０８８０　　（ｍａｅニル／ｌ　） 収率（→ 第７Ｂｌ！ 例１０ 誘導体化して混合ジサルファイドにすることによる１ｃ
２ｐ（ｔ−ｐＡｐ導体、西ドイツ骨杆第３９０３５８１
号参照）の復元 西ドイツ特許第３９０３５８１号明細書に記載のように
、プラスきドｐＡ２７ｆｄ　及びｐＵＢ８５００で形質
変換され九Ｅ、コリー（Ｄ８Ｍ２０９５）の細胞を培養
し、細胞湿潤物質ン収得する。この細胞湿潤物質から例
９に記載のように、変性され、還元され几蛋白質が得ら
れる。

グアニジｙ−Ｆｉ（Ｊ６４ル／１％ｐＨ２中のこの変性
され、還元され几蛋白質の溶液ｙ、０８８Ｇで０．１モ
ル／ｌに、トリスで０．１モル／ＩｔＩＣ調整し九。引
続き０、−値％’　ＮａＯＨン用いてｐＨ８，５Ｋｌ１
節し穴。室温で２時間のイン中ユペーションの後に、酸
化剤及び緩衝剤成分ｔ１新たなグアニジン−Ｈｃｔ６モ
ル／ｌ％ｐＨ２，４℃に対する透析忙より分離し九。

変性嘔れ、酸化され九蛋白質（混合ジサル７アイド）の
復元は、復元緩衝液中での稀釈により行なった。この蛋
白質濃度は、３０〜６０μＩ／−、温度は２０℃及び復
元時間は１２時間であり尼。

第８Ａｌ！は、トリス−ＨＧ０．１モル／１１〜８”５
、Ｌ−アルギニン０．８崎ル／Ｊ、ＫＤ’ｌ’Ａ２ｍモ
ル／ｌ中のに２Ｆの再活性化とＧＩ９Ｈ−濃度との関係
χ示す。

第８Ｂ表は、０８ＨＯ，５ｍモル／！χ有する前記緩衝
液中での活性に２Ｆの収率と緩衝液のβ値との関係χ示
す。

第８Ａ表 ０８Ｈ（ｍモル／ｌ）　　　　　収率（４）０．１ ０．５ １．４ 第８Ｂ表 収率

【図面の簡単な説明】

第１図はＭＡＫ　３３のに一鎖（ヌクレオチド位ｆｔ７
〜６６３）の表現のためのプラスミドｐＢＴ１１１の配
列χ示す図であり、第２図線、ＭＡＫ３３のＦ（１〜鎖
（ヌクレオチド位ｆｌｔ２４０−９１７）の表現の丸め
のプラスミドｐ１０１６９の配列ン示す図である。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、変性及び還元性条件下での可溶化による細胞溶解及
   び酸化及び復元条件下での引続く再活性化により、遺伝
   子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性
   蛋白質を活性化する方法において、１〜１０００μｇ／
   ｍｌの蛋白質濃度で操作し、可溶化と再活性化との間で
   、１〜４のｐＨ値を有し、塩酸グアニジン４〜８モル／
   ｌ又は尿素６〜１０モル／ｌを含有する緩衝液に対する
   透析を行なうことを特徴とする、遺伝子工学で製造され
   、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化す
   る方法。 ２、透析緩衝液は塩酸グアニジン５〜７モル／ｌを含有
   する、請求項１記載の方法。 ５、再活性化を、９〜１２のｐＨ値、０．１〜２０ｍモ
   ル／ｌのＧＳＨ濃度、０．０１〜３ｍモル／ｌのＧＳＳ
   Ｇ濃度でかつ非変性性濃度の変性剤を用いて、１〜３０
   ０時間にわたつて実施する、請求項１記載の方法。 ４、再活性化工程で、まず、変性条件下で ＧＳＳＧの添加により蛋白質のチオール基を蛋白質の混
   合ジスルフィドとグルタチオンに変じ、改めて、塩化グ
   アニジン又は尿素を含有する緩衝液に対して透析させ、
   次いで６〜 １０のｐＨ−値、０．１〜５ｍモル／ｌのＧＳＨ濃度で
   、かつ非変性性濃度の変性剤を用いて、１〜３００時間
   にわたり再活性化させる、請求項１又は２記載の方法。 ５、再活性化工程で、変性剤として、アルギニン、塩酸
   グアニジン及び／又は少なくとも１種の式：Ｒ＿２−Ｃ
   Ｏ−ＮＲＲ＿１（ I ）（式中Ｒ及びＲ＿１は、Ｈ又は
   Ｃ−原子数１〜４のアルキル基であり、Ｒ＿２はＨ又は
   Ｃ−原子数１〜３のアルキル基である）の化合物を使用
   する、請求項３から４までのいずれか１項記載の方法。 ６、再活性化の工程で、非蛋白質分解作用蛋白質の存在
   で、殊に牛血清アルブミンの存在で操作する、請求項１
   から５までのいずれか１項記載の方法。 ７、再活性化の工程でＥＤＴＡ１〜１０ｍモル／ｌの存
   在で操作する、請求項１から６までのいずれか１項記載
   の方法。 ８、可溶化の工程で、アルカリ性ｐＨ値で、メルカプタ
   ン類からの還元剤の存在で、かつ変性剤の存在で操作す
   る、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。 ９、抗体もしくは抗体フラグメントを再活性化させる、
   請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。 １０、ｔ−ＰＡ又はｔ−ＰＡ−類似作用蛋白質を再活性
   化させる、請求項１から９までのいずれか１項記載の方
   法。