KR920010873B1 - 유전자 공학적으로 생성되고 원핵생물내 발현된 항체의 활성화 방법 - Google Patents

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Abstract

내용 없음.

Description

유전자 공학적으로 생성되고 원핵생물내 발현된 항체의 활성화 방법
제1도는 MAB 33의 카파 사슬의 발현에 대한 플라즈미드 pBT III의 서열을 표시한다.
제2도는 MAB 33의 Fd 사슬의 발현에 대한 플라즈미드 p10169의 서열을 표시한다.
본 발명은 유전자 공학적으로 생성되고 원핵생물내 발현된 생물학적 활성 단백질의 활성화 방법에 관한 것이다.
이형의 숙주 생물내 항체같은 단백질의 유전자 공학적 생성으로 불활성이고 불용성인 단백질 응집체, 즉 소위 “봉입체(inclusion body)”가 형성된다. 이러한 “봉입체”의 형성은 특히 발현의 경우에 생기는 세포내 높은 단백질 농도의 결과이다. 생물학적으로 활성인 단백질을 얻기 위해, 봉입체가 변성과 환원으로 용해된 다음 이것의 원래 공간적인 형태인 단백질의 입체 구조가 적당한 용액 조건을 조절하므로써 만들어져야 한다(M. Sela와 그의 동료, 125, 691/1957참조). 폴딩(folding)된 것이 완전하게 펴지는 것은 예를들어 우레아나 구아니딘 같은 고농도의 캐오트로픽 에이젼트(chaotropic agent)를 부가함에 의해 이루어진다(R. Jaenicke, Prog. Biophy. Molec. Biol., 49, 117-237/1987). 이황화 결합의 환원을 위해, 강한 환원제, 예를들어 β-머캅토에탄올 또는 1,4-디티오에리트리톨이 사용된다.
그러나, 변성된 상태로부터 재생하는 경우, 두개의 경쟁적인 반응이 일어난다. 원래 상태로의 원하는 폴딩외에, 응집체 형성이 관찰된다(G. Zettlmeissl과 그의 동료, Biochemistry, 18, 5567). 평형을 원래의 분자에 가깝게 변화시키기 위해, 한편으로 불확실하게 폴드되어 더 불안정한 분자를 만드는 것과 응집체로의 이것의 비특이적인 교환 작용을 막고 한편으로 원래의 상태로 폴딩하는 것을 방해하지 않는 조건이 선택된다. 이것은 변하기 쉬운 농도의 캐오트로픽 에이젼트를 부가함에 의해 이루어진다. 부가하여, 단백질 농도가 재생 수율에 결정적인 영향을 미치는 것이 관찰되어야 한다(유럽 특허 명세서 제0,241,022호 참조). 원래 상태의 이황화 결합된 단백질의 경우, 부가적으로 불확실하게 쌍(pair)으로 된 시스틴을 환원시킬수 있고 정확하게 쌍으로 만들 수 있게 하는 산화 환원 조건이 재생하는 동안에 제공되는 것이 또한 필요하다. 환원된 티올 시약 및 산화된 티올 시약의 소위 “옥사이도-셔플링(oxide-shuffline) 용액”은 원래의 구조를 가지며 이황화 결합된 단백질의 수율을 증가시킨다.
항체의 재생은 완전한 변성후에 가능하며 환원은 Fab 단편을 이용해 Haber에 의해 처음으로 나타났다.(E. Haber, Biochemistry, 52, 1099-1106/1964참조.) 수율은 12-14%에 달한다. 이러한 결과는 Whiteny와 Tanford에 의한 Fab 단편의 재생으로 확인되었다. 이들은 8%의 수율을 얻었다(P. L. Whitney and C. Tanford, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 53, 524/1965 참조). 완전한 항체가 Freedman과 Sela에 의해 처음으로 성공적으로 재생되었고 수율은 20-25%이다.(M. H. Freedman and M. Sela, J. Biol. Chem., 241, 2388-2396/1966; J. Biol. Chem., 241, 5225-5232/1966 참조). 원래의 출발 분자가 가용성의 향상을 위해 폴리알라닐화 되었음을 주의해야 한다.
인용된 연구서의 경우, 이것이 다클론(polyclonal) 항체나 항체 단편, 즉 다른 파라토프(paratope)와 다른 친화항수를 갖는 항체의 혼합물에 관한 것임이 관찰된다. 이러한 이형 집단의 중쇄(heavy chain)와 경쇄(light chain)가 재생의 경우에 통계학적으로 순수하게 결합하므로, 결합 특이성과 친화력에 대해 원래의 분자와 일치하지 않는 재생된 분자가 생성된다. Escherichia coli내에 클론(clone)되어 발현된 기타 진핵 단백질의 경우처럼, Escherichia coli내에 발현된 항체의 중쇄와 경쇄가 또한 불용성 “봉입체”의 형태로 얻어진다(S. Cabilly와 그의 동료, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3273-3277/1984; M. Y. Boss와 그의 동료, Nucleic Acids Research, 12, 3791-3806/1984참조). 변형된 미생물로부터의 항체에 대해, 기능적인 항체의 재생을 가능하도록 하는 방법들이 Cabilly와 그의 동료 및 Boss와 그의 동료에 의해 기술되었다. 그러나, 단클론 항체에 대해, 이들 방법들은 단지 약 0.2-5%의 수율을 제공한다.
그러므로, 원핵생물내에 발현된 생물학적 활성 단백질의 재활성화 방법을 제공하는 것이 본 발명의 목적인데 발현후에 “봉입체”의 형태로 얻은 단백질은 양호한 수율의 그것의 재생된 활성 형태로 전환될 수 있다.
그러므로, 본 발명에 따라, 변성 및 환원 조건하에서 가용화하고 연속해서 산화 및 재생 조건하에서 재활성화함에 의해, 유전자 공학적으로 생성되고, 원핵생물내에 발현된 생물학적 활성 단백질을 활성화하는 방법이 제공되는데 이것을 1-100㎍/ml의 단백질 농도로 행하고 가용화와 재활성화 사이에 투석을 4-8mole/ℓ 구아니딘 하이드로클로라이드나 6-10mole/ℓ 우레아를 함유하는 pH 1-4의 완충액에 대해 행한다.
놀랍게도, 우레아, 특히 구아니딘 하이드로클로라이드의 존재에서 투석한후에 상당히 많은 수율의 활성 단백질이 재활성화후에 얻어짐을 알았다.
본 발명은 원핵생물내 유전자 공학적으로 생성된 모든 생물학적 활성 단백질의 경우에 사용하는데 적당하며 특히 항체 및 이것의 단편에 및 t-PA와 t-PA 같은 단백질 및 이것의 유도체에 적당하다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 투석 완충액은 5-7mole/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유한다.
재활성화의 경우, 변성시키지 않는 농도의 변성화제와 함께 9-12의 pH값, 0.1-20mmole/ℓ의 GSH 농도, 및 0.01-3mmole/ℓ의 GSSG 농도로 행하는 것이 바람직하며 1-300시간에 걸쳐 재활성화를 행하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게, GSH 농도는 0.2-10mmole/ℓ이고 GSSG 농도는 0.05-1mmole/ℓ이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 재활성화 단계에서, 항체의 티올 그룹은 우선 변성 조건하의 GSSG 부가에 의해 글루타티온과 항체의 혼합된 이황화물로 전환되고 구아니딘 하이드로클로라이드나 우레아를 함유하는 완충액에 대해 다시 투석된 다음 변성시키지 않는 농도의 변성화제와 함께 6-10의 pH, 및 0.1-5mmole/ℓ의 GSH 농도에서 1-300시간 동안 재활성화된다.
일반적으로, 변성화제로서, 산화 조건이나 아르기닌하에서 활성화하는데, 통상적으로 이용된 변성화제가 사용될 수 있다. 변성화제로서, 바람직하게 아르기닌, 구아니딘 하이드로클로라이드 및/또는 최소한 하나의 다음 구조식 화합물이 사용된다.
R2-CO-NRR1(I)
식중, R 및 R1은 수소 원자 또는 C4까지의 알킬기이며 R2는 수소 원자 또는 -NRR1또는 C3까지의 알킬기임.
이러한 변성화제는 또한 혼합물의 형태로 사용될 수 있다. 아르기닌 및/또는 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도는 바람직하게 0.1-1.0mole/ℓ, 특히 0.25-0.8mole/ℓ이다. 구조식 I 화합물의 농도는 바람직하게는 0.5-4mole/ℓ, 특히 1-3.5mole/ℓ이다.
본 발명의 또다른 바람직한 구체예에서, 재활성화 단계는 이종 단백질의 존재에서 행해진다. 이와 같이 일반적으로 단백질 분해적으로 작용하지 않을만큼 긴 어느 이종 단백질이 사용될 수 있다. 1-3mg/ml양인 소의 혈청 알부민(BSA)을 사용하는 것이 바람직하다. BSA를 부가하므로써 표면 변성 및/또는 단백질 분해적 파괴를 막게 되어 단백질의 안정화 및 수율이 다소 증가한다.
통상의 방법 조건은 재활성화 단계에 대해 선행 업계에 공지된 일반적인 조건에 상응할 수 있다. 재활성화는 유리하게 약 5℃-30℃의 온도 바람직하게 10℃의 온도에서 행해진다. 세포분해, 가용화(가용화, 환원)같이 투석과 재활성화 단계(재산화/활성화) 전의 단계 및 다음 단계들은 이형적으로 발현된 단백질이나 t-PA의 재활성화에 대해 선행 업계에 공지된, 예를들어 유럽 특허 명세서 제 A-0,114,506호 및 제A-0.093,169호에 공지된 통상적인 방법으로 행해질 수 있다. 그러나, 수율과 재활성화에 대해 최적인 결과를 위해, 본원에 설명된 하나 이상의 개발된 방법에 주의하는 각각 또는 모든 방법 단계를 행하는 것이 유리할 수 있다.
세포분해는 이 목적을 위한 통상적인 방법, 예를들어 초음파, 고압 분산 또는 리소자임에 의해 행해질 수 있다. 이것은 바람직하게 현탁 매체로서 중성을 약산성의 pH 값으로 조절하는데 적당한 완충 용액내, 예를들어 0.1mole/ℓ 트리스(Tris)/HCl내에서 행해진다. 세포분해후, 불용성 성분(봉입체)은 어느 원하는 방법, 바람직하게는 원심분리나 여과에 의해 분리된다. 임의로 트리톤(Triton) 같은 온화한 세척제를 부가하면서 예를들어 물, 인산염 완충 용액같이 가능한 이종 단백질을 용해시키지만 단백질을 방해하지 않는 시약으로 세척한 후에, 침전물(펠릿)을 가용화(가용화/환원)시킨다.
가용화는 바람직하게 머캅탄 그룹을 지닌 환원제 및 변성화제의 존재내 알칼리 pH 범위, 특히 pH 8.6±0.4에서 행해진다.
변성화제로서, 가용화에 대해 선행 업계에 공지된, 예를들어 유럽 특허 명세서 제A-0,114,506호에 공지된 통상적인 것, 특히 구아니딘 하이드로클로라이드 또는 구조식 I 화합물이 사용될 수 있다. 이것은 유리하게 6mole/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드 농도 또는 8mole/ℓ의 구조식 I 화합물 농도에서 행해진다.
머캅탄 그룹으로부터의 환원제로서, 예를들어 약 50-400mmole/ℓ 농도의 환원된 글루타티온(GSH) 또는 2-머캅토에탄올 및/또는 특히 예를들어 약 80-400mmole/ℓ 농도의 디티오에리트리톨(DTE) 또는 디티오트레이톨(DTT), 또는 시스테인이 사용될 수 있다. 가용화는 유리하게 주변온도에서 0.5 내지 여러 시간, 바람직하게 2시간의 인큐베이션 시간동안 일어난다. 대기 산소에 의해 환원제가 산화하는 것을 막기 위해, EDTA를 바람직하게 1-10mmole/ℓ의 양으로 부가하는 것이 또한 유리할 수 있다. 가용화/환원외에, 가용화 단계는 또한 많은 부분의 이종 단백질이 용액에 들어있지 않으므로 정제 효과를 갖는다.
본 발명의 또 다른 구체예는 재활성화 단계전에 글루타티온 및 원핵생물내 발현된 생물학적 활성 단백질의 혼합된 이황화물의 형성에 의존한다. 혼합된 이황화물의 형성에 대해, 환원제가 없는 투석되고 환원된 단백질은 변성화제를 함유하는 GSSG의 희석 용액, 예를들어 0.2mole/ℓ와 함께 인큐베이트 된다. 활성화는 산화제를 분리해낸 후에 변성시키지 않은 농도의 변성화제와 함께 0.1-5mmole/ℓ의 GSH 농도 및 6-10의 pH 값에서 구아니딘 하이드로클로라이드와 우레아를 함유하는 완충액에 대해 1-300시간 동안 반복하여 투석시킴에 의해 일어난다.
기타 모든 반응 단계에서, GSSG와 혼합된 이황화물의 형성에 의한 단백질 활성화는 이미 앞에서 기술한 본 발명의 부분의 단백질 활성화에 대한 구체예에 상응한다. 이러한 구체예의 경우, 최적 pH는 6-8이고 활성화된 단백질은 재생 완충액내에서 비교적 오랜 시간 동안 안정하다.
본 발명에 따라, 예를들어 원핵생물내 발현된 재활성화 단백질이 항체인 경우 30%까지 수율의 면역 반응성과 함께 재활성화하는 것이 가능하다. 이것은 선행 업계에 공지된 방법 수율의 약 10배에 해당한다. 본 발명에서 항체라 함은 일반적인 이것의 단편을 의미한다.
다음 실시예는 도면에 대한 언급과 함께 본 발명을 설명하기 위해 주어진다. 다른 언급이 없으면 퍼센트는 중량 퍼센트이다.
제1도는 MAB 33의 카파(kappa) 사슬(누클레오타이드 위치 7-663)의 발현에 대한 플라즈미드 pBT III의 서열을 표시하며; 제2도는 MAB의 Fd 사슬(누클레오타이드 240-917)의 발현에 대한 플라즈미드 p10169의 서열을 표시한다.
[실시예 1]
[Escherichia coli내 항체 단편의 발현]
1·1 Escherichia coli내 MAB 33 카파 사슬이 발현하는 것에 대한 플라즈미드의 구성
pBR 322내 Pst I 단편으로서 MAB 33의 카파 cDNA를 클로닝하는 것이 기재되었다. (P. Buckel 및 그의 동료에 의한 Gene, 51, 13-19/1987). 제한 엔도뉴클레아제 Mnl I에 의해, cDNA는 숙성 카파 사슬의 5′에 이웃해 있는 첫번째 아미노산 코돈에서 즉시 분해되고 Eco RI-Pst I 단편으로서 어댑터(5‘CATGAATT3’로 혼성된 5‘GATG3’) 223-3, DMS 3694P로 되고, 또한 Eco RI 및 Pst I으로 분리된다(Brosius 및 그의 동료에 의한 Plasmid, 6, 112-118/1981 참조). cDNA의 3′에서 해독되지 않은 부분을 짧게 하기 위하여, 결과의 플라즈미드가 Pst I으로 열렸고 Bal 31로 핵정도로 짧아졌으며 연속해서 kappa cDNA에 상응하는 Eco RI-Bal 31 단편은 Hind III 링커로 클론되어 벡터 pKK 223-3으로 분해되었다. 결과의 플라즈미드는 pBT III(수반하는 도식중 제1도는 발현 플라즈미드의 서열을 나타낸다:뉴클레오타이드의 7-653위치로부터 얻은 카파)으로 표시된다.
1·2 E.coli내 MAB 33의 감마 사슬의 Fd 단편이 발현하는 것에 대한 플라즈미드의 구성
Pst I 단편으로서 MAB 33 감마 cDNA를 pBR 322로 클로닝하는 것이 또한 기재되어 있다(Buckel 및 그의 동료에 의한 v. 상기 문헌 참조, 1987). 발현을 위하여 숙성된 감마 사슬의 첫번째 아미노산 바로 앞에 올리고뉴클레오티드로 지시된 무타게네시스로 Xma I 분해 위치를 도입하였다. 동일한 방법으로 아미노산 225 다음에 스탑 코돈을 도입하여 감마 Fd 단편을 만들었는데, 이 경우 Bcl I 및 Sal I 분해 위치가 부가적으로 도입되었다. 감마 Fd 단편을 암호화한 결과의 Xma I-Sal 단편을 pUC 8로 클론시켰다(Vieira 및 Messing, Gene, 19, 259-268/1982 참조). 수반하는 도식중 제2도는 결과의 발현 플라즈미드 p10169(뉴클레오타이드의 240-917 위치로부터 얻은 감마 Fd)의 서열을 나타낸다.
1.2 E. coli내 항체 사슬의 발현
발현 플라즈미드 pBT III 및 p10169를 각각 트란스내 lac 억제체(lac Iq)가 발현하는 것에 대한 플라즈미드를 포함하는 Escherichia coli(DSM 3689)로 변형시켰다. Escherichia coli 세포를 LB 배지내에서 광밀도가 OD550nm=0.5가 될 때까지 배양시키고 1g/ℓ의 이소프로필-β-D-티오갈락토사이드(IPTG)로 유도하여 37℃에서 4시간 더 인큐베이션시켰다. 연속해서 세포를 원심분리하였다.
1.4 “봉입체”의 제조방법
이러한 목적으로, 이뮤노글로불린 사슬당 0.1몰/ℓ의 트리스/HCl(pH 6.5) 및 20mmole/ℓ의 EDTA 580ml내 약 25g의 Escherichia coli(실시예 1·3 비교 참조) 세포 습윤 질량을 취하고 세포를 전단 막대(ultraturax)로 균질화하였다. 그후 0.25mg/ml의 리소자임을 부가하고 주변온도에서 30분 동안 인큐베이션시키며 연속해서 5% v/v의 트리톤 X-100을 함유하는 0.5몰/ℓ의 수성 염화나트륨 용액내에 분산시켜 전단막대(ultraturax)로 균질화시키고 주변온도에서 30분 동안 더 교반하였다. 그후 Sorvall GSA 회전자를 4℃에서 13000r.p.m으로 하여 50분 동안 원심분리를 행하였다. 펠렛을 0.1몰/ℓ의 트리스/HCl(pH 6.5), 20mmole/ℓ EDTA 및 2.5% v/v의 트리톤 X-100의 300ml로 처리하고 균질화시켰다. 회전자를 4℃에서 13000r.p.m으로 하여 30분 동안 더 원심분리를 행하였다. 펠렛을 0.1몰/ℓ의 트리스/HCl(pH 6.5), 20mmole/ℓ의 EDTA 및 0.5% v/v의 트리톤 X-100의 300ml로 처리하고 균질화시켰다. 그후 Sorvall GSA 회전자를 4℃에서 13000r.p.m으로 하여 각각 30분 동안 두번 더 원심분리를 행하고 이후 각 경우에 펠렛을 0.1몰/ℓ의 트리스/HCl(pH 6.5) 및 20mmole/ℓ EDTA의 300ml 및 250ml로 각각 처리하고 균질화시켰다.
[실시예 2]
[항체의 변성]
실시예 1에 따라 제조된 “봉입체”의 펠렛뿐만 아니라 하이브리도마 세포선(ECACC 88091404) 또는 이것의 Fab 단편(Fab 단편에 대해 A. Johnstone 및 R. Thorpe에 의한 Immunochemistry in practice, pub. Blackwell Scientific Publications, 1982, pp. 52-53 비교 참조)로부터 얻어진 항체 MAB 33의 동결전조체를 주변온도에서 3시간 동안 0.1몰/ℓ의 트리스. HCl(pH 8.5), 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드, 2mmole/ℓ의 EDTA 및 0.3몰/ℓ의 DTE내에 인큐베이트시켰다. 단백질 농도는 4-6mg/ml였다. 사슬 분리를 비환원 조건하에서 SDS-PAGE로 관찰하였다. G. L. Ellmann(Arch. Biochem. Biophys., 82, 70/1959)의 방법에 따라 유도된 SH 그룹을 측정함으로써 이황화 결합이 완전히 환원이 되었는가를 확인하였다. 연속해서 용액을 농축된 염산으로 pH 3까지 조절하였다.
재생시키기 위해 다음에 기재되어 있는 실시예는 완전히 변성되고 MAB 33이나 MAB 33 Fab 또는 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 투석된후 재산화 완충액에 1:100으로 희석되어 있는 “봉입체”로부터 얻어진 항체 사슬을 사용하여 실시예 2에 기재된 바와 같이 행해졌다. 재생 비치를 25℃로 온도조절하였다.
[실시예 3]
[MAB 33 Fab 단편의 재생]
재산화 완충액은 0.1몰/ℓ의 트리스, HCl(pH 8.5), 0.5몰/ℓ의 L-아르기닌 및 2mmole/ℓ의 EDTA를 함유한다. 단백질 농도는 30-60㎍/ml이었다. 재생 기간은 200시간까지 였다. 수동 면역반응성에 대한 배열이 특이적인 ELISA 테스트 시스템으로(실시예 8 참조) 재산화를 조사하였다.
하기한 표 1A-1C는 다음의 여러 변수에 의존한 활성 MAB 33 Fab 단편의 수율을 나타낸다:1A-GSSG 농도가 일정한(5mmole/ℓ의 GSSG) 경우의 DTE 농도:1B-DTE 농도가 일정한(3mmole/ℓ의 DTE) 경우의 GSSG 농도:1C-GSH 농도가 일정한(1mmole/ℓ) 경우의 GSSG 농도.
[표 1A]
Figure kpo00002
[표 1B]
Figure kpo00003
[표 1C]
Figure kpo00004
[실시예 4]
완전히 변성되고 환원된 MAB 33 Fab 단편을 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 투석하고 연속하여 20℃의 온도에서 약 200시간의 재생 시간으로 0.1몰/ℓ의 트리스, HCl(pH 8.5), 0.3몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.2몰/ℓ의 GSSG, 2mmole/ℓ의 GSH 및 2mmole/ℓ의 EDTA내에서 재산화시켰다. 다음 표 2는 재생되는 경우에 단백질 농도가 변화되는 것에 따른 활성 MAB 33의 수율을 나타낸다. 활성 면역반응성에 대한 Elisa 테스트 시스템(실시예 8 참조)으로 재산화를 조사하였다.
[표 2]
Figure kpo00005
[실시예 5]
완전히 변성되고 환원된 MAB 33 항체를 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)로 투석하고 연속하여 20℃의 온도에서 약 200시간의 재생 시간으로 0.1몰/ℓ의 트리스 HCl(pH 8.5), 0.5몰/ℓ의 L-아르기닌, 2mmole/ℓ의 EDTA 및 1mmole/ℓ의 GSH내에서 재산화시켰다. 활성 면역반응성에 대한 Elisa 테스트 시스템(실시예 8참조)으로 재산화를 조사하였다. 다음 표 3은 GSH 농도가 일정한(1mmole/ℓ) 경우에 GSSG 농도가 변화하는 것에 따른 활성 항체의 수율을 나타낸다.
[표 3]
Figure kpo00006
[실시예 6]
[혼합된 이황화물로 전환된후의 재생]
실시예 2에 기재된 바와 같이 MAB 33 또는 MAB 33 Fab를 변성시켰다. 그후 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 투석하고 연속하여 주변온도에서 약 5시간에 걸쳐 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드, 0.2몰/ℓ의 GSSG 및 0.1몰/ℓ의 트리스. HCl(pH 8.5)로 유도화하였다. 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 새로이 투석한후, 다른 변형체에 재생을 행하였다.
표 4A는 20℃ 온도에서 약 200시간에 걸쳐 0.1몰/ℓ의 트리스.HCl(pH 7), 0.5몰/ℓ의 L-아르기닌 및 2mmole/ℓ의 EDTA내에서 MAB 33 Fab가 재생하는 것을 나타낸다.
표 4B는 완충액의 pH에 의존하는 완충액 1ℓ당 GSH 2mmole/ℓ 내에서의 활성 MAB 33 Fab의 수율을 나타낸다.
표 5A는 GSH 농도에 의존하여 20℃의 온도에서 약 200시간의 재생 시간에 걸쳐 0.1몰/ℓ의 트리스.HCl(pH 7.0), 0.5몰/ℓ의 L-아르기닌 및 2mmole/ℓ의 EDTA내에서 MAB 33 IgG가 재생하는 것을 나타낸다. 수동 면역반응성에 대한 배열이 특이적인 Elisa 테스트 시스템(실시예 8 참조)으로 재생하는 것을 조사하였다.
표 5B는 pH값에 의존하는 완충액 1ℓ당 GSH 2mmole/ℓ 내에서의 활성 항체 수율을 나타낸다.
[표 4A]
Figure kpo00007
[표 4B]
Figure kpo00008
[표 5A]
Figure kpo00009
[표 5B]
Figure kpo00010
[실시예 7]
[Escherichia coli로 항체 사슬의 재생]
보족 단일 사슬의 항복체(실시예 1의 kappa 및 Fd)를 실시예 2에 기재된 바와 같이 용해시켰다. 연속해서 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 투석을 행하였다. 두 사슬에 대해 용해화 및 투석이 분리되어 일어난다.
재산화를 위해, 동물의 환원된 단일 사슬을 동시에 100배 부피의 0.1몰/ℓ 트리스-HCl(pH 8.5), 0.6몰/ℓ의 L-아르기닌, 0.1mmole/ℓ의 GSSG, 1mmole/ℓ의 GSH 및 2mmole/ℓ의 EDTA에 희석시켰다. 20℃에서 200시간에 걸쳐 인큐베이션함으로써 재생이 일어난다.
생물학적으로 활성인 천연 단백질의 수율은 18%에 달한다. 수동 면역반응성(실시예 8 참조)을 측정하여 천연 항체의 비율을 결정하였다.
[실시예 8]
[수동 면역반응성, 활성 면역반응성 및 억제 활성의 검사]
8·1 사람의 CK-MM(사람의 크레아틴 키나제의 골격근 이소엔자임)에 대한 단클론 항체의 수동 면역반응성 검사
본원에서 수동 면역반응성이란 천연 항체 또는 재생된 항체에 천연 구조의 에피토프를 만드는 것이다. 상기 에프토프를 검사하는 것은 Elisa 테스트 시스템으로 다른 형태의 동물(본원에서 양)로부터 얻어진 배열이 특이적인 항쥐 항체에 의해 행해진다.
[배열이 특이적인 다클론 양의 항쥐 Fab 항체 제조방법]
다클론 쥐 면역글로불린에 대한 항혈청을 양에서 A. Johnstone 및 R. Thorpe, Immunochemistry in Practice, pub. Blackwell Scientific Publications, Oxford, 1982, pp. 27-31의 방법에 따라 제조하였다.
항혈청의 IgG 단편을 황산암모늄 분별법 및 DEAE-이온 교환 크로마토그래피에 의해 Johnstone 및 Thorpe(상기 인용문중 pp. 44-46)에 따라 분리하였다.
항쥐 카파 활성이 효소 면역 테스트에 의해 더 이상 검출되지 않을때까지 500mg의 상기 IgG 단편을 20ml의 쥐 카파 사슬 Spherosil 면역흡수체(1.5mg의 쥐 카파 사슬/1ml의 Spherosil)에 흡수시켰다. IgG 단편을 20ml의 쥐 Fab Spherosil(5mg의 쥐 Fab/1ml의 Spherosil)이 충진되어 있는컬럼에 통과시키고 특별하게 흡수된 IgG 단편 부분을 0.2몰/ℓ의 글리신(pH 2.8)으로 용리하였다. 1mmole/ℓ의 아세트산에 대해 투석한후, 이 부분의 단편을 동결건조시켰다.
면역 테스트에 의해, 만들어진 IgG는 유리된 M-카파, M-감마 및 M-Fe 사슬과 반응하지 않거나 또는 불완전하게 폴드된 M-카파/M-Fb 착물과 반응하지 않았다는 것은 확실하다.
재생된 항체 및 천연 표준 샘플을 배열이 특이적인 항쥐 Fab 항체로 미리 인큐베이트하였다. 자연적으로 형성된 배열의 에피토프의 수에 의존하여, 배열이 특이적인 항쥐 Fab 항체의 결합 위치에 대한 다른 수가 포화된다. 미리 인큐베이트된 용액을 쥐과의 항체-효소 공액물(항체-퍼록시다제 공액물)과 함께 테스트 튜브에 넣었는데 테스트 튜브의 벽은 쥐의 항체로 피복되어 있다.
양으로부터 얻은, 불포화된 배열이 특이적인 항쥐 항체에 의해 벽에 붙어있는 쥐의 항체가 쥐의 항체-효소 공액물과 결합되었는데 결합된 공액물의 양은 미리 인큐베이트된 용액내의 천연 항체 또는 재생된 항체의 양에 간접적으로 비례한다. 항체가 공액되어 있는 효소에 의해 색원체 물질 ABTS
Figure kpo00011
(2,2′-아지노-비스-(3-에틸벤조티아졸린-6-설포네이트)이 반응한후, 405nm에서 흡수를 측정하여 분광학적 검사를 행하였다(H. U. Bergmeyer, Methods in Enzymology, 3rd edition, Volume 9, pp. 15-37참조).
8·2 단클론 항체의 활성 면역반응성 검사
MAB 33 IgG는 특이적으로 사람의 크레아틴 카나제의 골격근 이소엔자임을 인지한다(CK-MM; P. Buckel 및 그의 동료에 의한 Gene, 51, 13-19/1987 비교 참조).
본 실시예에서 활성 면역반응성이란 천연 항체 또는 재생된 항체와 특이한 항원(본 경우에 있어서, 사람의 CK-MM)과의 반응을 의미한다.
Elisa 테스트 시스템에서, 상기 반응은 색원체 물질 ABTS의 반응에 의해 효소가 공액되어 있는 다클론 항쥐 항체의 도움으로 색도계에 의해 정량적으로 측정된다.
8·3 단클론 항체의 억제 활성 검사
MAB 33 IgG는 골격근이 특이적인 이소엔자임 CK-MM의 M 서브유니트에서만 만들어지는 에피토프를 인지한다. 에피토프에 결합되므로써 효소적 활성은 80% 억제된다(P. Buckel 및 그의 동료에 의한 문헌, 1987 참조). 완전히 재생된 항원의 결합 위치는 효소를 억제할 수 있기 때문에 CK-MM 억제 테스트 MAB 33이 완전히 변성되고 환원된 후 복원되었는가를 검사하기 위한 매우 결정적인 테스트이다.
크레아틴 키나제의 활성은 Boehringer Mannheim GmbH의 커플된 효소적 테스트에 의해 결정된다(H. U. Bergmeyer, Methods of Enzymatic Analysis, 3rd edition Volume III, pp. 510-540 참조). 크레아틴 키나제는 크레아틴 포스페이트 및 ADP와 반응하여 크레아틴 및 ATP를 만든다. 분광학적으로 검사가능한 반응을 얻기 위하여 글루코스를 인산화시키는 헥소키나제에 결과의 ATP가 사용되어 글루코스-6-포스페이트를 만들었다. NADP+로부터 NADPH+H+를 만들면서 글루코스-6-포스페이트가 글루코스-6-포스페이트 디하이드로게나제로 산화되어 글루코네이트-6-포스페이트가 되었다. 크레아틴 키나제의 활성은 분당 감광 변화로부터 계산될 수 있다.
CK-MM에 대한 천연 항체의 교정 곡선으로부터 재생 배치내 억제 활성에 상응하는 천연 물질의 양이 결정될 수 있다. 재생된 배치내 단백질의 총량에 대한 활성이 억제된 단백질의 비는 활성이 억제된 항체의 퍼센트 율을 나타낸다.
8·4 수동/활성 면역반응성 및 억제활성에 의한 재생 수율의 비교 측정
완전히 변성되고 환원된 MAB 33 Fab 단편을 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 투석하고 계속해서 20℃의 온도에서 0.1몰/ℓ의 트리스-HCl(pH 8.5), 0.5몰/ℓ의 L-아르기닌, 0.2mmole/ℓ의 GSSG, 2mmole/ℓ의 GSH 및 2mmole/ℓ의 EDTA로 1:100 희석시켜 약 200시간의 재생시간 동안 재산화시켰다.
억제 활성을 측정하는 경우에 사용되는 비교적 높은 농도의 항체를 기본으로 하여 재생 배치를 농축시켰다. 상기 목적을 위하여, 재생 용액을 1mmole/ℓ의 아세트산에 대해 투석시키고 계속해서 동결건조하였다. 동결건조물을 물(물:재생물 부피=1:200)로 처리하고 50mmole/ℓ의 인산칼륨. 0.15몰/ℓ의 염화나트륨(pH 7.5)에 대해 투석시켰다.
다음 표 6는 수동-활성 면역반응성 및 억제 활성에 의해 측정된, 투석물내 활성 Fab 단편의 수율을 나타낸다.
[표 6]
Figure kpo00012
[실시예 9]
[Escherichia coli로부터 t-PA의 활성화]
실시예 1·4에 기재된 바와 같이, “봉입체”를 pePa 133으로 변형된 DSM 3689인 Escherichia coli의 습기있는 세포량으로부터 펠렛으로서 제조하였다.(유럽 특허 명세서 제0,242,835호 참조). “봉입체” 제조물의 펠렛을 4-6mg/ml의 단백질 농도 및 주변온도에서 0.1몰/ℓ의 트리스-HCl(pH 8.5), 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드, 2mmole/ℓ의 EDTA 및 0.3몰/ℓ의 DTE내에 3시간동안 인큐베이션시켰다. 용해화시킨후 용액의 pH를 농축된 염산으로 pH 3까지 조절하였다. 환원제 및 완충액 성분을 4℃에서 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 투석시켜 분리해 내었다.
[t-PA의 재생]
얻어진 변성되고 환원된 단백질을 재생시키는 것은 0.1몰/ℓ의 트리스-HCl(pH 10.5), 0.5몰/ℓ의 L-아르기닌, 1몰/ℓ의 EDTA 및 1mg/ml의 소 혈청 알부민으로 희석되어 행해진다. 단백질의 농도는 10-30㎍/ml이고 온도는 20℃이며 재생 시간은 24시간이었다.
재활성화를 Boehringer Mannheim GmbH의 고유번호 제1080954의 t-PA 표준물질에 대한 테스트 방법에 따라 측정하였다. 다음 표 7A 및 7B는 다음의 변수에 의존하는 활성 t-PA의 수율을 나타낸다:7A-DTE 농도가 일정한(3mmole/ℓ) 경우의 GSSG 농도 및 7B-GSH 농도가 일정한(1mmole/ℓ)경우의 GSSG 농도.
[표 7A]
Figure kpo00013
[표 7B]
Figure kpo00014
[실시예 10]
[혼합된 이황화물로 전환된 후의 K2P(t-PA 유도체, 독일연방공화국 특허 명세서 제39 03 581 비교 참조) 재생]
독일연방공화국 특허 명세서 제39 03 581호에 기재된 바와 같이, PA 27fd 및 pUBS500 플라즈미드로 변형된 DSM 2093인 Eshcerichia coli 세포를 배양하고 세포량을 회수하였다. 상기 습기있는 세포량으로부터 실시예 9에 기재된 바와 같은 변성되고 환원된 단백질을 얻었다.
6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)내 변성되고 환원된 단백질의 용액을 GSSG로 0.1몰/ℓ까지 조절하고 트리스로 0.1몰/ℓ까지 조절하였다. 계속해서 수산화나트륨을 사용하여 PH 값을 8.5로 조절하였다. 주변온도에서 2시간 동안 인큐베이션시킨후 4℃에서 6몰/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드(pH 2)에 대해 새로이 투석하여 산화제 및 완충액 성분을 분리해내었다.
재생 완충액에서 희석시킨후 변성되고 산화된 단백질(혼합된 이황화물)의 재생을 행하였다. 단백질 농도는 30-60㎍/ml이고 온도는 20℃이며 재생 시간은 12시간이었다.
다음 표 8A는 GSH 농도에 따른 0.1몰/ℓ의 트리스-HCl(pH 8.5), 0.8몰/ℓ의 L-아르기닌 및 2mmole/ℓ의 EDTA내 K2P의 재활성화를 나타내며 다음 표 8B는 완충액의 pH 값에 따른 0.5mmole/ℓ의 GSH가 들어있는 상기 완충액내 활성 K2P의 수율을 나타낸다.
[표 8A]
Figure kpo00015
[표 8B]
Figure kpo00016

Claims (24)

10-1000g/ml의 단백질 농도로 방법을 행하고 가용화와 재활성화 사이에 4-8mole/ℓ 구아니딘 하이드로클로라이드나 6-10mole/ℓ 우레아를 함유하는 pH 1-4의 완충액에 대해 투석을 행하는 것으로 특징되며, 세포분해후 변성 및 환원 조건하에서 가용화하고 연속해서 산화 및 재생조건하에서 재활성화함에 의해 유전자 공학적으로 생성되고 원핵생물내 발현된 생물학적 활성 단백질을 활성화하는 방법.
제1항에 있어서, 투석 완충액이 5-7mole/ℓ의 구아니딘 하이드로클로라이드를 함유하는 방법.
제1항에 있어서, 재활성화가 변성시키지 않는 농도의 변성화제와 함께 0.1-20mole/ℓ의 GSH 농도, 0.01-3mmole/ℓ의 GSH 농도 및 pH 9-12에서 1-300시간 동안 행해지는 방법.
제3항에 있어서, GSH 농도가 0.2-10mmole/ℓ이고 또는 GSSG 농도가 0.05-1mmole/ℓ인 방법.
제1항에 있어서, 재활성화 단계에서, 변성 조건하에서 GSSG를 부가하므로써 단백질의 티올 그룹이 우선 글루타티온과 단백질의 혼합된 이황화물로 전환되고 구아니딘 하이드로클로라이드나 우레아를 함유하는 완충액에 대해 다시 투석된 다음 변성시키지 않는 농도의 변성화제와 함께 0.1-5mmole/ℓ의 GSH 농도 및 pH 6-10에서 1-300시간 동안 재활성화되는 방법.
제3항에 있어서, 재활성화 단계에서, 변성화제로서 아르기닌, 구아니딘 하이드로클로라이드 및 최소한 하나의 다음 구조식 화합물로 구성된 그룹으로부터 선택된 최소한 하나의 물질이 사용되는 방법.
R2-CO-NRR1(I)
식중, R 및 R1은 수소 원자 또는 C4까지의 알킬기이며, R2는 수소 원자 또는 -NRR1또는 C3까지의 알킬임.
제6항에 있어서, 아르기닌 및 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된 그룹에서부터 선택된 최소한 하나의 물질의 농도가 0.1-10mmole/ℓ인 방법.
제7항에 있어서, 아르기닌 및 구아니딘 하이드로클로라이드로 구성된 그룹에서부터 선택된 최소한 하나의 물질의 농도가 0.25-8mmole/ℓ인 방법.
제6항에 있어서, 구조식 I 화합물의 농도가 0.5-4mmole/ℓ인 방법.
제9항에 있어서, 구조식 I 화합물의 농도가 1-3.5mmole/ℓ인 방법.
제1항에 있어서, 재활성화 단계에서, 단백질 분해적으로 활성이 아닌 단백질의 존재에서 행해지는 방법.
제11항에 있어서, 단백질 분해적으로 활성이 아닌 단백질이 소의 혈청 알부민인 방법.
제1항에 있어서, 재활성화 단계에서, 1-10mmole/ℓ EDTA의 존재에서 행해지는 방법.
제1항에 있어서, 세포분해가 초음파, 고압분산 또는 리소자임에 의해 행해지는 방법
제14항에 있어서, 분해가 중성 내지 약산성 pH 값의 묽은 수성 완충용액에서 행해지는 방법.
제15항에 있어서, 묽은 수성 완충액이 0.1mmole/ℓ 트리스인 방법.
제1항에 있어서, 세포분해후에, 불용성 성분이 분리되는 방법.
제1항에 있어서, 가용화 단계에 있어, 머캅탄 그룹을 지닌 환원제 및 변성화제의 존재내 알칼리성 pH 값에서 행해지는 방법.
제18항에 있어서, 변성화제로서 구아니딘 하이드로클로라이드 및구조식 I 화합물로 구성된 그룹에서부터 선택된 최소한 하나의 물질의 존재하에서 행해지는 방법.
제19항에 있어서, 구아니딘 하이드로클로라이드의 농도가 6mmole/ℓ이고 구조식 I 화합물의 농도가 8mmole/ℓ인 방법.
제18항에 있어서, DTE, β-머캅토에탄올, 시스테인 또는 GSH의 존재에서 행해지는 방법.
전기한 항의 어느 한 항에 있어서, 항체나 항체 단편이 재활성화되는 방법.
제1항 내지 제21항의 어느 한 항에 있어서, tPA 또는 tPA 같이 작용하는 단백질이 재활성화되는 방법.
제1항 내지 제21항의 어느 한 항의 방법에 의해 활성화된, 유전자 공학적으로 생성되고 원핵생물내 발현된 생물학적 활성 단백질.
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