DK175439B1

DK175439B1 - Fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede og i prokaryoter udtrykte antistoffer

Info

Publication number: DK175439B1
Application number: DK198905159A
Authority: DK
Inventors: Helmut Lenz; Rainer Rudolph; Johannes Buchner
Original assignee: Roche Diagnostics Gmbh
Priority date: 1988-10-17
Filing date: 1989-10-17
Publication date: 2004-10-18
Also published as: JPH0793879B2; DK515989A; DK515989D0; JPH02227090A; ES2061876T3; KR920010873B1; DD285613A5; ATE101650T1; EP0364926A2; DE58906984D1; CA2000604A1; KR900006515A; AU4293189A; US5077392A; IL92012A0; EP0364926B1; CA2000604C; EP0364926A3; AU609645B2; DE3835350A1

Description

jj^a_______^ - -trjrn —,ΤΓΓ.Γ '- ;; "-jgsa DK 175439 B1 i

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede og i prokaryoter udtrykte biologisk aktive proteiner.

5 Den genteknologiske fremstilling af proteiner, såsom f.eks. antistoffer i heterologe værtsorganismer, fører til dannelse af inaktive, tungt opløselige proteinaggregater, såkaldte "inklusionslegemer". Det formodes, at dannelsen af sådanne "inklusionslegemer" blandt andet er en følge af de véd eks-10 pressionen fremkomne høje proteinkoncentrationer i cellen. For at opnå aktive proteiner, skal inklusionslegemerne opløses ved hjælp af denaturering og reduktion, og derefter genfremstilles proteinets tredimensionale struktur i dens naturlige rumform ved indstilling af egnede opløsningsbetingelser {M. Sela et 15 al., 1957, Science 125, 691). Den fuldstændige udfoldelse opnås ved tilsætning af høje koncentrationer af chaotrope stoffer, såsom urinstof og guanidin (R. Jaenicke, (1987), Prog.

Biophys. Molec. Biol. 49, 117-237). Til reduktion af disulfid-broer anvendes kraftige reduktionsmidler, såsom Ø-mercapto-20 ethanol eller 1,4-dithioerythritol.

Ved renaturer i ngen fra den denaturerede tilstand optræder imidlertid to konkurrencereakt i oner. Foruden den ønskede foldning i den naturlige tilstand iagttager man aggregatdan-25 nelse (G. ZettlmeiØl et al., Biochemistry 18 , 5567 ). For at forskyde ligevægten til det naturlige molekyles side, vælger man betingelser, der for det første hindrer etableringen af falsk foldede og dermed mere ustabile molekyler og deres uspecifikke vekselvirkning til dannelse af aggregater, men for det 30 andet ikke hindrer tilbagefoldningen til den naturlige tilstand. Man opnår dette ved tilsætning af chaotrope stoffer i 1 ab i 1 i serende koncentrat i oner. Yderligere må det tages i betragtning, at proteinkoncentrationen indvirker afgørende på renatureringsudbyttet (EP 0 241 022). I tilfælde af proteiner, 35 som i den naturlige tilstand har disulfidbroer, gælder det yderligere om at tilvejebringe redoxbetingelser under renatu-reringen, hvilke redoxbetingelser gør det muligt atter at re-

I DK 175439 B1 I

I 2 I

I ducere falsk brodannede cystiner og at populere rigtigt parre- I

de cystiner. Såkaldte "oxido-shuff1 ing solutions" ud fra redu- I

I ceret og oxideret thi o 1 reagens forhøjer udbyttet af naturligt I

I struktureretogdisulfid-brodannetprotein. I

I 5 I

I At renatureri ngen af antistoffer er mulig efter fuldstændig I

I denaturering og reduktion blev for første, gang vist af Haber I

I med et Fab-fragment som eksempel (E. Haber, Biochemistry 52, I

I 1099-1106 81964). Udbytterne androg 12 til 14%. Disse blev I

I 10 bekræftet ved hjælp af Whitney og Tanford's resultater med I

I renaturering af et Fab-fragment. De opnåede udbytter på 8% (P. I

I L. Whitney og C. Tanford, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 53, 524 I

I (1965)). Et fuldstændigt antistof blev første gang vellykket I

I renatureret af Freedman og Sela. Udbytterne androg mellem 20 I

I 15 og 25% (Μ. H. Freedman og M. Sela, J. Biol. Chem. 241, I

I 2383-2396 (1966) og J. 6iol. Chem. 241, 5225-5232 (1966)). Det I

I skal bemærkes, at det naturlige udgangsmolekyle blev polyala- I

I nyleret til forbedring af opløsningsegenskaberne. I

I 20 Vedrørende de anførte arbejder må det bemærkes, at der er tale I

I om polyklonale antistoffer eller anti stoffragmenter, altså en I

I blanding af antistoffer med forskellige paratoper og forskel- I

I lige affinitetskonstanter. Da denne heterologe populations I

I tunge-og lette kæder associerer rent statistisk ved renature- I

I 25 ringen, frembringes her renaturerede molekyler, som med hensyn I

til bindingsspecificitet og affinitet ikke stemmer overens med I

de naturlige. I

Lige som i tilfælde af andre eukaryote proteiner, der blev I

I 30 klonet og udtrykt i E. coli, opstod der også i E. coli udtryk- I

I te tunge og lette kæder af antistoffer i form af uopløselige I

I ”inklusionslegemer" (S. Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. I

I USA 81, 3273-3277 (1984), og Μ. Y. Boss et al., 1984, Nucleic I

I Acids Research 12, 3791-3806). For antistoffer fra transfor- I

I 35 merede mikroorganismer blev der af Cabilly et al. og Boss et I

I al. beskrevet fremgangsmåder, der skal muliggøre renaturerin- I

I gen af funktionelle antistoffer. Disse fremgangsmåder til- I

^ ' ______··, Λ ·· ly^p^yv^* * -t ^^w^s^Ajtir,.

DK 175439 B1 3 vejebragte imidlertid for så vidt angår monoklonale antistoffer kun udbytter mellem ca. 0,2¾ og 5%.

Opf i ndel sen tager derfor sigte på at give anvisning på en 5 fremgangsmåde til reaktivering af i prokaryoter udtrykte biologisk aktive proteiner, hvorved de i form af "ink1usi ons 1ege-mer" efter ekspression opnåede proteiner i godt udbytte kan omdannes til deres aktive renaturerede form.

10 Oette opnås ved hjælp af en fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstillede, i prokaryoter udtrykte biologisk aktive proteiner efter celleoplukning ved hjælp af solubili-sering under denaturerende og reducerende betingelser samt efterfølgende reaktivering under oxiderende og renaturerende IS betingelser, som er ejendommelig ved, at man arbejder ved en proteinkoncentration fra 1 til 1000 pg/ml og mellem solubili-seringen og reaktiveringen gennemfører en dialyse mod en puffer med en pH-værdi mellem 1 og 4, der indeholder 4 til 8 mol/1 guanidinhydrochlorid eller 6 til 10 mol/1 urinstof.

20

Det blev nemlig overraskende fastslået, at efter en dialyse i nærværelse af urinstof eller især guanidinhydrochlorid, opnås overordentligt forhøjede udbytter af aktivt protein efter reaktiveringen.

25

Opfindelsen egner sig til anvendelse i tilfælde af alle genteknologisk i prokaryoter fremstillede biologisk aktive proteiner, fortrinsvis til antistoffer og deres fragmenter samt til t-PA og t-PA-1ignende proteiner eller -derivater.

30 I en foretrukken udførelsesform for opfindelsen indeholder dialysepufferen 5 til 7 mol/1 guan idinhydroch1 or id.

Ved reakt i ver i ngen foretrækkes det at arbejde ved en pH-værdi 35 fra 9 til 12, en GSH-koncentration fra 0,1 til 20 mmol/1, en GSSG-koncentration fra 0,01 til 3 mmol/1 og med en ikke-dena-turerende koncentration af et denatureringsmiddel samt at

I DK 175439 B1 I

I 4 I

I gennemføre reaktiveringen i løbet af et tidsrum fra 1 til 300 I

I timer. GSH-koncentrationen andrager herved særlig foretrukket I

I 0,2 til 10 mmol/1 og/eller GSSG-koncentrationen 0,05 til 1 I

I mmol/1. I

I 5 I

I I en anden foretrukken udførelsesform for opfindelsen omdanner I

I man i reaktiveringstrinnet til at begynde med antistoffernes I

I thiolgrupper til de blandede disulfider af antistof og glu- I

I tathion ved tilsætning af GSSG under denaturerende betinge!- I

I 10 ser, dialyserer på ny mod pufferen indeholdende guan idinhydro- I

I chlorid eller urinstof og reaktiverer derpå ved en pH-værdi I

I fra 6 til 10, en GSH-koncentration fra 0,1 til 5 mmol/1 og med I

I en ikke-denaturerende koncentration af et denatureringsmiddel I

I i løbet af et tidsrum fra 1 til 300 timer. I

I 15 I

I Som denatureringsmiddel kan der i reglen anvendes et til akti- I

I veringer under oxiderende betingelser sædvanligvis benyttet I

I denatureringsmiddel eller arginin. Fortrinsvis anvender man I

I som denatureringsmiddel arginin, guanidinhydrochlorid og/eller I

I 20 mindst en forbindelse med den almene formel I

I R2-CO-NNR! (I), I

I hvori R og Rj betyder H eller alkyl med 1 til 4 carbonatomer, I

I 25 og R2 betyder H eller NRRj eller alkyl med 1 til 3 carbonato- I

I mer. Oisse denaturer ingsmidler kan endvi dere benyttes som I

I blandinger. Fortrinsvis andrager koncentrationen af arginin I

og/eller guanidinhydrochlorid 0,1 til 1,0 mol/1, især 0,25 til I

I 0,8 mol/1. Koncentrationen af forbindelsen med den almene for- I

I 30 mel I andrager fortrinsvis 0,5 til 4 mol/1, især 1 til 3,5 I

I mol/1. I en yderligere foretrukken udførelsesform for opfin- I

I delsen gennemføres reaktiveringstrinnet i nærværelse af et I

I fremmed protein. Som sådant egner sig i reglen ethvert fremmed I

I protein, når blot det ikke er proteolytisk virksomt. Fortrins- I

I 35 vis benyttes kvægserumalbumin (BSA), f.eks. i en mængde på 1 I

I til 3 mg/1. Tilsætningen af BSA bevirker en let forhøjelse af I

I udbyttet samt stabilisering af proteinet (sandsynligvis ved I

wbl ^ · «g t'z - ia^v^r>. - 'iH'jt . - i.Λ «ττψικ“—τ7Γ^*&£*&*.¥-?·-· ·_;_s___:^Ώ*ι«Η DK 175439 B1 5 beskyttelse mod overfladedenaturering og/eller proteolytisk nedbrydning). De sædvanlige fremgangsmådebetingelser kan svare til de for reakt i ver ingstrin hidtil kendte og sædvanlige betingelser. Reaktiveringen gennemføres hensigtsmæssigt ved ca.

5 '5eC til 30° C, fortrinsvis ved 10*C. De forud for dialysen og reaktiveringstrinnet (reoxidation/aktivering) gående og efterfølgende fremgangsmådetrin, såsom ce11eop1ukning, solubilise-ring (sol ubi 1 i ser ing, reduktion) kan gennemføres i henhold til de fra teknikkens standpunkt kendte og sædvanlige metoder, 10 f.eks. ifølge EP-A-0 114 506 og EP-A-0 093 619, til reaktivering af heterologt udtrykte proteiner eller af t-PA. Med henblik på et i henseende til udbytte og aktivering optimalt resultat kan det imidlertid være hensigtsmæssigt at gennemføre enkelte eller alle fremgangsmådetrin under hensyntagen til en 15 eller flere af de her belyste fremgangsmådeudførelsesformer.

Cel 1eop1ukni ngen kan gennemføres ved hjælp af hertil sædvanlige metoder, f.eks. ved hjælp af ultralyd, højtryksdispersion eller lysozym. Den gennemføres fortrinsvis i en til indstil-20 ling af en neutral til svagt sur pH-værdi egnet pufferopløsning, som suspensionsmedium, såsom eksempelvis i 0,1 mol/1 Tris/HCl. Efter ce11eop1ukni ngen fraskilles de uopløselige bestanddele (inklusionslegemer) på vilkårlig måde, fortrinsvis ved fracentr i fugering eller ved filtrering. Efter vaskningen 25 med midler, der ikke generer proteinerne, men så vidt muligt opløser fremmede ce11eprotei ner , f.eks. vand, phosphat-puffer-opløsning, eventuelt under tilsætning af milde detergenter, såsom triton, underkastes bundfaldet (pellet) so 1ubi 1 i ser i ngen (solubi1 i ser ing/redukti on).

30

Solubi1 i seringen sker fortrinsvis i det alkaliske pH-område, især ved pH 8,6 t o,4 og i nærværelse af et reduktionsmiddel fra mercaptangruppen samt et denatureringsmiddel.

35 Som denatureringsmiddel kan anvendes de til solubi1iseringer fra teknikkens standpunkt kendte og sædvanlige denaturer ings- midler, såsom fra EP-A-0 114 506, og især guanidinhydrochlorid

DK 175439 B1 I

eller forbindelser med den almene formel I. Hensigtsmæssigt I

sker dette i en koncentration af guanidinhydrochlorid på 6 I

mol/1 eller en koncentration af forbindelsen med den almene I

formel I på 8 mol/1. I

Som reduktionsmiddel fra mercaptangruppen kan f.eks. anvendes H

reduceret glutathion (GSH) eller 2-mercaptoethanol, f.eks. i I

en koncentration på ca. 50 til 400 mmol/1, og/eller især DTE H

(dithioerythritol) eller DTT (dithiothreito 1), f.eks. i en I

10 koncentration på ca. 80 til 400 mmol/1, eller cystein. Solubi- I

liseringen sker hensigtsmæssigt ved stuetemperatur i løbet af I

et tidsrum (inkubation) på 0,5 til flere timer, fortrinsvis på I

2 timer. Til forhindring af autooxidation af reduktionsmidlet

med luftens oxygen kan det også være hensigtsmæssigt at til- I

15 sætte EDTA, fortrinsvis i en mængde på 1 til 10 mmol/1. Foru- I

den sol ubi 1iseringen/reduktionen har solubi1iseringstrinnet I

også en rensningseffekt, da en stor del af fremmedprotei ner I

ikke går i opløsning. I

20 En anden udførelsesform for opfindelsen beror på dannelsen af I

de blandede disulfider af i prokaryoter udtrykte biologisk I

aktive proteiner samt glutathion før reaktiveringstrinnet. Til I

dannelse af de blandede disulfider inkuberes dialyserede, re- I

ducerede og for reduktionsmidler rensede proteiner sammen med I

25 en denatureringsmiddelholdig fortyndet opløsning af GSSG, I

f.eks. 0,2 mol/1. Aktiveringen sker efter fraskillelse af oxi- I

dat i onsmidlet ved hjælp af gentaget dialyse mod den guanidin/ I

hydrochlorid- eller urinstofholdige puffer ved en pH-værdi fra I

6 til 10, en GSH-koncentration fra 0,1 til 5 mmol/1 og med en I

30 ikke-denaturerende koncentration af et denaturer ingsmidde1 i I

løbet af et tidsrum fra 1 til 300 timer. I

I alle andre reaktionstrin svarer aktiveringen af proteinet via dannelsen af de blandede disulfider med GSSG til udførel-

35 sesformerne for aktiveringen af proteiner i den ovenfor nævnte I

del af opfindelsen. I denne udførel sesform ligger den optimale I

pH-værdi ved 6 til 8, og de aktiverede proteiner er i længere I

tid stabile i renatureringspufferen. I

7 DK 175439 B1

Ifølge opfindelsen lykkes det at reaktivere med et udbytte på indtil 30% af immunreaktiviteten, f.eks. i tilfælde af antistoffer som proteiner, der skal reaktiveres, og som blev udtrykt i prokaryoter. Dette svarer til ca. det 10-dobbelte ud-5 bytte ved den fra teknikkens standpunkt kendte fremgangsmåde.

Som antistoffer skal i opfindelsens forstand også forstås de sædvanlige fragmenter deraf.

De efterfølgende eksempler belyser opfindelsen yderligere i 10 forbindelse med tegningens figurer. Når intet andet er anført, er procentangivelser og temperaturangivelser henholdsvis vægt% og "C.

På tegningen viser: 15 fig. 1 sekvensen af plasmid pBTlll til ekspression af kappa-kæden af MAK33 (nukleotidposition 7 til 663), og fig. 2 sekvensen af pl0169 til ekspression af Fd-kæden af HAK 20 33 (nuk1eotidposition 240 til 917).

EKSEMPEL 1

Ekspression af antistof fragmenter i E. coli.

25 1.1 Opbygning af et plasmid til ekspression af MAK33 kappa-kæden i E-coli.

Kloningen af kappa-cDNA af MAK33 som Pstl-fragment i 30 pBR322 blev beskrevet (P. Buekel et al., (1987), Gene 51, 13-19). Med restriktionsendonuk1easen Mnl I blev cDNA skåret over umiddelbart 5'-nabosti 1 let til den fuldt udviklede kappa-kædes første aminosyrecodon og ved hjælp af en addaptor (5'CATG3’ hybridiseret med 5'CATGAATT3') som 35 EcoRI-Pstl-fragment klonet til den ligeledes med EcoRI og

PstI overskårne vektor pKK223-3, 0SM 3694P (Brosius et al.

(1981), Plasmid 6, 112-118). Til forkortelse af cDNA's

I DK 175439 B1 I

I I

I 3 1-utranslaterede region blev det resulterende plasmid I

I åbnet med PstI, forkortet nukleolytisk med Bal31 og det I

I til kappa-cONA svarende EcoRI-BA131-fragment derpå ved I

hjalp af en HindIII-1inker tilbageklonet til den EcoRI- I

I 5 Hind 111-overskårne vektor pKK223-3. Det resulterende plas- I

I mid betegnes som pBTlll (fig. 1 viser ekspressionsplasmi- I

I dets sekvens; kappa fra nuk1eotidposition 7 til 663). I

I 1.2 Opbygning af et plasmid til ekspression af Fd-fragmentet I

I 10 af gamma-kæden af MAK33 i E. coli. I

I Kloningen af MAK33's gamme-cDNA som Pstl-fragment i pBR322 I

I blev ligeledes beskrevet {Buekel et al., 1987). Til eks- I

I pression blev et Xmal-snitsted ved hjalp af oligonukleo- I

I 15 tid-rettet mutagenese indført umiddelbart før den fuldt I

I udviklede gamme-kædes første aminosyre. Et gamma-Fd-frag- I

I ment blev ved indføring af en stop-codon ved hjalpafsam- I

I me teknik frembragt efter aminosyreposition 225, hvorved I

I der yderligere blev indført et Bell- og SalI-snitsted. Oet I

I 20 resulterende Xmal-SalI-fragment, som koder for gamma-Fd- I

I fragmentet, blev klonet til pUC8 (Vieira + Messing (1982), I

I Gene 19, 259-268). Fig. 2 viser sekvensen af det fremkomne I

ekspressionsp1 asm id pl0169 (gamma-Fd fra nukleotidposition I

I 240 ti 1 917) . I

I 25 I

1.3 Ekspression af antistofkæderne i E. coli I

I 1.4 Fremstilling af "inklusionslegemerne" I

Ekspressionspi asmiderne pBTlll og pl0169 blev hver for sig I

I transformeret i E. coli (OSM 3689), som desuden indeholdt I

30 et plasmid til ekspression af 1ac-repressoren (lacl^) i I

I trans. E. coli-cel lerne blev dyrket indtil en optisk tæt- I

I hed 0D55Qnffl = 0,5 på LB-medium, derpå induceret med 1 g/1 I

I isopropyl-/S-D-thiogalaktosid (IPTG) og inkuberet i yder- I

I ligere 4 timer ved 37®C. Derpå blev cellerne fracentrifu- I

I 35 geret. I

9 DK 175439 B1

Hertil blev der per immunglobulinkade optaget ca. 25 g E. col i (se eksempel 1.3} som fugtig cellemasse i 580 ml 0,1 mol/1 Tris*HCl, pH 6,5, 20 mmol/1 EOTA, og ce11 erne homogeniseredes med omrørerstaven {U1traturax). Derpå blev der 5 tilsat 0,25 mg/ml lysozym, inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur og derpå suspenderet i 0,5 mol/1 NaCl, 5% vol/vol Triton-X-100 og homogeniseret med omrørerstaven (Ultraturex) og omrørt i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Derefter gennemførtes en centrifugering i en 10 Sorvall GSA-rotor i 30 minutter ved 4eC og 13.0.00 omdrej ninger per minut. Småkuglerne (pellets) blev optaget i 300 ml 0,1 mol/1 Tris*HCl, pH 6,5, 20 mmol/1 EDTA, 2,5¾ vol/ vol Triton-X-100 og homogeniseret. Derefter blev der foretaget en yderligere centrifugering i 30 minutter ved 4eC 15 og 13.000 omdrejninger per minut, igen i en Sorvall GSA- rotor. Småkuglerne blev optaget i 300 ml 0,1 mo 1/Tri s·HC1, pH 6,5, 20 mmol/1 EDTA, 0,5% vol/vol Triton-X-100 samt homogeniseret. Derpå blev der yderligere to gange foretaget en centrifugering i 30 minutter ved 4eC og 13.000 20 omdrejninger per minut i en Sorvall GSA-rotor, og derefter blev småkuglerne optaget i henholdsvis 300 ml og 250 ml 0,1 raol/1 Tris*HCl, pH 6,5, 20 mmol/1 EOTA samt homogeniseret.

25 EKSEMPEL 2

Denaturering af antistofferne

Lyofilisater af fra hybridomacellelinier (ECACC 88091404) op-30 nået antistof MAK33 eller af Fab-fragmenter deraf (vedrørende produktion .af Fab-fragmenter henvises til A. Johnstone og R. Thorpe i Immunoehemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications (1982), side 52 til 53) samt småkuglerne fra "inklusionslegeme''-fremsti 11 ingen ifølge eksempel l blev inku-35 beret i 0,1 mol/1 Tris*HCl, pH 8,5; 6 mol/1 guanidin*HCl; 2 mmol/1 EOTA, 0,3 mol/1 DTE i 3 timer ved stuetemperatur. Pro-teinkoncentrationen androg mellem 4 og 6 mg/ml. Ksdeadskillel-

I DK 175439 B1 I

I io I

I sen blev kontrolleret med SOS-PAGE under ikke reducerende be- I

I tingelser. Oen fuldstændige reduktion af disulfidbroerne blev I

I bekræftet ved bestemmelse af de frie SH-grupper ifølge G.L. I

Ellman (1959), Arch. Biochem. Biophys. 82, 70. Derpå blev op- I

I 5 løsningernes pH-værdi indstillet til pH 3 med koncentreret I

I saltsyre. I

De nedenfor anførte eksempler på renaturering blev som beskre- I

I vet i eksempel 2 gennemført med fuldstændigt denatureret, re- I

I 10 duceret MAK33 el 1 er MAK33-Fab eller anti stofkædernæ fra "in- I

I kl us i ons 1 egernerne" i 1:100 fortynding i reoxidationspuf fer I

I efter dialyse mod 6 mol/1 guanidinhydrochlorid, pH 2. Renatu- I

I rer ingsmængderne blev termostat i seret ved 20eC. I

I 15 EKSEMPEL 3 I

I Renaturering af MAK33-Fab-fragmenter. I

I Reoxidat ionspuf feren indeholdt 0,1 mol/1 Tris HCl, pH 8,5, 0,5 I

I 20 mol/1 L-arginin, 2 mmol/1 EDTA. I

I Proteinkoncentrationen androg mellem 30 og 60 pg/ml. Renature- I

I ringstiden androg indtil 200 timer. Reoxidationen kontrollere- I

I des med det konformationsspecifikke ELISA-testsystem (eksempel I

I 25 8) for passiv immunreaktivitet. I

I Tabellerne 1A til 1C viser udbyttet af aktivt MAK33-Fab-frag- I

I ment i afhængighed af ændringen: I

I 30 1A af DTE-koncentrationen ved konstant GSSG-koncentration (5 I

I mmol/1 GSSG): I

11 DK 175439 B1

TABEL 1A

_DTE - (mmo 1/1 |_Udbytte (¾¾ 0 53 51 53 3 41 5 8 10 3

10 TABEL IB

_GSSG (mmol/ii_ Udbytte (¾)_ 0 18 1 15 15 3 23 5 32 10 37

TABEL 1C

20 GSSG (mmol /1 1_ Udbytte (¾)_ 0 22 0,1 53 1 38 25 5 28 EKSEMPEL 4

Fuldstændigt denaturerede og reducerede MAK33-Fab-fragmenter 30 blev dialyseret mod 6 mol/1 guan i d i nhydroch 1 or i d, pH 2, og derpå reoxideret i 0,1 mol/1 Tris*HCl, pH 8,5, 0,3 mol/1 gua-nidinhydrochlorid, 0,2 mol/1 GSSG, 2 mmol/1 GSH og 2 mmol/1 EDTA ved en temperatur på 20“C og en renaturer i ngst i d på ca.

200 timer. Tabel 2 viser udbyttet af aktivt MAK33-Fab i afhæn-35 gighed af ændr i ngen af proteinkoncentrationen ved renatureringen. Reoxidationen blev undersøgt for aktiv immunreaktivitet (eksempel 8) med El isa-testsystemet.

DK 175439 B1 I

TABEL 2 I

Fab-koncentrati on Udbytte |

(Ltq/ml )_ (%) I

5 5 13 I

10 9 I

20 4 I

30 3 I

70 li

10 130 0,5 I

560 0 I

EKSEMPEL 5 I

15 Fuldstændigt denatureret og reduceret MAK33-antistof blev dia- | lyseret mod 6 mol/1 guan i d i nhydroch-1 or i d , pH 2, og derpå re-

oxideret i 0,1 mol/1 Tris»HCl, pH 8,5, 0,5 mol/1 L-arginin, 2 I

mtnol/1 EOTA og 1 mmol/1 GSH ved en temperatur på 20°C og en | renat urer ingstid på ca. 200 timer. Reoxidationen blev under- | 20 søgt for aktiv immunreaktivitet med Elisa-testsystemet (eksem- | pel 8). Tabel 3 viser udbyttet af aktivt antistof i afhængig- | hed af ændringen i GSSG-koncentrat ionen ved konstant GSH-kon- | centration (1 mmol/1). |

25 TABEL 3 I

GSSG (mmol/1) Udbytte 1%) I

0 2,0 I

0/1 3,5 I

30 0,5 4,7 I

1 4,8 I

2 4,2 4 3,9

6 3,4 I

35 10 2,7 I

DK 175439 B1 13 EKSEMPEL 6

Renaturering efter der i vat i sering til det blandede disulfid 5 Denatureringen af MAK33 eller MAK33-Fab blev gennemført som beskrevet i eksempel 2. Derefter fulgte en dialyse mod 6 mol/1 guan idinhydroch1 or id, pH 2, og i tilslutning dertil derivati-seringen med 6 mol/1 guanidinhydrochlorid, 0,2 mol/1 GSSG og 0,1 mol/1 Tris*HCl, pH 8,5, ved stuetemperatur i løbet af et 10 tidsrum på ca. 5 timer. Efter dialyse på ny mod 6 mo-1/1 guani-dinhydroch1 or id, pH 2, gennemførtes renatureringen i forskellige varianter.

Tabel 4 A viser renatureringen af MAK33-Fab i 0,1 mol/1 Tris* 15 HC1, pH 7, 0,5 mol/1 L-arginin og 2 mmol/1 EDTA ved 20eC i løbet af ca. 200 timer. Renatureringen b 1 ev med det konformationsspecifikke Elisa-testsystem kontrolleret for passiv (eksempel 8) immunreaktivitet i afhængighed af GSH-koncentrationen.

20

Tabel 4B viser udbyttet af aktivt MAK33-Fab i ovennævnte puffer med 2 mmol/1 GSH i afhængighed af pufferens pH-værdi.

25 Tabel 5A viser renatureri ngen af MAK33 IgG i 0,1 mol/1 Tris· HC1, pH 7, 0,5 mol/1 L-arginin og 2 mmol/1 EDTA ved en temperatur på 20eC i løbet af en renatureringstid på ca. 200 timer i afhængighed af GSH-koncentrationen. Renatureringen blev med det konformati onsspeci -30 fikke Elisa-testsystem undersøgt for passiv immun reaktivitet (eksempel 8).

Tabel 5B viser udbyttet af aktivt antistof i ovennævnte puf-fer med 2 mmol/1 GSH i afhængighed af pH-værdien.

35

DK 175439 B1 I

TABEL 4 A I

GSH (mmo1/1) Udbytte (%) I

0 5 I

5 0,1 48 I

0,5 48 I

41 I

2 35 I

3 31 I

10 4 27 ' I

24 I

10 23 I

TABEL 4B I

15 _gH_;_Udbytte (%) I

7 40 I

8 39 I

9 30 I

20 10 19 I

11 1 I

TABEL 5A

GSH (mmo1/1 ) Udbytte (¾) I

25 I

O 0,3 I

0,1 3,0 I

0,2 4,0 I

0,5 3,8 I

30 1 3,1 I

2 2,5 I

3 2,0 I

6 1/4 I

10 1,4 I

PW····—ΙΒΒΙ^^^ ~--' "iifsrrrrL ’rrjracrr. :tt3gæ-Vi&. * ^Tr ^·,^..:Μ^··::. , .·.:. h .. , r^ppc?. ». ;_·.·»TTgg^·· DK 175439 B1 15

TABEL 5B

_£H__Udbytte (%) 6 3,9 5 7 3,8 8 2,9 9 1,5 10 0,8 11 0,6 10 EKSEMPEL 7

Renaturering af i E. coli udtrykte anti stofkæder.

15 De komplementære enkeltkæders ink1usi ons 1egemer (kappe og Fd, eksempel 1) blev sol ubi 1 i seret som beskrevet i eksempel 2.

Derpå dialyseredes mod 6 mol/1 guanidinhydroch1 or id, pH 2.

Sol ubi 1 i ser ing og dialyse skete separat for de to kæder. 1 2 3 4 5 6

Med henblik på reoxidationen blev ækvimolære mængder af de 2 reducerede enkeltkæder samtidigt fortyndet i et 100 gange så 3 stort volumen af 0,1 mol/1 Tris-HCl, pH 8,5, 0,6 mol/1 L-argi- 4 ni.n, 0,1 rnmol/1 GSS6, 1 mmol/1 GSH og 2 mmol/1 EDTA. Renature- 5 ringen skete ved inkubation i 200 timer ved 20eC.

6

Udbyttet af naturligt, biologisk aktivt protein androg 18%.

Andelen af naturlige antistoffer blev bestemt ved måling af den passive immunreaktivitet (eksempel 8).

30 EKSEMPEL 8 Påvisning af den passive og aktive immunreaktivitet samt af hæmningsaktiviteten.

/ 3 5 8.1 Påvisning af det monoklonale antistofs passive immunreak tivitet over for human-CK-MM (den humane creatinkinases skel et-muskel i soenzym)

I DK 175439 B1 I

I I

Ved passiv immunreaktivitet forstås her udvikling af na- I

I turligt strukturerede epitoper på det naturlige eller re- I

I naturerede antistof. Påvisningen af disse epitoper sker I

H ved hjælp af konformationsspecifi kke anti-mus-antistof- I

5 fer, der udvindes fra en anden dyreart {her: får), i et I

ELISA-tes tsystem. I

Fremstilling af konformat ionsspecifikke, polyklonale får- I

anti-mus-Fab-antistoffer. I

10 I

Antiserum mod polyklonalt mus-immunglobulin blev frem- I

stillet i får ifølge A. Johnstone og R. Thorpe, Immuno- I

chemistry in Practice, Blackwell Scientific Publications, I

I Oxford, 1982, side 27 til 31. I

I 15 I

H Anti-serumets IgG-fraktion blev via ammon i umsulfatfrak- I

H tionering og DEAE-ionbytterkromatografi isoleret ifølge I

Johnstone og Thorpe, side 44 til 46. I

I 20 500 mg af denne IgG-fraktion blev adsorberet så ofte til I

I 10 ral af en mus-kappakæde-Spherosi1-immunadsorber (1,5 mg I

mus-kappakæde/ml Spherosil), indtil ingen ant i-mus-kappa- I

I aktivitet længere kunne påvises ved hjælp af enzymimmun- I

I test. Oerefter blev IgG-frakt ionen ført gennem en søjle I

I 25 med 20 ml af en mus-Fab-Spherosi1-fyldning (5 mg mus-Fab/ I

ml Spherosil), og den specifikt adsorberede andel af IgG- I

fraktionen blev elueret med 0,2 mol/l glycin, pH 2,8. I

I Efter dialyse mod 1 mmol/1 eddikesyre blev denne delfrak- I

I tion lyofi 1iseret. I

I 30 I

Ved hjælp 'af immuntests blev det fastslået: at således I

I fremstillet IgG ikke reagerer med frie M-kappa-, M-gam- I

I ma- eller M-Fd-kæder eller med ufuldstændigt foldede I

I M-kappa/M-Fd-komplekser. Binding finder sted med Μ-Fab, I

I 35 Μ-IgG og fuldstændigt foldede komplekser af M-kappa/M-Fd I

eller M-kappa/M-gamma. I

-:--ιξ;-—n'årshSTr i"*"& y._.·· ---^¾ DK 175439 B1 17

Renaturerede antistoffer og naturlige standardprøver blev for-inkuberet sammen med konformat i onsspecifikke ant i -mus-anti-Fab-antistoffer. Alt efter antal naturligt udviklede konformationsepitoper blev forskelligt mange af 5 det konformationsspecifikke anti-mus-Fab-anti stofs bin dingssteder mættet. For-inkubationsopløsningen blev sammen med murint anti stof-enzym-konjugat (antistof-peroxi-dase-konjugat) fyldt på reagensglas, hvis vægge var belagt med museantistoffer.

10

De umættede konformationsspecif ikke anti-mus-antistoffer fra får dannede derpå bro mellem de vægbundne muse-antistoffer og muse-anti stof-enzym-konjugaterne, hvorved mængden af bundet konjugat er indirekte proportional med 15 mængden af naturligt eller renatureret antistof i for-in kubationsopløsningen. Den spektroskopiske påvisning skete efter omsætning af det chromogene substrat ABTS® (2,2'-azino-bis-(3-ethy1benzothiazolin-6-su1fonat)) ved hjælp af det anti stof-konjugerede enzym via absorptionsmåling 20 ved 405 nm (H.U. Bergmeyer, Meth. in Enzymol. 3. udgave, bind 9, 15-37).

8.2 Påvisning af det monoklonale antistofs aktive immunreak-tivi tet 25 MAK33 IgG genkender specifikt den humane creatinkinases skeletmuskel-isoenzym (CK-MM; se P. Buekel et al., Gene 51 (1987), 13-19).

30 Ved aktiv immunreaktivitet forstås her det naturlige el ler renaturerede antistofs reaktion med det specifikke antigen (i det foreliggende tilfælde: human-CK-MM).

I et ELISA-testsystem blev denne reaktion bestemt kvanti-35 tativt kolorimetrisk ved hjælp af enzymkonjugeret, poly- klonalt anti-mus-antistof via omsætningen af det chromogene substrat ABTS.

I DK 175439 B1 I

I I

I 8.3 Påvisning af det monoklonale antistofs hæmningsaktivitet I

I MAK33 IgG genkender en epitop, som kun udvikles på M-un- I

I derenhederne af det ske 1etmuske1 spec ifikke isoenzym I

I 5 CK-MM. Ved binding til epitopen hæmmes den enzymatiske I

I aktivitet 80% (P. Buekel et al., 1987). CK-MM-hæmnings- I

I testen er således en meget beviskraftig test til påvis- I

I ning af rekonsti tut ionen af MAK33 efter fuldstændig dena- I

I turering og reduktion, da kun et fuldstændigt renatureret I

I 10 antigenbindingssted kan hæmme enzymet. - I

I Creatinkinasens aktivitet blev bestemt ved hjælp af en I

I koblet enzymatisk test fra firmaet Boehringer Mannheim I

I (H.U. Bergmeyer, Meth. of Enzym. Analysis, 3. udgave, I

I 15 bind III, 510-540). Derved omsættes creatinkinasen, crea- I

I tinphosphat og AOP til dannelse af creatin og ATP. For at I

I opnå en spektroskopisk påviselig reaktion blev det fra I

hexokinasen dannede ATP forbrugt til phosphoryleringen af I

I glucose til giucose-6-phosphat. GIucose-6-phosphat bliver I

I 20 af g 1ucose-6-phosphatdehydrogenasen oxideret til gluco- I

I nat-6-phosphat under dannelse af ΝΑ0ΡΗ + H+ fra NA0P+. Ud I

I fra extinktionsændringen per minut kan creatinkinasens I

I aktivitet beregnes. Ud fra en kalibreringskurve med na- I

I turligt antistof mod CK-MM kan mængden af naturligt mate- I

I 25 riale, der svarer til hæmningsvirkningen i renaturerings- I

mængden, bestemmes. Andelen af hæmningsaktivt protein, I

I regnet i forhold til den samlede proteinmængde i renatu- I

I rer ingsmængden, resulterer i det procentuelle udbytte af I

I hæmningsaktive antistoffer. I

I 3 0 I

I 8.4 Sammenlignende bestemmelse af renatureringsudbyttet ved I

I hjælp af passiv/aktiv immunreaktivitet og hæmningsakti vi - I

tet. I

I 35 Fuldstændigt denaturerede og reducerede MAK33-Fab-frag- I

I menter blev dialyseret mod 6 mol/1 guanidi nhydrochlor id, I

pH 2, og derpå reoxideret ved hjælp af 1:100 fortynding i I

BMB-flte;.*·. '”Γ""_ . " .' · ^!»g3ETr%crTry^^ DK 175439 B1 19 0,1 mol/1 Tris-HCl, pH 8,5, 0,5 mol/1 L-arginin, 0,2 mmol/1 6SSG, 2 mmol/1 GSH og 2 mmol/1 EDTA ved en temperatur på 20eC og en renaturingstid på ca. 200 timer.

5 På grund af den relativt høje anti stofkoncentrat i on, der skal anvendes ved målingen af hæmningsaktiviteten, blev renatureringsmængden koncentreret. Dertil blev renature-ringsopløsningen dialyseret mod l mmol/1 eddikesyre og derefter lyofi 1iseret. Lyofilisatet blev optaget i H2O 10 (H2O: renatureringsvolumen = 1:200) og dialyseret mod 50 mmol/1 kaliumphosphat og 0,15 mol/1 MaCl, pH 7,5.

Tabel 6 viser udbyttet af aktivt Fab-fragment i dialysa-tet, bestemt ved hjælp af passiv/aktiv immunreaktivitet 15 og hæmningsaktivitet.

TABEL 6

Testmetode _Udbytte (%) 20 passiv immunreaktivitet 28 aktiv immunreaktivitet 26 hæmningsaktivitet 25 EKSEMPEL 9 25

Aktivering af t-PA fra E. coli

Fra fugtig cellemasse af E. coli, DSM 3689, der er transformeret med plasmid pePa 133 (EP-A 0 242 835), fremstilles som 30 beskrevet i eksempel 1.4 "inklusionslegemer" som pellets eller småkugler.

Småkuglerne fra "inklusionslegerne"-fremsti 11 i ngen blev inkuberet i 0,1 mol/1 Tris-HCl, pH 8,5; 6 mol/1 guanidin-HCl; 2 35 mmol/1 EDTA; og 0,3 mol/1 DTE i 3 timer ved stuetemperatur og ved en proteinkoncentration mellem 4 og 6 mg/ml. I tilslutning til so 1ubi 1 i seri ngen blev opløsningens pH-værdi indstillet til

I DK 175439 B1 I

I 20 I

I pH 3 med koncentreret saltsyre. Reduktionsmiddel og puffer- I

I bestanddele blev fraskilt ved hjælp af dialyse mod 6 mol/1

I guanidin-HCl, pH 2, ved 4°C. I

I 5 Renaturering af t-PA I

I Renaturering af det således opnåede denaturerede og reducerede I

I protein skete ved fortynding i 0,1 mol/1 Tris-HCl, pH 10,5, I

I 0,5 mol/1 L-arginin, 1 mmol/1 EDTA og 1 mg/ml kvægseruma1 bu- I

I 10 min. Proteinkoncentrationen androg mellem 10 og 30 pg/ml, tem- I

I peraturen 20°C og renatureringstiden 24 timer. I

I Reaktiveringen blev bestemt i overensstemmelse med test-for- I

I skriften for tPA fra firmaet Boehringer Mannheim GmbH, be- I

I 15 stillingsnr. 1080954. Tabellerne 7A og 7B viser udbyttet af I

I aktivt tPA i afhængighed af ændringen: I

I 7 A af GSSG-koncentrationen ved konstant DTE-koncentrati on I

I (2 mmo 1/1) I

I 20 I

I 7 B af GSSG-koncentrationen ved konstant GSH-koncentration I

I (1 mmol/1) I

I Tabel 7 A I

I 25 GSSG (mmol/n_Udbytte (*) I

l'O 0 I

I - I

I I

I 30 5 12 I

I '10 6 I

I 35 I

pr; ---:-, .......τ .....y λ' -...-.-tÆælBmssm:: · ? - · · -__ · DK 175439 B1 21

Tabel 7 B

GSSG (mmol/1)_Udbytte (*) 0 6 5 0,1 14 1 10 5 1 EKSEMPEL 10 10

Renaturerina af K2P (t-PA-derivat, se DE 39 03 581) efter der ivati ser inq til det blandede disulfid

Som beskrevet i DE 39 03 581 dyrkes celler af E. coli, DSM 15 2093, der er transformeret med plasmiderne pA27fd og pUBS500, dyrket, og fugtig cellemasse udvindes. Ud fra denne fugtige cellemasse udvindes som beskrevet i eksempel 9 denatureret og reduceret protein.

20 Opløsningen af det denaturerede og reducerede, protein i 6 mol/1 guanidin-HCl, pH 2, blev indstillet til 0,1 mol/1 roed GSSG og til 0,1 mol/1 med Tris. Derpå blev pH-værdien indstillet til pH 8,5 med NaOH. Efter 2 timers inkubation ved stuetemperatur blev oxidationsmiddel og pufferbestanddele fraskilt 25 ved hjælp af en dialyse igen mod 6 mol/1 guan i di n-HC1, pH 2, 4 * C.

Renaturering af det denaturerede og oxiderede protein ("blandet disulfid") skete ved fortynding i renatureringspuffer.

30 Proteinkoncentrationen androg mellem 30 og 60 pg/ml , temperaturen 20eC og renatureringstiden 12 timer.

Tabel 8 A viser reaktiveringen af K2P i 0,1 mol/1 Tris-HCl, pH 8,5, 0,8 mol/1 L-arginin og 2 mmol/1 EDTA i af-35 hængighed af GSH-koncentrati on, og

Tabel 8 B viser udbyttet af aktivt K2P i ovennævnte puffer med 0,5 mmol/1 GSH i afhængighed af pufferens pH-

I DK 175439 B1 I

I I

I værd i. I

I Tabel 8 A I

I GSH (mmol/1) Udbytte (%) I

I 5 I

I 0 I

I 0,1 14 I

I 0,5 26 I

I 1 20 I

I 10 2 10 I

I Tabel 8 B I

I pH Udbytte (%} I

I 15 I

I I

I 8 15 I

I 9 23 I

I I

I 20 I

I 25 I

I 30 - I

I 35 I

Claims

1. Fremgangsmåde til aktivering af genteknologisk fremstil-5 lede og i prokaryoter udtrykte biologisk aktive proteiner efter ce11eop1ukning ved sol ubi 1 iser ing under denaturerende betingelser og efterfølgende reaktivering under oxiderende og renaturerende betingelser, kendetegnet ved, at man arbejder ved en proteinkoncentration fra 1 til 1000 pg/ml og 10 mellem solubi1iseringen og reaktiveringen gennemfører en dialyse mod en puffer med en pH-værdi mellem 1 og 4, hvilken puffer indeholder 4 til 8 mol/1 guanidinhydrochlorid eller 6 til 10 mol/1 uri nstof.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at dialysepufferen indeholder 5 til 7 mol/1 guanidinhydrochlorid.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, 20 at man gennemfører reaktiveringen ved en pH-værdi fra 9 til 12, en GSH-koncentration fra 0,1 til 20 mmol/1, en GSSG-kon-centration fra 0,01 til 3 mmol/1 og roed en ikke denaturerende koncentration af et denatureringsmiddel i løbet af et tidsrum fra 1 til 300 timer. 25

4. Fremgangsmåde ifølge krav 3, kendetegnet ved, at GSH-koncentrationen andrager 0,2 til 10 mmol/1, og/eller at GSSG-koncentrationen andrager 0,05 til 1 mmol/1. 1 2 3 4 5 6

5. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendeteg 2 net ved, at man på reakt i veringstri nnet til at begynde med 3 omdanner proteinernes diolgrupper til de blandede disulfider 4 af protein og glutathion ved tilsætning af GSSG under dena 5 turerende betingelser, på ny dialyserer mod den guan idinhydro- 6 chlorid- eller urinstofholdige puffer og derpå i løbet af et tidsrum fra 1 til 300 timer reaktiverer ved en pH-værdi fra 6 til 10, en GSH-koncentration fra 0,1 til 5 mmol/1 og med en ikke denaturerende koncentration af et denatureringsmiddel. I DK 175439 B1 I I i

6. Fremgangsmåde ifølge krav 3 til 5, kendetegnet I I ved, at man i reaktiveringstrinnet som denatureringsmiddel I I anvender arginin, guanidinhydrochlorid og/eller mindst en for- I I bindelse med den almene formel R^-CO-NRR^ (I), hvori R og Rj I I 5 betyder H eller alkyl med l til 4 carbonatomer, og R2 betyder I I H eller NRRi eller alkyl med 1 til 3 carbonatomer. I

7. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, I I at koncentrationen af arginin og/eller guanidinhydrochlorid I I 10 andrager 0,1 til 1,0 mol/1, især 0,25 til 0,8 mol/1.- I

8. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, I at koncentrationen af forbindelsen med den almene formel I I I andrager 0,5 til 5 mol/1, især 1 til 3,5 mol/1. I I 15 I

9. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, I I kendetegnet ved, at man i reaktiveringstrinnet I I arbejder i nærværelse af et ikke proteolytisk virksomt pro- I tein, især i nærværelse af kvægseruma1 bumi η. I I I

10. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, I I kendetegnet ved, at man i reaktiveringstrinnet I I arbejder i nærværelse af 1 til 10 mmol/1 EDTA. I I 25

11. Fremgangangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, I I kendetegnet ved, at man gennemfører celleoplukniη- I gen ved hjælp af ultralyd, højtryksdispersion eller lysozym. I

12. Fremgangsmåde ifølge krav 11, kendetegnet ved, I I 30 at man gennemfører oplukningen i en fortyndet, vandig puffer- I I opløsning, især i 0,1 mol/1 Tris, ved en neutral til svagt sur I pH-værdi. I

13. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, I I 35 kendetegnet ved, at man efter ce11eop1ukni ngen I fraskiller de uopløselige bestanddele. I DK 175439 B1

14. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendeteg net ved, at man på solubi1 iser ingstrinnet arbejder ved en alkalisk pH-værdi i nærvsrelse af et reduktionsmiddel fra mercaptangruppen og i nærværelse af et dena- 5 tureringsmiddel.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, kendetegnet ved, at man arbejder i nærværelse af guan id inhydroch1 or id og/eller en forbindelse med den almene formel I som denaturer ingsmid- 10 del.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 15, kendetegnet ved, at koncentrationen af guanidinhydrochlorid andrager 6 mol/1, og at koncentrationen af forbindelsen med den almene formel I 15 andrager β mol/1.

17. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 14 til 16, kendetegnet ved, at man arbejder i nærværelse af OTE, £-mercaptoethanol, cystein eller GSH. 20

18. Fremgangsmåde ifølge ethvert af de foregående krav, kendetegnet ved, at man reaktiverer antistoffer eller antistof fragmenter.

19. Fremgangsmåde ifølge ethvert af kravene 1 til 17, ken detegnet ved, at man reaktiverer t-PA eller et protein, der virker på lignende måde som t-PA. 1 35