JPH0793879B2 - 遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方法 - Google Patents
遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した
生物学的に活性の蛋白質の活性化法に関する。
生物学的に活性の蛋白質の活性化法に関する。
蛋白質例えば、非相同宿主組織中での抗体の遺伝子工学
による製造は、不活性で難溶性の蛋白質凝集物いわゆる
「封入体（inclusion bodies）」をもたらす。このよう
な封入体の形成は、特に、表現時に生じる細胞内での高
い蛋白質濃度の結果であると思われる。生物学的に活性
の蛋白質を得るためには、この封入体を変性及び還元に
より溶解させ、次いで、その本来の形のこの蛋白質の三
次元構造を適当な溶解条件の調整により再び製造しなけ
ればならない（M.Sela等による1957、Science 125、691
参照）。完全なたたみ込み除去（Entfaltung）は、高濃
度のカオトロピツク剤例えば尿素及びグアニジンの添加
により達成される（R.Jaenicke（1987）、Prog.Biophy
s.Molec.Biol.49、117〜237参照）。ジスルフイド橋の
還元のために、強力な還元剤例えばβ−メルカプトエタ
ノール又は1,4−ジチオエリスリツトが使用される。
による製造は、不活性で難溶性の蛋白質凝集物いわゆる
「封入体（inclusion bodies）」をもたらす。このよう
な封入体の形成は、特に、表現時に生じる細胞内での高
い蛋白質濃度の結果であると思われる。生物学的に活性
の蛋白質を得るためには、この封入体を変性及び還元に
より溶解させ、次いで、その本来の形のこの蛋白質の三
次元構造を適当な溶解条件の調整により再び製造しなけ
ればならない（M.Sela等による1957、Science 125、691
参照）。完全なたたみ込み除去（Entfaltung）は、高濃
度のカオトロピツク剤例えば尿素及びグアニジンの添加
により達成される（R.Jaenicke（1987）、Prog.Biophy
s.Molec.Biol.49、117〜237参照）。ジスルフイド橋の
還元のために、強力な還元剤例えばβ−メルカプトエタ
ノール又は1,4−ジチオエリスリツトが使用される。
しかしながら、変性状態からの復元（Renaturierung）
の際には２つの競争反応が現われる。本来の状態への所
望のたたみ込みと共に、凝集物形成も認められる（G.Ze
ttlmeissl等によるBiochemistry 18、5567参照）。本来
の分子の側への平衡を大きくするためには、一方では、
誤まつたたたみ込みの、従つて不安定な分子を創製し、
凝集へのその非特異的な交換作用を阻止するが、他方で
は、本来の状態への戻りたたみ込みを阻止しない条件を
選択する。これは、不安定化濃度（labilisierende kon
zentration）でのカオトロピツク剤の添加により達成し
ている。付加的に、この蛋白質濃度は厳密に復元収率に
作用を及ぼすように注意すべきである（欧州特許第0241
022号）。本来の状態でジスルフイド架橋された蛋白質
においては、復元の間に付加的に、誤まつて架橋された
システインを再び還元し、正しい対に集団化することの
できるレドツクス条件を与えることが重要である。還元
され、酸化されたチオール試薬からのいわゆるオキシド
シヤフリング溶液（Oxido-shuffling solution）は、本
来の構造のジスルフイド架橋された蛋白質の収率を高め
る。
の際には２つの競争反応が現われる。本来の状態への所
望のたたみ込みと共に、凝集物形成も認められる（G.Ze
ttlmeissl等によるBiochemistry 18、5567参照）。本来
の分子の側への平衡を大きくするためには、一方では、
誤まつたたたみ込みの、従つて不安定な分子を創製し、
凝集へのその非特異的な交換作用を阻止するが、他方で
は、本来の状態への戻りたたみ込みを阻止しない条件を
選択する。これは、不安定化濃度（labilisierende kon
zentration）でのカオトロピツク剤の添加により達成し
ている。付加的に、この蛋白質濃度は厳密に復元収率に
作用を及ぼすように注意すべきである（欧州特許第0241
022号）。本来の状態でジスルフイド架橋された蛋白質
においては、復元の間に付加的に、誤まつて架橋された
システインを再び還元し、正しい対に集団化することの
できるレドツクス条件を与えることが重要である。還元
され、酸化されたチオール試薬からのいわゆるオキシド
シヤフリング溶液（Oxido-shuffling solution）は、本
来の構造のジスルフイド架橋された蛋白質の収率を高め
る。
完全な変性及び還元後の抗体の復元が可能であること
は、ハーバー（Haber）により、はじめて、Fab−フラグ
メントの例で示された（E.Haber,Biochemistry52、1099
〜1106（1964）参照）。その収率は、12〜14％であつ
た。これは、ホイツトニイ（Whitney）及びタンフオー
ド（Tanford）により、Fab−フラグメントの復元の結果
により追認された。彼らは８％の収率を得た（P.L.Whit
ney,C.Tanford,Proc.Natl.Acad.Sci.USA53（1965）参
照）。完全な抗体は、フリードマン（Freedman）及びセ
ラ（Sela）によりはじめて有効に復元された。その収率
は、20〜25％であつた（M.H.Freedman,M.Sela,J.Biol.C
hem.241、2383〜2396（1966）、J.Biol.Chem.241、5225
〜5232（1966）参照）。本来の出発分子を溶解特性の改
良のために、ポリアラニル化したことは注目に値する。
は、ハーバー（Haber）により、はじめて、Fab−フラグ
メントの例で示された（E.Haber,Biochemistry52、1099
〜1106（1964）参照）。その収率は、12〜14％であつ
た。これは、ホイツトニイ（Whitney）及びタンフオー
ド（Tanford）により、Fab−フラグメントの復元の結果
により追認された。彼らは８％の収率を得た（P.L.Whit
ney,C.Tanford,Proc.Natl.Acad.Sci.USA53（1965）参
照）。完全な抗体は、フリードマン（Freedman）及びセ
ラ（Sela）によりはじめて有効に復元された。その収率
は、20〜25％であつた（M.H.Freedman,M.Sela,J.Biol.C
hem.241、2383〜2396（1966）、J.Biol.Chem.241、5225
〜5232（1966）参照）。本来の出発分子を溶解特性の改
良のために、ポリアラニル化したことは注目に値する。
ここに挙げた操作では、これは、ポリクローナル抗体も
しくは抗体フラグメント即ち種々異なるパラトープ（Pa
ratopen）及び種々異なる親和定数を有する抗体の混合
物に関することに注目すべきである。
しくは抗体フラグメント即ち種々異なるパラトープ（Pa
ratopen）及び種々異なる親和定数を有する抗体の混合
物に関することに注目すべきである。
この非相同ポピユレーシヨンの重い及び軽い鏡が復元の
際に純粋に統計的に会合するので、ここでは、本来の関
連結合特異性及び親和性と一致しない復元分子が得られ
る。
際に純粋に統計的に会合するので、ここでは、本来の関
連結合特異性及び親和性と一致しない復元分子が得られ
る。
E.コリー（Coli）中でクローニングされ、発現された他
の真核生物蛋白質におけるように、E.コリー中でも、不
溶性封入体の形の抗体の表現された重い及び軽い鎖が生
じる（S.Cabilly等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81、3273
〜3277（1984）、M.Y.Boss等1984、Nucleic Acids Rese
arch 12、3791〜3806参照）。形質転換された微生物か
らの抗体を得るために、Cabilly等及びBoss等は、官能
性抗体の復元を可能にする方法を記載している。しかし
ながら、この方法ではモノクローナル抗体に関して、約
0.2〜0.5％の収率のみを与えた。
の真核生物蛋白質におけるように、E.コリー中でも、不
溶性封入体の形の抗体の表現された重い及び軽い鎖が生
じる（S.Cabilly等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81、3273
〜3277（1984）、M.Y.Boss等1984、Nucleic Acids Rese
arch 12、3791〜3806参照）。形質転換された微生物か
らの抗体を得るために、Cabilly等及びBoss等は、官能
性抗体の復元を可能にする方法を記載している。しかし
ながら、この方法ではモノクローナル抗体に関して、約
0.2〜0.5％の収率のみを与えた。
従つて、本発明は、原核生物中に発現した生物学的に活
性の蛋白質の再活性化の方法を得ることを課題とし、こ
の際、表現により封入体の形で得られる蛋白質を良好な
収率でその活性の復元形に変じることができる。
性の蛋白質の再活性化の方法を得ることを課題とし、こ
の際、表現により封入体の形で得られる蛋白質を良好な
収率でその活性の復元形に変じることができる。
この課題は、変性及び還元性条件下での可溶化による細
胞溶解及び引続く酸化性及び復元性条件下での再活性化
により、原核生物中に発現した生物学的活性の蛋白質を
活性化する方法により解決され、これは、１〜1000μg/
mlの蛋白質濃度で操作し、可溶化と再活性化との間に、
pH1〜４を有し、塩酸グアニジン４〜８モル/l又は尿素
６〜10モル/lを含有する緩衝液に対する透析を実施する
ことよりなる。
胞溶解及び引続く酸化性及び復元性条件下での再活性化
により、原核生物中に発現した生物学的活性の蛋白質を
活性化する方法により解決され、これは、１〜1000μg/
mlの蛋白質濃度で操作し、可溶化と再活性化との間に、
pH1〜４を有し、塩酸グアニジン４〜８モル/l又は尿素
６〜10モル/lを含有する緩衝液に対する透析を実施する
ことよりなる。
意外にも、尿素又は殊に塩酸グアニジンの存在における
透析の後に、再活性化の後の活性蛋白質の極めて高い収
率が得られることが確認された。
透析の後に、再活性化の後の活性蛋白質の極めて高い収
率が得られることが確認された。
本発明は、遺伝子工学により原核生物中で製造されたす
べての生物学的活性蛋白質での使用、特に抗体及びソノ
フラグメント及びｔ−PA及びｔ−PA類似蛋白質もしくは
類縁体を得るための使用に好適である。
べての生物学的活性蛋白質での使用、特に抗体及びソノ
フラグメント及びｔ−PA及びｔ−PA類似蛋白質もしくは
類縁体を得るための使用に好適である。
本発明の有利な実施形では、透析緩衝液は、塩酸グアニ
ジン５〜７モル/lを含有する。
ジン５〜７モル/lを含有する。
再活性化の際に、pH値９〜12、GSH−濃度0.1〜20mモル/
lで、GSSG−濃度0.01〜3mモル/lで、かつ非変性濃度の
変性剤を用いて操作し、この再活性化を１〜300時間の
時間にわたつて実施するのが有利である。特に、この
際、GSH−濃度は0.2〜10mモル/l及び／又はGSSG−濃度
は0.05〜1mモル/lであるのが有利である。
lで、GSSG−濃度0.01〜3mモル/lで、かつ非変性濃度の
変性剤を用いて操作し、この再活性化を１〜300時間の
時間にわたつて実施するのが有利である。特に、この
際、GSH−濃度は0.2〜10mモル/l及び／又はGSSG−濃度
は0.05〜1mモル/lであるのが有利である。
本発明のもう１つの有利な実施形では、再活性化の工程
で、まず変性条件下でGSSGの添加により抗体のチオール
基を抗体の混合ジスルフイド及びグルタチオンに変じ、
改めて、塩酸グアニジン又は尿素を含有する緩衝液に対
して透析させ、次いで、６〜10のpH値、0.1〜5mモル/l
のGSH濃度で、かつ非変性性濃度の変性剤を用いて、１
〜300時間にわたつて再活性化させる。
で、まず変性条件下でGSSGの添加により抗体のチオール
基を抗体の混合ジスルフイド及びグルタチオンに変じ、
改めて、塩酸グアニジン又は尿素を含有する緩衝液に対
して透析させ、次いで、６〜10のpH値、0.1〜5mモル/l
のGSH濃度で、かつ非変性性濃度の変性剤を用いて、１
〜300時間にわたつて再活性化させる。
変性剤としては、一般に、酸化条件下での活性化のため
に通例使用されている変性剤又はアルギニンを使用する
ことができる。変性剤として、アルギニン、塩酸グアニ
ジン及び／又は少なくとも１種の一般式： R2‐CO-NRR1 （Ｉ） 〔式中Ｒ及びR1はＨ又はＣ−原子数１〜４のアルキルを
表わし、R2はＨ又はNRR1又はＣ−原子数１〜３のアルキ
ルを表わす〕の化合物を使用するのが有利である。これ
らの変性剤は、更に混合物として使用できる。アルギニ
ン及び／又は塩酸グアニジンの濃度は、0.1〜1.0モル/l
殊に0.25〜0.8モル/lであるのが有利である。一般式Ｉ
の化合物の濃度は0.5〜４モル/l、殊に１〜3.5モル/lで
ある。本発明のもう１つの有利な実施形においては、再
活性化工程を、異種蛋白質の存在で実施する。そのもの
としては、一般に、蛋白質分解作用をしない任意の異種
蛋白質が好適であり、特に牛血清アルブミン（BSA）を
例えば１〜3mg/mlの量で使用するのが有利である。BSA
の添加は、蛋白質の収率を高め安定化させる作用をする
（おそらく、表面変性及び／又は蛋白質分解の前の保護
による）。
に通例使用されている変性剤又はアルギニンを使用する
ことができる。変性剤として、アルギニン、塩酸グアニ
ジン及び／又は少なくとも１種の一般式： R2‐CO-NRR1 （Ｉ） 〔式中Ｒ及びR1はＨ又はＣ−原子数１〜４のアルキルを
表わし、R2はＨ又はNRR1又はＣ−原子数１〜３のアルキ
ルを表わす〕の化合物を使用するのが有利である。これ
らの変性剤は、更に混合物として使用できる。アルギニ
ン及び／又は塩酸グアニジンの濃度は、0.1〜1.0モル/l
殊に0.25〜0.8モル/lであるのが有利である。一般式Ｉ
の化合物の濃度は0.5〜４モル/l、殊に１〜3.5モル/lで
ある。本発明のもう１つの有利な実施形においては、再
活性化工程を、異種蛋白質の存在で実施する。そのもの
としては、一般に、蛋白質分解作用をしない任意の異種
蛋白質が好適であり、特に牛血清アルブミン（BSA）を
例えば１〜3mg/mlの量で使用するのが有利である。BSA
の添加は、蛋白質の収率を高め安定化させる作用をする
（おそらく、表面変性及び／又は蛋白質分解の前の保護
による）。
慣用の方法条件は、再活性化工程のための技術水準から
公知で慣用の条件に一致しうる。この再活性化は、有利
に、約５〜30℃、特に10℃で実施される。透析及び再活
性化工程（再酸化／活性化）を先行し、後続の工程例え
ば細胞崩壊、可溶化（可溶化、還元）は、例えば欧州特
許（EP-A）第0114506号、同第0093619号の技術水準から
非相同表現蛋白質もしくはt-PAの再活性化のために公知
かつ慣用の方法で実施することができ、収率及び活性化
に関して最適な結果を得るためには、個々の又は全ての
工程を、ここに説明した１以上の方法形式の考慮のもと
に実施するのが有利である。
公知で慣用の条件に一致しうる。この再活性化は、有利
に、約５〜30℃、特に10℃で実施される。透析及び再活
性化工程（再酸化／活性化）を先行し、後続の工程例え
ば細胞崩壊、可溶化（可溶化、還元）は、例えば欧州特
許（EP-A）第0114506号、同第0093619号の技術水準から
非相同表現蛋白質もしくはt-PAの再活性化のために公知
かつ慣用の方法で実施することができ、収率及び活性化
に関して最適な結果を得るためには、個々の又は全ての
工程を、ここに説明した１以上の方法形式の考慮のもと
に実施するのが有利である。
細胞崩壊は、このために慣用の方法により、例えば超音
波、高圧分散又はリソチームを用いて行なうことができ
る。懸濁媒体としての、中性〜弱酸性のpH値の調節のた
めに好適な緩衝液溶液中で、例えばトリス/HCl0.1モル/
l中で実施するのが有利である。細胞崩壊の後に、不溶
成分（封入体）を常法で、特に、遠心分離又は濾過によ
り分離する。蛋白質を害しないが、異種細胞蛋白質をで
きるだけ溶解する薬剤例えば水、燐酸塩緩衝溶液での洗
浄（場合によつては温和な変性剤例えばトリトンの添加
のもとに）の後に、沈澱（ペレツト）を可溶化（可溶化
／還元）させる。
波、高圧分散又はリソチームを用いて行なうことができ
る。懸濁媒体としての、中性〜弱酸性のpH値の調節のた
めに好適な緩衝液溶液中で、例えばトリス/HCl0.1モル/
l中で実施するのが有利である。細胞崩壊の後に、不溶
成分（封入体）を常法で、特に、遠心分離又は濾過によ
り分離する。蛋白質を害しないが、異種細胞蛋白質をで
きるだけ溶解する薬剤例えば水、燐酸塩緩衝溶液での洗
浄（場合によつては温和な変性剤例えばトリトンの添加
のもとに）の後に、沈澱（ペレツト）を可溶化（可溶化
／還元）させる。
この可溶化は、有利に、アルカリ性pH領域で、殊にpH8.
6±0.4で、メルカプタン群からの還元剤及び変性剤の存
在で行なうのが有利である。
6±0.4で、メルカプタン群からの還元剤及び変性剤の存
在で行なうのが有利である。
変性剤としては、技術水準例えば欧州特許（EP−Ａ）第
0114506号明細書から公知で慣用の変性剤殊に塩酸グア
ニジン又は一般式Ｉの化合物を使用することができる。
これは、塩酸グアニジン６モル/lの濃度でもしくは一般
式の化合物８モル/lの濃度で行なうのが有利である。
0114506号明細書から公知で慣用の変性剤殊に塩酸グア
ニジン又は一般式Ｉの化合物を使用することができる。
これは、塩酸グアニジン６モル/lの濃度でもしくは一般
式の化合物８モル/lの濃度で行なうのが有利である。
メルカプタン群からの還元剤としては、例えば還元グル
タチオン（GSH）又は２−メルカプトエタノールを例え
ば約50〜400mモル/lの濃度でかつ／又は殊にDTE（ジチ
オエリスリトール）もしくはDTT（ジチオスレイトー
ル）を例えば約80〜400mモル/lの濃度で、もしくはシス
テインを使用することができる。可溶化は、室温で、0.
5〜数時間、有利に２時間の間に行なうのが有利であ
る。空気酸素による還元剤の酸化を阻止するために、ED
TAを、有利に１〜10mモル/lの量で添加するのも有利で
ありうる。可溶化／還元と並んで、この可溶化工程は、
精製作用をも有する。それというのも、異種蛋白質の大
部分は溶解しないからである。
タチオン（GSH）又は２−メルカプトエタノールを例え
ば約50〜400mモル/lの濃度でかつ／又は殊にDTE（ジチ
オエリスリトール）もしくはDTT（ジチオスレイトー
ル）を例えば約80〜400mモル/lの濃度で、もしくはシス
テインを使用することができる。可溶化は、室温で、0.
5〜数時間、有利に２時間の間に行なうのが有利であ
る。空気酸素による還元剤の酸化を阻止するために、ED
TAを、有利に１〜10mモル/lの量で添加するのも有利で
ありうる。可溶化／還元と並んで、この可溶化工程は、
精製作用をも有する。それというのも、異種蛋白質の大
部分は溶解しないからである。
本発明の他の実施形は、再活性化の工程の前の原核生物
中で発現した生物学的活性蛋白質の混合ジスルスイドと
グルタチオンの形成に基づく。この混合ジスルスイドの
形成のために、透析され、還元されて、還元剤から精製
された蛋白質を、変性剤含有GSSGの稀溶液例えば0.2モ
ル/lと共にインキユベートする。酸化剤の分離の後に、
GSH濃度0.1〜5mモル/l及び非変性性濃度の変性剤を有す
るグアニジン／塩酸又は尿素含有緩衝液（pH6〜10）に
対して１〜300時間にわたつて透析することにより、活
性化を行なう。
中で発現した生物学的活性蛋白質の混合ジスルスイドと
グルタチオンの形成に基づく。この混合ジスルスイドの
形成のために、透析され、還元されて、還元剤から精製
された蛋白質を、変性剤含有GSSGの稀溶液例えば0.2モ
ル/lと共にインキユベートする。酸化剤の分離の後に、
GSH濃度0.1〜5mモル/l及び非変性性濃度の変性剤を有す
るグアニジン／塩酸又は尿素含有緩衝液（pH6〜10）に
対して１〜300時間にわたつて透析することにより、活
性化を行なう。
他のすべての反応工程において、GSSGとの混合ジサルフ
アイドの形成を介する蛋白質の活性化は、この発明の先
に記載の部分の蛋白質の活性化のための実施形に一致す
る。この実施形において、至適pHは６〜８であり、活性
化された蛋白質は、復元緩衝液中で長時間にわたり安定
である。
アイドの形成を介する蛋白質の活性化は、この発明の先
に記載の部分の蛋白質の活性化のための実施形に一致す
る。この実施形において、至適pHは６〜８であり、活性
化された蛋白質は、復元緩衝液中で長時間にわたり安定
である。
本発明によれば、例えば原核生物中で発現された再活性
化すべき蛋白質としての抗体の場合に、免疫反応性の30
％までの収率で再活性化することが成功する。このこと
は、技術水準により公知の方法の約10倍の収率に相当す
る。本発明の意味における抗体とは、その通常のフラグ
メントとも理解される。
化すべき蛋白質としての抗体の場合に、免疫反応性の30
％までの収率で再活性化することが成功する。このこと
は、技術水準により公知の方法の約10倍の収率に相当す
る。本発明の意味における抗体とは、その通常のフラグ
メントとも理解される。
次の実施例につき、図面と関連させて本発明を更に説明
する。他の記載のないかぎり、「％」は「重量％」であ
り、温度は「℃」である。
する。他の記載のないかぎり、「％」は「重量％」であ
り、温度は「℃」である。
第１図はMAK 33のκ−鎖（kappa-kette:ヌクレオチド位
置７〜663）の表現のためのプラスミドpBT 111の配列を
示す図であり、第２図は、MAK 33のFd−鎖（ヌクレオチ
ド位置240〜917）の表現のためのプラスミドp10169の配
列を示す図である。
置７〜663）の表現のためのプラスミドpBT 111の配列を
示す図であり、第２図は、MAK 33のFd−鎖（ヌクレオチ
ド位置240〜917）の表現のためのプラスミドp10169の配
列を示す図である。
例１ E.コリー中の抗体フラグメントの表現 1.1.E.コリー中のMAK 33のκ−鎖の表現のためのプラス
ミドの構成 pBR 322中のPstI−フラグメントとしてのMAK 33のκ−c
DNAのクローニングは文献に記載されている（Buckel.P.
等（1987）、Gene51、13〜19参照）。制限ヌクレアーゼ
MnlIを用いて、cDNAを、成熟κ−鎖の第１アミノ酸コド
ンの直接５′−隣接で切断し、EcoRI-PstI−フラグメン
トとしてのアダプター（５′CATG3′は５′CATGAATT3′
とハイブリツト形成する）を用いて、同様にEcoRI及びP
t1により切断されたベクターpKK 223-3、DSM3694P（Bro
sius等（1981）、Plasmid6、112〜118参照）中でクロー
ニングした。cDNAの３′−非翻訳領域の短縮のために、
生じるプラスミドを、PstIで開き、Bal 31を用いて核分
解的に短縮させ、引続き、κ−cDNAに相応するEcoRI-Ba
l 31−フラグメントをHind III−リンカーを用いて、Ec
oRI Hind III中で切断されたベクターpKK 223−３中に
逆クローニングさせた。生ずるプラスミドをpBT 111と
称する（第１図は、表現プラスミドの配列を示してい
る；ヌクレオチド７〜663のカツパ）。
ミドの構成 pBR 322中のPstI−フラグメントとしてのMAK 33のκ−c
DNAのクローニングは文献に記載されている（Buckel.P.
等（1987）、Gene51、13〜19参照）。制限ヌクレアーゼ
MnlIを用いて、cDNAを、成熟κ−鎖の第１アミノ酸コド
ンの直接５′−隣接で切断し、EcoRI-PstI−フラグメン
トとしてのアダプター（５′CATG3′は５′CATGAATT3′
とハイブリツト形成する）を用いて、同様にEcoRI及びP
t1により切断されたベクターpKK 223-3、DSM3694P（Bro
sius等（1981）、Plasmid6、112〜118参照）中でクロー
ニングした。cDNAの３′−非翻訳領域の短縮のために、
生じるプラスミドを、PstIで開き、Bal 31を用いて核分
解的に短縮させ、引続き、κ−cDNAに相応するEcoRI-Ba
l 31−フラグメントをHind III−リンカーを用いて、Ec
oRI Hind III中で切断されたベクターpKK 223−３中に
逆クローニングさせた。生ずるプラスミドをpBT 111と
称する（第１図は、表現プラスミドの配列を示してい
る；ヌクレオチド７〜663のカツパ）。
1.2 E.コリ中のMAK 33のγ−鎖のFd−フラグメントの
表現のためのプラスミドの構成 pBR 322中のPstI−フラグメントとしてのMAKK 33 γ−c
DNAのクローニングは、同様に文献に記載されていた（B
uckel等1987）。表現のために、成熟γ−鎖の第１アミ
ノ酸の直前に、オリゴヌクレオチド指向突然変異形成に
よりXmaxI−切断位置を導入した。γ−Fd−フラグメン
トは、アミノ酸位置225の後にストツプ−コドンを導入
することにより、同じ技術で得られ、この際、付加的に
Bcl I−及びSalI−切断位置が導入された。生じるXmaI-
SalI−フラグメント（これは、γ−Fd−フラグメントに
関してコードする）をpUC 8（Vieira＋Messing（1982）
Gene19、259〜268）中でクローンニングした。第２図
は、生じた表現プラスミドp10169（ヌクレオチド位置24
0〜919のγ−Fd）の配列を示す。
表現のためのプラスミドの構成 pBR 322中のPstI−フラグメントとしてのMAKK 33 γ−c
DNAのクローニングは、同様に文献に記載されていた（B
uckel等1987）。表現のために、成熟γ−鎖の第１アミ
ノ酸の直前に、オリゴヌクレオチド指向突然変異形成に
よりXmaxI−切断位置を導入した。γ−Fd−フラグメン
トは、アミノ酸位置225の後にストツプ−コドンを導入
することにより、同じ技術で得られ、この際、付加的に
Bcl I−及びSalI−切断位置が導入された。生じるXmaI-
SalI−フラグメント（これは、γ−Fd−フラグメントに
関してコードする）をpUC 8（Vieira＋Messing（1982）
Gene19、259〜268）中でクローンニングした。第２図
は、生じた表現プラスミドp10169（ヌクレオチド位置24
0〜919のγ−Fd）の配列を示す。
1.3 E.コリー中の抗体連鎖の表現 表現プラスミドpBT 111及びp10169を、それぞれ個々
に、更にlac−リプレツサー（lacIq）の表現のためのプ
ラスミドをトランスに含有するE.コリー（DSM 3689）中
にトランスフオームさせた。このE.コリー細胞をLB−培
地上で光学密度OD550nm＝0.5になるまで培養し、次いで
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）lg/l
を導入し、37℃で更に４時間インキユベートした。最後
に、細胞を遠心分離した。
に、更にlac−リプレツサー（lacIq）の表現のためのプ
ラスミドをトランスに含有するE.コリー（DSM 3689）中
にトランスフオームさせた。このE.コリー細胞をLB−培
地上で光学密度OD550nm＝0.5になるまで培養し、次いで
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（IPTG）lg/l
を導入し、37℃で更に４時間インキユベートした。最後
に、細胞を遠心分離した。
1.4 封入体の製造 このために、免疫グロブリン鎖１個当り、E.コリー（例
1.3参照）細胞湿潤物質約25gを、トリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l 580ml中に入れ、この細胞を
剪断棒（Ultraturax）を用いてホモゲナイズした。次い
で、リソチーム0.25mg/mlを添加し、室温で30分間イン
キユベートし、引続きNaCl 0.5モル/l、5v/v％トリトン
−Ｘ−100中に懸濁させ、剪断棒（Ultraturax）を用い
てホモゲナイズし、更に、室温で30分間撹拌した。その
後、Sorvall GSA−ローター中、４℃及び13000u.p.m.で
50分間遠心分離した。ペレツトをトリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l、25v/v％トリトン−Ｘ−100
300ml中に入れ、ホモゲナイズした。その後、４℃、13
000u.p.m.でSorvall GSA−ローター中で30分間宛２回更
に遠心分離した。ペレツトをトリスHCl 0.1モル/l、pH
6.5、EDTA 200mモル/l、0.5v/v％トリトンＸ−100 300m
l中に入れ、ホモゲナイズした。その後４℃及び13000u.
p.m.でSorvall GSA−ローター中で30分間２回遠心分離
し、その都度、その後、ペレツトをトリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l各々300mlもしくは250ml中に
入れ、ホモゲナイズした。
1.3参照）細胞湿潤物質約25gを、トリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l 580ml中に入れ、この細胞を
剪断棒（Ultraturax）を用いてホモゲナイズした。次い
で、リソチーム0.25mg/mlを添加し、室温で30分間イン
キユベートし、引続きNaCl 0.5モル/l、5v/v％トリトン
−Ｘ−100中に懸濁させ、剪断棒（Ultraturax）を用い
てホモゲナイズし、更に、室温で30分間撹拌した。その
後、Sorvall GSA−ローター中、４℃及び13000u.p.m.で
50分間遠心分離した。ペレツトをトリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l、25v/v％トリトン−Ｘ−100
300ml中に入れ、ホモゲナイズした。その後、４℃、13
000u.p.m.でSorvall GSA−ローター中で30分間宛２回更
に遠心分離した。ペレツトをトリスHCl 0.1モル/l、pH
6.5、EDTA 200mモル/l、0.5v/v％トリトンＸ−100 300m
l中に入れ、ホモゲナイズした。その後４℃及び13000u.
p.m.でSorvall GSA−ローター中で30分間２回遠心分離
し、その都度、その後、ペレツトをトリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l各々300mlもしくは250ml中に
入れ、ホモゲナイズした。
例２ 抗体の変性 ハイブリドーマ細胞系（ECACC88091404）から得られたM
AK 33のもしくはそのFab−フラグメントのリオフイリゼ
ート（Fab−フラグメントの製造のためには、A.Johnsto
n及びR.ThorpeのImmunochemistry in Practice,Blackwe
ll Scientific Publications（1982）、52〜53頁参照）
並びに例１による封入体製剤のペレツトを、トリスHCl
0.1モル/l、pH8.5;グアニジンHCl 6モル/l;EDTA 2モル/
l、DTE 0.3モル/l中で室温で３時間インキユベートし
た。蛋白質濃度は、４〜6mg/mlであつた。連鎖分離は、
非還元性条件下でSDS-PAGEを用いて検査した。ジスルフ
イド橋の完全な還元は、G.L.Ellman（1959）のArch.Bio
chem.Biophys.82、70による遊離SH基の測定により確認
した。引続き、溶液のpH値を濃塩酸を用いてpH3に調節
した。
AK 33のもしくはそのFab−フラグメントのリオフイリゼ
ート（Fab−フラグメントの製造のためには、A.Johnsto
n及びR.ThorpeのImmunochemistry in Practice,Blackwe
ll Scientific Publications（1982）、52〜53頁参照）
並びに例１による封入体製剤のペレツトを、トリスHCl
0.1モル/l、pH8.5;グアニジンHCl 6モル/l;EDTA 2モル/
l、DTE 0.3モル/l中で室温で３時間インキユベートし
た。蛋白質濃度は、４〜6mg/mlであつた。連鎖分離は、
非還元性条件下でSDS-PAGEを用いて検査した。ジスルフ
イド橋の完全な還元は、G.L.Ellman（1959）のArch.Bio
chem.Biophys.82、70による遊離SH基の測定により確認
した。引続き、溶液のpH値を濃塩酸を用いてpH3に調節
した。
復元のための次の例は、例２に記載のように完全に変性
され、還元されたMAK 33もしくはMAK 33 Fab又は封入体
からの抗体連鎖を用い、再酸化緩衝液中での1:100の稀
釈率で、塩酸グアニジン６モル/l、pH2に対する透析に
より実施した。復縁バツチを、20℃で恒温保持した。
され、還元されたMAK 33もしくはMAK 33 Fab又は封入体
からの抗体連鎖を用い、再酸化緩衝液中での1:100の稀
釈率で、塩酸グアニジン６モル/l、pH2に対する透析に
より実施した。復縁バツチを、20℃で恒温保持した。
例３ MAK 33-Fab−フラグメントの復元 酸化還元緩衝液は、トリスHCl 0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−
アルギニン0.5モル/l、EDTA 2mモル/lを含有した。
アルギニン0.5モル/l、EDTA 2mモル/lを含有した。
蛋白質濃度は30〜60μg/mlであつた。
復元時間は200時間までであつた。再酸化は、配座特異
的なELISA−テスト系（例８）を用いて、受動免疫活性
で検査した。
的なELISA−テスト系（例８）を用いて、受動免疫活性
で検査した。
第1A〜1C表は、活性MAK 33 Fab−フラグメントの収率と
次の変動数との関係を示している： 1A:一定GSSG−濃度（GSSG 5mモル/l）におけるDTA−濃
度； 1B:一定DTE濃度（DTE 3mモル/l）におけるGSSG濃度； 1C:一定GSH濃度（1mモル/l）におけるGSSG濃度。
次の変動数との関係を示している： 1A:一定GSSG−濃度（GSSG 5mモル/l）におけるDTA−濃
度； 1B:一定DTE濃度（DTE 3mモル/l）におけるGSSG濃度； 1C:一定GSH濃度（1mモル/l）におけるGSSG濃度。
第1A表 DTE（ｍモル/l） 収率（％） 0 53 1 53 3 41 5 ８ 10 3 第1B表 GSSG（ｍモル/l） 収率（％） 0 18 1 15 3 23 5 32 10 37 第1C表 GSSG（ｍモル/l） 収率（％） ０ 22 0.1 53 １ 38 5 28 例４ 完全に変性され、還元されたMAK 33 Fab−フラグメント
を塩酸グアニジン６モル/l、pH2に対して透析させ、引
続き、トリスHCl 0.1モル/l、pH8.5、塩酸グアニジン0.
3モル/l、GSSG 0.2モル/l、GSH 2mモル/l及びEDTA 2mモ
ル/l中で、20℃の温度で、約200時間の復元時間で再酸
化する。第２表は、活性MAK 33 Fabの収率と復元時の蛋
白質濃度の変化との関係を示す。再酸化は、ELISA−テ
スト系を用いて能動免疫反応体（aktiv Immunreaktivit
aet）（例８）で検査した。
を塩酸グアニジン６モル/l、pH2に対して透析させ、引
続き、トリスHCl 0.1モル/l、pH8.5、塩酸グアニジン0.
3モル/l、GSSG 0.2モル/l、GSH 2mモル/l及びEDTA 2mモ
ル/l中で、20℃の温度で、約200時間の復元時間で再酸
化する。第２表は、活性MAK 33 Fabの収率と復元時の蛋
白質濃度の変化との関係を示す。再酸化は、ELISA−テ
スト系を用いて能動免疫反応体（aktiv Immunreaktivit
aet）（例８）で検査した。
例５ 完全に変性され、還元されたMAK 33抗体を塩酸グアニジ
ン６モル/l、pH2に対して透析させ、引続きトリスHCl
0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−アルギニン0.5モル/l、EDTA 2m
モル/l、GSH 1mモル/l中で20℃の温度でかつ約200時間
の復元時間で再酸化する。この再酸化は、ELISA−テス
ト系（例８）を用いて能動免疫反応性で検査した。第３
表は、一定GSH濃度（1mモル/l）における活性抗体の収
率とGSSG濃度の変動との関係を示す。
ン６モル/l、pH2に対して透析させ、引続きトリスHCl
0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−アルギニン0.5モル/l、EDTA 2m
モル/l、GSH 1mモル/l中で20℃の温度でかつ約200時間
の復元時間で再酸化する。この再酸化は、ELISA−テス
ト系（例８）を用いて能動免疫反応性で検査した。第３
表は、一定GSH濃度（1mモル/l）における活性抗体の収
率とGSSG濃度の変動との関係を示す。
例６ 混合ジスルフイドへの誘導体化後の復元 MAK 33もしくはMAK 33 Fabの変性を、例２の記載のよう
に実施した。次いで、塩酸グアニジン６モル/l、pH8に
対して透析させ、引続き、塩酸グアニジン６モル/l、GS
SG 0.2モル/l、トリスHCl 0.1モル/l、pH8.5を用い、室
温で約５時間にわたつて誘導体化した。塩酸グアニジン
６モル/l、pH2.4に対する新たな透析の後に、種々の変
法で復元を実施する：第4A表はMAK 33 FabをトリスHCl
0.1モル/l、pH7、Ｌ−アルギニン0.5モル/l、EDTA 2mモ
ル/l中で、20℃で約200時間にわたる復元を示してい
る。この変性は、配座特異性ELISA−テスト系を用い
て、受動免疫反応性（例８）をGSH−濃度との関連で試
験した。
に実施した。次いで、塩酸グアニジン６モル/l、pH8に
対して透析させ、引続き、塩酸グアニジン６モル/l、GS
SG 0.2モル/l、トリスHCl 0.1モル/l、pH8.5を用い、室
温で約５時間にわたつて誘導体化した。塩酸グアニジン
６モル/l、pH2.4に対する新たな透析の後に、種々の変
法で復元を実施する：第4A表はMAK 33 FabをトリスHCl
0.1モル/l、pH7、Ｌ−アルギニン0.5モル/l、EDTA 2mモ
ル/l中で、20℃で約200時間にわたる復元を示してい
る。この変性は、配座特異性ELISA−テスト系を用い
て、受動免疫反応性（例８）をGSH−濃度との関連で試
験した。
第4B表は、GSH 2mモル/lを有する前記緩衝液中の活性MA
K 33 Fabの収率と緩衝液のpHとの関係を示している。
K 33 Fabの収率と緩衝液のpHとの関係を示している。
第5A表は、トリスHCl 0.1モル/l、pH7、Ｌ−アルギニン
0.5モル/l、EDTA 2mモル/l中、20℃の温度における、約
200時間の変性時間にわたるMAK 33 IgGの復元とGSH濃度
との関係を示している。配座特異性ELISA−テスト系を
用いて、受動免疫反応性（例８）で、この復元を検査し
た。
0.5モル/l、EDTA 2mモル/l中、20℃の温度における、約
200時間の変性時間にわたるMAK 33 IgGの復元とGSH濃度
との関係を示している。配座特異性ELISA−テスト系を
用いて、受動免疫反応性（例８）で、この復元を検査し
た。
第5B表は、GSH 2mモル/lを有する前記緩衝液中での活性
抗体の収率とpH値の関係を示している。
抗体の収率とpH値の関係を示している。
第4A表 GSH（ｍモル/l） 収率（％） ０ ５ 0.1 48 0.5 48 １ 41 ２ 36 ３ 31 ４ 27 ７ 24 10 23 第4B表 pH 収率（％） 7 40 8 39 9 30 10 19 11 １ 第5A表 GSH（ｍモル/l） 収率（％） 0 0.3 0.1 3.0 0.2 4.0 0.5 3.8 1 3.1 2 2.5 3 2.0 6 1.4 10 1.4 第5B表 pH 収率（％） 6 3.9 7 3.8 8 2.9 9 1.5 10 0.8 11 0.6 例７ E.コリー中で表現された抗体連鎖の復元 相補的一本鎖の封入体（κ及びFd、例１）を例２の記載
と同様に可溶化させた。引続き、塩酸グアニジン６モル
/l、pH2に対して透析させた。可溶化及び透析を双方の
鎖に対して別別に行なつた。
と同様に可溶化させた。引続き、塩酸グアニジン６モル
/l、pH2に対して透析させた。可溶化及び透析を双方の
鎖に対して別別に行なつた。
再酸化のために、当モル量の還元された一本鎖を同時
に、100倍量のトリス−HCl 0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−ア
ルギニン0.6モル/l、GSSG 0.1mモル/l、GSH 1mモル/l及
びEDTA 2mモル/l中で稀釈した。復元は、20℃で200時間
にわたるインキユベーシヨンにより行なつた。
に、100倍量のトリス−HCl 0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−ア
ルギニン0.6モル/l、GSSG 0.1mモル/l、GSH 1mモル/l及
びEDTA 2mモル/l中で稀釈した。復元は、20℃で200時間
にわたるインキユベーシヨンにより行なつた。
自然の生物学的活性蛋白質の収率は、18％であつた。本
来の抗体分を、受動免疫反応性の測定（例８）により測
定した。
来の抗体分を、受動免疫反応性の測定（例８）により測
定した。
例８ 受動及び能動免疫反応性並びに阻害活性の立証 8.1 モノクローナル抗体のヒト−CK-MN（ヒトクレアチ
ンキナーゼの骨格筋イン酵素）に対する受動免疫反応性
の立証 ここで「受動免疫反応性」とは、本来のもしくは変性さ
れた抗体上での天然構造のエピトープの形成と解され
る。このエピトープの探索は、他の種属の動物（ここで
は羊）から得られる配座特異性抗−マウス−抗体により
ELISA−テスト系で行なう。
ンキナーゼの骨格筋イン酵素）に対する受動免疫反応性
の立証 ここで「受動免疫反応性」とは、本来のもしくは変性さ
れた抗体上での天然構造のエピトープの形成と解され
る。このエピトープの探索は、他の種属の動物（ここで
は羊）から得られる配座特異性抗−マウス−抗体により
ELISA−テスト系で行なう。
配座特異性ポリクローナル羊−抗−マウス−Fab−抗体
の製造。
の製造。
ポリクローナルマウス−免疫グロブリンに対する抗血清
をA.ジヨンストン（Johnston）及びR.トルペ（Thorpe）
によるイムノケミストリイ・イン・プラクテイス（Immu
nochemistry in Practice,Blackwell Scientific Publi
cations,Oxfort,1982、27〜31頁）により、羊中で製造
した。
をA.ジヨンストン（Johnston）及びR.トルペ（Thorpe）
によるイムノケミストリイ・イン・プラクテイス（Immu
nochemistry in Practice,Blackwell Scientific Publi
cations,Oxfort,1982、27〜31頁）により、羊中で製造
した。
この抗血清のIgG−フラクシヨンを、ジヨンストン及び
トルペの文献44〜46頁により、硫酸アンモニウム分画及
びDEAE−イオン交換体クロマトグラフイにより単離し
た。
トルペの文献44〜46頁により、硫酸アンモニウム分画及
びDEAE−イオン交換体クロマトグラフイにより単離し
た。
このIgG−フラクシヨン500mgを、マウス−キヤツプ連鎖
−スフエロシル免疫吸着剤（マウス−κ−鎖1.5mg/スフ
エロシルml）20mlに、酵素免疫試験で抗−マウス−κ−
活性が検出不能になるまで繰り返し吸着させた。次い
で、このIgG−フラクシヨンをマウス−Fab−スフエロシ
ル−充填体20ml（マウス−Fab15mg/スフエロシルml）を
有するカラムを通し、特異的に吸着されたIgG−フラク
シヨン分をグリシン0.2モル/l、pH2.8で溶離させた。酢
酸1mモル/lに対する透析の後に、この部分フラクシヨン
を凍結乾燥させた。
−スフエロシル免疫吸着剤（マウス−κ−鎖1.5mg/スフ
エロシルml）20mlに、酵素免疫試験で抗−マウス−κ−
活性が検出不能になるまで繰り返し吸着させた。次い
で、このIgG−フラクシヨンをマウス−Fab−スフエロシ
ル−充填体20ml（マウス−Fab15mg/スフエロシルml）を
有するカラムを通し、特異的に吸着されたIgG−フラク
シヨン分をグリシン0.2モル/l、pH2.8で溶離させた。酢
酸1mモル/lに対する透析の後に、この部分フラクシヨン
を凍結乾燥させた。
免疫試験により、このように製造されたIgGは、遊離の
Ｍ−κ−、Ｍ−γ−、Ｍ−Fd−鎖とは反応しないか又は
不完全に折りたたまれたＭ−κ/M−Fd−錯体と反応する
ことが確認された。代りにＭ−Fab、Ｍ−IgG及び完全に
折りたたまれたＭ−κ/M−FdもしくはＭ−κ/M−γの錯
体と結合する。
Ｍ−κ−、Ｍ−γ−、Ｍ−Fd−鎖とは反応しないか又は
不完全に折りたたまれたＭ−κ/M−Fd−錯体と反応する
ことが確認された。代りにＭ−Fab、Ｍ−IgG及び完全に
折りたたまれたＭ−κ/M−FdもしくはＭ−κ/M−γの錯
体と結合する。
復元抗体及び本来の標準試料を配座特異性抗−マウス−
Fab−抗体と共に前インキユベートした。天然で形成さ
れた配座エピトープの数に応じて、配座特異性抗−マウ
ス−Fab−抗体の種々の多数の結合位置は飽和された。
前インキユベーシヨン溶液をマウス抗体−酵素−接合体
（抗体−ペルオキシダーゼ−接合体）と共に、壁がマウ
ス抗体で被覆された試験管内に入れた。
Fab−抗体と共に前インキユベートした。天然で形成さ
れた配座エピトープの数に応じて、配座特異性抗−マウ
ス−Fab−抗体の種々の多数の結合位置は飽和された。
前インキユベーシヨン溶液をマウス抗体−酵素−接合体
（抗体−ペルオキシダーゼ−接合体）と共に、壁がマウ
ス抗体で被覆された試験管内に入れた。
羊からの不飽和配座特異性抗マウス−抗体は、次いで壁
結合されたマウス抗体をマウス抗体−酵素−接合体と架
橋させ、この際、結合した接合体の量は、前インキユベ
ーシヨン溶液中の天然もしくは変性抗体の量に間接液に
比例する。分光学的立証は、抗体−接合酵素により色原
性基質ABTR （2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホネート）の変換の後に、40
5nmでの吸収測定により行なつた（H.U.Bergmeyer,Meth.
in Exzymol.第３版、第９巻 15〜37頁）。
結合されたマウス抗体をマウス抗体−酵素−接合体と架
橋させ、この際、結合した接合体の量は、前インキユベ
ーシヨン溶液中の天然もしくは変性抗体の量に間接液に
比例する。分光学的立証は、抗体−接合酵素により色原
性基質ABTR （2,2′−アジノ−ビス−（３−エチルベ
ンゾチアゾリン−６−スルホネート）の変換の後に、40
5nmでの吸収測定により行なつた（H.U.Bergmeyer,Meth.
in Exzymol.第３版、第９巻 15〜37頁）。
8.2 モノクローナル抗体の能動免疫反応性の立証 MAK 33 IgGは、特異的にヒトクレアチンキナーゼの骨格
筋−イソ酵素を認識する（CK-MM;P.Buckel等のGene 51
（1987）、13〜19） ここで、能動免疫反応性とは、本来のもしくは復元され
た抗体と特異抗原（この場合ヒト−CK-MM）との反応で
ある。
筋−イソ酵素を認識する（CK-MM;P.Buckel等のGene 51
（1987）、13〜19） ここで、能動免疫反応性とは、本来のもしくは復元され
た抗体と特異抗原（この場合ヒト−CK-MM）との反応で
ある。
ELISA−テスト系中で、この反応を、酵素−接合された
ポリクローナル抗−マウス−抗体を用いて色原性基質AB
TSの変換を介して比色計により定量的に測定した。
ポリクローナル抗−マウス−抗体を用いて色原性基質AB
TSの変換を介して比色計により定量的に測定した。
8.3モノクローナル抗体の抑制活性の立証 MAK 33 IgGは、骨格筋特異性のイソ酵素CK-MMのＭ下位
単位上にのみ形成されるエピトープを認識する。このエ
ピトープへの結合により、酵素活性は80％だけ抑制され
る（P.Buckel等1989）。従つて、このCK-MM−抑制テス
トは、完全な変性及び還元後のMAK 33の再構成を立証す
るための非常に有効なテストである。それというのも、
完全に復元された抗原結合位置のみをこの酵素は抑制で
きるからである。
単位上にのみ形成されるエピトープを認識する。このエ
ピトープへの結合により、酵素活性は80％だけ抑制され
る（P.Buckel等1989）。従つて、このCK-MM−抑制テス
トは、完全な変性及び還元後のMAK 33の再構成を立証す
るための非常に有効なテストである。それというのも、
完全に復元された抗原結合位置のみをこの酵素は抑制で
きるからである。
クレアチンキナーゼの活性を、ベーリンガー社（Firma
Boehringer Mannheim）のカツプリングされた酵素テス
トを用いて測定した（H.U.Bergmeyer,Meth.of Enzym.An
alysis,第３版、III巻 510〜540頁）。この場合、クレ
アチンキナーゼは、クレアチンホスフエート及びADPを
クレアチン及びATPに変換する。比色法で立証可能な反
応を得るために、生じたATPをグルコースをホスホリル
化するヘキソキナーゼにより消化させてグルコース−６
−ホスフエートにする。グルコース−６−ホスフエート
をグルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼによ
りNADP+からのNADPH＋H+の形成下に酸化して、グルコネ
ート−６−ホスフエートとする。１分間当りの吸光度変
化から、クレアチンキナーゼの活性を計算することがで
きる。
Boehringer Mannheim）のカツプリングされた酵素テス
トを用いて測定した（H.U.Bergmeyer,Meth.of Enzym.An
alysis,第３版、III巻 510〜540頁）。この場合、クレ
アチンキナーゼは、クレアチンホスフエート及びADPを
クレアチン及びATPに変換する。比色法で立証可能な反
応を得るために、生じたATPをグルコースをホスホリル
化するヘキソキナーゼにより消化させてグルコース−６
−ホスフエートにする。グルコース−６−ホスフエート
をグルコース−６−ホスフエートデヒドロゲナーゼによ
りNADP+からのNADPH＋H+の形成下に酸化して、グルコネ
ート−６−ホスフエートとする。１分間当りの吸光度変
化から、クレアチンキナーゼの活性を計算することがで
きる。
CK-MMに対する天然抗体を用いる較正曲線から、復元バ
ツチ中の抑制作用に相当する本来の物質の量を測定する
ことができる。復元バツチ中の全蛋白質に対する抑制活
性蛋白質分は抑制活性抗体の収率（％）を示す。
ツチ中の抑制作用に相当する本来の物質の量を測定する
ことができる。復元バツチ中の全蛋白質に対する抑制活
性蛋白質分は抑制活性抗体の収率（％）を示す。
8.4 受動／能動免疫反応性及び抑制活性を用いる復元
収率の比較測定 完全に変性され、還元されたMAK 33-Fab−フラグメント
を塩酸グアニジン６モル/l、pH2に対して透析させ、引
続きトリス−HCl 0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−アルギニン0.
5モル/l、GSSG 0.2mモル/l、GSH 2mモル/l及びEDTA 2m
モル/l中の1:100の稀釈、20℃の温度、かつ約200時間の
復元時間で再酸化する。
収率の比較測定 完全に変性され、還元されたMAK 33-Fab−フラグメント
を塩酸グアニジン６モル/l、pH2に対して透析させ、引
続きトリス−HCl 0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−アルギニン0.
5モル/l、GSSG 0.2mモル/l、GSH 2mモル/l及びEDTA 2m
モル/l中の1:100の稀釈、20℃の温度、かつ約200時間の
復元時間で再酸化する。
抑制活性の測定時に使用されるべき比較的高い抗体濃度
に基づき、この復元バツチを濃縮した。更に、この復元
溶液を酢酸1mモル/lに対して透析させ、引続き凍結乾燥
させた。この凍結乾燥物をH2O中に入れ（H2O：復元量＝
1:200）、燐酸カリウム50mモル/l、NaCl 0.15モル/l、p
H7.5に対して透析させた。
に基づき、この復元バツチを濃縮した。更に、この復元
溶液を酢酸1mモル/lに対して透析させ、引続き凍結乾燥
させた。この凍結乾燥物をH2O中に入れ（H2O：復元量＝
1:200）、燐酸カリウム50mモル/l、NaCl 0.15モル/l、p
H7.5に対して透析させた。
第６表は、受動／能動免疫反応性により測定された透析
液中の活性Fab−フラグメントの収率を示す。
液中の活性Fab−フラグメントの収率を示す。
例９ E.コリーからのＴ−PAの活性化 E.コリー（DSM3689）からの細胞湿潤物質から、プラス
ミドpePA 133（欧州特許第0242835号）を用いて形質転
換させ、例1.4に記載のように封入体をペレツトとして
調製する。
ミドpePA 133（欧州特許第0242835号）を用いて形質転
換させ、例1.4に記載のように封入体をペレツトとして
調製する。
この封入体製剤のペレツトを、トリス−HCl 0.1モル/
l、pH8.5、グアニジンHCl 0.6モル/l、EDTA 2mモル/l、
DTE 0.3モル/l中、室温で、蛋白質濃度４〜6mg/mlでイ
ンキユベートした。この可溶化に引続き、濃塩酸を用い
て、この溶液のpH値を３に調節した。還元剤及び緩衝剤
成分を、グアニジン−HCl 6モル/l、pH2、４℃に対する
透析により分離した。
l、pH8.5、グアニジンHCl 0.6モル/l、EDTA 2mモル/l、
DTE 0.3モル/l中、室温で、蛋白質濃度４〜6mg/mlでイ
ンキユベートした。この可溶化に引続き、濃塩酸を用い
て、この溶液のpH値を３に調節した。還元剤及び緩衝剤
成分を、グアニジン−HCl 6モル/l、pH2、４℃に対する
透析により分離した。
ｔ−PAの復元 こうして得られた変性され、復元された蛋白質の復元
は、トリス−HCl 0.1モル/l、pH10.5、Ｌ−アルギニン
0.5モル/l、EDTA 1mモル/l及び牛血清アルブミン1mg/ml
中での稀釈により行なつた。蛋白質濃度は10〜30μg/m
l、温度は20℃及び再結合時間は24時間であつた。
は、トリス−HCl 0.1モル/l、pH10.5、Ｌ−アルギニン
0.5モル/l、EDTA 1mモル/l及び牛血清アルブミン1mg/ml
中での稀釈により行なつた。蛋白質濃度は10〜30μg/m
l、温度は20℃及び再結合時間は24時間であつた。
再活性化を、ベーリンガー社（Firma Boehringer Mannh
eim GmbH）のtPA−標準（整理番号1080954）に関する試
験法で測定した。第7A表及び第7B表は、活性tPAの収率
と次の変数との関係を示す： 7A:一定DTE濃度（2mモル/l）におけるGSSG−濃度 7B:一定GSH濃度（1mモル/l）におけるGSSG−濃度 例10 誘導体化して混合ジサルフアイドにすることによるK2P
（ｔ−PA誘導体、西ドイツ特許第3903581号参照）の復
元 西ドイツ特許第3903581号明細書に記載のように、プラ
スミドpA 27 fd及びpUBS 500で形質変換されたE.コリー
（DSM 2093）の細胞を培養し、細胞湿潤物質を収得す
る。この細胞湿潤物質から例９に記載のように、変性さ
れ、復元された蛋白質が得られる。
eim GmbH）のtPA−標準（整理番号1080954）に関する試
験法で測定した。第7A表及び第7B表は、活性tPAの収率
と次の変数との関係を示す： 7A:一定DTE濃度（2mモル/l）におけるGSSG−濃度 7B:一定GSH濃度（1mモル/l）におけるGSSG−濃度 例10 誘導体化して混合ジサルフアイドにすることによるK2P
（ｔ−PA誘導体、西ドイツ特許第3903581号参照）の復
元 西ドイツ特許第3903581号明細書に記載のように、プラ
スミドpA 27 fd及びpUBS 500で形質変換されたE.コリー
（DSM 2093）の細胞を培養し、細胞湿潤物質を収得す
る。この細胞湿潤物質から例９に記載のように、変性さ
れ、復元された蛋白質が得られる。
グアニジン−HCl 6モル/l、pH2中のこの変性され、復元
された蛋白質の溶液を、GSSGで0.1モル/lに、トリスで
0.1モル/lに調整した。引続き、pH値をNaOHを用いてpH
8.5に調節した。室温で２時間のインキユベーシヨンの
後に、酸化剤及び緩衝剤成分を、新たなグアニジン−HC
l 6モル/l、pH2、４℃に対する透析により分離した。
された蛋白質の溶液を、GSSGで0.1モル/lに、トリスで
0.1モル/lに調整した。引続き、pH値をNaOHを用いてpH
8.5に調節した。室温で２時間のインキユベーシヨンの
後に、酸化剤及び緩衝剤成分を、新たなグアニジン−HC
l 6モル/l、pH2、４℃に対する透析により分離した。
変性され、酸化された蛋白質（混合ジサルフアイド）の
復元は、復元緩衝液中での稀釈により行なつた。この蛋
白質濃度は、30〜60μg/ml、温度は20℃及び復元時間は
12時間であつた。
復元は、復元緩衝液中での稀釈により行なつた。この蛋
白質濃度は、30〜60μg/ml、温度は20℃及び復元時間は
12時間であつた。
第8A表は、トリス−HCl 0.1モル/l、pH8.5、Ｌ−アルギ
ニン0.8モル/l、EDTA 2mモル/l中のK2Pの再活性化とGSH
−濃度との関係を示す。
ニン0.8モル/l、EDTA 2mモル/l中のK2Pの再活性化とGSH
−濃度との関係を示す。
第8B表は、GSH 0.5mモル/lを有する前記緩衝液中での活
性K2Pの収率と緩衝液のpH値との関係を示す。
性K2Pの収率と緩衝液のpH値との関係を示す。
第8A表 GSH（ｍモル/l） 収率（％） ０ ０ 0.1 14 0.5 26 １ 20 ２ 10 第8B表 pH 収率（％） 7 ６ 8 15 9 23 10 ７
第１図はMAK 33のκ−鎖（ヌクレオチド位置７〜663）
の表現のためのプラスミドpBT 111の配列を示す図であ
り、第２図は、MAK 33のFd−鎖（ヌクレオチド位置240
〜917）の表現のためのプラスミドp10169の配列を示す
図である。
の表現のためのプラスミドpBT 111の配列を示す図であ
り、第２図は、MAK 33のFd−鎖（ヌクレオチド位置240
〜917）の表現のためのプラスミドp10169の配列を示す
図である。
フロントページの続き (72)発明者 ヘルムート・レンツ ドイツ連邦共和国トウツイング・フオン- キユールマン‐シユトラーセ 14 (56)参考文献 特開 昭62−265983（ＪＰ，Ａ) 特表 昭62−502895（ＪＰ，Ａ)
Claims (10)
- 【請求項１】変性及び還元性条件下での可溶化による細
胞溶解及び酸化及び復元条件下での引続く再活性化によ
り、遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物
学的活性蛋白質を活性化する方法において、１〜1000μ
g/mlの蛋白質濃度で操作し、可溶化と再活性化との間
で、１〜４のpH値を有し、塩酸グアニジン４〜８モル/l
又は尿素６〜10モル/lを含有する緩衝液に対する透析を
行なうことを特徴とする、遺伝子工学で製造され、原核
生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方
法。 - 【請求項２】透析緩衝液は塩酸グアニジン５〜７モル/l
を含有する、請求項１記載の方法。 - 【請求項３】再活性化を、９〜12のpH値、0.1〜20mモル
/lのGSH濃度、0.01〜3mモル/lのGSSG濃度でかつ非変性
性濃度の変性剤を用いて、１〜300時間にわたつて実施
する、請求項１記載の方法。 - 【請求項４】再活性化工程で、まず、変性条件下でGSSG
の添加により蛋白質のチオール基を蛋白質の混合ジスル
フイドとグルタチオンに変じ、改めて、塩化グアニジン
又は尿素を含有する緩衝液に対して透析させ、次いで６
〜10のpH−値、0.1〜5mモル/lのGSH濃度で、かつ非変性
性濃度の変性剤を用いて、１〜300時間にわたり再活性
化させる、請求項１又は２記載の方法。 - 【請求項５】再活性化工程で、変性剤として、アルギニ
ン、塩酸グアニジン及び／又は少なくとも１種の式：R2
‐CO-NRR1（Ｉ）（式中Ｒ及びR1は、Ｈ又はＣ−原子数
１〜４のアルキル基であり、R2はＨ又はＣ−原子数１〜
３のアルキル基である）の化合物を使用する、請求項３
から４までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】再活性化の工程で、非蛋白質分解作用蛋白
質の存在で、殊に牛血清アルブミンの存在で操作する、
請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】再活性化の工程でEDTA1〜10mモル/lの存在
で操作する、請求項１から６までのいずれか１項記載の
方法。 - 【請求項８】可溶化の工程で、アルカリ性pH値で、メル
カプタン類からの還元剤の存在で、かつ変性剤の存在で
操作する、請求項１から７までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項９】抗体もしくは抗体フラグメントを再活性化
させる、請求項１から８までのいずれか１項記載の方
法。 - 【請求項１０】t-PA又はt-PA−類似作用蛋白質を再活性
化させる、請求項１から９までのいずれか１項記載の方
法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3835350A DE3835350A1 (de) | 1988-10-17 | 1988-10-17 | Aktivierung von gentechnologisch hergestellten, in prokaryonten exprimierten antikoerpern |
| DE3835350.4 | 1988-10-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH02227090A JPH02227090A (ja) | 1990-09-10 |
| JPH0793879B2 true JPH0793879B2 (ja) | 1995-10-11 |
Family
ID=6365312
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1268298A Expired - Lifetime JPH0793879B2 (ja) | 1988-10-17 | 1989-10-17 | 遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方法 |
Country Status (12)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5077392A (ja) |
| EP (1) | EP0364926B1 (ja) |
| JP (1) | JPH0793879B2 (ja) |
| KR (1) | KR920010873B1 (ja) |
| AT (1) | ATE101650T1 (ja) |
| AU (1) | AU609645B2 (ja) |
| CA (1) | CA2000604C (ja) |
| DD (1) | DD285613A5 (ja) |
| DE (2) | DE3835350A1 (ja) |
| DK (1) | DK175439B1 (ja) |
| ES (1) | ES2061876T3 (ja) |
| IL (1) | IL92012A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1916020A2 (en) | 1997-08-15 | 2008-04-30 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Preventives and/or remedies for systemic lupus erythematosus containing anti-IL-6 receptor antibody as the active ingredient |
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| DE4037196A1 (de) * | 1990-11-22 | 1992-05-27 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur reaktivierung von denaturiertem protein |
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| DE102005033250A1 (de) | 2005-07-15 | 2007-01-18 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | Verfahren zur Reinigung von G-CSF |
| CA2633554C (en) * | 2005-12-22 | 2012-11-13 | Genetech, Inc. | Recombinant production of heparin binding proteins |
| DE202006020194U1 (de) | 2006-03-01 | 2007-12-06 | Bioceuticals Arzneimittel Ag | G-CSF-Flüssigformulierung |
| CN101506222B (zh) | 2006-07-14 | 2013-10-02 | 健泰科生物技术公司 | 重组蛋白的重折叠 |
| CA2663416A1 (en) * | 2006-09-15 | 2008-03-20 | Barofold, Inc. | High pressure treatment of proteins for reduced immunogenicity |
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