JPH0793879B2 - 遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方法 - Google Patents
遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方法Info
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Description
生物学的に活性の蛋白質の活性化法に関する。
による製造は、不活性で難溶性の蛋白質凝集物いわゆる
「封入体(inclusion bodies)」をもたらす。このよう
な封入体の形成は、特に、表現時に生じる細胞内での高
い蛋白質濃度の結果であると思われる。生物学的に活性
の蛋白質を得るためには、この封入体を変性及び還元に
より溶解させ、次いで、その本来の形のこの蛋白質の三
次元構造を適当な溶解条件の調整により再び製造しなけ
ればならない(M.Sela等による1957、Science 125、691
参照)。完全なたたみ込み除去(Entfaltung)は、高濃
度のカオトロピツク剤例えば尿素及びグアニジンの添加
により達成される(R.Jaenicke(1987)、Prog.Biophy
s.Molec.Biol.49、117〜237参照)。ジスルフイド橋の
還元のために、強力な還元剤例えばβ−メルカプトエタ
ノール又は1,4−ジチオエリスリツトが使用される。
の際には2つの競争反応が現われる。本来の状態への所
望のたたみ込みと共に、凝集物形成も認められる(G.Ze
ttlmeissl等によるBiochemistry 18、5567参照)。本来
の分子の側への平衡を大きくするためには、一方では、
誤まつたたたみ込みの、従つて不安定な分子を創製し、
凝集へのその非特異的な交換作用を阻止するが、他方で
は、本来の状態への戻りたたみ込みを阻止しない条件を
選択する。これは、不安定化濃度(labilisierende kon
zentration)でのカオトロピツク剤の添加により達成し
ている。付加的に、この蛋白質濃度は厳密に復元収率に
作用を及ぼすように注意すべきである(欧州特許第0241
022号)。本来の状態でジスルフイド架橋された蛋白質
においては、復元の間に付加的に、誤まつて架橋された
システインを再び還元し、正しい対に集団化することの
できるレドツクス条件を与えることが重要である。還元
され、酸化されたチオール試薬からのいわゆるオキシド
シヤフリング溶液(Oxido-shuffling solution)は、本
来の構造のジスルフイド架橋された蛋白質の収率を高め
る。
は、ハーバー(Haber)により、はじめて、Fab−フラグ
メントの例で示された(E.Haber,Biochemistry52、1099
〜1106(1964)参照)。その収率は、12〜14%であつ
た。これは、ホイツトニイ(Whitney)及びタンフオー
ド(Tanford)により、Fab−フラグメントの復元の結果
により追認された。彼らは8%の収率を得た(P.L.Whit
ney,C.Tanford,Proc.Natl.Acad.Sci.USA53(1965)参
照)。完全な抗体は、フリードマン(Freedman)及びセ
ラ(Sela)によりはじめて有効に復元された。その収率
は、20〜25%であつた(M.H.Freedman,M.Sela,J.Biol.C
hem.241、2383〜2396(1966)、J.Biol.Chem.241、5225
〜5232(1966)参照)。本来の出発分子を溶解特性の改
良のために、ポリアラニル化したことは注目に値する。
しくは抗体フラグメント即ち種々異なるパラトープ(Pa
ratopen)及び種々異なる親和定数を有する抗体の混合
物に関することに注目すべきである。
際に純粋に統計的に会合するので、ここでは、本来の関
連結合特異性及び親和性と一致しない復元分子が得られ
る。
の真核生物蛋白質におけるように、E.コリー中でも、不
溶性封入体の形の抗体の表現された重い及び軽い鎖が生
じる(S.Cabilly等、Proc.Natl.Acad.Sci.USA81、3273
〜3277(1984)、M.Y.Boss等1984、Nucleic Acids Rese
arch 12、3791〜3806参照)。形質転換された微生物か
らの抗体を得るために、Cabilly等及びBoss等は、官能
性抗体の復元を可能にする方法を記載している。しかし
ながら、この方法ではモノクローナル抗体に関して、約
0.2〜0.5%の収率のみを与えた。
性の蛋白質の再活性化の方法を得ることを課題とし、こ
の際、表現により封入体の形で得られる蛋白質を良好な
収率でその活性の復元形に変じることができる。
胞溶解及び引続く酸化性及び復元性条件下での再活性化
により、原核生物中に発現した生物学的活性の蛋白質を
活性化する方法により解決され、これは、1〜1000μg/
mlの蛋白質濃度で操作し、可溶化と再活性化との間に、
pH1〜4を有し、塩酸グアニジン4〜8モル/l又は尿素
6〜10モル/lを含有する緩衝液に対する透析を実施する
ことよりなる。
透析の後に、再活性化の後の活性蛋白質の極めて高い収
率が得られることが確認された。
べての生物学的活性蛋白質での使用、特に抗体及びソノ
フラグメント及びt−PA及びt−PA類似蛋白質もしくは
類縁体を得るための使用に好適である。
ジン5〜7モル/lを含有する。
lで、GSSG−濃度0.01〜3mモル/lで、かつ非変性濃度の
変性剤を用いて操作し、この再活性化を1〜300時間の
時間にわたつて実施するのが有利である。特に、この
際、GSH−濃度は0.2〜10mモル/l及び/又はGSSG−濃度
は0.05〜1mモル/lであるのが有利である。
で、まず変性条件下でGSSGの添加により抗体のチオール
基を抗体の混合ジスルフイド及びグルタチオンに変じ、
改めて、塩酸グアニジン又は尿素を含有する緩衝液に対
して透析させ、次いで、6〜10のpH値、0.1〜5mモル/l
のGSH濃度で、かつ非変性性濃度の変性剤を用いて、1
〜300時間にわたつて再活性化させる。
に通例使用されている変性剤又はアルギニンを使用する
ことができる。変性剤として、アルギニン、塩酸グアニ
ジン及び/又は少なくとも1種の一般式: R2‐CO-NRR1 (I) 〔式中R及びR1はH又はC−原子数1〜4のアルキルを
表わし、R2はH又はNRR1又はC−原子数1〜3のアルキ
ルを表わす〕の化合物を使用するのが有利である。これ
らの変性剤は、更に混合物として使用できる。アルギニ
ン及び/又は塩酸グアニジンの濃度は、0.1〜1.0モル/l
殊に0.25〜0.8モル/lであるのが有利である。一般式I
の化合物の濃度は0.5〜4モル/l、殊に1〜3.5モル/lで
ある。本発明のもう1つの有利な実施形においては、再
活性化工程を、異種蛋白質の存在で実施する。そのもの
としては、一般に、蛋白質分解作用をしない任意の異種
蛋白質が好適であり、特に牛血清アルブミン(BSA)を
例えば1〜3mg/mlの量で使用するのが有利である。BSA
の添加は、蛋白質の収率を高め安定化させる作用をする
(おそらく、表面変性及び/又は蛋白質分解の前の保護
による)。
公知で慣用の条件に一致しうる。この再活性化は、有利
に、約5〜30℃、特に10℃で実施される。透析及び再活
性化工程(再酸化/活性化)を先行し、後続の工程例え
ば細胞崩壊、可溶化(可溶化、還元)は、例えば欧州特
許(EP-A)第0114506号、同第0093619号の技術水準から
非相同表現蛋白質もしくはt-PAの再活性化のために公知
かつ慣用の方法で実施することができ、収率及び活性化
に関して最適な結果を得るためには、個々の又は全ての
工程を、ここに説明した1以上の方法形式の考慮のもと
に実施するのが有利である。
波、高圧分散又はリソチームを用いて行なうことができ
る。懸濁媒体としての、中性〜弱酸性のpH値の調節のた
めに好適な緩衝液溶液中で、例えばトリス/HCl0.1モル/
l中で実施するのが有利である。細胞崩壊の後に、不溶
成分(封入体)を常法で、特に、遠心分離又は濾過によ
り分離する。蛋白質を害しないが、異種細胞蛋白質をで
きるだけ溶解する薬剤例えば水、燐酸塩緩衝溶液での洗
浄(場合によつては温和な変性剤例えばトリトンの添加
のもとに)の後に、沈澱(ペレツト)を可溶化(可溶化
/還元)させる。
6±0.4で、メルカプタン群からの還元剤及び変性剤の存
在で行なうのが有利である。
0114506号明細書から公知で慣用の変性剤殊に塩酸グア
ニジン又は一般式Iの化合物を使用することができる。
これは、塩酸グアニジン6モル/lの濃度でもしくは一般
式の化合物8モル/lの濃度で行なうのが有利である。
タチオン(GSH)又は2−メルカプトエタノールを例え
ば約50〜400mモル/lの濃度でかつ/又は殊にDTE(ジチ
オエリスリトール)もしくはDTT(ジチオスレイトー
ル)を例えば約80〜400mモル/lの濃度で、もしくはシス
テインを使用することができる。可溶化は、室温で、0.
5〜数時間、有利に2時間の間に行なうのが有利であ
る。空気酸素による還元剤の酸化を阻止するために、ED
TAを、有利に1〜10mモル/lの量で添加するのも有利で
ありうる。可溶化/還元と並んで、この可溶化工程は、
精製作用をも有する。それというのも、異種蛋白質の大
部分は溶解しないからである。
中で発現した生物学的活性蛋白質の混合ジスルスイドと
グルタチオンの形成に基づく。この混合ジスルスイドの
形成のために、透析され、還元されて、還元剤から精製
された蛋白質を、変性剤含有GSSGの稀溶液例えば0.2モ
ル/lと共にインキユベートする。酸化剤の分離の後に、
GSH濃度0.1〜5mモル/l及び非変性性濃度の変性剤を有す
るグアニジン/塩酸又は尿素含有緩衝液(pH6〜10)に
対して1〜300時間にわたつて透析することにより、活
性化を行なう。
アイドの形成を介する蛋白質の活性化は、この発明の先
に記載の部分の蛋白質の活性化のための実施形に一致す
る。この実施形において、至適pHは6〜8であり、活性
化された蛋白質は、復元緩衝液中で長時間にわたり安定
である。
化すべき蛋白質としての抗体の場合に、免疫反応性の30
%までの収率で再活性化することが成功する。このこと
は、技術水準により公知の方法の約10倍の収率に相当す
る。本発明の意味における抗体とは、その通常のフラグ
メントとも理解される。
する。他の記載のないかぎり、「%」は「重量%」であ
り、温度は「℃」である。
置7〜663)の表現のためのプラスミドpBT 111の配列を
示す図であり、第2図は、MAK 33のFd−鎖(ヌクレオチ
ド位置240〜917)の表現のためのプラスミドp10169の配
列を示す図である。
ミドの構成 pBR 322中のPstI−フラグメントとしてのMAK 33のκ−c
DNAのクローニングは文献に記載されている(Buckel.P.
等(1987)、Gene51、13〜19参照)。制限ヌクレアーゼ
MnlIを用いて、cDNAを、成熟κ−鎖の第1アミノ酸コド
ンの直接5′−隣接で切断し、EcoRI-PstI−フラグメン
トとしてのアダプター(5′CATG3′は5′CATGAATT3′
とハイブリツト形成する)を用いて、同様にEcoRI及びP
t1により切断されたベクターpKK 223-3、DSM3694P(Bro
sius等(1981)、Plasmid6、112〜118参照)中でクロー
ニングした。cDNAの3′−非翻訳領域の短縮のために、
生じるプラスミドを、PstIで開き、Bal 31を用いて核分
解的に短縮させ、引続き、κ−cDNAに相応するEcoRI-Ba
l 31−フラグメントをHind III−リンカーを用いて、Ec
oRI Hind III中で切断されたベクターpKK 223−3中に
逆クローニングさせた。生ずるプラスミドをpBT 111と
称する(第1図は、表現プラスミドの配列を示してい
る;ヌクレオチド7〜663のカツパ)。
表現のためのプラスミドの構成 pBR 322中のPstI−フラグメントとしてのMAKK 33 γ−c
DNAのクローニングは、同様に文献に記載されていた(B
uckel等1987)。表現のために、成熟γ−鎖の第1アミ
ノ酸の直前に、オリゴヌクレオチド指向突然変異形成に
よりXmaxI−切断位置を導入した。γ−Fd−フラグメン
トは、アミノ酸位置225の後にストツプ−コドンを導入
することにより、同じ技術で得られ、この際、付加的に
Bcl I−及びSalI−切断位置が導入された。生じるXmaI-
SalI−フラグメント(これは、γ−Fd−フラグメントに
関してコードする)をpUC 8(Vieira+Messing(1982)
Gene19、259〜268)中でクローンニングした。第2図
は、生じた表現プラスミドp10169(ヌクレオチド位置24
0〜919のγ−Fd)の配列を示す。
に、更にlac−リプレツサー(lacIq)の表現のためのプ
ラスミドをトランスに含有するE.コリー(DSM 3689)中
にトランスフオームさせた。このE.コリー細胞をLB−培
地上で光学密度OD550nm=0.5になるまで培養し、次いで
イソプロピル−β−D−チオガラクトシド(IPTG)lg/l
を導入し、37℃で更に4時間インキユベートした。最後
に、細胞を遠心分離した。
1.3参照)細胞湿潤物質約25gを、トリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l 580ml中に入れ、この細胞を
剪断棒(Ultraturax)を用いてホモゲナイズした。次い
で、リソチーム0.25mg/mlを添加し、室温で30分間イン
キユベートし、引続きNaCl 0.5モル/l、5v/v%トリトン
−X−100中に懸濁させ、剪断棒(Ultraturax)を用い
てホモゲナイズし、更に、室温で30分間撹拌した。その
後、Sorvall GSA−ローター中、4℃及び13000u.p.m.で
50分間遠心分離した。ペレツトをトリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l、25v/v%トリトン−X−100
300ml中に入れ、ホモゲナイズした。その後、4℃、13
000u.p.m.でSorvall GSA−ローター中で30分間宛2回更
に遠心分離した。ペレツトをトリスHCl 0.1モル/l、pH
6.5、EDTA 200mモル/l、0.5v/v%トリトンX−100 300m
l中に入れ、ホモゲナイズした。その後4℃及び13000u.
p.m.でSorvall GSA−ローター中で30分間2回遠心分離
し、その都度、その後、ペレツトをトリスHCl 0.1モル/
l、pH6.5、EDTA 20mモル/l各々300mlもしくは250ml中に
入れ、ホモゲナイズした。
AK 33のもしくはそのFab−フラグメントのリオフイリゼ
ート(Fab−フラグメントの製造のためには、A.Johnsto
n及びR.ThorpeのImmunochemistry in Practice,Blackwe
ll Scientific Publications(1982)、52〜53頁参照)
並びに例1による封入体製剤のペレツトを、トリスHCl
0.1モル/l、pH8.5;グアニジンHCl 6モル/l;EDTA 2モル/
l、DTE 0.3モル/l中で室温で3時間インキユベートし
た。蛋白質濃度は、4〜6mg/mlであつた。連鎖分離は、
非還元性条件下でSDS-PAGEを用いて検査した。ジスルフ
イド橋の完全な還元は、G.L.Ellman(1959)のArch.Bio
chem.Biophys.82、70による遊離SH基の測定により確認
した。引続き、溶液のpH値を濃塩酸を用いてpH3に調節
した。
され、還元されたMAK 33もしくはMAK 33 Fab又は封入体
からの抗体連鎖を用い、再酸化緩衝液中での1:100の稀
釈率で、塩酸グアニジン6モル/l、pH2に対する透析に
より実施した。復縁バツチを、20℃で恒温保持した。
アルギニン0.5モル/l、EDTA 2mモル/lを含有した。
的なELISA−テスト系(例8)を用いて、受動免疫活性
で検査した。
次の変動数との関係を示している: 1A:一定GSSG−濃度(GSSG 5mモル/l)におけるDTA−濃
度; 1B:一定DTE濃度(DTE 3mモル/l)におけるGSSG濃度; 1C:一定GSH濃度(1mモル/l)におけるGSSG濃度。
を塩酸グアニジン6モル/l、pH2に対して透析させ、引
続き、トリスHCl 0.1モル/l、pH8.5、塩酸グアニジン0.
3モル/l、GSSG 0.2モル/l、GSH 2mモル/l及びEDTA 2mモ
ル/l中で、20℃の温度で、約200時間の復元時間で再酸
化する。第2表は、活性MAK 33 Fabの収率と復元時の蛋
白質濃度の変化との関係を示す。再酸化は、ELISA−テ
スト系を用いて能動免疫反応体(aktiv Immunreaktivit
aet)(例8)で検査した。
ン6モル/l、pH2に対して透析させ、引続きトリスHCl
0.1モル/l、pH8.5、L−アルギニン0.5モル/l、EDTA 2m
モル/l、GSH 1mモル/l中で20℃の温度でかつ約200時間
の復元時間で再酸化する。この再酸化は、ELISA−テス
ト系(例8)を用いて能動免疫反応性で検査した。第3
表は、一定GSH濃度(1mモル/l)における活性抗体の収
率とGSSG濃度の変動との関係を示す。
に実施した。次いで、塩酸グアニジン6モル/l、pH8に
対して透析させ、引続き、塩酸グアニジン6モル/l、GS
SG 0.2モル/l、トリスHCl 0.1モル/l、pH8.5を用い、室
温で約5時間にわたつて誘導体化した。塩酸グアニジン
6モル/l、pH2.4に対する新たな透析の後に、種々の変
法で復元を実施する:第4A表はMAK 33 FabをトリスHCl
0.1モル/l、pH7、L−アルギニン0.5モル/l、EDTA 2mモ
ル/l中で、20℃で約200時間にわたる復元を示してい
る。この変性は、配座特異性ELISA−テスト系を用い
て、受動免疫反応性(例8)をGSH−濃度との関連で試
験した。
K 33 Fabの収率と緩衝液のpHとの関係を示している。
0.5モル/l、EDTA 2mモル/l中、20℃の温度における、約
200時間の変性時間にわたるMAK 33 IgGの復元とGSH濃度
との関係を示している。配座特異性ELISA−テスト系を
用いて、受動免疫反応性(例8)で、この復元を検査し
た。
抗体の収率とpH値の関係を示している。
と同様に可溶化させた。引続き、塩酸グアニジン6モル
/l、pH2に対して透析させた。可溶化及び透析を双方の
鎖に対して別別に行なつた。
に、100倍量のトリス−HCl 0.1モル/l、pH8.5、L−ア
ルギニン0.6モル/l、GSSG 0.1mモル/l、GSH 1mモル/l及
びEDTA 2mモル/l中で稀釈した。復元は、20℃で200時間
にわたるインキユベーシヨンにより行なつた。
来の抗体分を、受動免疫反応性の測定(例8)により測
定した。
ンキナーゼの骨格筋イン酵素)に対する受動免疫反応性
の立証 ここで「受動免疫反応性」とは、本来のもしくは変性さ
れた抗体上での天然構造のエピトープの形成と解され
る。このエピトープの探索は、他の種属の動物(ここで
は羊)から得られる配座特異性抗−マウス−抗体により
ELISA−テスト系で行なう。
の製造。
をA.ジヨンストン(Johnston)及びR.トルペ(Thorpe)
によるイムノケミストリイ・イン・プラクテイス(Immu
nochemistry in Practice,Blackwell Scientific Publi
cations,Oxfort,1982、27〜31頁)により、羊中で製造
した。
トルペの文献44〜46頁により、硫酸アンモニウム分画及
びDEAE−イオン交換体クロマトグラフイにより単離し
た。
−スフエロシル免疫吸着剤(マウス−κ−鎖1.5mg/スフ
エロシルml)20mlに、酵素免疫試験で抗−マウス−κ−
活性が検出不能になるまで繰り返し吸着させた。次い
で、このIgG−フラクシヨンをマウス−Fab−スフエロシ
ル−充填体20ml(マウス−Fab15mg/スフエロシルml)を
有するカラムを通し、特異的に吸着されたIgG−フラク
シヨン分をグリシン0.2モル/l、pH2.8で溶離させた。酢
酸1mモル/lに対する透析の後に、この部分フラクシヨン
を凍結乾燥させた。
M−κ−、M−γ−、M−Fd−鎖とは反応しないか又は
不完全に折りたたまれたM−κ/M−Fd−錯体と反応する
ことが確認された。代りにM−Fab、M−IgG及び完全に
折りたたまれたM−κ/M−FdもしくはM−κ/M−γの錯
体と結合する。
Fab−抗体と共に前インキユベートした。天然で形成さ
れた配座エピトープの数に応じて、配座特異性抗−マウ
ス−Fab−抗体の種々の多数の結合位置は飽和された。
前インキユベーシヨン溶液をマウス抗体−酵素−接合体
(抗体−ペルオキシダーゼ−接合体)と共に、壁がマウ
ス抗体で被覆された試験管内に入れた。
結合されたマウス抗体をマウス抗体−酵素−接合体と架
橋させ、この際、結合した接合体の量は、前インキユベ
ーシヨン溶液中の天然もしくは変性抗体の量に間接液に
比例する。分光学的立証は、抗体−接合酵素により色原
性基質ABTR (2,2′−アジノ−ビス−(3−エチルベ
ンゾチアゾリン−6−スルホネート)の変換の後に、40
5nmでの吸収測定により行なつた(H.U.Bergmeyer,Meth.
in Exzymol.第3版、第9巻 15〜37頁)。
筋−イソ酵素を認識する(CK-MM;P.Buckel等のGene 51
(1987)、13〜19) ここで、能動免疫反応性とは、本来のもしくは復元され
た抗体と特異抗原(この場合ヒト−CK-MM)との反応で
ある。
ポリクローナル抗−マウス−抗体を用いて色原性基質AB
TSの変換を介して比色計により定量的に測定した。
単位上にのみ形成されるエピトープを認識する。このエ
ピトープへの結合により、酵素活性は80%だけ抑制され
る(P.Buckel等1989)。従つて、このCK-MM−抑制テス
トは、完全な変性及び還元後のMAK 33の再構成を立証す
るための非常に有効なテストである。それというのも、
完全に復元された抗原結合位置のみをこの酵素は抑制で
きるからである。
Boehringer Mannheim)のカツプリングされた酵素テス
トを用いて測定した(H.U.Bergmeyer,Meth.of Enzym.An
alysis,第3版、III巻 510〜540頁)。この場合、クレ
アチンキナーゼは、クレアチンホスフエート及びADPを
クレアチン及びATPに変換する。比色法で立証可能な反
応を得るために、生じたATPをグルコースをホスホリル
化するヘキソキナーゼにより消化させてグルコース−6
−ホスフエートにする。グルコース−6−ホスフエート
をグルコース−6−ホスフエートデヒドロゲナーゼによ
りNADP+からのNADPH+H+の形成下に酸化して、グルコネ
ート−6−ホスフエートとする。1分間当りの吸光度変
化から、クレアチンキナーゼの活性を計算することがで
きる。
ツチ中の抑制作用に相当する本来の物質の量を測定する
ことができる。復元バツチ中の全蛋白質に対する抑制活
性蛋白質分は抑制活性抗体の収率(%)を示す。
収率の比較測定 完全に変性され、還元されたMAK 33-Fab−フラグメント
を塩酸グアニジン6モル/l、pH2に対して透析させ、引
続きトリス−HCl 0.1モル/l、pH8.5、L−アルギニン0.
5モル/l、GSSG 0.2mモル/l、GSH 2mモル/l及びEDTA 2m
モル/l中の1:100の稀釈、20℃の温度、かつ約200時間の
復元時間で再酸化する。
に基づき、この復元バツチを濃縮した。更に、この復元
溶液を酢酸1mモル/lに対して透析させ、引続き凍結乾燥
させた。この凍結乾燥物をH2O中に入れ(H2O:復元量=
1:200)、燐酸カリウム50mモル/l、NaCl 0.15モル/l、p
H7.5に対して透析させた。
液中の活性Fab−フラグメントの収率を示す。
ミドpePA 133(欧州特許第0242835号)を用いて形質転
換させ、例1.4に記載のように封入体をペレツトとして
調製する。
l、pH8.5、グアニジンHCl 0.6モル/l、EDTA 2mモル/l、
DTE 0.3モル/l中、室温で、蛋白質濃度4〜6mg/mlでイ
ンキユベートした。この可溶化に引続き、濃塩酸を用い
て、この溶液のpH値を3に調節した。還元剤及び緩衝剤
成分を、グアニジン−HCl 6モル/l、pH2、4℃に対する
透析により分離した。
は、トリス−HCl 0.1モル/l、pH10.5、L−アルギニン
0.5モル/l、EDTA 1mモル/l及び牛血清アルブミン1mg/ml
中での稀釈により行なつた。蛋白質濃度は10〜30μg/m
l、温度は20℃及び再結合時間は24時間であつた。
eim GmbH)のtPA−標準(整理番号1080954)に関する試
験法で測定した。第7A表及び第7B表は、活性tPAの収率
と次の変数との関係を示す: 7A:一定DTE濃度(2mモル/l)におけるGSSG−濃度 7B:一定GSH濃度(1mモル/l)におけるGSSG−濃度 例10 誘導体化して混合ジサルフアイドにすることによるK2P
(t−PA誘導体、西ドイツ特許第3903581号参照)の復
元 西ドイツ特許第3903581号明細書に記載のように、プラ
スミドpA 27 fd及びpUBS 500で形質変換されたE.コリー
(DSM 2093)の細胞を培養し、細胞湿潤物質を収得す
る。この細胞湿潤物質から例9に記載のように、変性さ
れ、復元された蛋白質が得られる。
された蛋白質の溶液を、GSSGで0.1モル/lに、トリスで
0.1モル/lに調整した。引続き、pH値をNaOHを用いてpH
8.5に調節した。室温で2時間のインキユベーシヨンの
後に、酸化剤及び緩衝剤成分を、新たなグアニジン−HC
l 6モル/l、pH2、4℃に対する透析により分離した。
復元は、復元緩衝液中での稀釈により行なつた。この蛋
白質濃度は、30〜60μg/ml、温度は20℃及び復元時間は
12時間であつた。
ニン0.8モル/l、EDTA 2mモル/l中のK2Pの再活性化とGSH
−濃度との関係を示す。
性K2Pの収率と緩衝液のpH値との関係を示す。
の表現のためのプラスミドpBT 111の配列を示す図であ
り、第2図は、MAK 33のFd−鎖(ヌクレオチド位置240
〜917)の表現のためのプラスミドp10169の配列を示す
図である。
Claims (10)
- 【請求項1】変性及び還元性条件下での可溶化による細
胞溶解及び酸化及び復元条件下での引続く再活性化によ
り、遺伝子工学で製造され、原核生物中に発現した生物
学的活性蛋白質を活性化する方法において、1〜1000μ
g/mlの蛋白質濃度で操作し、可溶化と再活性化との間
で、1〜4のpH値を有し、塩酸グアニジン4〜8モル/l
又は尿素6〜10モル/lを含有する緩衝液に対する透析を
行なうことを特徴とする、遺伝子工学で製造され、原核
生物中に発現した生物学的活性蛋白質を活性化する方
法。 - 【請求項2】透析緩衝液は塩酸グアニジン5〜7モル/l
を含有する、請求項1記載の方法。 - 【請求項3】再活性化を、9〜12のpH値、0.1〜20mモル
/lのGSH濃度、0.01〜3mモル/lのGSSG濃度でかつ非変性
性濃度の変性剤を用いて、1〜300時間にわたつて実施
する、請求項1記載の方法。 - 【請求項4】再活性化工程で、まず、変性条件下でGSSG
の添加により蛋白質のチオール基を蛋白質の混合ジスル
フイドとグルタチオンに変じ、改めて、塩化グアニジン
又は尿素を含有する緩衝液に対して透析させ、次いで6
〜10のpH−値、0.1〜5mモル/lのGSH濃度で、かつ非変性
性濃度の変性剤を用いて、1〜300時間にわたり再活性
化させる、請求項1又は2記載の方法。 - 【請求項5】再活性化工程で、変性剤として、アルギニ
ン、塩酸グアニジン及び/又は少なくとも1種の式:R2
‐CO-NRR1(I)(式中R及びR1は、H又はC−原子数
1〜4のアルキル基であり、R2はH又はC−原子数1〜
3のアルキル基である)の化合物を使用する、請求項3
から4までのいずれか1項記載の方法。 - 【請求項6】再活性化の工程で、非蛋白質分解作用蛋白
質の存在で、殊に牛血清アルブミンの存在で操作する、
請求項1から5までのいずれか1項記載の方法。 - 【請求項7】再活性化の工程でEDTA1〜10mモル/lの存在
で操作する、請求項1から6までのいずれか1項記載の
方法。 - 【請求項8】可溶化の工程で、アルカリ性pH値で、メル
カプタン類からの還元剤の存在で、かつ変性剤の存在で
操作する、請求項1から7までのいずれか1項記載の方
法。 - 【請求項9】抗体もしくは抗体フラグメントを再活性化
させる、請求項1から8までのいずれか1項記載の方
法。 - 【請求項10】t-PA又はt-PA−類似作用蛋白質を再活性
化させる、請求項1から9までのいずれか1項記載の方
法。
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