JPH0148278B2 - - Google Patents

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【発明の詳細な説明】 この数年間に、多くの方面でヒトインスリンの
合成的あるいは半合成的構造が前進した。インス
リン分子は、21個のアミノ酸残基を有するＡ鎖と
30個のアミノ酸残基を有するＢ鎖との２個のペプ
チド鎖を持つている。これらの鎖は、それぞれ２
個のシステイニル基で形成される３個のジスルフ
イド橋を含んでいる。これらのジスルフイド橋の
うち２個は、Ａ鎖とＢ鎖を結んでいる。これらの
架橋は、それぞれＡ−６とＡ−11、Ａ−７とＢ−
７としてＡ−20とＢ−19のシステイニル基で形成
されている。 インスリンの一般的製法のひとつは、プロイン
スリンまたはプロインスリン類似体を経るもので
ある。プロインスリンは単鎖ポリペプチドであつ
て、インスリンＡ鎖のＮ端が結合ペプチドを介し
てインスリンＢ鎖のＣ端と結合しており、システ
イン残基は適宜ジスルフイド結合で結ばれてい
る。例えば、ヒトプロインスリンは86個のアミノ
酸残基を有し、そのうち35個が結合ペプチドを形
成している。Yanaihara et al.Diabetes、27
（Suppl.1）149−160（1978）は、種々の結合ペプ
チドおよびヒトプロインスリンの合成について報
告している。 他のプロインスリン類似体も文献に報告されて
おり、そのプロインスリンとの主要な相異は、イ
ンスリンAB鎖を結合している部分の構造および
その結合点にある。 すなわち、Busse et al、Biochemistry、15、
No.81649−1657（1976）は、２個のメチオニンがカ
ルボニル基によつてＮ端で結合している結合基を
報告しており、これはＡ−１グリシルのN〓−末
端とＢ−29リシルのN〓−末端に結合している。 同様に、他の結合基が、例えば、Geiger et
al、Biochem.and Biophys.Res.comm.、５、60
−66（1973）；Brandenburg et al、Hoppe−
Seyler′s Z.Physiol.Chem.bd.354、613−627
（1973）；U.S.Patents Nos.3847893；3907、
763；3883496；3883500；3884897に記載されてい
る。 インスリンＡ鎖とＢ鎖とが特定の結合基を介し
て結合している単鎖体を経由してインスリンを製
造する方法では、常に、Ａ鎖とＢ鎖上に存在する
６個のシステイニル残基によつて３個のジスルフ
イド橋を形成することからなるインスリンＡ鎖と
Ｂ鎖との直接的結合を行なわせる必要がある。ジ
スルフイド結合の形成後に、初めの結合基を除去
してインスリンを生成させる。 インスリンを生成させるこの方法を実施するに
は、正しいジスルフイド橋を形成するための効果
的で容易な方法が強く望まれる。一般に、ジスル
フイド橋を形成する文献的方法には、所望の−
SH構造の空気酸化が含まれる。さらに、−SH構
造が不安定であることが知られているので、この
前駆体は、通常Ｓ−保護基、特にＳ−スルホネー
ト基（−Ｓ−SO^- ₃）から形成する。従つて、文献
的方法は二段階の反応からなつている。すなわ
ち、メルカプタンで処理してＳ−スルホネートを
−SHに還元し、次いで得られた−SH化合物を空
気酸化するのである。 今回、Ｓ−スルホネートを所望のジスルフイド
型インスリン前駆体に直接変換する容易で効率の
よい方法があることが判明した。この方法は、酸
化−還元を実施しようとするのではない。むしろ
酸化剤の不存在を好む条件下に（それは必須では
ない）、この直接変換は実施される。本発明は、
このような方法に関する。 線型Ｓ−スルホネートインスリン前駆体のジス
ルフイド形成ではなくて、インスリンＡ鎖とＢ鎖
の結合に使用される一般的二段階法に関する先行
技術における例外は、Dixon et、al、Nature、
188、721−724（1960）である。この文献は、Ａ鎖
とＢ鎖のスルホネートを単一溶液中で結合するこ
とによるインスリンの製法を暗示している可能性
がある。しかし、詳しくみると、この文献の方法
は極めて不完全であり、その収率は回収した生成
物の活性だけに基いており、僅か１−２％であ
る。後の報告、Dixon、Proc.Intern.Congr.
Endocrinal.2nd London 1964、1207−1215
（1965）はこの方法の詳細を幾分明確にしている
が1211頁の表にはＳ−スルホネートの嫌気的還
元とジスルフイドへの酸化を含む二段階法が示さ
れている。 本発明は、下式のインスリン前駆体の製造法に
関する。 式中、Ｒは水素、化学的もしくは酵素的に開裂
し得るアミノ酸残基または少くとも２個のアミノ
酸残基からなり、化学的もしくは酵素的に開裂し
得るペプチド残基； Ｙは−Lys （Ｂ−29）−Ｚ （Ｂ−30）− （但し、ＺはAla、ThrまたはSer）；Ａ−１乃至
Ａ−21はインスリンＡ鎖；Ｂ−１乃至Ｂ−30はイ
ンスリンＢ鎖；そしてＸはＡ−１のアミノ基でイ
ンスリンＡ鎖に結合し、Ｂ−29のε−アミノ基ま
たはＢ−30のカルボキシル基でインスリンＢ鎖に
結合している基であつて、化学的もしくは酵素的
に該Ａ鎖およびＢ鎖からそれらを切断することな
く開裂され得る基である。 本発明方法は、Ｓ−スルホネート化合物 （式中、Ｒ、ＸおよびＹは前記のとおり。） を、そのスルホネート濃度が約10mg/ml以下であ
つて、PHが約７乃至約11.5の水性媒質中におい
て、−SSO^- ₃基１個に対して約１個乃至約５個の−
SH基を提供し得る量のメルカプタンと反応させ
ることからなる。 本明細書中でいう“インスリン前駆体”とは、
(1)インスリンＡ鎖およびインスリンＢ鎖を含んで
おり、(2)Ａ鎖およびＢ鎖中の(a)Ａ−１とＡ−11、
(b)Ａ−７とＢ−７および(c)Ａ−20とＢ−19のそれ
ぞれに存在するCys基上の硫黄原子同志が結合し
て生ずる少くとも３個のジスルフイド結合を有
し、そして(3)インスリンＡ鎖とＡ−１のアミノ基
で結合しており、インスリンＢ鎖とＢ−29のリジ
ン残基上のε−アミノ基またはＢ−30のアミノ酸
残基上のカルボキシル基で結合している除去可能
な結合基を有する分子を意味する。 Ｚで表わされる基はインスリンのＢ−30のアミ
ノ酸残基を表わし、Ala、ThrまたはSerのいず
れかである。これらは天然インスリンに相当し、
Thrはヒトインスリン、Alaはウシおよびブタイ
ンスリン、そしてSerはウサギインスリンに含ま
れる。 Ｒは水素、アミノ酸残基または少くとも２個の
アミノ酸残基を持つペプチド残基である。Ｒがア
ミノ酸残基またはペプチド基であるとき、Ｒは本
発明方法で得られるインスリン前駆体から、残り
のインスリンの構造全体を損うことなく除去され
得る基である。ペプチド基のアミノ酸残基は如何
なる広い範囲のものであつてもＲの定義を充足す
る。開裂可能なアミノ酸残基の例としてはアルギ
ニン（Arg）やリシン（Lys）のような塩基性ア
ミノ酸があり、同様にカルボキシル側末端にこの
ようなアミノ酸残基を有するペプチド基が挙げら
れる。これらは、蛋白分解酵素トリプシンで処理
することにより開裂されるものである。他の開裂
可能なアミノ酸残基の例はメチオニン（Met）お
よびカルボキシル末端にMetを有するペプチド基
である。これらは臭化シアンで処理することによ
り除去される。さらに、トリプトフアン（Trp）
およびカルボキシル末端にTrpを有するペプチド
基も例示され得る。これらは、Ｎ−ブロモサクシ
ンイミドでの処理で除去される。 インスリン前駆体および線状Ｓ−スルホネート
インスリン前駆体における結合基Ｘは、広範な構
造を持ち得る。好ましくは、Ｘはポリペプチドで
ある。このポリペプチドは、一般に、少くとも２
個のアミノ酸残基を有する。アミノ酸残基の数に
ついて言れば、好ましくは約２個乃至約35個であ
り、さらに好ましくは約６個乃至約35個である。
Ｘは、Ａ−１のアミノ基でＡ鎖に、Ｂ−30のカル
ボキシル基でＢ鎖に結合している。Ｘがペプチド
である場合、最も好ましいのは、その結合の相手
としてＡ鎖、Ｂ鎖もしくはそれらの両方を含む一
般的インスリン前駆体における天然の結合ペプチ
ドである。天然結合ペプチドの例としては、次の
ようなものがある。 ウサギ −Arg−Arg−Glu−Val−Glu−Glu−Leu−
Gln−Val−Gly−Gln−Ala−Glu−Leu−Gly−
Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Gly−Leu−
Gln−Pro−Ser−Ala−Leu−Glu−Ala−Leu−
Gln−Lys−Arg−． ヒト −Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Leu−
Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−
Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−
Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−
Leu−Gln−Lys−Alg−． サル −Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−
Gln−Val−Gly−Gln−Val−Glu−Leu−Gly−
Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Ser−Leu−
Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ser−
Leu−Gln−Lys−Arg−． ウマ −Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asp−Pro−
Gln−Val−Gly−Glu−Val−Glu−Leu−Gly−
Gly−Gly−Pro−Gly−Leu−Gly−Gly−Leu−
Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Ala−Gly−Pro−
Gln−Gln−Lys−Arg−． ラツト −Arg−Arg−Glu−Val−Glu−Asp−Pro−
Gln−Val−Pro−Gln−Leu−Glu−Leu−Gly−
Gly−Gly−Pro−Glu−Ala−Gly−Asp−Leu−
Gln−Thr−Leu−Ala−Leu−Glu−Val−Ala−
Arg−Gln−Lys−Arg−． ラツト −Arg−Arg−Glu−Val−Glu−Asp−Pro−
Gln−Val−Ala−Gln−Leu−Glu−Leu−Gly−
Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Asp−Leu−
Gln−Thr−Leu−Ala−Leu−Glu−Val−Ala−
Arg−Gln−Lys−Arg−． ブタ −Arg−Arg−Glu−Ala−Glu−Asn−Pro−
Gln−Ala−Gly−Ala−Val−Glu−Leu−Gly−
Gly−Gly−Leu−Gly−Gly−Leu−Gln−Ala−
Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Pro−Pro−Gln−
Lys−Arg−． ウシ・ヒツジ −Arg−Arg−Glu−Val−Glu−Gly−Pro−
Gln−Val−Gly−Ala−Leu−Glu−Leu−Ala−
Gly−Gly−Pro−Gly−Ala−Gly−Gly−Leu−
Glu−Gly−Pro−Pro−Gln−Lys−Arg−． イヌ −Arg−Arg−Asp−Val−Glu−Leu−Ala−
Gly−Ala−Pro−Gly−Glu−Gly−Gly−Leu−
Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Gly−Ala−
Leu−Gln−Lys−Arg−． モルモツト −Arg−Arg−Glu−Leu−Glu−Asp−Pro−
Gln−Val−Glu−Gln−Thr−Glu−Leu−Gly−
Met−Gly−Leu−Gly−Ala−Gly−Gly−Leu−
Gln−Pro−Leu−Gln−Gly−Ala−Leu−Gln−
Lys−Arg−． チンチラ −Arg−Arg−Glu−Leu−Glu−Asp−Pro−
Gln−Val−Gly−Gln−Ala−Asp−Pro−Gly−
Val−Val−Pro−Glu−Ala−Gly−Arg−Leu−
Gln−Pro−Leu−Ala−Leu−Glu−Met−Thr−
Leu−Gln−Lys−Arg−． アヒル −Arg−Arg−Asp−Val−Glu−Gln−Pro−
Leu−Val−Asn−Gly−Pro−Leu−His−Gly−
Glu−Val−Gly−Glu−Leu−Pro−Phe−Gln−
His−Glu−Glu−Tyr−Gln−Lys−Arg−． Ａ−１乃至Ａ−21、ＸおよびＢ−１乃至Ｂ−30
からなるアミノ酸鎖が、ブタ、ウシまたはヒトの
プロインスリンのＡ鎖、結合ペプチドおよびＢ鎖
によつて構成されている天然のアミノ酸であるの
が好ましく、殊に好ましいのはヒトプロインスリ
ンのそれである場合である。 上述のように天然の結合鎖を用いるのが好まし
いが、この結合ペプチドとしてはもつて短いペプ
チド鎖を使用することもできる。このための要件
は、(1)Ａ鎖およびＢ鎖間に正しくジスルフイド結
合を形成させるために充分な鎖長を有することお
よび(2)インスリン前駆体から除去されてインスリ
ンを生成することである。使用可能なジペプチド
の代表例は−Arg−Arg−である。さらに、この
ジペプチドを修飾した−Arg−X′−Arg−（但し、
X′は少くとも１個のアミノ酸残基）も容易に利
用することができる。さらに好ましい結合ペプチ
ドとしては、−Arg−Arg−Lys−Arg−およびこ
れをさらに長くした−Arg−Arg−X²−Lys−
Arg−（但し、X²は少くとも１個のアミノ酸残
基、好ましくは２個のアミノ酸残基）が挙げられ
る。勿論、後者には天然結合ペプチドが含まれ、
それらの多くは先に例示した。 前述の基準に照らせば、さらに広範囲の結合基
が使用され得る。結合基がポリペプチドである場
合には、結合点はＡ鎖のアミノ末端（Ａ−１）お
よびＢ鎖のカルボキシル末端（Ｂ−30）である。
しかし、Ｂ−29のアミノ酸残基（Lys）はε−ア
ミノ基を有しているので、結合基はＡ−１および
Ｂ−29の両アミノ基を介してＡ鎖とＢ鎖を結合さ
せることもできる。従つて、カルボニルビス（メ
チオニル）〔Busse et al、supra〕、２，2′−スル
ホニルビス（エトキシカルボニル）〔Obermeier
et al、Hoppe−Sayler′s Z.Physiol.Chem.、356、
1631−1634（1975）〕、２，７−ザアミノスベロイ
ル〔Geiger et al、supra〕などが後者のタイプ
の有用な結合基である。 本発明方法を実施するに際しては、線状Ｓ−ス
ルホネートインスリン前駆体を、水性媒質中、PH
約７乃至約11.5において、メルカプタンで処理す
る。メルカプタンとは、言うまでもなく、少くと
も１個の−SH基を有する化合物であり、本発明
方法で使用するメルカプタンに関しては、それが
水溶性でなければならないというのが唯一の制限
である。 代表的な水溶性メルカプタンの例には、ジチオ
トレイトール、ジチオエリトリトール、２−メル
カプトエタノール、テオグリコール酸メチル、３
−メルカプト−１，２−プロパンジオール、３−
メルカプトプロピオン酸などがある。多数の−
SH基を有するメルカプタン、例えばジチオトレ
イトールも用い得るが、１個の−SH基を有する
メルカプタンを使用するのが好ましい。その中で
も、２−メルカプトエタノールが特に好ましい。 本発明方法は、一般に、適当な緩衝剤を添加す
ることにより所定のPHに維持した水性媒質中で実
施される。媒質のPHは約７から約11.5で変化し得
るが、好ましくは約9.5から約10.5である。従つ
て、上記の範囲で緩衝能力を有するものであれ
ば、如何なる緩衝剤であつても本発明方法に利用
し得る。適当な緩衝剤の例としては、リン酸緩衝
剤、トリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ト
リス）、ホウ酸緩衝剤、グリシンなどが挙げられ
る。 水性媒質中の緩衝剤の濃度は、一般に約0.5N
以下である。好ましい濃度範囲は約0.005N乃至
約0.5Nであり、さらに好ましくは約0.005N乃至
約0.1Nである。 線状Ｓ−スルホネートインスリン前駆体は、約
10mg/mlを超えない濃度で水性媒質に加える。こ
の濃度は低目の方が好ましく、一般に約0.05mg/
ml乃至約２mg/mlの範囲である。 本発明方法の重要因子は、線状Ｓ−スルホネー
トインスリン前駆体に対比したメルカプタンの使
用量である。Ｓ−スルホネートを−SHに還元す
る先行技術方法では、Ｓ−スルホネートに対して
大過剰のメルカプタンを使用してきた。そのよう
な大過剰はＳ−スルホネート原料物質を圧倒し、
Ｓ−スルホネートを完全還元して対応する−SH
化合物を生成する。そのため、次にこの−SH中
間体を単離するかもしくは反応混液を稀釈し、さ
らに別個に酸化工程（一般に空気を用いる）を実
施して−SH中間体を所望の−Ｓ−Ｓ−化合物に
変換するという手順を必要とする。この点に関し
ては、例えばCrestfield et al.、J.Biol.Chem.、
238、622−627（1963）、Steiner et al、Proc.
Nat1 Acad.Sci.U.S.A.、60、622−629（1968）お
よびYanaihara et al、Diabetes.27、（Suppl.1）、
149−160（1978）、などの報告がある。 他方、本発明方法は、−Ｓ−SO^- ₃基１個につい
て約１個乃至約５個の−SH基を与える量のメル
カプタン、好ましくは−Ｓ−SO^- ₃１個について約
２個乃至約４個の−SH基を与える量のメルカプ
タンを使用する。メルカプタンを上記範囲の量で
使用すると、高い効率と容易さで線状Ｓ−スルホ
ネートインスリン前駆体を直接所望のジスルフイ
ドインスリン前駆体に変換することができること
が見出された。線状Ｓ−スルホネートインスリン
前駆体の一部としてのＡおよびＢ鎖は６個のスル
ホネート基を有するので、先に述べた範囲を充足
するためには−SH基１個を有するメルカプタン
は、約６：１乃至約30：１のモル比で使用される
こととなる。 本発明方法を実施するに当り、PH、緩衝剤の強
度（buffer strength）および線状Ｓ−スルホネ
ートインスリン前駆体の濃度は、必須要件ではな
いが、重要な事項である。一般に、線状Ｓ−スル
ホネートインスリン前駆体の濃度の増加と共に、
PHを増大し、緩衝剤の強度を低下させるのが好ま
しい。 さらに、先行技術の方法と完全に区別される点
として、本発明方法は酸化的雰囲気下に実施する
ことを必須としない。酸化剤、例えば空気が反応
媒質中に存在してもよいが、驚くべきことに、本
反応を空気その他の酸化剤が実質的に存在しない
条件下に実施するのが特に好ましいことが見出さ
れた。ここで“実質的に存在しない”と言うのは
空気の確実な添加を避けるという意味である。こ
のことは、例えば、空気その他の酸化剤の利用可
能性を排除する密閉系の中で反応を実施すること
によつて達成される。空気の不存在をさらに確実
にするためには、反応剤の加える前に水性溶媒を
窒素パージし、脱ガスすることができる。 必須事項ではないが、本発明方法のいまひとつ
の特に望ましい事項は温度制御である。本方法は
一般に約０℃乃至約37℃の温度で実施される。好
ましくは、反応温度はこの範囲の低温端、一般に
は約２℃乃至約８℃、さらに好ましくは約４℃乃
至約６℃である。しかしながら、もつと好ましく
は、本方法は２つの温度範囲で実施される。反応
混液を室温付近で調製し、一旦こうして調製した
反応混液を約２℃乃至約８℃の温度に冷却し、残
りの反応時間を通じて後者の範囲に保持する。 従つて、本発明方法を実施する典型的な例を示
すと、一定のPHを持つ水性媒質を、例えばグリシ
ンを約0.05Nの濃度で使用して調製する。こうし
て調製した水性媒質を、一般には約０℃乃至約37
℃、好ましくは室温付近に保持し、脱ガスを行
い、窒素パージし、再び脱ガスする。線状Ｓ−ス
ルホネートインスリン前駆体を、所望の濃度、例
えば約0.1mg/mlを与えるように上記水性媒質に溶
解する。メルカプタンを、−Ｓ−SO^- ₃基１個につ
き約５個の−SH基を与える量だけ加える。この
混合物を実質的に空気その他の酸化剤が存在しな
い条件下に維持し、約４℃乃至約６℃の温度に冷
却し、反応が完結するまで同温度範囲に保持す
る。この反応は、一般に約５時間乃至約72時間、
さらに言えば約15時間乃至約24時間、通常は約18
時間乃至約20時間を要する。 反応が完了したら、インスリン前駆体生成物は
インスリン精製の分野でよく知られている各種の
方法のいずれかによつて単離され得る。最も普通
に用いられる方法は、例えばゲル過やイオン交
換クロマトグラフイーを含む各種のクロマトグラ
フイー法である。 得られたインスリン前駆体は、文献上知られて
いる手段を用いて、酵素的にあるいは化学的にイ
ンスリンに変換される。これらの方法には、例え
ばKemmler et al、J.Biol.Chem.、246、6786−
6791（1971）に記載されているトリプシンとカル
ボキシペプチダーゼＢの組合せを用いる開裂法が
含まれる。 インスリン生成物は、例えばポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法、アミノ酸分析法、ラジオレセ
プターアツセイ法、ラジオイムノアツセイ法、高
速液体クロマトグラフイー法（HPLC）、紫外線
スペクトル法、ダンシレーシヨン法、ウサギ血中
グルコースアツセイ法などの既知方法により、純
度および相対活性について検定され得る。 線状Ｓ−スルホネートインスリン前駆体原料物
質は組換えDNA法により得られる。これらはま
た天然インスリンおよびプロインスリンから製造
されるし、さらに溶液法および固相法を含めた古
典的ペプチド合成法によつても製造される。 線状Ｓ−スルホネートインスリン前駆体は、プ
ロインスリンから次のようにして製造される。冷
却した脱イオン7M尿素100mlに亜硫酸ナトリウム
786mgを加え、撹拌して溶解した。次に、テトラ
チオン酸ナトリウム594mgを加えた。撹拌すると
大部分のテトラチオン酸ナトリウムは溶解した
が、溶液はなお濁つていた。氷酢酸でPHを7.7に
調製した。HPLCで精製したウシプロインスリン
503mgを撹拌しながら加えた。反応液のPHを2N水
酸化ナトリウムで7.6に再調整し、得られたやゝ
混濁状の溶液を６℃において18時間撹拌した。 反応液の約半量を、2N水酸化ナトリウムでPH
9.1に調整し、セフアデツクスＧ−25コ−スカラ
ムに吸着させた。クロマトグラフイーの条件は次
のとおりとした。溶媒、0.05M炭酸水素アンモニ
ウム、PH9.0；カラムサイズ、２×90cm；温度、
21℃；流速、18.5ml／分。初期溶離液120mlを捨
て、次の75mlを集め、貯蔵した。カラムは、次い
で0.05M炭酸水素アンモニウム（PH9.0）400mlで
洗浄した。この操作を残りの半量の反応液につい
て反復した。２回のクロマトグラフイーで得られ
た目的分画の紫外線スペクトルは、合計401mgが
取得されていることを示した。これを合併し、凍
結乾燥して、乾燥脱塩生成物445.7mgを得た。こ
の生成物が線状Ｓ−スルホネートウシプロインス
リンであり、原料物質を含んでいないことを、セ
ルローズアセテート電気泳動およびポリアクリル
アミドデイスクゲル電気泳動によつて確認した。 線状Ｓ−スルホネートウシプロインスリンは、
DEAE−セルローズクロマトグラフイーによつて
精製された。粗製品443mgを7.5M尿素−0.01Mト
リス−0.001MEDTA（PH8.5）10mlに溶かし、
DEAEセルローズカラムに吸着させた。クロマト
グラフイーの条件は次のとおりであつた。溶媒、
7.5M尿素−0.01Mトリス−0.001MEDTA（PH8.5）
＋０〜0.35M塩化ナトリウム濃度勾配；カラムサ
イズ、2.5×90cm；温度、４℃；流速、約0.9ml／
分；分画容積、5.3ml。 分画番号に対して、各分画の276nmにおける吸
光度をプロツトすると、若干テーリングする１個
の大型ピークが得られた。紫外線スペクトルによ
る分析の結果、この大型のピークが生成物である
ことが示された。分画199〜240（溶離容積（1069
〜1291ml）を合併した。紫外線スペクトルによ
り、355mgの存在が示された。 この生成物をセフアデツクスＧ−25コースカラ
ム上で脱塩した。クロマトグラフイーの条件は次
のとおりであつた。溶媒、0.05M炭酸水素アンモ
ニウム（PH8.0）；カラムサイズ、3.7×105cm；温
度、４℃；流速16.0ml／分、初期溶離液395mlを
捨て、次の250mlを集め、貯蔵した。カラムの洗
浄は0.05M炭酸水素アンモニウム（PH8.0）2000
mlで行つた。上記貯蔵分画を紫外線スペクトルで
検定すると321mgの得量が示された。これを凍結
乾燥し、乾燥済物質373mgを得た。本品の同定は、
ポリアクリルアミドデイスクゲル電気泳動および
高速液体クロマトグラフイーにおける溶離位置に
基いて行つた。 本発明方法を説明するために以下に実施例を示
す。これらの実施例は、本発明の限界を示すため
のものではない。 実施例 １ （濃度0.1mg/mlでの実施） 線状Ｓ−スルホネートウシプロインスリン1.61
mgを、脱ガス済0.05Mグリシン（PH9.5）16.1mlに
溶かした。この溶液に、２−メルカプトエタノー
ルストツク水溶液0.158mlを加えた。このストツ
ク溶液は、エルマン試薬によつて滴下すると、メ
ルカプタン濃度は2.11mg/mlを示した。このこと
は、線状Ｓ−スルホネートウシプロインスリンの
−SSO^- ₃１個に対して、２−メルカプトエタノー
ル４当量を用いたことを意味する。最終PHは9.46
であつた。室温で調製した溶液をパラフイルムで
シールし、６℃に冷却し、19時間撹拌した。 反応混液を酸性化し、濃塩酸および0.5M水酸
化ナトリウムを用いてPH4.0±0.1（温度による補
正済）に調整した。生成物は高速低圧液体クロマ
トグラフイー（HPLPLC）により単離同定した。
HPLPLCの条件は次のとおりであつた。カラム、
1.1×54cmガラス製カラムにＣ含量16.6％のLP−
１／C₁₈を充填；溶媒、30％アセトニトリル／70
％（0.1Mギ酸アンモニウム、PH4.25）；温度、21
℃；圧力、8082ｇ/cm²；流速、2.40ml／分。試料
は、５mlのループ・インジエクターでカラムに注
入し、280nmで検出した。 先ず、0.1mg/mlの蛋白質濃度（nominal）を有
するウシプロインスリンストツク溶液５mlを注入
してクロマトグラフした。次に、上記の酸性化し
た反応混液５mlをクロマトグラフした。この反応
混液中に単量体ウシプロインスリンが存在するこ
とを容離の位置により確認した。さらに、２回の
HPLPLCのピーク面積を計算することにより、
反応混液中には、収率82.6％に当るウシプロイン
スリンが含まれていた。 実施例 ２ （濃度0.5mg/mlでの実施） 脱ガスした0.05Mグリシン（PH10.51）50.14ml
に、線状Ｓ−スルホネートウシプロインスリン
25.07mgを溶かした。この溶液に、２−メルカプ
トエタノールストツク水溶液（エルマン試薬で滴
定した濃度2.10mg/ml）1.302mlを加えた。これ
は、線状Ｓ−スルホネートウシプロインスリンの
−SSO^- ₃１個に対して2.1当量の２−メルカプトエ
タノールを使用したことになる。最終PHは10.47
であつた。室温で調製した溶液をパラフイルムで
シールし、６℃に冷却し、18時間撹拌した。 次に反応混液を、濃塩酸と0.1N塩酸を用いて
PH4.0±0.1（温度補正）に酸性化した。反応混液
中のウシプロインスリンの収率は、HPLPLCに
よる分析では69％であつた。 生成物は、脱塩後、ゲル過クロマトグラフイ
ーによつて単離した。反応混液、濃水酸化アンモ
ニウムでPH9.0に調整し、セフアデツクスＧ−25
コースカラムに吸着させた。脱塩クロマトグラフ
イーの条件は次のとおりであつた。溶媒、0.05M
炭酸水素アンモニウム（PH9.0）；カラムサイズ、
２×90cm；温度、21℃；流速、18.5ml／分、初め
の溶離液120mlを捨て、続く75mlを集めて貯蔵し
た。次いでカラムを0.05M炭酸水素アンモニウム
（PH9.0）400mlで洗浄した。貯蔵分画のUV分析に
よれば、21.6mgの蛋白質が含まれていた。これを
凍結乾燥して、乾燥脱塩蛋白質22.21mgを得た。 この物質の一部（14.84mg）をとり、1.0M酢酸
（5.5ml）に溶かした。この透明な溶液のUV分析
は、2.56mg/mlの蛋白質濃度を示した。この溶液
の５ml（UVで12.8mg）をセフアデツクスＧ−50
スーパーフアインカラムでクロマトグラフした。
クロマトグラフイーの条件は次のとおりであつ
た、溶媒、1M酢酸；カラムサイズ、1.5×100
cm；温度、21℃；流速、0.19ml／分；分画容積、
約1.9ml。 280nmの吸光度を見ながら、1M酢酸で一夜溶
離した。得られたグラフは２個のピークを示し
た。第１の小さいピークはウシプロインスリンの
重合体であり、第２のピークが単量体ウシプロイ
ンスリンであつた。２個のピークに従つて溶離液
をプールした。分画の合併は次のようにして行つ
た。 プール：分画30−46（55.0−84.0ml；ピーク、
70.4ml） プール：分画47−62（84.0−112.0ml；ピー
ク、99.8ml） UV分析によれば、プールは1.94mg、プール
は10.11mgであつた、これらを合計すると12.05
mgとなり、カラムに加えた量の94.1％を回収した
ことになる。回収全量に対して、単量体ウシプロ
インスリンは83.9％であつた。 両プールはそれぞれ凍結乾燥した。プールは
HPLPLCの溶離位置によりウシプロインスリン
であることが証明された。本品はまた文献の方法
によつてトリプシンおよびカルボキシペプチダー
ゼＢで処理するとウシインスリンを与えることが
証明された。 実施例 ３ （温度の影響） 実施例１の方法を用いて、線状Ｓ−スルホネー
トウシプロインスリンからウシインスリンを得る
収率に対する温度の影響を検討した。反応条件は
次のとおりであつた。蛋白質濃度、0.1mg/ml；緩
衝剤、0.05Mグリシン；PH、9.5；メルカプタン、
−SSO^- ₃１個に対して−SH4当量を与える量の２
−メルカプトエタノール；時間、18時間。 反応を21℃で実施した場合、HPLPLCによつ
て検定したプロインスリンの収率は47％であつ
た。反応剤を21℃で混合し、次いで混合物の温度
を６℃に下げた場合、収率は77％であつた。 実施例 ４ （PHの影響） 実施例１の方法を用いていくつかの反応を同時
に実施し、線状Ｓ−スルホネートウシプロインス
リンからウシプロインスリンを得る収率に対する
PHの影響を検討した。反応条件は次のとおりであ
つた。蛋白質濃度、0.5mg/ml；緩衝剤、0.05Mグ
リシン；メルカプタン、−SSO^- ₃１個に対して−
SH2当量を与える量の２−メルカプトエタノー
ル；時間、18時間；温度、６℃。 HPLPLCで定めたプロインスリンの収率は次
のとおりであつた。 PH 収率、％ 9.0 43.1 9.5 44.3 10.0 66.7 10.5 76.0 11.0 61.0 実施例 ５ （蛋白質濃度の影響） 実施例１の方法を用いていくかの反応を同時に
実施し、線状Ｓ−スルホネートウシプロインスリ
ンからウシプロインスリンを得る収率に対する蛋
白質濃度の影響を検討した。反応条件は次のとお
りであつた。緩衝液、0.05Mグリシン；PH、
9.5；メルカプタン、−SSO^- ₃１個に対して−SH4
当量を与える量の２−メルカプトエタノール；時
間18時間；温度、６℃。 HPLPLCで検定したプロインスリンの収率は
次のとおりであつた。 蛋白質濃度、mg/ml 収率、％ 0.1 78 0.2 63 0.3 46 0.4 37.6 0.5 25.4 1.0 12 −SSO^- ₃１個に対して２当量の−SHを用い、か
つPH10.5で実施した一連の反応の結果は次のとお
りであつた。 蛋白質濃度、mg/ml 収率、％ 0.5 77.2 0.96 58.3 1.83 19.5 4.2※ 20.1 7.4※ 19.6 ※−SH：−SSO^- ₃比＝1.2 実施例 ６ （−SH：−SSO^- ₃比の影響） 実施例１の方法を用いていくつかの反応を同時
に行い、線状Ｓ−スルホネートウシプロインスリ
ンからウシプロインスリンを得る反応の収率に対
する−SSO^- ₃対−SH比の影響を検討した。反応条
件は次のとおりであつた。蛋白質濃度、0.5mg/
ml；緩衝液、0.05Mグリシン；PH9.5；時間、18
時間；温度６℃。 HPLPLCで検定したプロインスリンの収率は
次のとおりであつた。−SH：−SSO^- ₃、比 収率、％ 4.0 30.8 2.0 44.7 1.0 37.0 0.5 4.5 実施例 ７ （メルカプタンの構造の影響） 実施例１の方法を用いていくつかの反応を同時
に実施し、線状Ｓ−スルホネートウシプロインス
リンからウシプロインスリンを得る反応の収率に
対するメルカプタンの構造の影響を検討した。反
応条件は次のとおりであつた。蛋白質濃度、0.1
mg／ml；緩衝液、0.05Mグリシン；PH、9.5；メル
カプタン、−SSO^- ₃１個に対して−SH4当量；時
間、18時間；温度、６℃。 HPLPLCで検定したプロインスリンの収率は
次のとおりであつた。 メルカプタン 収率、％ ジチオトレイトール 39.3 ジチオエリトリトール 34.9 チオグリコール酸メチル 56.1 ３−メルカプト−１，２−プロパンジオール65.5 ３−メルカプトプロピオン酸 65.3 ２−メルカプトエタノール 64.1 実施例 ８ （蛋白質の種類の影響） 実施例１の方法を用いていくつかの反応を同時
に実施し、線状Ｓ−スルホネートウシプロインス
リンからウシプロインスリンを得る反応の収率に
対する蛋白質の種類の影響を検討した。反応条件
は次のとおりであつた。蛋白質濃度、0.1mg/ml；
緩衝液、0.05Mグリシン；PH、9.5；メルカプタ
ン、−SSO^- ₃１個に対して−SH4当量を与える量の
２−メルカプトエタノール；時間、18時間；温
度、６℃。 HPLPLCで検定したプロインスリンの収率は
次のとおりであつた。線状Ｓ−スルホネートプロインスリン 収率、％ ウシ 60.6 ブタ 65.8 実施例 ９ （ヒトプロインスリンの製造） 生合成的に製造した線状Ｓ−スルホネートヒト
プロインスリン169.3mgを、脱ガスした0.05Mグ
リシン（PH10.54）338.6mlに溶解して溶液を調製
した。これに２−メルカプトエタノールストツク
水溶液7.71mlを加えた。このストツク水溶液のメ
ルカプタン濃度は、エルマン試薬を用いた滴定
で、2.08mg/mlであつた。これは、線状Ｓ−スル
ホネートヒトプロインスリンにおける−SSO^- ₃１
個に対して、２−メルカプトエタノールが２当量
存在することになる。5N水酸化ナトリウムを用
いる微調整により、最終PHを10.52とした。この
溶液をパラフイルムでシールして、６℃で18時間
撹拌した。 次いで、濃塩酸で反応混液をPH2.9±0.1（温度
調整済）に酸性化した。得られた透明な溶液をセ
フアデツクスＧ−25コースカラムを用いて脱塩し
た。クロマトグラフイーの条件は次のとおりであ
つた。溶媒、２％酢酸（Ｖ／Ｖ）；カラムサイズ、
５×100cm；温度、25℃；流速、28.8ml／分；分
画容積、20.2ml。 初めの779mlの溶離液を捨て、次の464mlを集
め、貯蔵した。280nmにおける光学密度に基い
て、このプールは蛋白質であることが示された。
カラムは２％酢酸2500mlで洗浄した。この蛋白質
プールのUVスペクトルに基く計算により164mg
の蛋白質が得られていることが示された。これは
カラムに添加した量（再生反応の理論収量）の
101.9％に当る。このプールは、凍結し、乾燥し
た。 目的物質の単離は、ゲル過クロマトグラフイ
ーによつて行つた。乾燥した物質（秤量せず）を
1M酢酸20mlに溶かし、その澄明溶液をセフアデ
ツクスＧ−50スーパーフアインカラムに吸着させ
た。クロマトグラフイーの条件は次のとおりであ
つた。溶媒、1M酢酸；カラムサイズ、2.5×125
cm；温度、25℃；流速、〜0.82ml／分；分画容
積、〜4.92ml。 280nmの吸光度でモニターしながら1M酢酸で
一夜溶離した。分画番号に対して280nmの吸光度
を図表にすると２個の主ピークが得られた。第１
ピーク（小さい）はヒトプロインスリンの重合体
であり、第２ピークは単量体ヒトプロインスリン
であつた。後者は前方に肩を有していた。分画を
３個のプールに分けた。合併した分画の容積は次
のとおりであつた。 プール：分画46−67（218−325.5ml） プール：分画68−81（325.5−395.5ml） プール：分画82−100（395.5−490.3ml） これらの各プールの蛋白質をUVスペクトルで
検定した結果は次のとおりであつた。 プール：22.1mg プール：28.3mg プール：103.6mg この合計は154mgで、カラムへの添加量に対し
て94％の回収率であつた。この回収量のうち67.3
％が単量体ヒトプロインスリンであつた。３個の
プールはそれぞれ凍結乾燥した。 乾燥物質合計106.55mgがプールから得られ
た。本品は、アミノ酸分析およびポリアクリルア
ミドデイスクゲル電気泳動によりヒトプロインス
リンと同定された。本品はまたHPLCにおいて、
ウシプロインスリンとの対比上ヒトプロインスリ
ンの位置と考えられる位置に溶離された。さら
に、これをトリプシンおよびカルボキシペプチダ
ーゼＢで処理するとヒトプロインスリンが得られ
ることが証明された。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 式： で表わされるＳ−スルホネートを、そのスルホネ
   ート濃度が約10mg/ml以下で、PHが約７乃至約
   11.5の水性基質中において、−SSO₃ ^-基１個に対
   して約１個乃至約５個の−SH基を提供し得る量
   のメルカプタンと反応させて、 式： で表わされるインスリン前駆体を得ることを特徴
   とする製造方法： ［式中、Ｒは水素、化学的もしくは酵素的に開裂
   し得るアミノ酸残基または少くとも２個のアミノ
   酸残基からなり化学的もしくは酵素的に開裂し得
   るペプチド残基； Ｙは−Lys （Ｂ−29）−Ｚ （Ｂ−30）− （但し、ＺはAla、ThrまたはSer）；Ａ−１乃至
   Ａ−21はインスリンＡ鎖；Ｂ−１乃至Ｂ−30はイ
   ンスリンＢ鎖；そしてＸはＡ−１のアミノ基でイ
   ンスリンＡ鎖に結合し、Ｂ−29のε−アミノ基ま
   たはＢ−30のカルボキシル基でインスリンＢ鎖に
   結合しているペプチド基であつて、酵素的もしく
   は化学的に該Ａ鎖およびＢ鎖からそれらを切断す
   ることなく開裂され得る、式：−Arg−Arg−ま
   たは式：−Arg−X′−Arg−（但し、X′は少くと
   も１個のアミノ酸残基）で示されるペプチド基で
   ある。］ ２ ＸがＢ−30のカルボキシル基でインスリンＢ
   鎖に結合しているペプチド基である特許請求の範
   囲第１項記載の方法。 ３ 反応をPH約9.5乃至約10.5で行う特許請求の
   範囲第１項または第２項記載の方法。 ４ −SSO₃ ^-基１個に対して約２個乃至約４個の
   −SH基を提供する量のメルカプタンを存在させ
   る特許請求の範囲第１項記載の方法。 ５ 酸化剤の実質的不存在下に反応を行う特許請
   求の範囲第１項、第２項、第３項または第４項記
   載の方法。 ６ 水性基質中のＳ−スルホネートの濃度が約
   0.05mg/ml乃至約２mg/mlである特許請求の範囲第
   １項記載の方法。 ７ メルカプタンが２−メルカプトエタノールで
   ある特許請求の範囲第１項、第２項、第４項また
   は第５項記載の方法。 ８ 反応を約０℃乃至約37℃の温度で行う特許請
   求の範囲第１項記載の方法。 ９ 反応を約２℃乃至約８℃の温度で行う特許請
   求の範囲第８項記載の方法。 １０ 反応混液を室温付近で調製し、約２℃乃至
   約８℃の温度に冷却して反応を進行させる特許請
   求の範囲第１項または第８項記載の方法。 １１ 約0.005N乃至約0.5Nの濃度で緩衝剤を加
   えて反応混液のPHを維持する特許請求の範囲第１
   項または第３項記載の方法。 １２ 緩衝剤がグリシンである特許請求の範囲第
   １１項記載の方法。 １３ Ｓ−スルホネートのインスリンＡ鎖および
   インスリンＢ鎖がヒトインスリンの構造を有する
   特許請求の範囲第１項乃至第１２項記載の方法。 １４ Ｘがヒトプロインスリンの結合ペプチドで
   ある特許請求の範囲第１項、第２項または第１３
   項記載の方法。