JPH05271283A - インスリン同族体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】 過血糖症を処置するために有用である、改変
された生理学的及び薬力学的性質を有する化合物を提供
することを目的とする。 【構成】 ヒトインスリンＢ鎖の１０位にＡsp残基を含
有し、Ｂ鎖の先端Ｃ末端を有し、要すれば他の部位にも
修飾を有するヒトインスリンの同族体に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】本発明はヒトの医療分野に属するものであ
り、詳細には糖尿病の処置に関する。より詳細には、本
発明は、ヒトインスリン分子の同族体、その同族体を使
用する方法、及びそのインスリン同族体を含有する医薬
製剤に関する。真性糖尿病は体組織が炭水化物を正常の
速度で酸化できないことを特徴とする代謝性疾患であ
る。インスリンの欠乏は、糖尿病の疾病状態における最
も重要な因子である。最近７０年間は、制御された量の
インスリンを投与することにより糖尿病の患者が大いに
助けられている。１９８０年代の初期までは、糖尿病に
使用されるインスリンは動物の膵臓、一般にはウシ及び
ブタの膵臓から単離されたものであった。しかし、組換
えＤＮＡ技術の導入により、天然のヒトインスリン並び
に天然に存在するヒトインスリンの同族体及び天然には
存在しないヒトインスリンの同族体が大量に生産できる
ようになった。これらのインスリン同族体は、天然のヒ
トインスリンと比較すると別個の物理的及び化学的性質
を示すものである。

【０００２】天然のヒトインスリンはＢ鎖の１０位にヒ
スチジン残基を含有している。このヒスチジン残基をア
スパラギン酸残基と置換し、またＢ鎖の２９位及び３０
位のリジン及びスレオニン残基を除去すると、溶液中で
凝集するＡsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２９−３０)ヒトインス
リン同族体が得られる。意外にも、この同族体の２８位
におけるプロリン残基を除去してＡsp(Ｂ１０)，デス
(Ｂ２８−３０)ヒトインスリンとすると、安定であり、
かつ迅速に作用する、溶液中では主としてモノマーとし
て維持される分子が得られる。さらに、このＡsp(Ｂ１
０)，デス(２８−３０)ヒトインスリンのＢ鎖の２７位
におけるスレオニン残基を削除すると、これも安定であ
り、かつ迅速に作用し、溶液中ではモノマー性であるＡ
sp(Ｂ１０)，デス(２７−３０)ヒトインスリンが得られ
る。

【０００３】本発明は、天然のヒトインスリンＢ鎖の１
０位アミノ酸をヒスチジンからアスパラギン酸に変化さ
せ、また天然のヒトインスリンＢ鎖のカルボキシ末端か
らトリペプチド又はテトラペプチドを除去することによ
り修飾したヒトインスリンの同族体に関する。これらの
分子は天然のヒトインスリンＡ鎖の２１位及び天然のヒ
トインスリンＢ鎖の１位及び３位の両部位も修飾されて
いることもある。これらのインスリン同族体は天然のヒ
トインスリンの生物学的活性を保持している一方で、よ
り安定であり、かつダイマー化または自己会合して高分
子量体に変わりにくいので、比較的より迅速に活性が発
現する。さらに、本発明は、本発明の同族体の有効量
を、それを必要としている患者に投与することを特徴と
する過血糖症を処置する方法も開示し、特許請求するも
のである。また、１つまたはそれ以上の製薬的に許容さ
れ得る賦形剤と共に、本発明の同族体の有効量を含有し
てなる医薬組成物をも開示し、特許請求するものであ
る。

【０００４】本発明の目的に沿って、本明細書、特許請
求の範囲に使用している用語及び略語を以下のように定
義する。 Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ−天然ヒトイ
ンスリンのＢ鎖の１０位におけるヒスチジンがアスパラ
ギン酸残基に変換され、天然のヒトインスリンＢ鎖の２
８位から３０位までのアミノ酸残基が欠失されているヒ
トインスリン同族体。 Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ−天然ヒトイ
ンスリンのＢ鎖の１０位におけるヒスチジンがアスパラ
ギン酸残基に変換され、天然のヒトインスリンＢ鎖の２
７位から３０位までのアミノ酸残基が欠失されているヒ
トインスリン同族体。 ＢＨＩ−生合成ヒトインスリン。 架橋−システイン残基間のジスルフィド結合の生成。
適切に架橋した天然のヒトインスリン又はインスリン同
族体は３つのジスルフィド橋を含有している。第１のジ
スルフィド橋はＡ鎖の６位及び１１位のシステイン残基
間に見いだされる。第２のジスルフィド橋は、Ａ鎖の７
位のシステインをＢ鎖の７位のシステインと結び付けて
いる。第３のジスルフィド橋は、Ａ鎖の２０位のシステ
インをＢ鎖の１９位のシステインと結び付けている。

【０００５】 配列番号１−配列： Ｇly Ｉle Ｖal Ｇlu Ｇln Ｃys Ｃys Ｔhr Ｓer Ｉle Ｃys Ｓer Ｌeu Ｔyr １ ５ １０ Ｇln Ｌeu Ｇlu Ａsn Ｔyr Ｃys Ｘaa １５ ２０ [式中、ＸaaはＡsn、Ａsp、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又
はＳerである]を有するヒトインスリンＡ鎖の同族体で
ある、配列表に記載している第１の配列。 配列番号２−配列： Ｘaa Ｖal Ｘaa Ｇln Ｈis Ｌeu Ｃys Ｇly Ｓer Ａsp Ｌeu Ｖal Ｇlu Ａla １ ５ １０ Ｌeu Ｔyr Ｌeu Ｖal Ｃys Ｇly Ｇlu Ａrg Ｇly Ｐhe Ｐhe Ｔyr Ｔhr １５ ２０ ２５ [式中、１位のＸaaはＰhe又はＡspであり、３位のＸaa
はＡsn又はＡspである]を有するヒトインスリンＢ鎖の
同族体である、配列表に記載している第２の配列。本明
細書で使用しているすべてのアミノ酸の略語は、３７
Ｃ.Ｆ.Ｒ. §１.８２２(ｂ)(２)(１９９０)に基づい
て、米国特許及び商標局にて許諾されているものであ
る。

【０００６】本発明は、式： 配列番号２： Ｘaa Ｖal Ｘaa Ｇln Ｈis Ｌeu Ｃys Ｇly Ｓer Ａsp Ｌeu Ｖal Ｇlu Ａla １ ５ １０ Ｌeu Ｔyr Ｌeu Ｖal Ｃys Ｇly Ｇlu Ａrg Ｇly Ｐhe Ｐhe Ｔyr Ｔhr 15 ２０ ２５ と適切に架橋している配列番号１： Ｇly Ｉle Ｖal Ｇlu Ｇln Ｃys Ｃys Ｔhr Ｓer Ｉle Ｃys Ｓer Ｌeu Ｔyr １ ５ １０ Ｇln Ｌeu Ｇlu Ａsn Ｔyr Ｃys Ｘaa １５ ２０ [式中、配列番号１(インスリンＡ鎖)の２１位における
ＸaaはＡsn、Ａsp、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerで
あり、配列番号２(インスリンＢ鎖)の１位におけるＸaa
はＰhe又はＡspであり、配列番号２の３位におけるＸaa
はＡsn又はＡspである]で示されるインスリン同族体又
はその製薬的に許容され得る塩に関する。配列番号１の
２１位におけるＸaaがＧly、Ａla、Ｓer又はＡsnである
ものが好ましい。アスパラギンがこの２１位における最
も好ましいアミノ酸である。配列番号２の１位における
好ましいアミノ酸はＰheであり、配列番号２の３位にお
いて最も好ましい残基はＡsnである。本発明の特に好ま
しいインスリン同族体は、配列番号１の２１位における
ＸaaがＡsnであり、配列番号２の１位におけるＸaaがＰ
heであり、配列番号２の３位におけるＸaaがＡsnである
ものである。当業者に周知の標準的な生化学の用語を用
いれば、この特に好ましい同族体はＡsp(Ｂ１０)，デス
(Ｂ２８−３０)ヒトインスリンとなる。

【０００７】本発明はまた、式： 配列番号２のアミノ酸１から２６位と適切に架橋してい
る配列番号１ [式中、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、配列番号
２の１位におけるＸaaはＰhe又はＡspであり、配列番号
２の３位におけるＸaaはＡsn又はＡspである]で示され
るインスリン同族体又はその製薬的に許容され得る塩に
関する。配列番号１の２１位におけるＸaaがＧly、Ａl
a、Ｓer又はＡsnであるものが好ましく、Ａsnが最も好
ましい。配列番号２の１位における好ましいアミノ酸は
Ｐheであり、配列番号２の３位において最も好ましい残
基はＡsnである。本発明の特に好ましいインスリン同族
体は、配列番号１の２１位におけるＸaaがＡsnであり、
配列番号２の１位におけるＸaaがＰheであり、配列番号
２の３位におけるＸaaがＡsnであり、配列番号２の２６
残基が末端であるものである。当業者に周知の標準的な
生化学の用語を用いれば、この特に好ましい同族体はＡ
sp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ヒトインスリンとな
る。

【０００８】別の本発明の同族体は、式： 配列番号２のアミノ酸２から２７位と適切に架橋してい
る配列番号１ [式中、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、配列番号
２の３位におけるＸaaはＡsn又はＡspである]で示され
るインスリン同族体又はその製薬的に許容され得る塩で
ある。配列番号１の２１位におけるＸaaがＡsnであり、
配列番号２の３位におけるＸaaもＡsnであるものが好ま
しい。この好ましい同族体は、Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ
１)，デス(Ｂ２８−３０)ヒトインスリンとして当業者
に知られる。さらに別の本発明の同族体は、式： 配列番号２のアミノ酸２から２６位と適切に架橋してい
る配列番号１ [式中、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、配列番号
２の３位におけるＸaaはＡsn又はＡspである]で示され
るインスリン同族体又はその製薬的に許容され得る塩で
ある。配列番号１の２１位におけるＸaaがＡsnであり、
配列番号２の３位におけるＸaaもＡsnであるものが好ま
しい。この好ましい同族体は、Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ
１)，デス(Ｂ２７−３０)ヒトインスリンとして当業者
に知られる。

【０００９】本発明のインスリン同族体は、亜鉛を含有
する溶液又は亜鉛を含有しない溶液中のいずれかで、ダ
イマー化あるいはそうでなくても自己会合して高分子量
体に変わる可能性が減じられている。本発明の同族体は
溶液中では一般にモノマーであるので、投与すると迅速
に活性を発現する。既述のように、本発明は本発明イン
スリン同族体の製薬的に許容され得る塩を包含してい
る。このような塩の好ましいものは、亜鉛、ナトリウ
ム、カリウム、マグネシウム、カルシウムの塩、又はこ
れらの塩の組合わせ物である。本発明のインスリン同族
体は、伝統的な方法(溶液法)、固相法、半合成法及び比
較的最近利用可能になった組換えＤＮＡ法などの認識さ
れている種々のペプチド合成法により調製することがで
きる。固相法では、アミノ酸配列は、不溶性の樹脂に固
定した最初のＣ-末端アミノ酸から順次構築される。こ
の固相法の手順は、スチュアート(J.Stewart)らのSolid
-Phase Peptide Synthesis，フリーマン・アンド・C
o.，サンフランシスコ,1969に記載されている。

【００１０】一般に固相法では、所望のペプチドのＣ末
端アミノ酸残基に相当するアミノ酸を不溶性樹脂の支持
体に引っ掛け(アンカーし)、次ぎに樹脂に固定化したこ
のＣ末端アミノ酸から開始してペプチド鎖を形成させ
る。個々のアミノ酸を、所望のアミノ酸配列になるまで
順次導入する。あるいは、小さなペプチドフラグメント
を製造し、所望の順序でそのペプチド鎖を導入すること
もできる。ペプチド鎖は、合成時には終始固定されたま
まであり、鎖形成が完了したなら、得られたペプチドを
樹脂から切断する。ペプチド鎖をポリスチレン樹脂に結
合するには、Ｃ末端部のカルボキシ基とその樹脂マトリ
ックスに存在する結合部位としての特異的メチレン基と
の間に、エステル結合を形成させることによって行う。
アミノ酸は、ペプチド結合を生成させるための当業界周
知の方法によって結合(カップリング)される。１つの方
法は、アミノ酸を、そのカルボキシ基がペプチドフラグ
メントの遊離Ｎ末端アミノ基とより反応し易くなってい
る誘導体へと変換することである。例えば、保護アミノ
酸をクロロギ酸エチル、クロロギ酸フェニル、クロロギ
酸sec-ブチル又はクロロギ酸イソブチルと反応させ、ア
ミノ酸を混合無水物に変換することができる。あるい
は、アミノ酸は、２，４，５−トリクロロフェニルエス
テル、ペンタクロロフェニルエステル、ｐ−ニトロフェ
ニルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステ
ル、又は１−ヒドロキシベンゾトリアゾールから生成さ
れるエステルなどの活性エステルに変換することができ
る。

【００１１】もう１つのカップリング法では、Ｎ，Ｎ'
−ジシクロヘキシルカルボジイミド(ＤＣＣ)又はＮ，
Ｎ'−ジイソプロピルカルボジイミド(ＤＩＣ)などの適
当なカップリング剤を用いる。他の適当なカップリング
剤は当業者に明らかであろう。ショーダー(Schroder)お
よびルーク(Lubke)のThe Peptides、アカデミック・プ
レス、1965年第III章を参照のこと。カップリング反応
時には、ペプチド合成に使用する各アミノ酸の反応性α
−アミノ基に関連する副反応を防ぐため、その官能基を
保護しなければならないことを認識すべきである。さら
に認識すべきことは、特定のアミノ酸は反応性の側鎖官
能基（例えば、スルフヒドリル、ε−アミノ、β−およ
びγ−カルボキシ、イミダゾール、グアニド及びヒドロ
キシル）を含有しており、このような官能基も最初の及
び以後のカップリング工程時に保護しなければならない
ことである。適当な保護基は当業者に既知である。例え
ば、マックオミー(McOmie)編のProtective Groups In O
rganic Chemistry、プレノーン・プレス(Plenum Pres
s)、ニューヨーク、1973、及び米国特許第４，６１７，
１４９号を参照のこと。

【００１２】具体的に保護基を選択するに当たっては、
特定の条件を守らなければならない。α−アミノ保護基
は、(１) カップリング反応に用いられる条件下でα−
アミノ基を不活性にしなければならず、(２) 側鎖の保
護基は除去せずに、かつペプチドフラグメントの構造を
変化させない条件下で、カップリング反応後に容易に除
去できなければならず、そして(３) カップリング反応
直前の活性化の際にラセミ化の起こる可能性が排除され
ていなければならない。側鎖保護基は、(１)カップリン
グ反応に用いられる条件下で側鎖官能基を不活性にして
おかなければならず、(２) α−アミノ保護基を除去す
るときに用いられる条件下で安定でなければならず、そ
して(３) ペプチド鎖の構造を変化させない反応条件下
で、所望のアミノ酸配列の形成完了時に容易に除去でき
なければならない。ペプチド合成に有用であると知られ
ている種々の保護基は、それらを除去するために使用さ
れる試剤に対する反応性が種々異なっていることは、当
業者にとって明らかであろう。例えば、トリフェニルメ
チル及び２−（ｐ−ビフェニルイル）イソプロピルオキ
シカルボニルなどの特定の保護基は非常に不安定であ
り、温和な酸条件下で開裂させることができる。他の保
護基、例えばt-ブチルオキシカルボニル、t-アミルオキ
シカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル及びｐ−
メトキシベンジルオキシカルボニルなどはそれほど不安
定でなく、これらを除去するには、トリフルオロ酢酸、
塩酸、又は酢酸中のホウ素トリフルオライドなどの中程
度に強い酸が必要である。さらに、ベンジルオキシカル
ボニル、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ−ニトロベ
ンジルオキシカルボニル、シクロアルキルオキシカルボ
ニル、及びイソプロピルオキシカルボニルなどのその他
の保護基もそれほど不安定でなく、それらを除去するに
は、フッ化水素、臭化水素又はトリフルオロ酢酸中のト
リフルオロ酢酸ホウ素などのより強い酸が必要である。

【００１３】所望のペプチド配列が生成されたなら、得
られた保護ペプチドを樹脂支持体から切断しなければな
らず、またすべての保護基を除去しなければならない。
この切断反応と保護基の除去は、同時に、又は段階的に
行うことができる。樹脂支持体がクロロメチル化ポリス
チレン樹脂である場合、樹脂にペプチドをアンカーして
いる結合は、Ｃ末端部の遊離カルボキシ基と樹脂マトリ
ックスに存在する多くのクロロメチル基のなかの１つと
の間に形成されるエステル結合である。このアンカー結
合は、エステル結合を分解でき、そして樹脂マトリック
スを透過できることが知られている試剤によって切断す
ることができることをは理解されよう。１つの特に簡便
な方法は、液体無水フッ化水素で処理することによるも
のである。この試剤はペプチドを樹脂から切断するばか
りでなく、すべての保護基を除去することもできる。従
って、この試剤を使用すれば、完全に脱保護されたペプ
チドを直接的に得ることができる。保護基を除去するこ
となく、ペプチドを切断することを望む場合は、保護ペ
プチド−樹脂にメタノリシスを施せば、Ｃ末端カルボキ
シ基がメチル化された保護ペプチドを得ることができ
る。次に、得られたメチルエステル体を温和なアルカリ
条件下で加水分解すれば、遊離のＣ末端カルボキシルを
得ることができる。次いで、ペプチド鎖の保護基を、液
体フッ化水素などの強酸で処理して除去すればよい。メ
タノリシスに特に有用な方法は、保護ペプチド−樹脂を
クラウンエーテルの存在下にメタノール及びシアン化カ
リウムで処理する、モア(G.Moore)らのPeptides,Proc.5
th Amer.Pept.Symp.，グッドマン(M.Goodman)及びメイ
ンホッファー(J.Meienhofer)編，ジョーン・ウィレイ，
ニューヨーク,1977,518-521頁の方法である。

【００１４】保護ペプチドを樹脂から切断するためのも
う１つの方法は、アンモノリシスに、又はヒドラジンで
処理することに、基づくものである。要すれば、得られ
たＣ末端アミド又はヒドラジドを加水分解して遊離のＣ
末端カルボキシルにし、常法により保護基を除去するこ
とができる。さらに、Ｎ末端α−アミノ基に存在する保
護基は、樹脂支持体から保護ペプチドを切断する前、又
はそれと同時に優先的に除去できることは理解されるで
あろう。本発明のインスリン同族体のＡ及びＢ鎖は組換
えＤＮＡ法によっても調製することができる。これらの
調製法では、そのような合成にとって今日常法である手
法により、Ａ又はＢ鎖の所望のペプチドをコードしてい
るヌクレオチド配列を調製する。これらの方法は、一般
には、所望のコード化配列のフラグメントとその相補配
列とをコードしているオリゴヌクレオチドを調製するこ
とを含む。これらのオリゴヌクレオチドは、コード化配
列の１つのフラグメントが相補配列の２つのフラグメン
トと重複(オーバーラップ)するように、またその逆とな
るように設計する。これらオリゴヌクレオチドを対合し
て結合させ、最終的に所望の遺伝子配列を得る。

【００１５】得られた配列を、クローニングベクターに
おける、それがコードしているペプチド産物が発現でき
る位置に挿入する。プロインスリン及びプロインスリン
同族体を発現できるプラスミドの構築は、１９９０年８
月２２日に公開されたチャンス(Chance)らの欧州特許公
開第０ ３８３ ４７２号に記載されている。本発明イン
スリン同族体のＡ及びＢ鎖は組換えＤＮＡ法により、さ
らにプロインスリン様前駆体分子を介して調製すること
もできる。フランク(Frank)らの Peptides：Synthesis-
Structure-Function, Proc.Seventh Am.Pept.Symp.,リ
ッチ(D.Rich)及びグロス(E.Gross)編(1981)を参照のこ
と。Ａ鎖及びＢ鎖のそれぞれを組み合わせる方法は、そ
れらがどのようにして製造されたかに関係なく、チャン
ス(Chance)らのPeptides: Synthesis,Structure and Fu
nction: Proc.of 7th American Peptide Symposium(198
1)の方法によって行うことができる。以下に実施例を挙
げて本発明をさらに詳細に説明するが、これらを本発明
の限定と解してはならない。

【００１６】実施例１ Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ヒトインスリン Ａ．酵素的半合成 標題のインスリン同族体を、Ａsp(Ｂ１０)デスオクタペ
プチド(Ｂ２３−３０)ヒトインスリン及び合成テトラペ
プチド：Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｔyrを使用し、酵素的半合
成(逆タンパク質分解)により調製した。このテトラペプ
チドは固相ペプチド合成により調製し、Ａsp(Ｂ１０)
デス−オクタペプチドヒトインスリンは、トリプシン加
水分解反応によって配列２３−６５を除去することによ
りＡsp(Ｂ１０)ヒトプロインスリンから誘導した。Ａsp
(Ｂ１０)プロインスリン同族体は、１９９０年８月２２
日公開のChanceらの欧州特許公開第０ ３８３ ４７２号
の教示に実質的に従って調製した。このＥＰＯ ０ ３８
３ ４７２の３５頁には、Ｍet−Ｔyr−[Ａsp(Ｂ１)，Ｌ
ys(Ｂ２８)，Ｐro(Ｂ２９)ＨＰＩ]をコードしているプ
ラスミドｐＲＢ１７６を構築するために使用したヌクレ
オチドリンカー配列(ii)が開示されている。この発明の
出発物質を製造するために使用されるＡsp(Ｂ１０)プラ
スミドは、配列(ii)中のＡspをコードする配列ＣＧＡＣ
がＰheをコードする配列ＴＴＴＴと置き換わっており、
かつＨisをコードする配列ＣＴＡが配列ＧＡＣに置き換
わっている以外は配列(ii)に類似しているリンカーを含
有しており、Ａsp(Ｂ１０)，Ｌys(Ｂ２８)，Ｐro(Ｂ２
９)ヒトプロインスリンをコードするプラスミドを構成
している。遺伝子暗号の重複性(redundancy)及び当業者
の知識により、Ａsp(Ｂ１０)ヒトプロインスリンをコー
ドするプラスミドを構築するための多くの置換が可能で
ある。

【００１７】Ａsp(Ｂ１０) デス−オクタペプチドヒト
インスリンは以下のようにして調製した： pＨ２．５
のグリシン緩衝液中、折りたたまれたＡsp(Ｂ１０)ヒト
プロインスリン７００ml (９．８ｇ)に水酸化アンモニ
ウム２５ml を撹拌下に加えてpＨ１０．２に調節した。
次いで、濃塩酸２０ml を加えてそのpＨを素早く９．１
０に調節した。この溶液に塩化カルシウムの水溶液(１
４．７mｇ/ml)７ml を加え、次にブタトリプシンの１４
mｇ／ml 水溶液７０ml を加え、酵素：基質の重量比を
約１：１０とした。このトリプシン加水分解反応物を十
分に混合し、次いで２５℃で１７時間保存し、その時点
で氷酢酸１６０ml を加えて最終pＨ３．０９とし、反応
を停止させた。次いでアセトニトリル１０５ml を加え
た。

【００１８】Ａsp(Ｂ１０) デス−オクタペプチドヒト
インスリンを単離して精製するため、得られたトリプシ
ン消化溶液を５．５×３０cm Ｃ−１８Ｖydac ＨＰＬＣ
カラム(２５℃)にポンプ注入した。このクロマトグラフ
ィーを行うため、２つの緩衝液を調製した： 緩衝液Ａ
はアセトニトリル１０部及び０．５％ＴＦＡ(トリフル
オロ酢酸)溶液９０部を含有しており、緩衝液Ｂはアセ
トニトリル５０部及び０．５％ＴＦＡ５０部を含有して
いる。緩衝液Ａで手短に洗浄した後、０−２０％緩衝液
Ｂからの直線勾配(直線グラジエント)を２．４ml／分で
１６時間ポンプ注入し、次いで２０−７０％緩衝液Ｂの
直線グラジエントを８ml／分で８時間ポンプ注入した。
Ａsp(Ｂ１０) デス−オクタペプチドヒトインスリンを
含有する主要なピークがおよそ５０％の緩衝液Ｂレベル
で溶出された。分析用逆相ＨＰＬＣに基づいてこの物質
を含有する画分をまとめ、凍結乾燥した。最終的に回収
された重量は５．５ｇであり、これはＨＰＬＣ純度９３
％であった。アミノ酸分析、質量スペクトル及びＮＨ₂
−末端分析により、このＡsp(Ｂ１０) デス−オクタペ
プチド(Ｂ２３−３０)ヒトインスリンの信頼度を確認し
た。

【００１９】標題のインスリン同族体を調製するため、
Ａsp(Ｂ１０) デス−オクタペプチドヒトインスリン５
４５mｇ及び合成テトラペプチドＧly−Ｐhe−Ｐhe−Ｔy
r３００mｇを、ジメチルスルホキシド１部、１，４−ブ
タンジオール２部、及び０．３５Ｍ トリス緩衝液１部
を含有する溶液(３７℃、pＨは調整せず)１５ml 中で混
合した。ブタトリプシン(８５mｇ)を加えた。得られた
溶液を十分に混合し、３７℃で３６０分時折撹拌した。
冷アセトンによりタンパク質を沈殿させ、ジエチルエー
テルで洗浄し、窒素気流で乾燥し、６Ｍ 塩酸グアニジ
ン(０．０１Ｎ塩酸)７５ml 中に最終的に溶解した。こ
の清澄な試料溶液をセファデックスＧ−５０(超微細)の
５×２００cm のカラム上でゲル濾過し、４℃において
１Ｍ 酢酸で溶出した。溶出液を逆相ＨＰＬＣにより２
７６nmにおいてモニターした。標題の生成物を含有する
画分をまとめ(〜２７５ml)、水で５００ml にまで希釈
し、２１×２５０mm Ｃ−８ Ｚorbaxカラムにポンプ注
入し、０．１Ｍ リン酸ナトリウム中のアセトニトリル
勾配、pＨ２緩衝液中に生成物を溶出させた。

【００２０】分析用ＨＰＬＣにより決定した、標題のイ
ンスリン同族体を含有する適当な画分をまとめ、水で４
倍に希釈し、２５×３００mm Ｃ−１８ Ｖydacカラムに
ポンプ注入した。脱塩したタンパク質を０．５％トリフ
ルオロ酢酸中、アセトニトリル勾配で溶出させた。精製
されたインスリン同族体を含有する画分をまとめ、凍結
乾燥し、物質２２mｇを得た。高速原子衝撃質量分析法
(ＦＡＢ/ＭＳ)及びアミノ酸分析により、その構造を確
認した。ＦＡＢ/ＭＳの結果は分子量５３５８．３であ
った(理論値：５３５８．０)。アミノ酸組成はモル単位
としてアスパラギン酸を基礎とすれば以下のようであっ
た(理論アミノ酸比を括弧内に示す)： Ａsp、４．００
(４)；Ｔhr、１．００(１)；Ｓer、２．５０(３)；Ｇl
u、６．９０(７)；Ｇly、３．９２(４)；Ａla、１．０
１(１)；１／２Ｃys、４．９２(６)；Ｖal、３．５５
(４)；Ｉle、１．７３(２)；Ｌeu、６．０３(６)；Ｔy
r、３．７０(４)；Ｐhe、２．８６(３)；Ｈis、１．３
１(１)；Ａrg、１．００(１)。

【００２１】Ｂ．鎖結合 １．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ヒトインスリン
Ｂ鎖の調製 アプライド・バイオシステムズ[Applied Biosystems]４
３０Ａペプチド合成装置(ソフトウェア改訂版１．４を
含む)を使用し、粗製のペプチジル樹脂を調製した。出
発固相樹脂(t-ＢＯＣ-Ｔhr(Ｂzl)ＯＣＨ₂ Ｐam樹脂)
０．５ミリモル(mＭol)を使用した(０．６１mＭol／ｇ
×０．９１ｇ)。使用したすべてのアミノ酸はＢＯＣ保
護し、グルタミン酸、アスパラギン酸及びヒスチジン以
外はすべて、購入したものを直接使用した(即ち、アプ
ライド・バイオシステムズＩnc.から市販されているカ
ートリッジ中、各々のカートリッジは保護アミノ酸を約
２mＭol含有している)。グルタミン酸、アスパラギン酸
及びヒスチジンは市販元から入手し、それらを各カート
リッジに所望の保護アミノ酸約２mＭolが含有されるよ
うカートリッジに移した。粗製のペプチジル樹脂を室温
にて減圧下に５時間乾燥し、その重量を出発重量と比較
することで、理論的な重量増加を確実にした。試料を少
量採取し、アミノ酸分析にかけ、所望のアミノ酸が正し
い比率で付加されていることを確認した。

【００２２】ペプチジル樹脂１部に対してＨＦ(５％v/v
ｐ−チオクレゾール及び５％v/vｍ−クレゾールを含
有)１０部(ｖ／ｗ)の溶液中、０℃で約１時間撹拌する
ことにより、ペプチドをペプチジル樹脂から切断し、側
鎖を脱保護した。減圧下にＨＦをほとんど除去した後、
得られたペプチドをエチルエーテルで沈殿させた。エチ
ルエーテルで数回すすいだ後、吸引濾過し、次いでペプ
チドを、０.１Ｍ トリス、３５mｇ/ml Ｎa₂ＳＯ₃及び２
５mｇ/ml Ｎa₂Ｓ₄Ｏ₆を含有する８Ｍ 塩酸グアニジン(p
Ｈ１１)約２００ml 中に溶解した。得られた溶液のｐＨ
を５Ｎ ＮaＯＨで８．８に調節し、室温にて３時間激し
く撹拌した。得られたＳ−スルホン化ペプチドの溶液
を、室温においてセファデックスＧ−２５(粗い)の５×
２１５cmカラムに入れた。その試料を５０mＭ ＮＨ₄Ｈ
ＣＯ₃を使用して室温にて２１ml／分で溶出した。流出
液を２７６nmでモニターし、所望の溶出液１０００ml
を採取し、凍結し、凍結乾燥した。

【００２３】２．Ａsp(Ｂ１０) デス(Ｂ２７−３０)ヒ
トインスリンＢ鎖とヒトインスリンＡ鎖との結合 ＥＰＯ ０ ３８３，４７２[前掲]に記載のようにして組
換え的に製造したＡ鎖を使用し、チャンス(Chance)らの
操作[前掲]によって、Ａ鎖及びＢ鎖を結合させた。組換
えＤＮＡ誘導化Ａ鎖Ｓ−スルホネート２．２７ｇ及び合
成Ａsp(Ｂ１０)デス(２７−３０)Ｂ鎖Ｓ−スルホネート
５１１mｇをフラスコ中で混合し、環境温度下、０．１
Ｍ グリシン緩衝液２４５ml 中に溶解した。得られた溶
液のpＨを５Ｎ 水酸化ナトリウムにより１０．５に調節
し、次いで４℃に冷却した。環境温度下、０．１Ｍ グ
リシン緩衝液中、濃度１５．５mｇ/ml のジチオトレイ
トール（ＤＴＴ）溶液を調製し、５Ｎ 水酸化ナトリウ
ムでそのｐＨを１０．５に調節し、次いで４℃に冷却し
た。Ａ鎖及びＢ鎖Ｓ−スルホネートの混合溶液に素早く
ＤＴＴ溶液１８．５ml を加えた（ＳＨ／ＳＳＯ₃ ^-＝
１．０）。５００ml 容量エーレンマイヤーフラスコ
中、４℃で２６時間その反応混合物を撹拌した。リン酸
(３．７ml)を加え、その反応物のpＨを２．９にまで低
下させた。

【００２４】得られた沈殿混合物をmilli-Ｑ水及びアセ
トニトリルで希釈し、逆相ＨＰＬＣにより精製した
[０．１Ｍ ＮaＨ₂ＰＯ₄，pＨ２．３中でアセトニトリル
を増加させる直線勾配を使用し、流速２．６ml／分、室
温にて５０×３００mm Ｖydac Ｃ−１８カラムを溶出す
る]。２８０nmで溶出液をモニターする。分析用ＨＰＬ
Ｃにより、選択した画分を検定する。所望の画分をまと
め(４０５ml)、milli-Ｑ水４００ml で希釈し、Ｎa₂Ｓ₄
Ｏ₆(１．２ｇ)と混合し、５Ｎ 水酸化ナトリウムでpＨ
７に調節し、逆相ＨＰＬＣ［２１×２５０mm ＤuＰont
Ｚorbax Ｃ−８カラムを使用し、０.１Ｍ (ＮＨ₄)₂ＨＰ
Ｏ₄中、アセトニトリルを増量する直線勾配により、室
温、２．０ml／分で溶出する］によってさらに精製し
た。溶出液を２８０nmでモニターした。分析用ＨＰＬＣ
によって、選択した画分を検定した。所望の画分をまと
め、Ｈ₃ＰＯ₄でpＨ２．３に調節し、Ｖydac Ｃ−１８
ＨＰＬＣカラム(２１×２５０mm)に入れ、０．５％水性
ＴＦＡ中、アセトニトリルを増量する直線勾配で溶出し
た。溶出液を２８０nmでモニターした。選択した画分を
分析用ＨＰＬＣによって検定した。適当な画分をまと
め、凍結乾燥し、インスリン同族体１３５mｇを得た。
これは逆相ＨＰＬＣによれば純度９１％以上であった。
高速原子衝撃質量分析法(ＦＡＢ/ＭＳ)及びアミノ酸分
析により、その構造を確認した。ＦＡＢ/ＭＳの結果は
分子量５３５８．５であった(理論値：５３５８．０)。
アミノ酸組成はモル単位としてアスパラギン酸を基礎と
すれば以下のようであった(理論アミノ酸比を括弧内に
示す)： Ａsp、４．００(４)；Ｔhr、０．９８(１)；
Ｓer、２．７２(３)；Ｇlu、７．１４(７)；Ｇly、３．
９３(４)；Ａla、０．９８(１)；１／２Ｃys、５．４４
(６)；Ｖal、３．４４(４)；Ｉle、１．５１(２)；Ｌe
u、６．１４(６)；Ｔyr、３．８６(４)；Ｐhe、２．８
８(３)；Ｈis、１．０９(１)；Ａrg、０．９７(１)。

【００２５】実施例２ Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ヒトインスリン 標題のインスリン同族体を、Ａsp(Ｂ１０)デス−オクタ
ペプチド(Ｂ２３−３０)ヒトインスリン及び合成ペンタ
ペプチド：Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−Ｔyr−Ｔhrを使用し、実
施例１に従って酵素的半合成(逆タンパク質分解)により
調製した。このペンタペプチドは固相ペプチド合成によ
り調製し、Ａsp(Ｂ１０) デス−オクタペプチドヒトイ
ンスリンは、実施例１に記載のようにトリプシン加水分
解反応によって配列２３−６５を除去することによりＡ
sp(Ｂ１０)ヒトプロインスリンから誘導した。

【００２６】標題のインスリン同族体を調製するため、
Ａsp(Ｂ１０) デス−オクタペプチドヒトインスリン７
６５mｇ及び合成ペンタペプチド：Ｇly−Ｐhe−Ｐhe−
Ｔyr−Ｔhr５００mｇを、ジメチルスルホキシド１部、
１，４−ブタンジオール２部及び０．３５Ｍ トリス緩
衝液１部を含有する溶液(３７℃、pＨは調整せず)２１m
l 中で混合した。ブタトリプシン(１２７mｇ)を加え
た。得られた溶液を十分に混合し、３７℃で３６０分時
折撹拌した。冷アセトンによりタンパク質を沈殿させ、
ジエチルエーテルで洗浄し、窒素気流で乾燥し、６Ｍ
塩酸グアニジン(０．０１Ｎ 塩酸を用いて調製)５０ml
中に最終的に溶解した。この清澄な試料溶液をセファデ
ックスＧ−５０(超微細)の５×２００cm のカラムでゲ
ル濾過し、４℃において１Ｍ 酢酸で溶出した。溶出液
を逆相ＨＰＬＣにより２７６nmにおいてモニターした。
標題の生成物を含有する画分をまとめ(〜２５０ml)、水
で５００ml にまで希釈し、２１×２５０mm Ｃ−８ Ｚo
rbaxカラムにポンプ注入し、０．１Ｍ リン酸ナトリウ
ム、pＨ２緩衝液中のアセトニトリルの勾配中に生成物
を溶出させた。分析用ＨＰＬＣにより決定した、標題の
インスリン同族体を含有する適当な画分をまとめ、水で
５倍に希釈し(４００ml)、２５×３００mm Ｃ−１８ Ｖ
ydacカラムにポンプ注入した。脱塩したタンパク質を
０．５％トリフルオロ酢酸中、アセトニトリル勾配で溶
出させた。精製されたインスリン同族体を含有する画分
をまとめ、凍結乾燥し、物質４７mｇを得た。高速原子
衝撃質量分析法(ＦＡＢ/ＭＳ)及びアミノ酸分析によ
り、その構造を確認した。ＦＡＢ/ＭＳの結果は分子量
５４５９．２であった(理論値：５４５９．１)。アミノ
酸組成はモル単位としてアスパラギン酸を基礎とすれば
以下のようであった(理論アミノ酸比を括弧内に示す)：
Ａsp、４．００(４)；Ｔhr、１．８６(２)；Ｓer、
２．５６(３)；Ｇlu、７．０３(７)；Ｇly、４．０１
(４)；Ａla、１．０７(１)；１／２Ｃys、５．３８
(６)；Ｖal、３．７６(４)；Ｉle、１．８５(２)；Ｌe
u、６．１４(６)；Ｔyr、３．８０(４)；Ｐhe、２．９
４(３)；Ｈis、１．１５(１)；Ａrg、０．９６(１)。

【００２７】実施例３ 溶液安定性 インスリン又はインスリン同族体の試料を０．１Ｍ リ
ン酸ナトリウムpＨ７．４(特に断らない限り、この条件
である)、０．２５％クレゾール及び１．６％グリセリ
ン中、約３．５mｇ/ml の濃度で５０℃においてインキ
ュベートすることにより、分解分析を行った。種々の時
間に、インキュベート混合物の一部を１０倍過剰の６Ｍ
塩酸グアニジン、０．１Ｍ リン酸ナトリウム、pＨ
３．０、２３℃を用いてクエンチし、ＨＰＬＣサイズ排
除法により分析した。ＨＰＬＣのサイズ排除比率を変え
ることなく、このクエンチしたインキュベート反応物を
２週間まで５℃で保存した。ＨＰＬＣサイズ排除分析
は、６Ｍ ＧdnＨＣl、０．１Ｍリン酸ナトリウムを溶出
溶液として使用するＤuＰont Ｚorbax ＧＦ−２５０カ
ラム(５０μl 注入)を用いて行った[流速＝１ml／分、
２３℃、及び２７８nmにおいて検出]。モノマーのピー
ク領域の対数と時間との傾きから、モノマーの分解速度
を決定し、分解の半減期(ｔ１/２)をｔ１/２＝０．６９
３÷速度に従って決定した。得られた結果を以下の表１
に示す。

【００２８】

【表１】 溶液安定性 ｔ１/２モノマー (50℃(+/-10%)における日数) 分 子 pＨ７．４ pＨ６．１ ＢＨＩ＋亜鉛 ９４ Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ ８９ デス(Ｂ２９−３０)ＨＩ ４９ Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ３０)ＨＩ ４９ デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ ４６ Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ３７ １９３ Ａsp(Ｂ１０)ＨＩ ３３ デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ３２ デス(Ｂ３０)ＨＩ ２４ ＢＨＩ(亜鉛不含) １２ デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ ＩＮ^a) Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ ＩＮ^a) ａ）化合物は実験の間中、溶解性を保持していないようであった。

【００２９】実施例４ 平 衡 変 性 ブレンス(Brems)らのBiochemistry 29:9289-9293(1990)
の教示に従って、平衡変性実験を行った。約１０mｇ/ml
インスリン又は同族体、２０mＭ ＨＥＰＥＳ，pＨ７．
５、２０％(ｖ／ｖ)エタノール及び１mＭ ＥＤＴＡ、並
びにＧdnＨＣlを加えたもの又は加えないもののタンパ
ク質ストック溶液を調製した。約７ＭGdnＨＣl 、２０m
Ｍ Ｈepes，pＨ７．５、２０％(ｖ／ｖ)エタノール及び
１mＭＥＤＴＡの変性剤ストックを調製した。タンパク
質及び変性剤ストック溶液並びに２０mＭ ＨＥＰＥＳ，
pＨ７．５、２０％(ｖ／ｖ)エタノール及び１mＭ ＥＤ
ＴＡの溶液を種々の比率で混合して変性試料を調製し、
所望の変性剤濃度とした。Ａbbe−３Ｌ屈折計を用いる
屈折率測定によりＧdnＨＣl 濃度を測定した。変性試料
を調製したなら、最後にタンパク質ストック溶液を加
え、次いで全試料を渦巻かせて穏やかに混合した。Ｇdn
ＨＣl は、２０％エタノール水溶液中において最大で約
７Ｍ の溶解性を示すので、エタノールを含有しない約
８Ｍ のストックＧdＮＨＣl 溶液から７Ｍ 以上の試料
を作成した。Ａviv ６２Ｄ分光装置を使用し、円二色性
測定を行った(２３℃)。得られた結果を以下の表２及び
表３に示す。

【００３０】

【表２】 平衡変性 デルタＧ(＋／−６％) １．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ ６．２ ２．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２９−３０)ＨＩ ６．０ ３．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ ５．８ ４．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ３０)ＨＩ ５．５ ５．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ５．４ ６．Ａsp(Ｂ１０)ＨＩ ５．１ ７．ＢＨＩ(亜鉛不含) ５．１ ８．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２３−３０)ＨＩ ５．１ ９．デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ５．０ １０．デス(Ｂ３０)ＨＩ ４．６ １１．デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ ４．５ １２．デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ ４．３ １３．デス(Ｂ２９−３０)ＨＩ ４．３ １４．デス(Ｂ２３−３０)ＨＩ ３．８

【００３１】

【表３】 平衡変性 頂点(＋／−２％) １．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ ５．８ ２．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ ５．７ ３．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ３０)ＨＩ ５．６ ４．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２３−３０)ＨＩ ５．６ ５．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２９−３０)ＨＩ ５．５ ６．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ５．５ ７．Ａsp(Ｂ１０)ＨＩ ５．３ ８．デス(Ｂ２９−３０)ＨＩ ５．２ ９．デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ ５．１ １０．デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ ５．１ １１．デス(Ｂ３０)ＨＩ ５．０ １２．デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ５．０ １３．デス(Ｂ２３−３０)ＨＩ ４．７ １４．ＢＨＩ(亜鉛不含) ４．５

【００３２】実施例５ 平 衡 超 遠 沈 沈降平衡超遠心によって、インスリンの凝集挙動を測定
した。ペーカー(Pekar,A.H.)及びフランク(Frank,B.H.)
のBiochemistry 11:4013-4016(1972)に記載の手法によ
り、各同族体の会合状態を測定した。タンパク質濃度
３．５mｇ/ml，pＨ７．２、０．０５Ｍ ＮaＣl−０．０
５Ｍ リン酸ナトリウム(４℃)のインスリン及びその関
連化合物について得られた結果を以下の表４に示す。表
中の値は、観察された重量の平均分子量を各化合物のモ
ノマー分子量で除したものである。従って、この比率は
インスリン同族体の凝集程度を示す指標となる。また、
亜鉛不含のＢＨＩについて得られた結果も示す。本発明
の化合物はヒトインスリンと比較して、非常に弱くしか
自己会合しない挙動を示していることが明らかである。

【００３３】

【表４】 平衡超遠沈 化 合 物 Ｍw／Ｍｌ １．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ １．０６ ２．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ １．２０ ３．デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ １．８０ ４．Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２９−３０)ＨＩ ２．０ ５．Ａsp(Ｂ１０)ＨＩ ２．３ ６．デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ２．３ ７．デス(Ｂ２９−３０)ＨＩ ４．６ ８．ＢＨＩ(亜鉛不含) ６．６

【００３４】実施例６ レセプター結合性 本発明のインスリン同族体の生理学的効果を以下のイン
ビトロインスリンレセプター結合検定によって試験し
た。文献開示(例えば、MarshallらのJ.Clin.Endocrin,M
etab.,39:283-292(1974)のヒト胎盤細胞膜のインスリン
及びソマトメジン−Ｃレセプターの特性化)の方法によ
って、月満ちた(full-term)ヒト胎盤からミクロソーム
膜を入手した。１００mＭ Ｈepes，pＨ７．８、１２０m
Ｍ ＮaＣl、５mＭ ＫＣl、１．２mＭ ＭgＳＯ₄、８mＭ
グルコール及び０．２５％ＢＳＡ０．５ml 中におい
て、タンパク質約３０μgを、４５，０００−５０，０
００cpmの¹²⁵Ｉ[Ａ１４]−ヒトインスリン及び増量させ
るコールド競合リガンドと共にインキュベートした。４
℃において２４時間後、Ｓkatron細胞捕集器を使用して
膜をガラス繊維フィルター上に採取し、結合した¹²⁵Ｉ
を測定した。種々のインスリン同族体をヒトインスリン
標品と比較するため(表５を参照)、競合結合性曲線を作
成し、¹²⁵Ｉインスリンを５０％置換するのに有効であ
るホルモン濃度を決定した。このレセプター結合試験で
は、Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ヒトインスリン
及びＡsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ヒトインスリン
が特に強力であった。

【００３５】

【表５】 ヒトインスリンレセプターに対する比結合強度^a) 化 合 物 平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ ヒトインスリン(ＨＩ) １００％(ｎ＝２) Ａsp(Ｂ１０)ＨＩ １７５ ± １７％(ｎ＝２) デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ６９ ± ２％(ｎ＝３) デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ １２５ ± １４％(ｎ＝２) Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ３０９ ± １９％(ｎ＝２) Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ ２７５ ± １５％(ｎ＝２) Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ １７２ ± ９５％(ｎ＝２) ａ）ヒトインスリンのＥＣ₅₀は０．２９nＭ である

【００３６】実施例７ ラット試験 本発明のインスリン同族体の生理学的効果を以下に記載
するインビボ検定系により試験した。カールス・リバー
・ラボラトリーズ[Charles River Laboratories,ポーテ
イジ,ＭＩ]から入手した正常なスプラーク・ダウリー(S
prague Dawley)雄性ラットを試験動物として使用した。
体重が１６０−１８０ｇの動物を入手し、制御した照明
サイクル[午前７時−午後７時は照射(照明オン)、午後
７時−午前７時は暗闇(照明オフ)]の条件下、７５°Ｆ
の動物室で１週間飼育した。動物には、食事としてプリ
ナ・ラット・チュー(Purina rat chow)５００１を自由
に摂らせた。各検定で使用した動物は、使用前１６時間
絶食させた。最初に使用する時、体重は約２００ｇであ
った。絶食させたときの体重が約２７５ｇ(３週間の間)
の場合には、その動物は使用しなかった。１０匹の雄性
ラットの１群を使用し、毎日、それぞれの試験化合物
(即ち、生合成ヒトインスリン、ブタインスリン、及び
ヒトインスリン同族体)を与えた。各群は、その週に１
回だけ使用した。この１０匹のラットをそれぞれ５匹づ
つの群に分けた。１つの群は対照としてビヒクルのみを
皮下投与した。他方のラット５匹の群には試験すべき化
合物を投与した。これらのタンパク質は０．０５Ｎ 塩
酸(pＨ１．６)に溶解し、１ml 当たり１００μｇのスト
ック溶液を調製した。このストック溶液から、普通の生
理食塩水中、多くの希釈液を調製し、ラットに皮下注射
する。投与後０時点、３０分、１時間、３時間及び４時
間の時点に、各ラットの尾静脈から血液試料１００μｌ
を採血した。グルコースオキシダーゼ法[シグマ・ケミ
カル・カンパニー(Sigma Chemical Co.)]によってグル
コースを比色分析で測定した。血中グルコースの０時値
に対する変化％を各ラットについて計算し、最終結果を
その試験日における対照群の平均変化について補正した
各実験群の平均変化％±ＳＥＭとして表した。

【００３７】特定の時間(通常はタンパク質投与後１ま
たは２時間)における最大応答を使用し、試験した化合
物の４から７つの種々の濃度で試験した結果を用いて用
量作用曲線を描いた。この曲線から、最大の低血糖性応
答の半分を与えるタンパク質の皮下投与量(μg／kg)を
ＥＤ₅₀値として求めた。得られた結果を次の表６に示
す。

【表５】 低血糖活性^a) 化 合 物 ＥＤ₅₀ ^b) 比低血糖活性(％)^c) ヒトインスリン(ＨＩ)^d) ７．７５ １００ Ａsp(Ｂ１０)ＨＩ ９．８ ７９ デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ８．１ ９６ デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ １２．７ ６１ Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−３０)ＨＩ ７．７ １０１ Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−３０)ＨＩ １１．９ ６５Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２６−３０)ＨＩ １１．０ ７０ ａ）すべての値は化合物投与後１時間目に採取した血液
試料についてのものである。 ｂ）μg／kgで表している。皮下。 ｃ）ヒトインスリンに対する％。 ｄ）生合成ヒトインスリン。

【００３８】既述したように、本発明のインスリン同族
体は、ダイマー化するか、又はそうでなくても自己会合
して高分子量体になるという傾向が減少されている。従
って、１つ又はそれ以上の本発明同族体を投与すると、
活性が急速に現れる。本発明のインスリン同族体は、そ
れを必要としている患者に式(Ｉ)で示されるインスリン
同族体の有効量を投与することによって過血糖症を処置
する上で有効である。本明細書中で使用している「有効
量」なる用語は、糖の血中レベルを治療的又は予防的に
低下又は維持させるのに必要とされる、１つ又はそれ以
上の本発明のインスリン同族体の量を意味する。この量
は通常、１日当たり約１０単位から約６０単位又はそれ
以上とすることができる[あるいは１mｇ当たり約２９単
位と推定して約０．３から約２mｇ]。しかし、実際に投
与するインスリン同族体(群)の量は、処置する状態(即
ち、過血糖症の原因)、投与する具体的な同族体、選択
する腸管外の投与経路、個々の患者の年令、体重及び応
答性、並びに患者の症状の重篤度など、関連する状況に
照らして臨床医によって決定されるものであることは理
解されよう。従って、上記投与量の範囲は、あらゆる意
味においても本発明の限定を意図するものではない。

【００３９】本発明のインスリン同族体はそれを必要と
している患者(即ち、過血糖症に罹患している患者)に投
与するに当たり、少なくとも１つの式(Ｉ)で示されるイ
ンスリン同族体の有効量を１つ又はそれ以上の製薬的に
許容され得る賦形剤又は担体と共に含有している医薬組
成物として投与する。この目的には、通常、有効量のイ
ンスリン同族体(群)を１ml 当たり約１００単位、又は
それよりも小さい濃度となるように含有する医薬組成物
を製剤化すればよい。これらの組成物は、必須ではない
が腸管外投与するのが通常であり、当業界周知の腸管外
製品のための通常の賦形剤又は担体を使用する各種の方
法のいずれの方法によっても製造することができる。例
えば、Remington's Pharmaceutical Sciences,17版,マ
ック・パブリッシィング・カンパニー,米国,PA,イースト
ン(1985)を参照のこと。例えば、腸管外投与のための投
与剤形は、少なくとも１つの式(Ｉ)で示されるインスリ
ン同族体の所望の量を注射に適した水性媒質などの無毒
性の液状ビヒクルに懸濁又は溶解し、そして得られた懸
濁液又は溶解液を滅菌することによって調製することが
できる。あるいは、測定した化合物の量をバイアルに入
れ、そのバイアル及び内容物を滅菌して封栓してもよ
い。ここに付随するバイアル又はビヒクルは、投与前の
混合を目的として得ることができる。腸管外投与に適し
た医薬組成物には、水及び水混和性有機溶媒、例えばグ
リセリン、ゴマ油、グランドナッツ油、水性プロピレン
グリコール、Ｎ，Ｎ'−ジメチルホルムアミドなどの希
釈剤、賦形剤、担体を使用する。医薬組成物の例として
は、製薬的に許容され得る緩衝液で緩衝化することので
きる、パイロジェン不含の式(Ｉ)で示されるインスリン
同族体の滅菌した等張性生理食塩水が挙げられる。さら
に、この腸管外医薬製剤には、メタ−クレゾールなどの
保存剤、又は水酸化ナトリウム又は塩酸などの最終製品
のｐＨを調節するためのその他の活性剤を含有させるこ
ともできる。

【００４０】本発明のインスリン同族体は、鼻腔内投与
に適した医薬組成物に製剤化することもできる。このよ
うな組成物は、欧州特許出願０２００３８３ Ａ３に詳
細に開示されている。簡単に言えば、このような組成物
は、１つ又はそれ以上の製薬的に許容され得る希釈剤、
製薬的に許容され得る量のインスリンのアルカリ金属
塩、アンモニウム塩又は実質的に亜鉛を含まないインス
リンの遊離酸、並びに要すれば、(１)オレイン酸又はそ
のエステルもしくは塩、(２)液状ソルビタン脂肪酸エス
テル、(３)ソルビタン脂肪酸エステルの液状ポリオキシ
エチレン誘導体及び(４)液状ヒドロキシポリオキシエチ
レン−ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレン共重
合体の中から選択される少なくとも１つの吸収促進剤の
吸収促進量から製剤化される。

【００４１】実施例８ イ ヌ 試 験 ヒトインスリン同族体であるＡsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２
７−３０)ヒトインスリン及びＡsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２
８−３０)ヒトインスリンを皮下投与した際における、
標準の可溶性ヒトインスリン製剤[ヒューマリンＲ^R(Hum
ulin R^R)]と比較したうえでの効能及び迅速な作用を証
明するため、以下に記載の試験を行った。雄性ビーグル
犬(体重１０−１２kg)の身体的状態を試験前及び試験中
に良好な状態に維持させた。１６時間イヌを絶食させた
が、インスリンレベルの予期できない変動に備えるため
水は飲めるようにした。試験の全期間にわたり、イヌを
ペントバルビタールナトリウムで麻酔し、グルコース変
動を最小にするため足蹠を暖めて体温を維持させた。試
験インスリン試料[即ち、Ａsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２７−
３０)ヒトインスリン及びＡsp(Ｂ１０)，デス(Ｂ２８−
３０)ヒトインスリン]をヒューマリンＲ^Rに使用されて
いる希釈剤と同じもので３．５mｇ/ml として製剤化し
た。この試験では、各インスリン同族体の低血糖活性が
重量を基礎としてインスリンと同等であると評価され
た。従って、これらの試験溶液は１００単位／ml を含
有していると考えられた。すべてのインスリン試験溶液
を１kg当たり０．１単位の投与量で、試料に応じて８匹
又は１０匹のビーグル犬それぞれの脇腹外側の表皮下に
皮内投与した。投与前３０分、１５分及び０分時、並び
に投与後１０分、２０分、３０分、４５分、６０分、９
０分、１２０分、１８０分及び２４０分時に血液試料を
採取した。グルコースオキシダーゼ法によりグルコース
を比色測定した。この比較試験の結果を以下の表７に示
す。

【００４２】

【表７】 血中グルコースレベル：０時に対する％^a) Asp(B10) Asp(B10) 時間(分) ヒューマリンR^R デス(B27-30)HI デス(B28-30)HI (n = 8) (n = 8) (n = 10) -30 102 ± 1.6 92 ± 2.1 103 ± 2.9 -15 101 ± 1.6 99 ± 1,2 101 ± 2.0 0 100 100 100 10 100 ± 1.3 93 ± 1.5 98 ± 1.8 20 99 ± 1.9 80 ± 3.3 93 ± 2.0 30 97 ± 2.1 63 ± 3.1 81 ± 2.9 45 86 ± 4.1 47 ± 4.1 67 ± 4.4 60 79 ± 4.9 43 ± 3.4 60 ± 4.8 90 67 ± 4.6 48 ± 2.9 67 ± 5.7 120 64 ± 4.8 58 ± 4.1 73 ± 4.9 180 62 ± 5.0 87 ± 2.6 89 ± 1.9 240 77 ± 4.9 89 ± 2.0 90 ± 2.2 ａ）血中グルコースレベル：平均±Ｓ.Ｅ.Ｍ

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：２１ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列の特徴： 特徴を表す記号：Variable Site 存在位置：２１ 他の情報：このアミノ酸は、Ａsn、Ａsp、Ｇlu、Ｇln、
Ａla、Ｇly又はＳerのいずれかである。 配列 Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln 1 5 10 15 Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa 20 配列番号２ 配列の長さ：２７ 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ポリペプチド 配列の特徴： 特徴を表す記号：Variable Site 存在位置：１ 他の情報：このアミノ酸は、Ｐhe又はＡspのいずれかで
ある。 配列の特徴： 特徴を表す記号：Variable Site 存在位置：３ 他の情報：このアミノ酸は、Ａsn又はＡspのいずれかで
ある。 配列 Ｘａａ Ｖａｌ Ｘａａ Ｇｌｎ Ｈｉｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｓｅｒ
Ａｓｐ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｇｌｕ Ａｌａ Ｌｅｕ １ ５
１０ １５ Ｔｙｒ Ｌｅｕ Ｖａｌ Ｃｙｓ Ｇｌｙ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｐｈｅ
Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｔｈｒ ２０
２５

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ロナルド・ユジーン・チャンス アメリカ合衆国46074インディアナ州ウエ ストフィールド、フリッピン・ロード 19303番 (72)発明者 ブルース・ヒル・フランク アメリカ合衆国46260インディアナ州イン ディアナポリス、スプリング・フォレス ト・ドライブ9377番

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列番号２と適切に架橋している配列番
   号１で示されるインスリン同族体又はその製薬的に許容
   され得る塩 [ただし、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
   p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、 配列番号２の１位におけるＸaaはＡsp又はＰheであり、 配列番号２の３位におけるＸaaはＡsp又はＡsnであ
   る]。
2. 【請求項２】 配列番号１の２１位におけるＸaaがＡsn
   である請求項１に記載のインスリン同族体。
3. 【請求項３】 配列番号２の１位におけるＸaaがＰheで
   ある請求項２に記載のインスリン同族体。
4. 【請求項４】 配列番号２の３位におけるＸaaがＡsnで
   ある請求項３に記載のインスリン同族体。
5. 【請求項５】 配列番号２の１位から２６位のアミノ酸
   残基と適切に架橋している配列番号１で示されるインス
   リン同族体又はその製薬的に許容され得る塩 [ただし、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
   p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、 配列番号２の１位におけるＸaaはＡsp又はＰheであり、 配列番号２の３位におけるＸaaはＡsp又はＡsnであ
   る]。
6. 【請求項６】 配列番号１の２１位におけるＸaaがＡsn
   である請求項５に記載のインスリン同族体。
7. 【請求項７】 配列番号２の１位におけるＸaaがＰheで
   ある請求項６に記載のインスリン同族体。
8. 【請求項８】 配列番号２の３位におけるＸaaがＡsnで
   ある請求項７に記載のインスリン同族体。
9. 【請求項９】 配列番号２の２位から２７位のアミノ酸
   残基と適切に架橋している配列番号１で示されるインス
   リン同族体又はその製薬的に許容され得る塩 [ただし、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
   p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、 配列番号２の１位におけるＸaaはＡsp又はＰheであり、 配列番号２の３位におけるＸaaはＡsp又はＡsnであ
   る]。
10. 【請求項１０】 配列番号２の２位から２６位のアミノ
    酸残基と適切に架橋している配列番号１で示されるイン
    スリン同族体又はその製薬的に許容され得る塩 [ただし、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
    p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、 配列番号２の１位におけるＸaaはＡsp又はＰheであり、 配列番号２の３位におけるＸaaはＡsp又はＡsnである]
11. 【請求項１１】 配列番号２と適切に架橋している配列
    番号１で示されるインスリン同族体又はその製薬的に許
    容され得る塩 [ただし、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
    p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、 配列番号２の１位におけるＸaaはＡsp又はＰheであり、 配列番号２の３位におけるＸaaはＡsp又はＡsnである]
    を製薬的に許容され得る希釈剤と共に含有してなる抗過
    血糖症製剤。
12. 【請求項１２】 配列番号１の２１位におけるＸaaがＡ
    snであり、配列番号２の１位におけるＸaaがＰheであ
    り、配列番号２の３位におけるＸaaがＡsnである請求項
    １１に記載の抗過血糖症製剤。
13. 【請求項１３】 配列番号２の１位から２６位のアミノ
    酸残基と適切に架橋している配列番号１で示されるイン
    スリン同族体又はその製薬的に許容され得る塩 [ただし、配列番号１の２１位におけるＸaaはＡsn、Ａs
    p、Ｇlu、Ｇln、Ａla、Ｇly又はＳerであり、 配列番号２の１位におけるＸaaはＡsp又はＰheであり、 配列番号２の３位におけるＸaaはＡsp又はＡsnである]
    を製薬的に許容され得る希釈剤と共に含有してなる抗過
    血糖症製剤。
14. 【請求項１４】 配列番号１の２１位におけるＸaaがＡ
    snであり、配列番号２の１位におけるＸaaがＰheであ
    り、配列番号２の３位におけるＸaaがＡsnである請求項
    １３に記載の抗過血糖症製剤。