CZ289343B6 - Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek pro léčení diabetes - Google Patents
Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek pro léčení diabetes Download PDFInfo
- Publication number
- CZ289343B6 CZ289343B6 CZ19972899A CZ289997A CZ289343B6 CZ 289343 B6 CZ289343 B6 CZ 289343B6 CZ 19972899 A CZ19972899 A CZ 19972899A CZ 289997 A CZ289997 A CZ 289997A CZ 289343 B6 CZ289343 B6 CZ 289343B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- insulin
- xaa
- amino acid
- glu
- group
- Prior art date
Links
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical class N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 310
- 239000004026 insulin derivative Substances 0.000 title claims abstract description 93
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 title claims abstract description 15
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title abstract description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims abstract description 113
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims abstract description 113
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims abstract description 112
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 29
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 23
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 20
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 16
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 14
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims abstract description 9
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 claims description 34
- -1 (1-carboxytridecyl) -2-aminosuccinyl Chemical group 0.000 claims description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 13
- AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N Tyr-Thr-Pro Chemical group C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O AOIZTZRWMSPPAY-KAOXEZKKSA-N 0.000 claims description 10
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 5
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 IEHDJWSAXBGJIP-RYUDHWBXSA-N 0.000 claims description 3
- 108010084572 phenylalanyl-valine Proteins 0.000 claims description 3
- 125000006367 bivalent amino carbonyl group Chemical group [H]N([*:1])C([*:2])=O 0.000 claims 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 abstract description 34
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 abstract 1
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 63
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 49
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 44
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical class C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 42
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 35
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 34
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 32
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 32
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 31
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 28
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 26
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 25
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 22
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 22
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 20
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 20
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 20
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 19
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 17
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 17
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 17
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 15
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 15
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000047 product Substances 0.000 description 14
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 12
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 12
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 12
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 11
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 9
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 8
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 description 8
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 8
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 8
- 241000590035 Achromobacter lyticus Species 0.000 description 7
- 102000007327 Protamines Human genes 0.000 description 7
- 108010007568 Protamines Proteins 0.000 description 7
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 7
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 7
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 7
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 7
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 7
- 238000010829 isocratic elution Methods 0.000 description 7
- NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N phloretic acid Chemical compound OC(=O)CCC1=CC=C(O)C=C1 NMHMNPHRMNGLLB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 6
- 235000010633 broth Nutrition 0.000 description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IYLXCLAZLAWMIR-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione;tetradecanoic acid Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.CCCCCCCCCCCCCC(O)=O IYLXCLAZLAWMIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 108010051815 Glutamyl endopeptidase Proteins 0.000 description 5
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 5
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 description 5
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 5
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 5
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 5
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000004987 plasma desorption mass spectroscopy Methods 0.000 description 4
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 229940048914 protamine Drugs 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 3
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 3
- 108010005991 Pork Regular Insulin Proteins 0.000 description 3
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 229940070353 protamines Drugs 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 239000012807 PCR reagent Substances 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- 101710136739 Teichoic acid poly(glycerol phosphate) polymerase Proteins 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 2
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001419 myristoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N sodium nitrate Chemical compound [Na+].[O-][N+]([O-])=O VWDWKYIASSYTQR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 description 2
- TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N tetradecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCC(O)=O TUNFSRHWOTWDNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N Ala-Ala-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N HHGYNJRJIINWAK-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N Ala-Ala-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FJVAQLJNTSUQPY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 101100519158 Arabidopsis thaliana PCR2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101001011741 Bos taurus Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000000496 Carboxypeptidases A Human genes 0.000 description 1
- 108010080937 Carboxypeptidases A Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N Glu-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N QOXDAWODGSIDDI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101500025353 Homo sapiens Insulin A chain Proteins 0.000 description 1
- 101500025354 Homo sapiens Insulin B chain Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090000769 Isomerases Proteins 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 108010053229 Lysyl endopeptidase Proteins 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N Phe-Val-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O GOUWCZRDTWTODO-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N Pro-Lys-Tyr Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)O WCNVGGZRTNHOOS-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N Ser-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N RZEQTVHJZCIUBT-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 101000993800 Sus scrofa Insulin Proteins 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Lys Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O MPUMPERGHHJGRP-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N Thr-Lys Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN YKRQRPFODDJQTC-CSMHCCOUSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Chemical compound CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 125000004442 acylamino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N bovine insulin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)C(C)C)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 IXIBAKNTJSCKJM-BUBXBXGNSA-N 0.000 description 1
- 125000003917 carbamoyl group Chemical group [H]N([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000002843 carboxylic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001055 chewing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 229910017052 cobalt Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010941 cobalt Substances 0.000 description 1
- GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N cobalt atom Chemical compound [Co] GUTLYIVDDKVIGB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- TZLFWVPLPHJLSE-UHFFFAOYSA-N cyclopentane phenanthrene Chemical group C1CCCC1.C1=CC=C2C3=CC=CC=C3C=CC2=C1 TZLFWVPLPHJLSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 238000001212 derivatisation Methods 0.000 description 1
- 108700011811 des(B27-B30)- insulin Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical group 0.000 description 1
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 description 1
- 230000002218 hypoglycaemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000002085 irritant Substances 0.000 description 1
- 231100000021 irritant Toxicity 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 229940100630 metacresol Drugs 0.000 description 1
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000007922 nasal spray Substances 0.000 description 1
- 229940097496 nasal spray Drugs 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 1
- 230000037081 physical activity Effects 0.000 description 1
- 229920001281 polyalkylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000007127 saponification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229960000999 sodium citrate dihydrate Drugs 0.000 description 1
- 239000004317 sodium nitrate Substances 0.000 description 1
- 235000010344 sodium nitrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/62—Insulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/04—Inotropic agents, i.e. stimulants of cardiac contraction; Drugs for heart failure
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Cardiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Obesity (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Hematology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
Je pops n inzulinov² deriv t vzorce I, v n m Xaa v poloze A21 znamen jakoukoliv k dovatelnou aminokyselinu krom Lys, Arg a Cys, Xaa v poloh ch B1, B2, B3, B26, B27, B28 a B29 znamenaj nez visle na sob jakoukoliv k dovatelnou aminokyselinu vyjma Cys nebo jsou vynech ny, Xaa v poloze B30 znamen jakoukoliv k dovatelnou aminokyselinu vyjma Cys, di-, tri- a tetrapeptid neobsahuj c Cys nebo Arg, nebo je vynech na a bu aminoskupina N-koncov aminokyseliny B-°et zce nebo karboxyskupina C-koncov aminokyseliny B-°et zce nese lipofiln skupinu W nebo Z s 16 a 22 resp. 16 a 31 atomy uhl ku. Je pops n tak farmaceutick² prost°edek pro l en diabetes, kter² obsahuje terapeuticky · inn mno stv uveden ho inzulinov ho deriv tu, pop° pad ve sm si s inzulinem nebo analogem inzulinu, kter² m rychl² n stup p soben .\
Description
Předložený vynález se týká inzulínového derivátu, farmaceutického prostředku pro léčení diabetes a způsobu jeho léčení. Podrobněji - předložený vynález se týká nového lidského inzulínového derivátu, který je rozpustný a má protrahovaný profil působení, způsobu získávání tohoto derivátu, farmaceutického prostředku, který ho obsahuje, a použití tohoto inzulínového derivátu pro léčení diabetes.
Dosavadní stav techniky
Mnoho diabetických pacientů je léčeno vícekrát denně podávanými injekcemi inzulínu v takovém režimu, který zahrnuje jedno nebo dvě denní injekce protrahovaného inzulínu, kterými se pokryje základní požadavek podávání bolus injekcemi rychle působícího inzulínu pro pokrytí požadavků souvisejících s jídlem.
Prostředky s protrahovaným inzulínem jsou dobře známy z oblasti techniky. Jeden z hlavních typů prostředků s protrahovaným inzulínem zahrnuje injekčně podávané vodné suspenze krystalů inzulínu nebo amorfního inzulínu. V těchto prostředcích se jako sloučeniny inzulínu typicky používá protaminový inzulín, Zn-inzulin nebo protaminový Zn-inzulin.
S používáním inzulínových suspenzí souvisí některé nevýhody. Aby se zajistilo přesné dávkování, musí být inzulínové částice homogenně suspendovány mírným třepáním před tím, než se z ampulky odebere definovaný objem suspenze nebo než se definovaný objem vytlačí z krabičky. Při skladování suspenzí inzulínu musí být teplota udržována v užších mezích než u inzulínových injekcí, abychom se vyhnuli tvorbě kousků nebo koagulaci.
I když bylo dříve předpokládáno, že protaminy nejsou imunogenní, nyní se ukázalo, že protaminy mohou být u člověka imunogenní a že jejich použití pro lékařské účely může vést k tvorbě protilátek [Samuel a spol.: Studie on the immunogenicity od protamines in humans and experimental animals of a micro-complement fixation test, Clin. Exp. Immunol. 33, 252 až 260 (1978).].
Byl zjištěn také důkaz toho, že komplex protamin-inzulin je sám imunogenní [Kurtz a spol.: Circulating IgG antibody to protamine in patients treated with protamine-insulins, Diabetologica 25, 322 až 324 (1983).]. U některých pacientů je tedy nutné vyhnout se použití protrahovaných inzulínových prostředků obsahujících protaminy.
Jiným typem protrahovaných inzulínových prostředků jsou roztoky, které mají pH pod fyziologickým pH, přičemž se inzulín bude srážet, protože pH se zvyšuje, když se roztok podává injekčně. Nevýhodou je to, že pevné částice inzulínu působí jako lokální dráždivě činidlo, které způsobuje zánět tkáně v místě injekce.
Spis WO 91/12817 (Novo Nordis A/S) popisuje protrahované, rozpustné inzulínové prostředky obsahující inzulínové komplexy trojmocného kobaltu. Protrahování těchto komplexů je pouze střední a biologická životaschopnost je snížena.
Lidský inzulín má tři primární aminové skupiny: N-koncovou skupinu A-řetězce a B-řetězce ae-aminovou skupinu LysB29. V oblasti techniky jsou známy některé inzulínové deriváty, které mají substituovány jednu nebo více z těchto skupin. Tak USA patent č. 3 528 960 (Eli Lilly) se týká N-karboxyaroylinzulinů, v nichž jedna, dvě nebo tři primární aminové skupiny molekuly
-1 CZ 289343 B6 inzulínu mají karboxyaroylovou skupinu. Nebyly popsány žádné specificky ΝεΒ29 substituované inzulíny.
Podle britského patentového spisu č. 1 492 997 (Nat. Res. Dev. Corp.) bylo zjištěno, že inzulín s karbamoylovou substitucí na ΝεΒ29 má zlepšený profil hypoglykemického účinku.
Japonský patentový vykládací spis č. 1-254669 (Kodama Co., Ltd.) popisuje inzulín, v němž je mastná kyselina navázána na aminovou skupinu PBI nebo na ε-aminovou skupinu LysB29 nebo na obě tyto skupiny. Stanoveným účelem této derivatizace je získat farmakologicky přijatelný, stabilní inzulínový přípravek.
Inzulíny, které mají v poloze B30 aminokyseliny s alespoň 5 atomy uhlíku, které nemají být nutně kódovány tripletem nukleotidů, jsou popsány v japonském patentovém vykládacím spisu č. 57-07548 (Shionogi). Inzulínové analogy jsou nárokovány jako užitečné při léčení diabetes mellitus, zvláště u pacientů, kteří jsou rezistentní na inzulín díky vzniku protilátek na hovězí nebo prasečí inzulín.
USA patent 5 359 030 (Ekwuribe, Protein Delivery, lne.) popisuje konjugaci - stabilizované polypeptidové prostředky pro orální nebo parenterální podávání obsahující polypeptid kovalentně kondenzovaný s polymerem zahrnujícím lineární polyalkylenovou část a lipofilní část. Tyto části jsou uspořádány navzájem vůči sobě tak, že polypeptid má zvýšenou in vivo rezistenci na enzymatickou degradaci.
Evropská patentová přihláška 511600 A2 se týká, mimo jiné proteinových derivátů obecného vzorce [protein][Zn], v němž [protein] znamená protein s n aminovými skupinami, z nichž každá je odvozena od aminové skupiny odstraněním jednoho z jejích atomů vodíku místo aminových skupin, [Z] znamená skupinu obecného vzorce -CO-W-COOH, v němž W znamená dvojvaznou uhlovodíkovou skupinu s dlouhým řetězcem, která může obsahovat také některé heteroatomy a n znamená průměrný počet amidových vazeb mezi [Z] a [proteinem]. Je uvedeno, že proteinové deriváty podle vynálezu mají mimořádně prodloužený poločas životnosti séra při srovnání s proteiny, od nichž jsou odvozeny, a že nevykazují žádnou antigeničnost. Také se uvádí, že inzulín je jedním z proteinů, z nichž lze vyrobit deriváty podle vynálezu, ale v evropské patentové přihlášce 511600 nejsou popsány žádné specifické inzulínové deriváty ani nejsou uvedeny výhodné [Z] nebo (a) poloha (polohy), do nichž by měl být [Z[] zaveden, aby se získaly užitečné inzulínové deriváty.
Kdykoliv je v předloženém spisu použit pojem inzulín v několikerém významu nebo ve významu generickém, zahrnuje jak v přírodě se vyskytující inzulíny tak analogy inzulínu a jeho deriváty. Pojmem „derivát inzulínu“ se zde rozumí polypeptid, který má molekulární strukturu podobnou struktuře lidského inzulínu včetně disulfídových můstků mezi CysA7 a CysB7 a mezi Cys^0 a CysBI9, vnitřní disulfidový můstek mezi CysAé a CysAH a který má inzulínovou aktivitu.
Existuje však ještě potřeba protrahovaných injekčně podaných inzulínových prostředků, kterými jsou roztoky, které obsahují inzulíny, které zůstávají po podání injekcí v roztoku a mají minimální zánětlivé a imunogenní vlastnosti.
Jedním z předmětů předloženého vynálezu je získat lidské inzulínové deriváty s protrahovaným profilem účinku, které jsou rozpustné při fyziologických hodnotách pH.
Jiným předmětem předloženého vynálezu je získání farmaceutického prostředku obsahujícího lidské inzulínové deriváty podle vynálezu.
Dalším předmětem vynálezu je získat způsob výroby lidských inzulínových derivátů podle vynálezu.
-2CZ 289343 B6
Podstata vynálezu
Překvapivě bylo zjištěno, že některé inzulínové deriváty, v nichž buď aminová skupina N-koncové aminokyseliny B-řetězce má napojený lipofilní substituent s 16 až 22 atomy uhlíku nebo v nichž skupina karboxylové kyseliny na C-konci aminokyseliny B-řetězce má napojený lipofilní substituent s 16 až 31 atomy uhlíku, mají protrahovaný profil účinku a jsou rozpustné při fyziologických hodnotách pH.
Předložený vynález se tedy ve svém nejširším spektru týká inzulínového derivátu následující obecné sekvence
SS
A-řetězec | 7|
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-
3 456] 89 10 1112
S
I
S B-řetězec|
Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val123456789 10 1112
A-řetězec (pokr.)20
Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa (sekv. id. δ. 1)
14 15 16 17 18 19 |21
----S I S
B-řetězec (pokr.)|
Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-
14 15 16 17 18 19 20 21 22 2324
B-řetězec (pokr.)
Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa- (sekv. id. C. 2)
26 27 28 2930 v níž
Xaa v poloze A21 znamená jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu kromě Lys, Arg a Cys,
Xaa v polohách Bl, B2, B3, B26, B27, B28 a B29 znamenají nezávisle na sobě jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu vyjma Cys nebojsou vynechány,
Xaa v poloze B30 znamená jakoukoliv kódovatelnou aminokyselinu vyjma Cys, dipeptid neobsahující Cys nebo Arg, tripeptid neobsahující Cys nebo Arg, tetrapeptid neobsahující Cys nebo Arg neboje vynechán, a buď aminoskupina N-konce aminokyseliny B-řetězce má lipofilní skupinu W na ni připojenou, přičemž tato skupina má 16 až 22 atomů uhlíku a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá, nebo karboxyskupina na C-konci aminokyseliny B-řetězce má lipofilní skupinu Z na ni připojenou, přičemž tato skupina má 16 až 31 atomů uhlíku a popřípadě obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá s tím, že jestliže
-3CZ 289343 B6 jedna nebo více aminokyselin v poloze Bl, B2 a B3 je deletováno, potom číslo N-koncové aminokyseliny se spočte odpočítáním od CysB7, který je vždy označen číslem 7, a že
a) jestliže B1-B2-B3 znamená Phe-Val-Asn, A21 znamená Asn a B26-B27-B28-B29-B30 znamená Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr nebo Tyr-Thr-Pro-Lys-Ala, potom W nebo Z vždy obsahuje skupinu, která může být negativně nabitá,
b) jestliže B29 a B30 jsou deletovány a shora uvedená skupina Z je přítomna na C-konci aminokyseliny B-řetězce a ani Bl, ani B2 ani B3 není deletována, potom B1-B2 neznamená Phe-Val nebo B26-B27-B28 neznamená Tyr-Thr-Pro nebo jak B1-B2 tak B26-B27-B28 znamenají jiné než uvedené sekvence, a
c) jestliže B29 a B30 jsou deletovány, shora uvedená skupina Z je přítomna na C-konci aminokyseliny B-řetězce a jedna zBl, B2 nebo B3 je deletována, potom N-koncová aminokyselina B-řetězce neznamená Val nebo sekvence B26-B27-B28 neznamená Tyr-Thr-Pro nebo jak N-koncová aminokyselina B-řetězce tak sekvence B26-B27-B28 neznamená Val, respektive Tyr-Thr-Pro.
Ve výhodném provedení se předložený vynález týká inzulínového derivátu následující obecné sekvence:
A-řetězec j 7 |
Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser1 2 3 4 5 6 I 8 9 10 11 12
B-řetězec ξ
Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-
2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
(sekv. id. č. 1)
B-řetězec (pokr.) Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-GIy-Phc 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
B-řetězec (pokr.)
Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa25 26 27 28 29 30 (sekv. id. č. 2) v níž
-4CZ 289343 B6
Xaa v poloze A21 znamená jakýkoliv zbytek kódovatelné aminokyseliny kromě zbytků Lys, Arg a Cys,
Xaa v polohách Bl, B2, B3, B26, B27, B28 a B29 znamenají nezávisle na sobě zbytek kódovatelné aminokyseliny vyjma zbytek Cys nebojsou vynechány,
Xaa v poloze B30 znamená zbytek kódovatelné aminokyseliny vyjma zbytku Cys, dipeptid zjakékoliv aminokyseliny neobsahující zbytek Cys nebo zbytek Arg, tripeptid zjakékoliv aminokyseliny neobsahující zbytek Cys nebo zbytek Arg, tetrapeptid zjakékoliv aminokyseliny neobsahující zbytek Cys nebo zbytek Arg nebo je vynechána, a buď aminoskupina N-koncové aminokyseliny B-řetězce má lipofílní skupinu W na ni připojenou, přičemž tato skupina má 16 až 22 atomů uhlíku, kde W je vybrána ze skupiny zahrnující obecné vzorce:
a) CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CO-, kde n znamená číslo od 9 do 15,
b) CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-, kde r znamená číslo od 9 do 15,
c) CH3(CH2)SCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-, kde s znamená číslo od 9 do 15,
d) (N( l-karboxytridecyl)-2-aminosukcinyl)a
e) tetradekanoylglutamyl-glycyl nebo karboxyskupina C-koncové aminokyseliny B-řetězce má lipofílní skupinu Z na ni připojenou, přičemž tato skupina má 16 až 31 atomů uhlíku, kde Z je vybrána ze skupiny zahrnující obecné vzorce:
a) -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3, kde m znamená číslo od 8 do 18,
b) -NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO (CH2)p CH3, kde p znamená číslo od 10 do 16,
c) -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COON)NH-CO (CH2)q CH3, kde q znamená číslo od 10 do 16 a
d) Lys(NE-tetradekanoyl), s tím, že jestliže jedna nebo více aminokyselin v poloze Bl, B2 a B3 je deletováno, potom číslo N-koncové aminokyseliny se spočte odpočítáním od CysB7, který je vždy označen číslem 7, a že
a) jestliže B29 a B30 jsou deletovány a shora uvedená skupina Z je přítomna na C-koncové aminokyselině B-řetězce a ani Bl, ani B2 ani B3 není deletována, potom B1-B2 neznamená zbytek Phe-Val nebo B26-B27-B28 neznamená zbytek Tyr-Thr-Pro nebo jak B1-B2, tak B26-B27-B28 znamenají jiné než tyto uvedené sekvence, a
b) jestliže B29 a B30 jsou deletovány, shora uvedená skupina Z je přítomna na C-koncové aminokyselině B-řetězce a jedna z Bl, B2 nebo B3 je deletována, potom N-koncová aminokyselina B-řetězce neznamená Val nebo B26-B27-B28 neznamená zbytek Tyr-Thr-Pro nebo jak N-koncová aminokyselina B-řetězce, tak sekvence B26-B27-B28 neznamená zbytek Tyr-Thr-Pro nebo jak N-koncová aminokyselina B-řetězce, tak sekvence B26B27-B28 neznamená zbytek Val či zbytek Tyr-Thr-Pro.
Jestliže je lipofílní skupina W připojena na α-aminovou skupinu N-koncové aminové skupiny B-řetězce, potom vazba mezi α-aminovou skupinou a W s výhodou znamená amidovou vazbu,
-5CZ 289343 B6 v níž N-koncová aminová skupina B-řetězce znamená aminovou část a skupina obsažená ve W znamená karboxylovou část.
Jestliže je lipofilní skupina Z napojena na karboxylovou skupinu C-koncové aminokyseliny B-řetězce, potom vazba mezi karboxylovou skupinou a Z s výhodou znamená amidovou vazbu, přičemž C-koncová karboxylová skupina znamená karboxylovou skupinu a aminová skupina obsažená v Z znamená aminovou část.
V jiném výhodném provedení se vynález týká shora popsaného inzulínového derivátu, v němž lipofilní skupina W je připojena na α-aminovou skupinu N-koncové aminokyseliny B-řetězce.
V jiném výhodném provedení se vynález týká shora popsaného inzulínového derivátu, v němž lipofilní skupina Z je připojena na karboxylovou skupinu C-koncové aminokyseliny B-řetězce.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze A21 je vybrána ze skupiny sestávající z Ala, Asn, Gin, Glu, Gly a Ser.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze Bl znamená Phe.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze Bije vynechána.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B2 je vybrána ze skupiny sestávající z Ala a Val.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B3 je vybrána ze skupiny sestávající z Asn, Gin, Glu a Thr.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B26 znamená Tyr.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B27 znamená Thr.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B28 znamená Pro.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B29 znamená Lys nebo Thr.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B28 znamená Lys a aminokyselina v poloze B29 znamená Pro.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B30 znamená Thr nebo ε-acylovaný Lys.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená dipeptid Thr-Lys.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená dipeptid Gly-lys.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tripeptid Glu-Ser-Lys.
-6I
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tripeptid Thr-Gly-Lys.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tetrapeptid Thr-Gly-Gly-Lys.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tetrapeptit Thr-Glu-Gly-Lys.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž Xaa v poloze 30 v sekv. id. č. 2 znamená tetrapeptid Gly-Asp-Thr-Lys.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž C-koncová aminokyselina B-řetězce znamená ε-acylovaný Lys a aminokyselina vedle C-koncové aminokyseliny znamená Gly.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B30)-inzulin.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B30)-lidský inzulín.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B28-B30)-inzulin.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B27-B30)-inzulin.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž původní inzulín znamená des(B26-B30)-inzulin.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž aminokyselina v poloze B28 znamená Pro a aminokyselina v poloze B29 znamená Thr.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina W připojena na N-koncovou α-aminoskupinu B-řetězce, přičemž W znamená skupinu obecného vzorce CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CO- kde n znamená číslo od 9 do 15.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina W připojena na N-koncovou α-aminoskupinu B-řetězce, přičemž W znamená skupinu obecného vzorce CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-, kde r znamená číslo od 9 do 15.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina W připojena na N-koncovou α-aminoskupinu B-řetězce, přičemž W znamená skupinu obecného vzorce CH3(CH2)SCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-, kde s znamená číslo do 9 do 15.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina Z připojena na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce, přičemž Z znamená skupinu obecného vzorce -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3, kde m znamená číslo od 8 do 18, tj. Z znamená N'-acylovaný lysinový zbytek.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina Z připojena na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce, přičemž Z znamená skupinu
-7CZ 289343 B6 obecného vzorce -NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO(CH2)PCH3, kde p znamená číslo od 10 do 16.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, v němž je shora uvedená skupina Z připojena na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce, přičemž Z znamená skupinu obecného vzorce -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO(CH2)qCH3, kde q znamená číslo od 10 do 16.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, který má shora uvedenou skupinu Z, která obsahuje částečně nebo úplně hydrogenovaný cyklopentanfenantrenový skelet.
V jiném výhodném provedení se vynález týká inzulínového derivátu, který má shora uvedenou skupinu Z, která znamená acylovou aminoskupinu, zvláště acylovaný lysin.
V jiném výhodném provedení se vynález týká ThrB29 lidského inzulínu, který má shora uvedenou skupinu Z připojenou na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce.
V jiném výhodném provedení se vynález týká des(B28-B30) lidského inzulínu, který má shora uvedenou skupinu Z připojenou na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce.
V jiném výhodném provedení se vynález týká des(B27-B30) lidského inzulínu, kteiý má shora uvedenou skupinu Z připojenou na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce.
V jiném výhodném provedení se vynález týká des(B26-B30) lidského inzulínu, který má shora uvedenou skupinu Z připojenou na C-koncovou aminokyselinu B-řetězce.
V jiném výhodném provedení se vynález týká použití inzulínového derivátu podle vynálezu pro výrobu íéčivového přípravku pro léčení diabetes.
V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku pro léčení diabetes pacientů, kteří toto léčení potřebují, přičemž tento přípravek obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.
V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku pro léčení diabetes u pacientů, kteří toto léčení potřebují, přičemž tento přípravek obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle vynálezu ve směsi s inzulínem nebo analogem inzulínu, který má rychlý nástup působení, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.
V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku, který obsahuje inzulínový derivát podle vynálezu, který je rozpustný při fyziologických hodnotách pH.
V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku, který obsahuje inzulínový derivát podle vynálezu, který je rozpustný při pH v rozmezí od 6,5 do 8,5.
V jiném výhodném provedení se vynález týká protrahovaného farmaceutického přípravku obsahujícího inzulínový derivát podle vynálezu.
V jiném výhodném provedení se vynález týká farmaceutického přípravku, kterým je roztok obsahující od 120 nmol/ml do 1200 nmol/ml, s výhodou 600 nmol/ml inzulínového derivátu podle vynálezu.
V jiném výhodném provedení se vynález týká způsobu léčení diabetes u pacienta, který toto léčení potřebuje, vyznačující se tím, že se pacientovi podává terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle tohoto vynálezu společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.
-8CZ 289343 B6
V jiném výhodném provedení se vynález týká způsobu léčení diabetes u pacienta, který toto léčení potřebuje, vyznačující se tím, že se pacientovi podává terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle tohoto vynálezu ve směsi s inzulínem nebo analogem inzulínu, který má rychlý nástup působení, společně s farmakologicky přijatelným nosičem.
Příklady výhodných inzulínových derivátů podle předloženého vynálezu jsou následující:
(NEB30-tetradekanoyl)ThrB29,LysB30-lidský inzulín, (NeB28-tetradekanoyl)LysB28des(B29,B30)-lidský inzulín, (N'B27-tetradekanoyl)LysB27des(B28-B30)-lidský inzulín, (NsB26-tetradekanoyl)LysB26des(B27-B30)-lidský inzulín a (NsB29-acetyl,NEB32-tetradekanoyl)GluB3°, SerB31 ,LysB32-lidský inzul in.
Předložený vynález je dále ilustrován odkazem na připojené obrázky, kde:
obrázek 1 ukazuje konstrukci plazmidů pKV153, pKV159, pJB173, pJB174 a pJB175 a obrázek 2a, který pokračuje jako obrázek 2b, ukazuje sekvenci pMT742, poloha 907 až 1500, a oligonukleotidy č. 94, č. 593, č. 2371 a č. 3075 použité pro pCRlA, pCRlB a pCRIC z příkladu 1. Sekvence o 138 aminokyselinách odpovídající MF alfa prepro-leaderu (aminokyseliny č. 1 až 85) a inzulínový prekurzor, který má aminokyselinovou sekvenci B(l-29)AlaAlaLys.A(l-21), kde A(l—21) znamená A řetězec lidského inzulínu a B(l—29) znamená B-řetězec lidského inzulínu, v němž chybí Thr(B30), je uvedena pod kódující sekvencí (aminokyseliny č. 86 až 138).
V další části spisu bude vynález popsán podrobněji.
Třípísmenkové kódy a jednopísmenkové kódy pro zbytky aminokyselin, jak jsou zde používány, jsou uvedeny v J. Biol. Chem. 243, 3558 (1968).
V DNA sekvencích A znamená adenin, C znamená cytosin, G znamená guanin a T znamená thymin.
Ve spisu jsou používány následující zkratky:
DMSO pro dimethylsulfoxid,
DMF pro dimethylformamid, Boc pro terc.butoxykarbonyl, NMP pro l-methyl-2-pyrrolidon, TFA pro trifluoroctovou kyselinu, X-OSu pro N-hydroxysukcinimidový ester, X pro acylovou skupinu a
RP-HPLC pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografii na obrácených fázích.
Příklady provedení vynálezu
Inzulínové deriváty podle předloženého vynálezu se mohou připravovat mimo jiné následujícími způsoby.
1. Inzulínové deriváty, vyznačující se tím, že mají v poloze B30 aminokyselinový zbytek, který může být kódován genetickým kódem, např. threonin (lidský inzulín) nebo alanin (vepřový inzulín)
-9CZ 289343 B6
1.1 Inzuliny modifikované připojením lipofilní skupiny W na N-koncovou aminovou skupinu, vycházející z lidského inzulínu
Lidský inzulín se nechá zreagovat s Boc-reakčním činidlem (např. di-terc.butyldikarbonátem). Vytvoří se (Al,B29)-diBoc-lidský inzulín, tj. lidský inzulín, v němž N-konec A-řetězce a ε-aminoskupina Lys829 jsou chráněny Boc-skupinou. Po případném vyčištění, např. HPLC, se do α-aminové skupiny PheB1 zavede acylovaná skupina tak, že se produkt nechá zreagovat s N-hydroxysukcinimidovým esterem obecného vzorce W-OSu, v němž W znamená acylovou skupinu jak shora uvedeno, která má být zavedena na N-koncovou α-aminovou skupinu B-řetězce. V konečném stupni se pro odstranění Boc-skupiny použije TFA. Izoluje se produkt N“b1-W lidský inzulín.
2. Inzulínové deriváty bez aminokyselinového zbytku v poloze B30, tj. des(B30) inzuliny
2.1 Výchozím materiálem je lidský nebo vepřový inzulín
Reakcí s karboxypeptidázou A v amoniakovém pufru jak lidský tak vepřový inzulín poskytly des(B30)-inzulin. Po případném vyčištění se des(B30)-inzulin nechá zreagovat s Boc-reakčním činidlem (např. di-terc.butyl-dikarbonátem). Vznikne (Al,B29)-diBoc-des(B30)-inzulin. Po případném vyčištění, např. HPLC, se do α-aminové skupiny aminokyseliny v poloze B1 zavede acylová skupina tak, že se produkt nechá zreagovat s N-hydroxysukcinimidovým esterem obecného vzorce W-OSu, v němž W znamená acylovou skupinu, která má být zavedena.
V konečném stupni se pro odstranění Boc-skupin použije TFA. Izoluje se produkt - (N“B1W)des(B3 0)-inzulin.
2.2 Výchozím materiálem je prekurzor lidského inzulínu s jedním řetězcem
Jako výchozí materiál se může použít prekurzor lidského inzulínu s jedním řetězcem, který je rozšířen v poloze B1 přidáním Ext, které je napojeno B1 argininovým zbytkem a který má můstek od C-koncového lysinu v poloze B26, B27, B28 nebo B30 na AI. Tímto můstkem je s výhodou peptid obecného vzorce Yn-Arg, v němž Y znamená kodovatelnou aminokyselinu kromě cysteinu, lysinu a argininu, a n znamená číslo nula nebo číslo mezi 1 a 35. Jestliže n>l,
V mohou znamenat různé aminokyseliny. Výhodnými příklady můstku od Lys v poloze B26, B27, B28 nebo B30 na AI jsou: AlaAlaArg, SerArg, SerAspAspAlaArg a Arg (evropský patent č. 163 529). Reakce tohoto prekurzoru obecného vzorce Xtx-Arg-B(l-Q)-Yn-Arg-A(l-21), v němž Q znamená 26, 27, 28 nebo 3, s lysylendopeptidázou, např. Achromobacter lyticus proteázou, poskytuje Ext-Arg-B(l-Q) Yn-Arg-A(l-21)-inzulin. Acylace tohoto meziproduktu N-hydroxysukdinimidovým esterem obecného vzorce X-OSu, v němž X znamená acylovou skupinu, zavádí acylovou skupinu X do ε-aminové skupiny LysBQ a do N-koncové aminoskupiny A-řetězce a B-řetězce za vzniku (NeBQ-X) X-Ext-Arg-B(l-Q) X-Yn-Arg-A(l-21)inzulinu. Tento meziprodukt reakcí s trypsinem ve směsi vody a vhodného organického rozpouštědla, např. DMF, DMSO nebo nižšího alkoholu, poskytuje žádaný derivát, Z-lidský inzulín, v němž Z znamená Lys^-Y.
V další části popisu jsou popsány farmaceutické přípravky.
Farmaceutické přípravky obsahující derivát lidského inzulínu podle předloženého vynálezu se mohou pacientům, kteří to potřebují, podávat parenterálně. Parenterální podávání se může provádět subkutánní, intramuskulámí nebo intravenózní injekcí injekční stříkačkou, popřípadě injekčním perem. Parenterální podávání se může provádět také infuzní pumpou. Další volbou je prostředek, který může být prášek nebo kapalina pro podávání derivátu lidského inzulínu jako nazální sprej.
-10CZ 289343 B6
Farmaceutické prostředky obsahující sloučeniny podle předloženého vynálezu se mohou připravovat konvenčními způsoby, např. jak je popsáno v Remingtonů Pharmaceutical Sciences, 1985.
Injektovatelné lidské inzulínové prostředky podle vynálezu se mohou připravovat konvenčními způsoby farmaceutického průmyslu, které zahrnují rozpuštění a smíchání složek tak, aby se získal žádaný produkt.
Podle jednoho postupu se lidský inzulínový derivát rozpustí v takovém množství vody, které je poněkud menší než konečný objem prostředku, který se připravuje. Podle potřeby se přidá izotonické činidlo, ochranné činidlo a pufr a pH roztoku se upraví, jestliže je to nutné, kyselinou, např. kyselinou chlorovodíkovou, nebo bází, např. vodným hydroxidem sodným, podle potřeby. A nakonec se objem roztoku upraví vodou tak, aby se získala žádaná koncentrace složek.
Příklady izotonických činidel jsou chlorid sodný, mannitol a glycerol.
Příklady ochranných činidel jsou fenol, m-kresol, methylester p-hydroxybenzoové kyseliny a benzylalkohol.
Příklady vhodných pufrů jsou octan sodný a fosforečnan sodný.
Výhodnými farmaceutickými prostředky příslušných inzulínů podle předloženého vynálezu jsou roztoky hexamemích komplexů. Hexamemí komplexy jsou typicky stabilizovány dvěma nebo více ionty zinku a třemi nebo více molekulami fenolické sloučeniny, jako je fenol nebo m-kresol nebo jejich směsi na hexamer.
Ve zvláštním provedení se získává prostředek, kteiý obsahuje dva různé inzulíny, jeden s protrahovaným profilem působením a jeden s rychlým nástupem působení, ve formě rozpustných hexamemích komplexů. Hexamemí komplexy jsou typicky stabilizovány dvěma nebo více iontu zinku a třemi nebo více molekulami fenolické sloučeniny, jako je fenol nebo meta-kresol nebo jejich směsi, na hexamer. Tyto komplexy jsou směsi hexamerů příslušných inzulínů a směsných hexamerů, v nichž je poměr mezi dvěma různými inzulíny od 1:5 do 5:1.
Prostředek pro nazální podávání inzulínového derivátu podle předloženého vynálezu se může připravovat například tak, jak je to popsáno v evropském patentu č. 272 097 (Novo Nordisk A/S).
Inzulínové prostředky podle tohoto vynálezu se mohou používat pro léčení diabetes. Optimální dávka pro pacienta bude záviset na různých faktorech, mezi něž patří účinnost specifického používaného lidského inzulínového derivátu, věk, tělesná hmotnost, fyzická aktivita, dieta pacienta, na možné kombinaci s jinými léčivými látkami a na intenzitě diabetes. Doporučuje se, aby denní dávka lidského inzulínového derivátu podle tohoto vynálezu byla stanovena pro každého jednotlivého pacienta odborníkem z oblasti techniky podobným způsobem jako je to u známých inzulínových prostředků.
Jestliže je to vhodné, deriváty lidského inzulínu podle tohoto vynálezu se mohou používat ve směsi s jinými typy inzulínů, například lidským inzulínem, vepřovým inzulínem nebo analogy inzulínu s rychlejším nástupem působením. Příklady těchto analogů inzulínu jsou popsány např. v evropských patentových přihláškách č. 214 826 (Novo Nordisk A/S), 375 437 (Novo Nordisk A/S) a 382 472 (Eli Lilly & Co.).
Předložený vynález je dále ilustrován následujícími příklady, které však nejsou zkonstruovány jako omezení rozsahu ochrany. Vlastnosti popsané v předcházejícím popisu a v následujících příkladech mohou, jak odděleně tak vjakékoliv kombinaci, být materiálem pro uskutečnění vynálezu v jeho různých formách.
-11 CZ 289343 B6
Plazmidy a DNA materiál
Všechny expresní plazmidy jsou typu cPOT. Takové plazmidy jsou popsány v evropské patentové přihlášce č. 171 142 a vyznačují se tím, že obsahují Schizosaccaromyces pombe triosofosfátisomerázový gen (POT) pro selekci a stabilizaci plazmidu. Plazmid obsahující POT-gen je dostupný z uloženého E. coli kmene (ATCC 39 685). Plazmidy dále obsahují S. carevisiae triosofosfátisomerázový promotor a terminátor (Ptpi a TTpi). Jsou identické s pMT742 [Engel-Mitami M. a spol.: Gene 73, 113 až 120 (1988).] (viz obr. 1) až na oblast definovanou EcoRI-Xbal restrikčními místy zahrnujícími oblast kódující MF alfa prepro-leader/produkt. EcoRI/Xbal fragment plazmidu pMT742 samotný kóduje MF alfa prepro-leader sekvenci Saccharomyces cerevisiae následovanou inzulínovým prekurzorem MI3, který má můstek Ala-Ala-Lys spojující B29 a A1 (tj. B( l-29)-Ala-Ala-Lys-A( 1-21)) (viz obr. 2).
Syntetické DNA fragmenty byly syntetizovány na automatickém syntetizátoru DNA (Applied Biosystems model 380A), pomocí fosforamiditové chemie a komerčně dostupných reakčních činidel [Beacage S.L. a Caruthers M.H.: Tetrahedron Letters 22, 1859 až 1869 (1981).].
Všechny další způsoby a materiály používají obvyklý stav znalostí z oblasti techniky [viz např. Sambrook J., Fritsch E. F. a Miniatis T.: Molecular Cloning: A Laboratoiy Manual“, Cold Spring Harbour Larboratory Press, New York, 1989.).].
Analytické způsoby
Molekulární hmotnost vyrobených inzulínových prekurzorů byly získány hmotnostní spektroskopií (MS), buď hmotnostní spektrometrií sdesorpcí plazmou (PDMS) použitím přístroje Bio-Ion 20 (Bio-Ion Nordic AB, Uppsala, Švédské) nebo hmotnostní spektrometrií s ionizací elektrosprejem (ESMS) použitím přístroje API III Biomolecular Mass Analyzer (Perkin Elmer Sciex Instuments, Thomhill, Kanada).
Lipofilnost inzulínových derivátů vzhledem k lidskému inzulínu, k'rei, byla měřena na HPLC koloně LiChrosorb(R) RP 18 (5 pm, 250 x 4 mm) izokratickou elucí při 40 °C použitím směsi A. 0,lM pufr fosforečnanu sodného, pH 7,3, obsahující 10% (hmotn.) acetonitrilu a B: 50% (hmotn.) acetonitrilu ve vodě. Eluce byla sledována absorpcí eluátu při 214 nm. Mrtvý čas to byl zjištěn injektováním 0,1 mM dusičnanu sodného. Retenční doba lidského inzulínu thuman byla upravena měřením poměru roztoků A a B tak, aby činila alespoň 2t<,. Hodnota k'rei je definována jako pOmer (tderivátu~toX(lhuman—to)·
Jako míra protrahování (zpomalené uvolňování) sloučeniny podle vynálezu byla studována rychlost mizení u prasat a byla stanovena hodnota T5o% . Tso% je doba, za kterou vymizí 50 % hmotn. A14 Tyr(l25I)-značeného analogu z místa injekce, měřeno vnějším γ-počítačem (Ribel U. a spol.: „The Pig as a Model for Subcutaneous Absorption in Man“, V. M. Serrano-Rios aP. J. Leferbe (red.); Diaberes 1985; Proceedings of the 12th Congress of the Intemational Diabetes Federation“, Madrid, Španělsko, 1985 (Excerpta Medica, Amsterodam, 891 až 896 (1986).).)
Příklad 1
Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-29)-Ser-Asp-AspAla-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru z kvasinkového kmene yKV153 použitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu
-12CZ 289343 Β6
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
Č. 593 5' -CCAAGTACAAAGCTTCAACCAAGTGGGAACCGCACAAGTGTTGGTTAA
CGAATCTTGTAGCCTTTGGTTCAGCTTCAGCTTCAGCTTCTTCTCTTTTAT CCAAAGAAACACC-3 *
Č. 94 5'-TAAATCTATAACTACAAAAAACACATA-3'
Č. 3075 5 ' -TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC
ACTCCTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTG-3' a
č.2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3'.
Byly provedeny následující dvě polymerázové řetězce reakce (PCR) pomocí sestavy Gene Amp PCR reagent kit (Perkin Almer, 761 Main Avewark, Kt. USA) podle pokynů výrobce (viz obr. 2).
PCR1A:
0,2 μΐ pMT742 plazmidového templátu,
4,0 μΐ oligonukleotidu č. 593 (100 pmol),
4,0 μΐ oligonukleotidu č. 94 (100 pmol),
10,0 μΐ lOx PCR pufru,
10,0 μΙ 2,5MmdNTP,
0,5 μΐ Taq polymerázového enzymu,
71,3 μΐ vody.
PCR1B:
0,2 μΐ pMT742 plazmidového templátu,
4,0 μΐ oligonukleotidu č. 3075 (100 pmol),
4,0 μ oligonukleotidu č. 2371 (100 pmol),
10,0 μΐ lOx PCR pufru,
10,0 μΐ 2,5Mm dNTP,
0,5 μΐ Taq polymerázového enzymu,
71,3 μΐ vody.
V obou případech byly provedeny dva cykly při 94 °C 1 min., 45 °C 1 min a 72 °C 1 min. a následně 11 cyklů: 94 °C 1 min., 55 °C 1 min. a 72 °C 1 min.
μΐ každé PCR směsi se nanese na 2% (hmotn.) agarosový gel a podrobí se elektroforéze standardními způsoby [Sambrook a spol.: „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.]. Výsledné DNA fragmenty (452 párů nukleotidů od PCR1A a 170 párů nukleotidů od PCR1B) byly vyříznuty zagarosového gelu a byly izolovány sestavou Gene Clean (BiolOl lne., PO Box 2284, La Jolla, Ka. USA) podle pokynů výrobce. Vyčištěné DNA fragmenty byly rozpuštěny ve 100 μΐ vody.
-13CZ 289343 B6
Byla provedena následující PCR:
PCR1C:
1,0 μΐ DNA fragmentu z PCR 1 A,
1,0 μΐ DNA fragmentu z PCR1B,
10,0 μΐ lOx PCR pufru,
10,0 μΐ 2,5Mm dNTP,
0,5 μΐ Tag polymerázového enzymu,
69,5 μΙ vody.
Byly provedeny dva cykly při 94 °C 1 min., 45 °C 1 min. a 72 °C 1 min.
Potom byly přidány 4 μΐ oligonukleotidu č. 94 (lOOpmol) a 4,0 μΐ oligonukleotidu č. 2371 (100 pmol). Bylo provedeno 15 cyklů při 94 °C 1 min., 55 °C 1 min. a 72 °C 1 min.
PCR směs se nanese na 1% (hmotn.) agarosový gel. Výsledné fragmenty o 594 párech nukleotidů (pn.) se vyčistí sestavou Gene Clean Kit jak shora popsáno. Vyčištěný PCR DNA fragment se rozpustí ve 20 μΐ vody a pufru restrikčních endonukleáz a rozštěpí se restrikčními endonukleázami EcoRI a Xbal (New England Biolabs, lne., Ma. USA). Výsledný EcoRI/Xbal restrikční fragment o 550 pn. se nechá běžet na agarosovém gelu. Izoluje se vyčištěním sestavou Gene Clean.
Dvěma oddělenými štěpeními restrikčními endonukleázami se plazmid pMT742 rozštěpí i) restrikčními endonukleázami Apal a Xbal a ii) restrikčními endonukleázami Apal a EcoRI. Z těchto štěpení se izoluje Apal/Xbal restrikční fragment o 8600 pn a Apal/EcoRI restrikční fragment o 2100 pn.
Tyto tři fragmenty (tj. EcoRI/Xbal restrikční fragment o 550 pn z PCR1C, Apal/Xbal restrikční fragment o 8600 pn a Apal/EcoRI restrikční fragment o 2100 pn zpMT742) se spolu ligují pomocí T4 DNA ligázy za standardních podmínek [Sambrook a spol.: „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.] (viz obr. 1). Ligační směs se transformuje do příslušných E. coli buněk (Apr‘). Následuje selekce na ampicilinovou rezistenci. Z výsledných E. coli kolonií se standardními DNA minipreparačními způsoby (Sambrook a spol.: „Molecular Cloning“, Cold Spring Harbour Laboratory Press, 1989.) izolují plazmidy, které se zkontrolují příslušnými restrikčními endonukleázami (tj. EcoRI, Apal a Xbal). DNA sekvenční analýzou (sestavou Sequenase od U.S. Biochemical Corp. podle pokynů výrobce) bylo ukázáno, že vybraný plazmid označený pKV153 obsahuje správnou sekvenci kódující MF alfa preproleader/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-29)-Ser-Asp-AspAla-Arg-A( 1-21) inzulínový prekurzor.
Plazmid pVK153 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663 a vybrán pro růst na glukóze, jak je popsáno v evropské patentové přihlášce publikované pod č. 214 826.
Výsledný kvasinkový kmen byl označen yKV153. HPLC a hmotnostní spektrometrií bylo ověřeno, že v kultivačním médiu produkuje Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-LysAla-Thr-Arg-B( l-29)-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) inzulínový prekurzor.
- 14CZ 289343 B6
Příklad 2
Syntéza LysB30(NE-tetradekanoyl)ThrB29-lidského inzulínu
2a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Ala-Glu-Glu-Ala-Ala-Glu-Glu-Ala-Glu-Při-Lys-AlaThr-Arg-B( l-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) inzulínového prekurzoru z kvasinkového kmene yKV153 s po užitím S. cerevisiae MS alfa prepro-leaderu
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
č. 3881 5 ' -TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACTCCTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3 · a
č. 2371 5·-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3·.
Byla provedena následující polymerázová řetězcová reakce (PCR) pomocí sestavy Gene Amp PCR Reagent Kit jak shora popsáno.
PCR2:
0,2μ1 pKV153 plazmidového templátu (z příkladu 1),
4,0 μΐ oligonukleotidu č. 3881 (100 pmol),
4,0 μΐ oligonukleotidu č. 2371 (100 pmol),
10,0 μΐ lOxPCRpufru,
10,0 μ! 2,5mMdNTP,
0,5 μΐ Tag polymerázového enzymu,
71,3 μΐ vody.
Byly provedeny dva cykly při 94 °C 1 min., 45 °C 1 min. a 72 °C 1 min. a následně 11 cyklů: 94 °C 1 min., 55 °C 1 min. a 72 °C 1 min.
PCR směs se nanese na 2% (hmotn.) agarosový gel a výsledný fragment o 174 pn se vyčistí sestavou Gene Clean kit jak shora popsáno. Vyčištěný PCR DNA fragment se rozpustí ve 20 μΐ vody a pufru restrikčních endonukleas a rozštěpí se restrikčními endonukleázami HindlII a Xbal. Výsledný HindlII/Xbal restrikční fragment o 153 pn se oddělí na agarosovém gelu. Izoluje a vyčistí se sestavou gene Clean Kit.
Dvěma oddělenými štěpeními restrikčními endonukleasou se plazmid pMT742 rozštěpí restrikčními endonukleázami Apal a Xbal, zatímco pKV153 (z příkladu 1) se rozštěpí restrikčními endonukleázami Apal a EcoRI. Z těchto štěpení se z pMT742 izoluje Apal/Xbal restrikční fragment o 8600 pn a z pKV153 Apal/EcoRI restrikční fragment o 2100 pn.
Tyto tři fragmenty (tj. EcoRI/Xbal restrikční fragment o 550 pn zPCR2, Apal/Xba restrikční fragment o 8600 pn z pMT742 a Apal/EcoRI restrikční fragment o 2100 pn z pKV153) se spolu ligují pomocí T4 DNA ligázy jak shora popsáno (viz obrázek 1). Ligační směs se transformuje do příslušných E. coli buněk (Apr). Následuje selekce na ampicilinovou rezistenci. Z výsledných E. coli kolonií se izolují plazmidy, které se zkontrolují příslušnými restrikčními endonukleázami (tj. HindlII, Apal a Xbal) jak shora popsáno.
Dna sekvenční analýzou bylo ukázáno, že vybraný plazmid označený pKV159 obsahuje správnou sekvenci kódující MF alfa prepro-leader/Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Glu-Ala-ProLys-Ala-Thr-Arg-B(l-28)-Trh-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínový prekurzor.
-15CZ 289343 B6 pKV159 byl transformován do S. cerevisiae kmene MT663 a vybrán pro růst na glukóze jak shora popsáno.
Výsledný kvasinkový kmen byl označen yK.V159. HPLC a hmotnostní spektrometrií bylo ověřeno, že v kultivačním médiu produkuje Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-LysAla-Thr-Arg-B(l-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) inzulínový prekurzor.
2b. Izolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-GIu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-28)-Thr-LysSer-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru
Kmen yKV159 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 5 litrů živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřeďováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a inzulínový prekurzor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine(R) 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline(R) SP. Po promytí 25mM citrátovým pufrem, pH 3,6, byl prekurzor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. pH bylo upraveno na 2,5 a prekurzor byl vyčištěn RP-HPLC na 15μ kulovitém Cl8 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1000 nm, 0,2M Na2SO4, pufrem 0,04M H3PO4 a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu. Prekurzor se eluoval 27 až 28% (hmotn.) acetonitrilem. Spojená část obsahující střední hlavní maximum prekurzoru byla odsolena gelovou filtrací na Sephadexu(R) G-50 F v 0,5M kyselině octové. Prekurzor byl izolován lyofilizací. Výtěžek: 486 mg.
2c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(l-28)-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
486 mg jednovláknového prekurzoru, získaného jak shora popsáno, se rozpustí ve 30 ml 0,05M glutamátového pufru při pH 9,0. Přidají se 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteázového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 5 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. Rozšířený inzulín o dvou řetězcích se překrystaluje přidáním 10 mi ethanolu, 845 mg dihydrátu citrátu sodného a 78 mg chloridu zinečnatého. Po úpravě pH na 6,1 a skladování přes noc při 4 °C se krystaly izolují odstřeďováním, promyjí se dvakrát izopropanolem a vysuší se ve vakuu. Výtěžek 450 mg.
2d. Syntéza ΝαΑ'5, NaB~3, NEB30-tris(tetradekanolyl)-Ala-Thr-Arg-B(l-28)-Thr-Lys-Ser-AspAsp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
450 mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích, získaného jak shora uvedeno, se rozpustí ve směsi 3,15 ml DMSO a 0,69 ml 2M diizopropylethylaminu vNMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,69 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 112 ml 0,01M glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl izolován triacylovaný meziprodukt.
2e. Syntéza LysB30(NE-tetradekanoyl)-ThrB29 lidského inzulínu
K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 5 ml imobilizovaného trypsinového gelu (viz PCT/KD94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 16 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (2,5 x 25 cm) s náplní QAE-Sephadex(R) A-25. Izokratická eluce byla prováděna rychlostí 17,3 ml/h 0,12M NH4CI pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upraveném amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 650 ml. Byl spojen podíl od 650 do 754 ml. Nakonec byl pufr změněn na 0,01M NH4HCO3 gelovou filtrací na náplni Sephadex(R) G-50 Fine. Produkt byl izolován v suchém stavu lyofilizací. Výtěžek: 91 mg.
Molekulová hmotnost titulní sloučeniny zjištěná MS: 6020 ± 6, vypočteno: 6018. Molekulová hmotnost B-řetězce zjištěná MS: 3642 ± 5, vypočteno: 3640. Molekulová hmotnost C-konco
-16CZ 289343 B6 vého fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 proteázou zjištěná MS: 1326 ± 2, vypočteno: 1326. Relativní lipofilnost k'rei 113. Poločas vymizení T5o% po subkutánní injekci vepřům: 20,3 ± 5,2 h (n=6).
Příklad 3
Syntéza LysB28(NE-tetradekanoyl)-des(B29-B30)-lidského inzulínu
a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-27)-Lys-SerAsp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru z kvasinkového kmene yJB173 použitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
č. 627 5'-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTC
TACACTAAGTCTGACGATGCTAG-3' a
Č. 2371 5,-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3z.
DNA kódující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-27)-LysSer-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 s náhradou oligonukleotidu č. 3881 oligonukleotidem č. 627.
Výsledný plazmid byl označen pJB173 a kvasinkový kmen exprimují Glu-Glu-Ala-GluAla-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) byl označen yJB173.
3b. Izolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-27)-Lys-SerAsp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru
Kmen yJB173 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 4,81 živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřeďováním a hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0. Vodivost byla 7,8 mS/cm. Inzulínový prekurzor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine(R) 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline(R) SP. Po promyjtí 25mM citrátovým pufrem, pH 3,6, byl prekurzor eluován 0,5m amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. Volný amoniak byl ve vakuu odpařen za teploty místnosti. Hodnota pH výsledných 280 ml byla upravena kyselinou chlorovodíkovou na 9,0.
3c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B( 1-27)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
K 280 ml roztoku 118 mg jednovláknového prekurzoru, získaného jak shora popsáno, se přidají 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteázového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 24 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 3,5. Roztok byl zfdtrován 0,45μ fdtrem Millipore(R). Rozšířený inzulín se dvěma řetězci byl vyčištěn ve dvou podílech RP-HPLC na 15μ kulovitém Cl8 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1000 nm (kolona 2 x 20 cm), 0,2M Na2SO4, 0,04M H3PO4, pH 3,5, jako pufr a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu rychlostí 4 ml/min a teplotě kolony 40 °C. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 30 až 31 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů (70 ml) odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na koloně (5 x 47 cm) Sephadexu G-50 F v 0,5M kyselině octové. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem byl izolován lyofilizací. Výtěžek: 110 mg.
-17CZ 289343 B6
3d. Syntéza N“A 5, NaB“3, NEB28-tris(tetradekanoyl)-Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Lys, Ser-Asp-AspAla-Arg-A(l-21) inzulínu
110 mg rozšířeného inzulinu o dvou řetězcích, který se získá jak shora popsáno, se rozpustí ve směsi 0,84 ml DMSO a 0,275 ml 2m diizopropylethylaminu v NMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,185 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 32,5 ml 0,01M glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl izolován triacylovaný meziprodukt.
3e. Syntéza L828(NE-tetradekanoyl)-des(B29-B30) lidského inzulinu
K. výslednému roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1,5 ml imobilizovaného trypsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 18 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (1,5 x 21 cm) s náplní QAE-Sephadex(R) A-25. Izokratická eluce byla prováděna rychlostí 10 ml/h 0,12m NH4CI pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 250 až 390 ml s maximem u 330 ml. Nakonec byl pufr změněn na 0,01M NH4HCO3 gelovou filtrací na náplni Sephadex(R) G-50 Fine. Produkt byl izolován v suchém stavu lyofilizací. Výtěžek: 47 mg.
Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5820 ± 2, vypočteno: 5819. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3444 ± 4, vypočteno: 3442. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 proteázou nalezená MS: 1128 ± 2, vypočteno: 1128. Relativní lipofilnost k'ret =121. Poločas vymizení T50% po subkutánní injekci u vepřů: 19,6 ± 3,6H(n = 4).
Příklad 4
Syntéza LysB27(Ns-tetradekanoyl)-des(B28-B30) lidského inzulinu
4a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-26)-Lys-SerAsp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru z kvasinkového kmene yJB174 s použitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
č. 628 5 r-C ACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTC
TACAAGTCTGACGATGCTAG-3' a
e. 2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3'.
DNA kódující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-26)-LysSer-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 až na to, že se oligonukleotid č. 3881 nahradí oligonukleotidem č. 628.
Výsledný plazmid byl označen pJB174 a kvasinkový kmen exprimující Glu-Glu-Ala-GluAla-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-26)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) byl označen yJB174.
-18CZ 289343 B6
4b. Izolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-26)-Lys-SerAsp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru
Kmen yJB174 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 3,5 litru živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřeďováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn vodou na 8 litrů, aby se snížila koncentrace soli. Výsledná vodivost byla 7,9 mS/cm. Inzulínový prekurzor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine(R) 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline(Ř) SP. Po promytí 25mM citrátovým pufrem, pH 3,6, byl prekurzor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. Volný amoniak byl ve vakuu odpařen za teploty místnosti. Hodnota pH výsledných 280 ml byla upravena kyselinou chlorovodíkovou na 9,0.
4c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(l-26)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
K roztoku 280 ml jednovláknového prekurzoru, získaného jak shora popsáno, se přidají 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteázového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 13 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 2,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Millipore(R). Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve čtyřech podílech RP-HPLC na 15μ kulovitém Cl8 oxidu křemičitém o velikosti pórů 2,5, a gradientem od 24 do 33 % hmotn. acetonitrilu. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 30 až 31 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na Sephadexu G-5é F v 0,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 cm). Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem byl izolován lyofilizací. Výtěžek: 69 mg.
4d. Syntéza NaA_5, N“B~3,NEB27-tris(tetradekanolyl)-Ala-Thr-Arg-B(l-26)-Lys, Ser-Asp-AspAla-Arg-A(l-21) inzulín mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích získaného jak popsáno pod 4e, se rozpustí ve směsi 0,44 ml DMSO a 0,15 ml 2M diizopropylethylaminu vNMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,096 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 17 ml 0,01M glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl izolován triacylovaný meziprodukt.
4e. Syntéza LB27(NE-tetradekanoyl)-des(B28-B30) lidského inzulínu
K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1 ml imobilizovaného trypsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 26 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (1,5 x 25,5 cm) s náplní QAE-Sephadex(R) A-25. Izokratická eluce byla prováděna rychlostí 17,3 ml/h 0,12M NH4CI pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 360 ml. Byl shromažďován podíl 272 až 455 ml. Nakonec byl pufr změněn na 0,01M NH4HCO3 gelovou filtrací na náplni Sephadex(R) G-50 Fine. Produkt byl izolován v suchém stavu lyofilizací. Výtěžek: 38 mg.
Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5720 + 6, vypočteno: 5718. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3343 ± 4, vypočteno: 3340. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 proteázou nalezená SM: 1027 ± 2, vypočteno: 1027. Relativní lipofílnost k'rei = 151. Poločas vymizení T50% po subkutánní injekci u vepřů: 15,2 ±2,2 h (n = 5).
-19CZ 289343 B6
Příklad 5
Syntéza LysB26(NE-tetradekanoyl)des(B27-B30) lidského inzulínu
5a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-25)-Lys-SerAsp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru z kvasinkového kmene yJB175 s použitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
Č. 629 5 '-CACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTC
AAAGTCTGACGATGCTAG-3' a
č. 2371 5'-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG—3z·
DNA kódující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-25)-LysSer-Asp-Asp-Ala-A(l-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 až na to, že se oligonukleotid č. 3881 nahradí oligonukleotidem č. 629.
Výsledný plazmid byl označen pJB175 a kvasinkový kmen exprimující Glu-Glu-Ala-GluAla-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-25)-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) byl označen yJB175.
5b. Izolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-25)-Lys-SerAsp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru
Kmen yJB175 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 3,7 litru živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřeďováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn vodou na 8,5 litru, aby se snížila koncentrace soli. Výsledná vodivost byla 7,7 mS/cm. Inzulínový prekurzor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine(R) 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline(R) SP. Po promytí 25mM citrátovým pufrem, pH 3,6, byl prekurzor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. Volný amoniak byl ve vakuu odpařen za teploty místnosti. Hodnota pH výsledných 270 ml byla upravena kyselinou chlorovodíkovou na 9,0.
5c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(l-25)-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
K roztoku 270 ml jednovláknového prekurzoru získaného jak shora popsáno se přidají 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteázového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 23 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 2,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Millipore<R). Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve čtyřech podílech RP-HPLC na 15μ kulovitém C18 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1000 nm (kolona 2 x 20 cm), 0,2M Na2SO4, 0,04M H3PO4 pufr, pH 3,5, a gradientem od 24 do 33 % hmotn. acetonitrilu. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 29 až 31 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na Sephadexu(R) G-50 F v 0,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 cm). Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem byl izolován lyofilizací. Výtěžek: 81 mg.
5d. Syntéza NaA“5,NaB_3,NeB26-tris(tetradekanolyl)-Ala-Thr-Arg-B(l-25)-Lys, Ser-Asp-AspAla-Arg-A(l-21) inzulínu mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích se rozpustí ve směsi 0,56 ml DMSO a 0,19 ml 2M diizopropylethylaminu vNMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,124 ml 0,3M
-20CZ 289343 B6
N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 21,8 ml 0,01M glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl izolován triacylovaný meziprodukt.
5e. Syntéza LB26(NE-tetradekanoyl)-des(B27-B30) lidského inzulínu
K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1 ml imobilizovaného trypsinového gelu (viz PCT/DK.94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 23 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (1,5 x 25,5 cm) s náplní QAE-Sephadex(R) A-25. Izokratická eluce byla prováděna rychlostí lí,3 ml/h 0,12M NH4CI pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony po eluování 320 ml. Byla shromažďována frakce od 320 do 535 ml. Nakonec byl pufr změněn na 0,01M NH4HCO3 gelovou filtrací na náplni Sephadex(R) G-50 Fine. Produkt byl izolován v suchém stavu lyofílizací. Výtěžek: 25 mg.
Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5555 ± 6, vypočteno: 5555. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3179 + 4, vypočteno: 3178. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 proteázou nalezená MS: 864 ± 1, vypočteno: 863,5. Relativní lipofilnost k'rei =151. Poločas vymizení T5o% po subkutánní injekci u vepřů: 14,4 ± 1,5 (n = 5).
Příklad 6
Syntéza (N-(l-karboxytridecyl)-2-aminosukcinyl)-PheaBI-des(B30) lidského inzulínu
Al,B29-diBoc-des(B30) lidský inzulín (200 mg, 0,033 mmol) byl rozpuštěn vDMF (15 ml). K. tomuto roztoku byl přidán triethylamin (20 μΐ). Přidá se N-hydroxysukcinimidový ester N-(lkarbomethoxytridecyl)-2-amidojantarové kyseliny (16 mg, 0,033 mmol). Po 4 h za teploty místností se reakční směs odpaří ve vakuu do sucha. Boc skupiny se odstraní 30 minutovou reakcí s trifluoroctovou kyselinou (5 ml) za teploty místnosti. Trifluoroctová kyselina se odstraní odpařením ve vakuu. Odparek se rozpustí při 0 °C v 0,lN NaOH (20 ml). Zmýdelnění methylesteru se provede během 1 h při 0 °C. Hodnota pH reakční směsi se přidáním kyseliny octové a ethanolu (5 ml) upraví na 5,0. Vytvoří se sraženina, která se odstřeďuje.
Titulní sloučenina se ze sraženiny vyčistí ionexovou chromatografií na koloně 2,5 x 27 cm s náplní QAE Sephadex(R) A25.
Sraženina se rozpustí ve směsi ethanolu s vodou (60:40, obj.) (25 ml) upravením hodnoty pH na 9,8 (amoniakem) a roztok se nanese na kolonu. Eluce se provádí pufrem NH3/NH4CI při pH 9,0, lineárním gradientem od 0,12 do 0,18M NH4CI v ethanolu s vodou (60:40, obj.). Celkové množství eluentu bylo 1000 ml. UF absorbance eluátu byla sledována při 280 nm. Byly sbírány frakce po 10 ml. Titulní sloučenina byla eluována z kolony ve frakcích 62 až 72. Titulní sloučenina byla vysrážena zředěním spojeného podílu 2 objemu vody a úpravou pH na 5,0. Po odstřeďování byla sraženina promyta vodou a po druhém odstřeďování byl produkt vysušen ve vakuu. Výtěžek: 10 mg.
Molekulové hmotnost nalezená PDMS: 6032, vypočteno. 6032. Relativní lipofilnost k're( = 140. Poločas vymizení T50% po subkutánní injekci u vepřů: 8,65 + 1,65 h (n = 5).
-21 CZ 289343 B6
Příklad 7
Phe“BI-Tetradekanolyl-glutamyl-glycyl-des(B30) lidský inzulín
Al,B29-diBoc-des(B30) lidský inzulín (200 mg, 0,033 mmol) se rozpustí v DMF (15 ml). Přidá se triethylamin (100 μΐ). Přidá se N-hydroxysukcinimidový ester myristoyl-Glu(y-OtBu)-Gly (95 mg, 0,17 mmol) a po 4 h za teploty místnosti se reakční směs odpaří do sucha ve vakuu. Boc a tBu skupiny byly odstraněny 30minutovou reakcí za teploty místnosti s trifluoroctovou kyselinou (5 ml). Trifluoroctová kyselina byla odstraněna odpařením ve vakuu. Titulní sloučenina byla vyčištěna ze sraženiny RP-HPLC na koloně sC18 oxidem křemičitým, eluce lineárním gradientem od 16 do 64 % hmotn. acetonitrilu v 50 mM Tris/fosforečnanovém pufru obsahujícím 75mM (NHJSCh při pH 7. Titulní sloučenina byla eluována z kolony 50 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl odpařen ve vakuu. Přidá se ethanol na 20 % (obj.). Úprava hodnoty pH na 5,0 dojde k vysrážení produktu. Po odstřeďování se sraženina rozpustí v lOmM NH4HCO3, odsolí se gelovou filtrací na nosiči Sephadex G-25 a lyofilizuje se. Výtěžek: 97 mg.
Molekulová hmotnost nalezená PDMS: 6105, vypočteno: 6104.
Příklad 8
Syntéza GlyB28,ThrB29,LysB30(NE-tetradekanoyl)-lidského inzulínu
8a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-27}-Gly-ThrLys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21)inzulinového prekurzoru z kvasinkového kmene yKV195 s použitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
Č. 4790 5 '-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACTGGTACCAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATΊ,GTCG-3, a
č. 2371 5/-TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG-3/.
DNA kóduj ící Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-27)-GlyThr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 až na to, že se oligonukleotid č. 3881 nahradí oligonukleotidem č. 4790.
Výsledný plazmid byl označen pKV195 a kvasinkový kmen exprimující Glu-Glu-Ala-Glu-AlaGlu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( 1 -27)-Gly-Thr-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) byl označen yKV195.
8b. Izolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-27)-Gly-ThrLys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1 -21 )inzulinového prekurzoru
Kmen yKV195 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 4,4 litru živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřeďováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn 3,6 litry vody, aby se snížila koncentrace solí na vodivost 7,7 mS/cm. Inzulínový prekurzor byl zahuštěn na koloně Pharmacia Strealine(R) 50 naplněné 300 ml ionexu Streamline(R) SP. Po promytí 3 litry 25mM citrátového pufru, pH 3,6, byl prekurzor eluován 0,5M amoniakem. Byly sbírány frakce od 300 do 600 ml. Volná amoniak byl ve vakuu odpařen za teploty místnosti. Hodnoty pH výsledných 280 ml byla upravena kyselinou chlorovodíkovou na 9,0.
-22CZ 289343 B6
8c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Gly-Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
K roztoku 280 ml jednovláknového prekurzoru (300 mg) se přidají 3 ml imobilizovaného A. lyticus proteázového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 17 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 3,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Millipore(R). Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve třech podílech RP-HPLC na 10μ kulovitém Cl8 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1200 nm (kolona 2 x 20 cm), 0,2M NajSCý, 0,04M H3PO4 pufr, pH 3.5, a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu při rychlosti 4 ml/min a teplotě kolony 40 °C. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 30 až 31 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů (70 ml) odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na SephadexutR) G-50 F v 0,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 cm). Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem byl izolován lyofilizací. Výtěžek: 176 mg.
8d. Syntéza NaA'5,N“B-3,NeB3()-tris(tetradekanolyl)-Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Gly-Thr-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) inzulínu
176 mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích se rozpustí ve směsi 1,4 ml DMSO a 0,275 ml 2M diizoopropylethylaminu vNMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,963 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 20 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 50 ml 0,01M glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl izolován triacylovaný meziprodukt.
8e. Syntéza GlyB28,ThrB29,LysB'°(Ne-tetradekanoyl) lidského inzulínu
K. roztoku z předcházejícího stupně se přidá 2,5 ml imobilizovaného typsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 5 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se upraví na 9,0 a roztok se nanese na kolonu (1,5 x 25,5 cm) s náplní QAE-Sephadex(R) A-25. Izokratická eluce byla prováděna rychlostí 9,3 ml/h 0,12M NH4C1 pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upravené amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony při eluování 325 až 455 ml s maximem při 380 ml. Nakonec byl pufr změněn na 0,01M NH4HCO3 gelovou filtrací na náplni Sephadex(R) G-50 Fine. Produkt byl izolován v suchém stavu lyofilizací. Výtěžek: 50 mg.
Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5979 ± 6, vypočteno: 5977. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3600 ± 4, vypočteno: 3600. Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 proteázou nalezená MS: 1286 ± 2, vypočteno: 1286. Relativní lipofilnost k'rel = 103. Poločas vymizení T5o% po subkutánní injekci u vepřů: 17 ± 2 h (n = 4).
Příklad 9
Syntéza GlyB28,LysB39(NE-tetradekanoyl)-lidského inzulínu
9a. Syntéza Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( l-27)-Gly-LysSer-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru z kvasinkového kmene yKV196 s použitím S. cerevisiae MF alfa prepro-leaderu
-23CZ 289343 B6
Byly syntetizovány následující oligonukleotidy:
č. 4791 5Z-TTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGGTGAAAGAGGTTTCTTCTAC ACCGGTAAGTCTGACGATGCTAGAGGTATTGTCG-3' a
Č. 2371 5z—TTAATCTTAGTTTCTAGAGCCTGCGGG—37.
DNA kóduj ící Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( 1 -27)-GlyLys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) byla zkonstruována stejným způsobem jako je popsáno v příkladu 2 až na to, že se oligonukleotid č. 3881 nahradí oligonukleotidem č. 4791. Výsledný plazmid byl označen pKV196 a kvasinkový kmen exprimující Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-AlaGlu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B( 1 -27)-Gly-Lys-Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A( 1-21) byl označen yKV196.
9b. Izolace Glu-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Glu-Pro-Lys-Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Gly-LysSer-Asp-Asp-Alar-Arg-A(l-21) inzulínového prekurzoru
Kmen yKV196 byl fermentován 72 h. Bylo získáno 3,6 litru živné půdy. Buňky kvasinek byly odstraněny odstřeďováním, hodnota pH byla kyselinou sírovou upravena na 3,0 a roztok byl zředěn 3,4 litry vody, aby se snížila koncentrace solí na vodivost 7,7 mS/cm. Inzulínový prekurzor byl zahuštěn na 300 ml postupem popsaným v příkladu 8b.
9c. Syntéza Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Gly-Lys, Ser-Asp-Asp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
K roztoku 300 ml jednovláknového prekurzoru (390 mg) o pH 9k0 se přidá 5 ml mobilizovaného A. lyticus proteázového gelu (viz PCTPDK94/00347, strana 45). Po mírném míchání po dobu 40 h při 30 °C se gel odstraní filtrací. pH bylo upraveno na 3,5. Roztok byl zfiltrován 0,45μ filtrem Millipore(R). Rozšířený inzulín s dvěma řetězci byl vyčištěn ve třech podílech RP-HPLC na 10μ kulovitém Cl8 oxidu křemičitém o velikosti pórů 1200 nm (kolona 2 x 20 cm), 0,2M Na2SO4, 0,04M H3PO4 pufr, pH 3,5, a gradientem od 23 do 33 % hmotn. acetonitrilu při rychlosti 4 ml/min a teplotě kolony 40 °C. Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem se eluoval při 29 % (hmotn.) acetonitrilu. Acetonitril byl ze spojených podílů (60 ml) odstraněn odpařením ve vakuu. Soli byly odstraněny gelovou filtrací na Sephadexu(R) G-25 v 0,5M kyselině octové (kolona 5 x 47 cm). Rozšířený inzulín s dvojitým řetězcem byl izolován lyofilizací. Výtěžek: 154 mg.
9d. Syntéza NaA~5,NaB’3,NEB30-tris(tetradekanolyl)-Ala-Thr-Arg-B(l-27)-Gly-Lys, Ser-AspAsp-Ala-Arg-A(l-21) inzulínu
154 mg rozšířeného inzulínu o dvou řetězcích se rozpustí ve směsi 1,05 ml DMSO a 0,329 ml 2M diizopropylethylaminu vNMP. Tento roztok se ochladí na 15 °C a přidá se 0,22 ml 0,3M N-hydroxysukcinimidového esteru tetradekanové kyseliny v DMSO/NMP (1:1, obj. díly). Po 2 h při 15 °C se reakce zastaví přidáním 40 ml 0,0 IM glycinového pufru v ethanolu/vodě (60:40, obj.) a pH se upraví na 10,0. Nebyl izolován triacylovaný meziprodukt.
9e. Syntéza GlyB28,LysB29(NE-tetradekanoyl) lidského inzulínu
K roztoku z předcházejícího stupně se přidá 1,5 ml imobilizovaného trypsinového gelu (viz PCT/DK94/00347, strana 46). Po mírném míchání při 15 °C po dobu 21 h se gel odstraní odfiltrováním, pH se uprav na 9,0 a produkt ve 43 ml roztoku se nanese na kolonu (1,5x26,0 cm) s náplní QAE-Sephadex(R) A-25. Izokratická eluce byla prováděna rychlostí 9,5 ml/h 0,12M Nl-fiCl pufrem ve směsi ethanol/voda (60:40, obj.) upraveným amoniakem na pH 9,0. Titulní sloučenina vycházela z kolony při eluování 190 až 247 ml s maximem při 237 ml.
-24CZ 289343 B6
Nakonec byl pufr změněn na 0,01 M NH4HCO3 gelovou filtrací na náplni Sephadex(R) G-50 Fine. Produkt byl izolován v suchém stavu lyofilizací. Výtěžek: 67 mg.
Molekulová hmotnost titulní sloučeniny nalezená MS: 5877 ± 2, vypočteno: 5876. Molekulová hmotnost B-řetězce nalezená MS: 3499 ± 3, vypočteno: 3499.
Molekulová hmotnost C-koncového fragmentu B-řetězce rozštěpeného V8 proteázou nalezená MS: 1184 ± 2, vypočteno. 1185. Relativní lipofilnost k'rei = 118,5. Poločas vymizení T5o% po subkutánní injekci u vepřů: 25 ± 9 h (n = 4).
Claims (24)
1. Inzulínový derivát následující obecné sekvence
S-------------S
A-řetězcc | 7 |
Gty-IIe-Val-Glu-GIn-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Scr-
1 2 3 4 5 6 | 8 9 10 11 12
S
S
B-řetězec\
Xaa-Xaa-Xaa-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-
1 2 3 456789 10 11 12
A-řetčzcc (pokr.)20
Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Xaa13 14 15 16 17 18 1921 (sekv. id. č. 1)
B-řetězec (pokr.)
Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-GIu-Arg-Gly-Phe
13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24
B-řetězec (pokr.)
Phe-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa-Xaa25 26 27 28 29 30 v níž (sekv. id. č. 2)
-25CZ 289343 B6
Xaa v poloze A21 znamená jakýkoliv zbytek kódovatelné aminokyseliny kromě zbytků Lys, Arg a Cys,
Xaa v polohách Bl, B2, B3, B26, B27, B28 a B29 znamená nezávisle na sobě zbytek kódovatelné aminokyseliny vyjma zbytek Cys nebojsou vynechány,
Xaa v poloze B30 znamená zbytek kódovatelné aminokyseliny vyjma zbytku Cys, dipeptid z jakékoliv aminokyseliny neobsahující zbytek Cys nebo zbytek Arg, tripeptid z jakékoliv aminokyseliny neobsahující zbytek Cys nebo zbytek Arg, tetrapeptid zjakékoliv aminokyseliny neobsahující zbytek Cys nebo zbytek Arg nebo je vynechána, a buď aminoskupina N-koncové aminokyseliny B-řetězce má lipofílní skupinu W na ni připojenou, přičemž tato skupina má 16 až 22 atomů uhlíku, kde W je vybrána ze skupiny zahrnující
a) CH3(CH2)nCH(COOH)NH-CO(CH2)2CO-, kde n znamená číslo od 9 do 15,
b) CH3(CH2)rCO-NHCH(COOH)(CH2)2CO-, kde r znamená číslo od 9 do 15,
c) CH3(CH2)sCO-NHCH((CH2)2COOH)CO-, kde s znamená číslo od 9 do 15,
d) (N(l-karboxytridecyl)-2-aminosukcinyl) a
e) tetradekanoyl-glutamyl-glycyl, nebo karboxyskupina C-koncové aminokyseliny B-řetězce má lipofílní skupinu Z na ni připojenou, přičemž tato skupina má 16 až 31 atomů uhlíku, kde Z je vybrána ze skupiny zahrnující
a) -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3, kde m znamená číslo od 8 do 18,
b) -NHCH(COOH)(CH2)4NH-COCH((CH2)2COOH)NH-CO (CH2)q CH3 kde p znamená číslo od 10 do 16,
c) -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)2CH(COOH)NH-CO (CH2)q CH3, kde q znamená číslo od 10 do 16 a
d) Lys(NE-tetradekanoyl), s tím, že jestliže jedna nebo více aminokyselin v poloze Bl, B2 a B3 je deletováno, potom číslo N-koncové aminokyseliny se spočte odpočítáním od CysB7, který je vždy označen číslem 7, a že
a) jestliže B29 a B30 jsou deletovány a shora uvedená skupina Z je přítomna na C-koncové aminokyselině B-řetězce a ani Bl, ani B2 ani B3 není deletována, potom B1-B2 neznamená zbytek Phe-Val nebo B26-B27-B28 neznamená zbytek Tyr-Thr-Pro nebo jak B1-B2, tak B26-B27-B28 znamenají jiné než tyto uvedené sekvence, a
b) jestliže B29 a B30 jsou deletovány, shora uvedená skupina Z je přítomna na C-koncové aminokyselině B-řetězce a jedna z Bl, B2 nebo B3 je deletována, potom N-koncová aminokyselina B-řetězce neznamená Val nebo sekvence B26-B27-B28 neznamená zbytek TyrThr-Pro nebo jak N-koncová aminokyselina B-řetězce, tak sekvence B26-B27-B28 neznamená zbytek Val či zbytek Tyr-Thr-Pro.
2. Inzulínový derivát podle nároku 1, v němž lipofílní skupina W je připojena na aminovou skupinu N-koncové aminokyseliny B-řetězce.
3. Inzulínový derivát podle nároku 1, v němž lipofílní skupina Z je připojena na karboxylovou skupinu C-koncové aminokyseliny B-řetězce.
4. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z předcházejících nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze A21 znamená aminokyselinu, která je vybrána ze skupiny sestávající ze zbytků Ala, Asn, Gin, Glu, Gly a Ser.
-26CZ 289343 Β6
5. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, v němž Xaa v poloze B1 znamená zbytek Phe neboje deletována.
6. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B2 znamená zbytek Ala nebo zbytek Val.
7. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B3 znamená aminokyselinu, která je vybrána ze skupiny sestávající ze zbytků Asn, Gin, Glu a Thr.
8. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B26 znamená zbytek Tyr.
9. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B27 znamená zbytek Thr.
10. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B28 znamená zbytek Pro.
11. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B29 znamená zbytek Lys nebo zbytek Thr.
12. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B30 je zbytek Thr.
13. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B30 je deletována.
14. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B28 znamená zbytek Lys a Xaa v poloze B29 znamená zbytek Pro.
15. Inzulínový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, v němž Xaa v poloze B28 znamená zbytek a Xaa v poloze B29 znamená zbytek Thr.
16. Inzulínový derivát podle nároku 2, v němž je shora uvedená skupina W připojena na aminoskupinu N-koncové aminokyseliny amidovou vazbou.
17. Inzulínový derivát podle nároku 16, v němž W znamená skupinu obecného vzorce CH3(CH2)nCH(COOH)NHCO(CH2)2CO-, kde n znamená číslo od 9 do 15.
18. Inzulínový derivát podle nároku 3, v němž je skupina Z připojena na karboxylovou skupinu C-koncové aminokyseliny amidovou vazbou.
19. Inzulínový derivát podle nároku 18, v němž Z znamená skupinu obecného vzorce -NHCH(COOH)(CH2)4NH-CO(CH2)mCH3, kde m znamená číslo od 8 do 18.
20. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená ThrB29-lidský inzulín.
21. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená de(B28-B30)- lidský inzulín.
22. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená des(B27-B30)- lidský inzulín.
-27CZ 289343 B6
23. Inzulínový derivát podle nároku 19, v němž původní inzulín, na který je napojen Z, znamená des(B26-B30)-lidský inzulín.
24. Farmaceutický prostředek pro léčení diabetes pacientů, kteří toto léčení potřebují, 5 vyznačující se tím, že obsahuje terapeuticky účinné množství inzulínového derivátu podle nároku 1 společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DK27695 | 1995-03-17 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ289997A3 CZ289997A3 (cs) | 1998-01-14 |
| CZ289343B6 true CZ289343B6 (cs) | 2002-01-16 |
Family
ID=8091725
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19972899A CZ289343B6 (cs) | 1995-03-17 | 1996-03-18 | Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek pro léčení diabetes |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0871665B1 (cs) |
| JP (1) | JP3872105B2 (cs) |
| KR (1) | KR19980703039A (cs) |
| CN (1) | CN1196061A (cs) |
| AT (1) | ATE245659T1 (cs) |
| AU (1) | AU720966B2 (cs) |
| BR (1) | BR9607647A (cs) |
| CA (1) | CA2215694A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ289343B6 (cs) |
| DE (1) | DE69629210T2 (cs) |
| HU (1) | HUP9800523A3 (cs) |
| NO (1) | NO974270L (cs) |
| PL (1) | PL183698B1 (cs) |
| WO (1) | WO1996029344A1 (cs) |
Families Citing this family (41)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5693609A (en) * | 1994-11-17 | 1997-12-02 | Eli Lilly And Company | Acylated insulin analogs |
| US6451970B1 (en) | 1996-02-21 | 2002-09-17 | Novo Nordisk A/S | Peptide derivatives |
| US6268343B1 (en) | 1996-08-30 | 2001-07-31 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of GLP-1 analogs |
| US6458924B2 (en) | 1996-08-30 | 2002-10-01 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of GLP-1 analogs |
| US7235627B2 (en) | 1996-08-30 | 2007-06-26 | Novo Nordisk A/S | Derivatives of GLP-1 analogs |
| AU747926B2 (en) | 1997-10-24 | 2002-05-30 | Eli Lilly And Company | Insoluble insulin compositions |
| CO4970787A1 (es) | 1997-12-23 | 2000-11-07 | Lilly Co Eli | Composiciones insolubles de insulina y derivados de insulina que controlan la glucosa sanguinea |
| JP2002534959A (ja) * | 1998-12-08 | 2002-10-22 | バイオベーション リミテッド | 免疫原性タンパク質の改変方法 |
| TWI242000B (en) * | 1998-12-10 | 2005-10-21 | Univ Southern California | Reversible aqueous pH sensitive lipidizing reagents, compositions and methods of use |
| AU2003236201A1 (en) | 2002-05-07 | 2003-11-11 | Novo Nordisk A/S | Soluble formulations comprising monomeric insulin and acylated insulin |
| CN1247616C (zh) * | 2002-07-19 | 2006-03-29 | 上海中科生龙达生物技术（集团）有限公司 | 新的单体胰岛素，药物组合物及其制法 |
| CA2531988C (en) | 2003-08-05 | 2016-06-28 | Novo Nordisk A/S | Novel insulin derivatives |
| EP1687428A1 (en) | 2003-11-14 | 2006-08-09 | Novo Nordisk A/S | Processes for making acylated insulin |
| MXPA06008209A (es) | 2004-01-21 | 2006-08-31 | Novo Nordisk As | Conjugacion de peptidos mediada por transglutaminasa. |
| EA011860B1 (ru) | 2004-03-17 | 2009-06-30 | 7ТиЭм ФАРМА А/С | Селективные агонисты рецептора y2 для терапевтического воздействия |
| US20080269114A1 (en) | 2004-03-17 | 2008-10-30 | 7Tm Pharma A/S | Y4 Selective Receptor Agonists For Thereapeutic Interventions |
| JP5410020B2 (ja) | 2005-02-02 | 2014-02-05 | ノヴォ ノルディスク アー／エス | インスリン誘導体 |
| US8067362B2 (en) | 2005-02-02 | 2011-11-29 | Novo Nordisk As | Insulin derivatives |
| CN101389650B (zh) | 2005-12-28 | 2012-10-10 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 包含酰化胰岛素和锌的组合物以及制备所述组合物的方法 |
| ATE557037T1 (de) | 2006-02-27 | 2012-05-15 | Novo Nordisk As | Insulin derivate |
| US8933021B2 (en) * | 2006-05-09 | 2015-01-13 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivative |
| JP5550338B2 (ja) | 2006-07-31 | 2014-07-16 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | ペグ化持続型インスリン |
| JP5864834B2 (ja) | 2006-09-22 | 2016-02-17 | ノボ・ノルデイスク・エー／エス | プロテアーゼ耐性のインスリンアナログ |
| WO2008132224A2 (en) | 2007-04-30 | 2008-11-06 | Novo Nordisk A/S | Method for drying a protein composition, a dried protein composition and a pharmaceutical composition comprising the dried protein |
| EP2167032B1 (en) | 2007-06-13 | 2019-08-07 | Novo Nordisk A/S | Pharmaceutical formulation comprising an insulin derivative |
| EP2058330A1 (en) * | 2007-11-08 | 2009-05-13 | Novo Nordisk A/S | Insulin derivative |
| CN101932601B (zh) | 2007-11-08 | 2016-08-03 | 诺沃-诺迪斯克有限公司 | 胰岛素衍生物 |
| US9260502B2 (en) | 2008-03-14 | 2016-02-16 | Novo Nordisk A/S | Protease-stabilized insulin analogues |
| WO2009115469A1 (en) | 2008-03-18 | 2009-09-24 | Novo Nordisk A/S | Protease stabilized, acylated insulin analogues |
| CA2738615A1 (en) | 2008-10-30 | 2010-05-06 | Novo Nordisk A/S | Treating diabetes melitus using insulin injections with less than daily injection frequency |
| RU2013123515A (ru) | 2010-10-27 | 2014-12-10 | Ново Нордиск А/С | Лечение сахарного диабета с помощью инъекций инсулина, вводимых с различными интервалами |
| ES2594303T3 (es) | 2012-04-11 | 2016-12-19 | Novo Nordisk A/S | Formulaciones de insulina |
| US10137172B2 (en) | 2013-04-30 | 2018-11-27 | Novo Nordisk A/S | Administration regime |
| RU2673185C2 (ru) | 2013-10-07 | 2018-11-22 | Ново Нордиск А/С | Новое производное аналога инсулина |
| AR099569A1 (es) | 2014-02-28 | 2016-08-03 | Novo Nordisk As | Derivados de insulina y los usos médicos de estos |
| HRP20211281T1 (hr) | 2016-12-16 | 2021-11-12 | Novo Nordisk A/S | Pripravci koji sadrže inzulin |
| CA3082033A1 (en) | 2017-08-24 | 2019-02-28 | Novo Nordisk A\S | Glp-1 compositions and uses thereof |
| US10335464B1 (en) | 2018-06-26 | 2019-07-02 | Novo Nordisk A/S | Device for titrating basal insulin |
| TW202039539A (zh) | 2018-12-11 | 2020-11-01 | 法商賽諾菲公司 | 具有經降低胰島素受體結合親和力的胰島素類似物 |
| CN114096269B (zh) | 2019-07-12 | 2024-06-11 | 诺和诺德股份有限公司 | 高浓度胰岛素制剂 |
| AU2021208601B2 (en) | 2020-02-18 | 2025-06-05 | Novo Nordisk A/S | Glp-1 compositions and uses thereof |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3844211A1 (de) * | 1988-12-29 | 1990-07-05 | Hoechst Ag | Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung |
| DK155690D0 (da) * | 1990-06-28 | 1990-06-28 | Novo Nordisk As | Nye peptider |
| PL178466B1 (pl) * | 1993-09-17 | 2000-05-31 | Novo Nordisk As | Pochodna insuliny i kompozycja farmaceutyczna do leczenia cukrzycy |
-
1996
- 1996-03-18 KR KR1019970706447A patent/KR19980703039A/ko not_active Ceased
- 1996-03-18 DE DE69629210T patent/DE69629210T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 WO PCT/DK1996/000107 patent/WO1996029344A1/en not_active Application Discontinuation
- 1996-03-18 CA CA002215694A patent/CA2215694A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-18 EP EP96905764A patent/EP0871665B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-18 PL PL96322299A patent/PL183698B1/pl unknown
- 1996-03-18 HU HU9800523A patent/HUP9800523A3/hu unknown
- 1996-03-18 AT AT96905764T patent/ATE245659T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 BR BR9607647A patent/BR9607647A/pt not_active Application Discontinuation
- 1996-03-18 CN CN96193362A patent/CN1196061A/zh active Pending
- 1996-03-18 CZ CZ19972899A patent/CZ289343B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-03-18 AU AU49396/96A patent/AU720966B2/en not_active Ceased
- 1996-03-18 JP JP52799596A patent/JP3872105B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1997
- 1997-09-16 NO NO974270A patent/NO974270L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ATE245659T1 (de) | 2003-08-15 |
| NO974270L (no) | 1997-11-14 |
| DE69629210T2 (de) | 2004-04-22 |
| CZ289997A3 (cs) | 1998-01-14 |
| BR9607647A (pt) | 1999-04-06 |
| PL322299A1 (en) | 1998-01-19 |
| EP0871665A1 (en) | 1998-10-21 |
| EP0871665B1 (en) | 2003-07-23 |
| CN1196061A (zh) | 1998-10-14 |
| CA2215694A1 (en) | 1996-09-26 |
| NO974270D0 (no) | 1997-09-16 |
| MX9707056A (es) | 1997-11-29 |
| PL183698B1 (pl) | 2002-06-28 |
| WO1996029344A1 (en) | 1996-09-26 |
| KR19980703039A (ko) | 1998-09-05 |
| AU720966B2 (en) | 2000-06-22 |
| JPH11502110A (ja) | 1999-02-23 |
| DE69629210D1 (de) | 2003-08-28 |
| JP3872105B2 (ja) | 2007-01-24 |
| HUP9800523A3 (en) | 1998-09-28 |
| AU4939696A (en) | 1996-10-08 |
| HUP9800523A2 (hu) | 1998-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ289343B6 (cs) | Inzulinový derivát a farmaceutický prostředek pro léčení diabetes | |
| US7229964B2 (en) | Insulin derivatives | |
| US6869930B1 (en) | Acylated insulin | |
| JP4060583B2 (ja) | アシル化インスリン | |
| EP0894095B1 (en) | Insulin derivatives and their use | |
| EP2178912B1 (en) | Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety | |
| JP5710253B2 (ja) | 速効型インスリンアナログ | |
| US20090069215A1 (en) | Acylated Single Chain Insulin | |
| US20090099065A1 (en) | Acylated Single Chain Insulin | |
| JP2017534676A (ja) | インクレチン−インスリンコンジュゲート | |
| CA2468100A1 (en) | Insulin molecule having protracted time action | |
| KR20110061552A (ko) | 할로겐 안정화된 인슐린 | |
| JPH11502204A (ja) | 親油性のペプチドホルモン誘導体 | |
| WO2007081824A2 (en) | Fibrillation resistant proteins | |
| MXPA97007056A (en) | Insulated derivatives | |
| AU5196000A (en) | Acylated insulin |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20030318 |