JP5550338B2 - ペグ化持続型インスリン - Google Patents
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Description
残念なことに、多くの糖尿病患者は、グルコースレベルの密なコントロールを維持するために必要とされる多くの注射に伴う不快のために集中的な治療を受けるのを嫌がる。この種の治療は精神的痛み及び肉体的痛みの双方を伴いうる。経口投与では、インスリンは胃腸管で急速に分解され、血流中に吸収されない。よって、多くの研究者は、インスリン投与の代替経路、例えば経口、直腸、経皮、及び経鼻経路について研究している。しかしながら、今までのところ、これらの投与経路では、インスリンを効果的に吸収する結果には至っていない。
性質を高めるためにしばしば使用される有機鎖様分子は、ポリエチレングリコールベース鎖、すなわち繰り返し単位-CH2CH2O-をベースにした鎖である。以下、「PEG」なる略語をポリエチレングリコールに使用する。
ポリエチレングリコールを含む非天然の親水性ポリマーの一又は複数の分子に、共有的に結合させた二本鎖インスリンコンジュゲートを含有する肺投与用のインスリン組成物とその調製方法は、国際公開第02/094200号及び国際公開第03/022996号に開示されている。
この発明の他の態様は、糖尿病患者を治療し、糖尿病にしばしば伴う後期合併症のいくらかの又は全ての危険性を低減するために、肺に簡便に投与することができる薬剤の提供を取り扱う。
この発明の他の態様は、糖尿病患者を治療するために、肺に簡便に投与することができ、注射を使用する多くの患者が使用するのにさらに便利な薬剤の提供を取り扱う。
この発明の他の態様は、糖尿病患者を治療するために、肺に簡便に投与することができ、十分な物理的安定性を有する薬剤の提供を取り扱う。
この発明の他の態様は、十分に高いインスリンレセプター親和性を有する薬剤の提供を取り扱う。
この発明の目的は、従来技術の不具合の少なくとも一を克服又は改善するか、又は有用な代替法を提供することである。
インスリンは、膵臓のβ-細胞から分泌されるポリペプチドホルモンであり、2つの鎖間ジスルフィド架橋によって互いに結合されたA鎖及びB鎖と命名された二つのポリペプチド鎖からなる。該ホルモンは、次の立体配置:プレペプチドB-Arg-Arg-C-Lys-Arg-A(ここで、Cは31のアミノ酸の連結ペプチドであり、A及びBは、それぞれインスリンのA及びB鎖である)において、24のアミノ酸のプレペプチドに86のアミノ酸を含むプロインスリンが続いてなる単鎖前駆体プロインスリン(プレプロインスリン)として合成される。 Arg-Arg及びLys-Argは、A鎖及びB鎖間の連結ペプチドを切断するための切断部位であり、二本鎖インスリン分子が形成される。インスリンは正常な代謝調節の維持に必須である。
ここで、アミノ酸残基なる用語は、水素原子がアミノ基から除去された、及び/又はヒドロキシ基がカルボキシ基から除去された、及び/又は水素原子がメルカプト基から除去されたアミノ酸を包含する。不正確であるが、アミノ酸残基はアミノ酸とも表示されうる。
ここで、インスリンアナログなる用語は、天然インスリン中に生じる一又は複数のアミノ酸残基を欠失及び/又は置換する(置き換える)ことにより、及び/又は一又は複数のアミノ酸残基を付加することにより、例えばヒトインスリン等の天然に生じるインスリンの構造体から形式上誘導可能な分子構造体を有するポリペプチドを包含する。付加及び/又は置換されたアミノ酸残基は、コード可能なアミノ酸残基又は他の天然に生じるアミノ酸残基又は純粋に合成されたアミノ酸残基のいずれかとすることができる。
ここで、変異なる用語は、アミノ酸配列における任意の変化を包含する(コード可能アミノ酸の挿入及び置換、並びに欠失)。
ここで、ヒトインスリンのA鎖のアナログ及びB鎖のアナログなる用語は、それぞれ、ヒトインスリンのA及びB鎖に対して、A及びBアミノ酸の一又は複数の置換、欠失及び/又は伸長(付加)を有するヒトインスリンのA鎖及びB鎖を包含する。
ここで、A-1、B-1等の用語は、A1及びB1位に対し、それぞれN末端の第1アミノ酸の位置を示す。
ここで、desB29及びdesB30等の用語は、それぞれB29又はB30アミノ酸残基を欠くインスリンアナログを示す。
速効型インスリンとは、通常の又はレギュラーのヒトインスリンよりも作用発現が速いインスリンを意味する。
長時間作用するインスリンとは、通常の又はレギュラーのヒトインスリンよりも作用の持続期間が長いインスリンを意味する。
インスリンアナログ、持続型インスリン、及びA及びB鎖における位置の番号付けは、親化合物がそのために使用される番号を有するヒトインスリンであるようになされる。
ここで使用される基礎インスリン(ベイサルインスリン)なる用語は、8時間を超え、特に少なくとも9時間の作用時間を有するインスリンペプチドを意味する。好ましくは、基礎インスリンは少なくとも10時間の作用時間を有する。基礎インスリンはよって約8〜24時間の範囲、好ましくは約9〜約15時間の範囲の作用時間を有しうる。
ここで使用される場合、「PEG」又はポリエチレングリコールとは、任意の水溶性ポリ(エチレングリコール)又はポリ(エチレンオキシド)を意味する。PEGなる表現は-(CH2CH2O)n-なる構造を含み、ここでnは2から約1000の整数である。よく使用されるPEGは、PEG末端の一端が比較的不活性な基、例えばアルコキシで末端キャップされる一方、他端はリンカー部分でさらに修飾されていてもよいヒドロキシル基である末端キャップPEGである。しばしば使用されるキャップ基はメトキシであり、対応する末端キャップPEGはしばしばmPEGと標記される。よって、mPEGはCH3O(CH2CH2O)n-であり、ここで、nは、全PEG部分に対して示される平均分子量を付与するのに十分な2から約1000の整数であり、例えばmPEGがMw2000の場合、nは約44(バッチ間変動を受けた数)である。PEGなる標記はしばしばmPEGの代わりに使用される。「PEG」に続く数字(下付き文字ではない)は、その数字と等しいおおよその分子量を有するPEG部分を示す。よって、「PEG2000」とは、2000のおおよその分子量を有するPEG部分である。
他の特定のPEG形態は、同じく分枝状、直鎖状、フォーク状、又はダンベル状の形状となりうる単分散系である。単分散系とは、PEGポリマーの長さ(又は分子量)が特定的に定まっており、様々な長さ(又は分子量)の混合物ではないことを意味する。ここで、mdPEGなる標記は、「discrete」の「d」を使用し、mPEG分子が単分散系であることを示すために使用される。mdPEGの後の下付き数字、例えばmdPEG12の「12」は、多分散ポリマー(オリゴマー)内のエチレングリコールモノマーの数を示す。
インスリン活性を有するペグ化持続型インスリンは、ラット、ウサギ、又はブタモデルであってよい、適切な動物モデルにおいて測定して、例えば静脈内、皮下、又は肺投与によって適切に投与した後、哺乳動物の血中グルコースを低下させる能力、又はインスリンレセプター結合親和性を有する、ペグ化持続型インスリンを意味する。
ここで、アルコキシなる用語は、基「アルキル-O-」を包含する。代表例はメトキシ、エトキシ、プロポキシ(例えば、1-プロポキシ及び2-プロポキシ)、ブトキシ(例えば、1-ブトキシ、2-ブトキシ、及び2-メチル-2-プロポキシ)、ペントキシ(1-ペントキシ及び2-ペントキシ)、ヘキソキシ(1-ヘキソキシ及び3-ヘキソキシ)等である。
ここで、アルキレンなる用語は、1〜12の炭素原子を有する飽和した分枝状又は直鎖状の二価炭化水素基を包含する。代表例には、限定されるものではないが、メチレン、1,2-エチレン、1,3-プロピレン、1,2-プロピレン、1,3-ブチレン、1,4-ブチレン、1,4-ペンチレン、1,5-ペンチレン、1,5-ヘキシレン、1,6-ヘキシレン等が含まれる。
インスリンレセプター及びIGF-1レセプター親和性を有するポリペプチドは、適切な結合アッセイにおいてインスリンレセプター及びIGF-1レセプターと相互作用し得るポリペプチドである。このようなレセプターアッセイは、当該分野ではよく知られており、実施例にさらに記載する。本ペグ化持続型インスリンは、IGF-1レセプターに結合しないか、又は該レセプターに対してかなり低い親和性しか有さない。より厳密には、この発明の持続型インスリンは、ヒトインスリンと実質的同程度の大きさ又はそれ以下の大きさのIGF-1レセプターに対する親和性を有する。
ここで使用される病気の治療なる用語は、病気、病状又は疾患を発症した患者の管理及びケアを意味する。治療の目的は、病気、病状又は疾患に抗することである。治療には、病気、病状又は疾患の除去又は管理、並びに病気、病状又は疾患に付随する徴候又は合併症を緩和するために、活性化合物を投与することを含む。
ここで使用される病気の予防なる用語は、病気の臨床的発症の前に、病気を発症する危険性を、個々に管理及びケアすることと定義される。予防の目的は、病気、病状又は疾患の発症に抗することであり、徴候又は合併症の発症を予防又は遅延化させるため、関連する病気、病状又は疾患の発症を予防又は遅延化させるために、活性化合物を投与することを含む。
POTは、分裂酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子であり、TPI1は出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子である。
リーダーとは、プレペプチド(シグナルペプチド)及びプロペプチドからなるアミノ酸配列を意味する。
アミノ酸に対する略語
次の略語が明細書及び実施例において使用される:Daはダルトン(分子量)であり、kDaはキロダルトン(=1000Da)であり、mPEG-SBAはmPEG-CH2CH2CH2-CO-OSu(mPEG-ブタン酸のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)であり、mPEG-SMBはmPEG-CH2CH2CH(CH3)-CO-OSu( mPEG-α-メチルブタン酸のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステル)であり、mPEG-SPAはmPEG-CH2CH2-CO-OSu(mPEG-プロピオン酸のN-ヒドロキシスクシンイミジルエステ)であり、Mwは分子量であり、OSuは1-スクシンイミジルオキシ=2,5-ジオキソピロリジン-1-イルオキシであり、Rは室温であり、SAはシナピン酸であり、SUは1-スクシンイミジル=2,5-ジオキソピロリジン-1-イルである。
親インスリンのN末端アミノ基又は双方の場所に存在又は付着される場合、適切なリンカー基を介して、PEG基はリジン又はシステイン残基の側鎖に付着されうる。リンカーは、典型的にはカルボン酸官能基がアミド結合を介しての親インスリンへの結合に使用されるカルボン酸の誘導体である。リンカーは、リンカーモチーフ(連結モチーフ):-CH2CO-を有する酢酸部分、リンカーモチーフ:-CH2CH2CO-又は-CHCH3CO-を有するプロピオン酸部分、又はリンカーモチーフ:-CH2CH2CH2CO-又は-CH2CHCH3CO-を有する酪酸でありうる。また、リンカーは-CO-基でありうる。
親インスリン分子は、明細書の詳細な部分で説明されるように、他のアミノ酸残基で置換された天然に生じるアミノ酸残基を限定数有していてもよい。
さらなる態様では、この発明は、哺乳動物の血糖値を低減する、特に糖尿病を治療する薬学的製剤の調製におけるペグ化持続型インスリンの使用に関する。
さらなる態様では、本発明は、治療を必要とする患者に、この発明のペグ化持続型インスリンの治療的活性用量を投与することにより、哺乳動物の血糖値を低減する方法に関する。
この発明のさらなる態様では、ペグ化持続型インスリンは、任意の適切な比で一又は複数種のさらなる活性物質と併用されて投与される。かかるさらなる活性剤は、ヒトインスリン、速効型インスリンアナログ、抗糖尿病剤、抗脂質異常症剤、抗肥満剤、抗高血圧剤、糖尿病から生じるか糖尿病に伴う合併症の治療剤から選択されうる。
一実施態様では、2つの活性成分は、混合薬学的製剤として投与される。他の実施態様では、2つの成分は、同時か逐次のいずれかで別個に投与される。
この発明のペグ化持続型インスリンは、また抗糖尿病剤と共に併用治療に使用されうる。
さらに、この発明のペグ化持続型インスリンは、一又は複数の抗肥満剤又は食欲調節剤と併用されて投与されうる。
一実施態様では、この発明は、この発明のペグ化持続型インスリン、及び適切なアジュバント及び添加剤、例えば安定化、防腐又は等張化に適した一又は複数の薬剤、特に亜鉛イオン、フェノール、クレゾール、パラベン、塩化ナトリウム、グリセロール、プロピレングリコール又はマンニトールを含有する肺用の薬学的製剤に関する。
食事制限及び/又は運動、上述の化合物の一又は複数及び場合によっては一又は複数の他の活性物質と、ペグ化持続型インスリンとの任意の適切な組合せがこの発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
この発明のペグ化持続型インスリンは、例えばヒトインスリンと比較して、相対的に高い生物学的利用能であるために、特に肺投与を意図している。さらに、ペグ化持続型インスリンは、遅延性インスリン活性を有しているであろう。
本発明のPEG基は、与えられた分子量に対して、典型的には、ある範囲のエチレングリコール(又はエチレンオキシド)モノマーからなる。例えば、分子量2000ダルトンのPEG基は、典型的には43±のモノマーからなり、平均は約43−44モノマーである。
組換え発現ベクターは酵母中で複製可能である。ベクターを酵母中で複製させることができる配列の例は酵母プラスミド2μm複製遺伝子REP1−3及び複製起点である。
細菌宿主細胞において転写を行わしめるのに適切なプロモーターの例は、大腸菌lacオペロン、ストレプトマイセス・セリカラーアガラーゼ(agarase)遺伝子(dagA)、枯草菌レバンスクラーゼ(levansucrase)遺伝子(sacB)、バチルス・リケニホルミスアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・ステアロサーモフィルスマルトゲンアミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリケファシエンスアルファ-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リケニホルミスペニシリナーゼ遺伝子(penP)から得られるプロモーターである。糸状菌宿主細胞において転写を行わしめるのに適切なプロモーターの例は、コウジカビTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(miehei)アスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビ天然アルファ-アミラーゼ、及びクロコウジカビ酸安定性アルファ-アミラーゼから得られるプロモーターである。酵母宿主では、有用なプロモーターは、出芽酵Ma1、TPI、ADH又はPGKプロモーターである。
親インスリンをコードするポリヌクレオチド配列は、典型的には適切なターミネーターに作用可能に連結される。酵母において、適切なターミネーターはTPIターミネーター(Alber等 (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434)である。
この発明のペグ化持続型インスリンは、皮下的、経口的、又は経肺的に投与されうる。
皮下投与用として、この発明のペグ化持続型インスリンは、公知のインスリンの処方物と同じように処方される。さらに、皮下投与用として、この発明のペグ化持続型インスリンは、公知のインスリンの投与と同じように投与され、医者はこの手順に通じている。
この発明のペグ化持続型インスリンは、循環インスリンレベルを増加させ、及び/又は循環グルコースレベルを低下させるのに効果的な用量で、吸入により投与されてよい。このような投与は、糖尿病又は高血糖等の疾患を治療するのに効果的である。インスリンの効果的な投与を達成するには、この発明のペグ化持続型インスリンを、約0.5μg/kg〜約50μg/kg以上の吸入量で投与することが必要である。治療的有効量は、インスリンレベル、血糖値、患者の身体コンディション、患者の肺の状態を含む種々の要因を考慮し、博識な実施者により決定することができる。
この発明のペグ化持続型インスリンは、吸入による治療剤の投与において、当該技術で公知の任意の様々な吸入装置により送達され得る。これらの装置には、定量噴霧式吸入器、ネブライザー、乾燥パウダー発生器、、スプレー等が含まれる。好ましくは、このペグ化持続型インスリンは、乾燥パウダー吸入器又はスプレーにより送達される。この発明のペグ化持続型インスリンを投与するための吸入装置には、いくつかの所望される特徴がある。例えば、吸入装置による送達には、有利には信頼性、再現性及び正確性がある。良好な呼吸性のためには、吸入装置は、小粒子又はエアゾール、例えば約10μm、例えば約1-5μm未満のものを送達すべきである。この発明の実施に適した商業的に入手可能な吸入装置のいくつかの特定の例は、Cyclohaler、TurbohalerTM(Astra)、Rotahaler(登録商標)(Glaxo)、Diskus(登録商標)(Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、吸入治療用に市販されている装置、AERxTM(Aradigm)、Ultravent(登録商標)ネブライザー(Mallinckrodt)、Acorn II(登録商標)ネブライザー(Marquest Medical Products)、Ventolin(登録商標)定量噴霧式吸入器(Glaxo)、Spinhaler(登録商標)パウダー吸入器(Fisons)等である。
適切なバッファーの例は、酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)及びリン酸ナトリウムである。
要約すれば、この発明の特徴は以下の通りである:
1.ヒトインスリンに匹敵し、A1、B1、A21及び/又はB30位から伸長した、一又は複数のPEG含有伸長部を有するペグ化インスリンアナログであって、該伸長部(類)がアミノ酸残基(類)からなり、PEG部分が、リンカーを介して、伸長部(類)の一又は複数のアミノ酸残基に結合しているペグ化されたされたインスリンアナログ。
2.1の伸長部に1のみのアミノ酸残基がPEG部分を担持している、第1項のペグ化インスリンアナログ。
3.2のみの伸長部がPEG部分を担持しており、好ましくは2のみのPEG部分が存在している、第1項のペグ化インスリンアナログ。
5.PEG部分を担持する伸長部が、B1位に対してN末端的位置に位置している、第1項のペグ化インスリンアナログ。
6.PEG部分を担持する伸長部が、A21位に対してC末端的位置に位置している、第1項のペグ化インスリンアナログ。
7.PEG部分を担持する伸長部が、B30位に対してN末端的位置に位置している、第1項のペグ化インスリンアナログ。
9.インスリン分子当たりの伸長部の数が3である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
10.インスリン分子当たりの伸長部の数が2である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
11.インスリン分子当たりの伸長部の数が1である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
− x1が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでKはリジンである)AAx1K(C末端伸長部に対して)、
− x2が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでKはリジンである)K-AAx2-(N末端伸長部に対して)、
− x3が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでCはシステインである)AAx3C(C末端伸長部に対して)、
− x4が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでCはシステインである)C-AAx4-(N末端伸長部に対して)、
− x5が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、yが0又は1である(さらに、ここでRはアルギニンである)AAx5-Ry-(N末端伸長部に対して)、
[ここでAAは、Lys及びCysを除く任意のコード性アミノ酸残基であり、好ましくはAAはペプチド鎖であり、各コード性アミノ酸は同一又は異なっている]
のものからなり、ここでPEG部分は、存在する場合はリジン又はシステイン残基(類)の側鎖(類)又はN末端アミノ基(類)(又はその双方)に結合している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
15.AAがグリシン残基である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
16.AAがアラニン残基である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
17.AAがグルタミン残基である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
− x1が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでG及びKは、それぞれグリシン及びリジンである)Gx1K(C末端伸長部に対して)、
− x2が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでG及びKは、それぞれグリシン及びリジンである)KGx2-(N末端伸長部に対して)、
− x3が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでG及びCは、それぞれグリシン及びシステインである)-Gx3C(C末端伸長部に対して)、
− x4が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(さらに、ここでG及びCは、それぞれグリシン及びcysteineである)C-Gx4−(N末端伸長部に対して)、
− x5が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8であり、yが0又は1である(さらに、ここでG及びRは、それぞれグリシン及びアルギニンである)Gx5-Ry-(N末端伸長部に対して)、
のものからなり、ここでPEG部分は、存在する場合はリジン又はシステイン残基(類)の側鎖(類)又はN末端アミノ基(類)(又はその双方)に結合している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
20.親インスリンアナログが、A22K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
21.親インスリンアナログが、A22G、A23K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
22.親インスリンアナログが、A22G、A23G、A24K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
24.親インスリンアナログが、A22K、B3Q、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
25.親インスリンアナログが、A22K、B3S、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
27.親インスリンアナログが、A22K、B1Q、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
28.親インスリンアナログが、A18Q、A22K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
30.親インスリンアナログが、B29Q及びB31Kを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
31.親インスリンアナログが、A21G、B29Q及びB31Kを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
33.親インスリンアナログが、A21Q、B29Q及びB31Kを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
34.親インスリンアナログが、A-1K及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
36.親インスリンアナログが、A-3G、A-2G、A-1R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
37.親インスリンアナログが、A22K、B28E、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
39.親インスリンアナログが、A22K、B28E、B29R、desB27及びdesB30Aを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
40.親インスリンアナログが、B28E、B29Q及びB31Kを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
42.親インスリンアナログが、A22K、B28R、desB29及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
43.親インスリンアナログが、B28R、B29P及びB31Kを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
45.親インスリンアナログが、A21G、B3Q、B28E、B29Q及びB31Kを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
46.親インスリンアナログが、A22K、B13Q、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
48.親インスリンアナログが、A14E、A22K、B25H及びdesBを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
49.親インスリンアナログが、A14E、B25H、B29Q及びB31Kを有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
51.親インスリンアナログが、A21Q、A22K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
52.親インスリンアナログが、A21Q、A22G、A23K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
54.親インスリンアナログが、A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
55.親インスリンアナログが、A21A、A22K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
57.親インスリンアナログが、A21A、A22G、A23G、A24K、B29R及びdesB30A22K、B3S、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
58.親インスリンアナログが、A21A、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
60.親インスリンアナログが、A21G、A22G、A23K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
61.親インスリンアナログが、A21G、A22G、A23G、A24K、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
63.親インスリンアナログが、A21Q、A22K、B3Q、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
64.親インスリンアナログが、A21G、A22K、B3Q、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
66.親インスリンアナログが、A14E、A22K、B25H、B29R及びdesB30を有することでヒトインスリンから逸脱しており、好ましくは該インスリンアナログにおいてさらなる変異がない、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
68.nが、2〜約1000、好ましくは2〜約500、好ましくは2〜約250、好ましくは2〜約125、好ましくは2〜約50、及び好ましくは2〜約25の範囲の整数である、部分-(OCH2CH2)n-を含有する、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
70.ポリエチレングリコール部分が単分散である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
71.ポリエチレングリコールが一般式-(CH2CH2O)n-を有するものであり、ここでnは、少なくとも約6、好ましくは少なくとも約10、及び約110を越えず、好ましくは約75を越えない整数であり、さらに好ましくは、nは約6〜約30の範囲、好ましくは約10〜約48の範囲にある、上述した可能な項のペグ化インスリンアナログ。
72.ポリエチレングリコール部分が多分散である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
74.一般式-Q1-(OCH2CH2)n-R1の基を有し、Q1が、伸長部において、アミノ酸のα-又はγ-NH-基に、好ましくはアミド又はカルバメート結合を介して、ポリエチレングリコール部分を連結させるリンカーであり、nは2〜約1000の範囲の整数であり、R1はアルコキシ又はヒドロキシル、好ましくはメトキシである、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
75.nが、2〜約500、好ましくは2〜約500、好ましくは2〜約250、好ましくは2〜約125、好ましくは2〜約50、及び好ましくは2〜約25の範囲の整数である、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
77.Q1がエチレンカルボニル(-(CH2)2-CO-)であり、カルボニル基を介して-NH-残基に連結している、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
78.Q1が-アルキレン-NHCO-アルキレン-CO-であり、カルボニル基を介して持続型インスリンの-NH-残基に連結している、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
79.Q1が-CO-アルキレン-CO-である、最後の3つを除く、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
80.Q1が-CO-(4-ニトロフェノキシ)である、最後の4つを除く、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
82.Q1が、-CH2CO-、-CH2CH2CO-、-CH2CH2CH2CO-、-CH2CH(CH3)CO-、-CH2CH2CH2CH2CO-、-CH2CH2CH(CH3)CO-、-CH2CH2CH2CH2CH2CO-、-CH2CH2NH-COCH2CH2CO-、-CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-、-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CO-、-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-、-COCH2CH2CO-、-COCH2CH2CH2CO-、-CO-(4-ニトロフェノキシ)、(-CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2)3CNHCOCH2CH2(OCH2CH2)4NHCOCH2CH2CO-又は(-CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2)3CNHCOCH2CH2(OCH2CH2)4NHCOCH2CH2CH2CO-である、上述した可能な項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログ。
84.R1がメトキシである、上述した項のペグ化インスリンアナログ。
86.糖尿病を治療する薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
87.糖尿病を治療するために肺投与可能な薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
88.糖尿病を治療するために肺投与可能で、長時間の作用降下を付与する薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
89.糖尿病を治療するために肺投与可能なパウダー状薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
90.糖尿病を治療するために肺投与可能な液状薬学的組成物の調製のための、上述した生産項のいずれか一つの化合物の使用。
91.上述した生産項のいずれか一つの化合物を治療的有効量、それを必要とする患者に投与することを含む、糖尿病の治療方法。
93.インスリンアスパルト(insulin aspart)、並びに上述した項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログを含有する組成物。
94.インスリンリスプロ(Lispro)、並びに上述した項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログを含有する組成物。
95.インスリングルリシン(Glulisine)、並びに上述した項のいずれか一つのペグ化インスリンアナログを含有する組成物。
96.任意の新規の特徴、又はここに記載した特徴の組合せ。
ここに引用された刊行物、特許出願及び特許を含む全ての文献は、各文献が、出典明示により個々にかつ特に援用され、その全内容がここに記載されているかの如く、その全体が出典明示によりその全内容がここに援用される(法律により許容される最大範囲)。
全ての表題及び副題は、ここでは便宜的に使用され、決してこの発明を限定するものと解してはならない。
ここに提供される任意かつ全ての例、又は例示的言語(例えば「等」)の使用は、単にこの発明をより明らかに例証することを意図しており、特に請求項に記載がない限り、この発明の範囲に限定をもたらすものではない。明細書中の如何なる語句も請求項に記載していない要素がこの発明の実施に必須であることを示しているものと解してはならない。
ここでの特許文献の引用及び援用は単に便宜上なされているもので、そのような特許文献の有効性、特許性、及び/又は権利行使性についての見解を反映させるものではない。
場合によっては、一又は複数の以下の請求項と、ここに記載の一又は複数の実施態様とを組合せることで、さらなる実施態様が得られ、この発明は該実施態様及び請求項の全ての可能な組合せに関する。
完全性の目的のために、この発明は、親インスリンアナログがいわゆる単鎖インスリンである、ペグ化インスリンアナログに関しない(Danish appl. No.: 2005/00400 and WO appl. No.: 欧州特許第2006/060816号; our ref.: 7148)。よって、この発明において、我々は、出典明記により援用されるその内容を、これにより請求放棄する。
以下の列挙において、選択されたペグ化試薬は、活性化されたN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(OSu)として列挙される。また明らかに、他の活性エステル、例えば4-ニトロフェノキシ、及び当業者に公知の多くの他の活性剤を使用してよい。PEG(又はmPEG)部分、CH3O-(CH2CH2O)n-は、Mw40000Daまでの任意のサイズ、例えば750Da、2000Da、5000Da、20000Da、及び40000Daのものとすることができる。mPEG部分は多分散であるが、m:メチル/メトキシの末端キャップ、d:分離、及びxは例えば12〜24等、エチレングルコール残基の数である、mdPEGxと示される、例えば12〜24の繰り返しエチレングリコール単位の良く定められた鎖長さ(例えば分子量)を有するmPEGからなる単分散であってもよい。PEG部分は直鎖状又は分枝状のいずれかであってよい。持続型インスリンのPEG残基の構造/配列は、形式的には、「NHインスリン」で、種々のペグ化試薬から離脱基(例えば「-OSu」)を繰り返すことにより得ることができ、ここでインスリンは、A又はB鎖(又は双方)のアルファ-アミノ位置、又はリジン残基のイプシロン位置のいずれかでペグ化されている:
mPEG-COCH2CH2CO-OSu、
mPEG-COCH2CH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH2CH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH2CH2CH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH(CH3)CO-OSu、
mPEG-CH2CH2CH(CH3)CO-OSu、
mPEG-CH2CH2NH-COCH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CO-OSu、
mPEG-CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-OSu、
mPEG-CO-(4-ニトロフェノキシ)、
(mdPEG12-CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2)3CNHCOCH2CH2(OCH2CH2)4NHCOCH2CH2CO-OSu(又は、短くは:(mdPEG12)3-dPEG4-OSu)、
(mdPEG12-CH2CH2NHCOCH2CH2OCH2)3CNHCOCH2CH2(OCH2CH2)4NHCOCH2CH2CH2CO-OSu(又は、短くは:(mdPEG12)3-dPEG4-OSu)、
mdPEGx-COCH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-COCH2CH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2CH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2CH2CH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH(CH3)CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2CH(CH3)CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2NH-COCH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2CH2NH-COCH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CH2CH2NH-COCH2CH2CH2CO-OSu、
mdPEGx-CO-(4-ニトロフェノキシ)、
上式中、xは約6〜約48の範囲の整数、例えば12又は24である。
この方法論により、さらに大きな単分散(及び多分散)の仕立てサイズのペグ化試薬の構築が可能となる。
mPEG750(ここで、「750」は、Daでの平均分子量を示す)、
mPEG2000、
mPEG5000、
mPEG10000、
mPEG20000、
mPEG30000、
mPEG40000、
mdPEG12(ここで、下付き文字「12」は、ここで定義されるように、PEG分子の数を示し、例えばQuanta BioDesign Ltd)、
mdPEG24、
mdPEG3x12 (ここで、下付き文字「3x12」は、ここで定義されるように、PEGが分枝状で、それぞれ12のPEGモノマーからなる3つのアームからなることを示し、例えばQuanta BioDesign Ltd)、
mdPEG12-dPEG12、
mdPEG12-dPEG24、
mdPEG24-dPEG12、
mdPEG24-dPEG24、
mdPEG24-dPEG24-dPEG24、
mdPEG3x12-dPEG12、
mdPEG3x12-dPEG24-dPEG24。
PEG-MALの例:mPEG-MAL。
A22K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A22K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21Q、A22K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21G、A22K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21Q、A22G、A23K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21G、A22G、A23K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21Q、A22G、A23G、A24K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21G、A22G、A23G、A24K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B25H、B29R、desB30ヒトインスリン;
B29Q、B31Kヒトインスリン;
A22K、B3Q、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22K、B3S、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22K、B3T、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22K、B1Q、B29R、desB30ヒトインスリン;
A18Q、A22K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22K、desB1、B3Q、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、B29Q、B31Kヒトインスリン;
A21A、B29Q、B31Kヒトインスリン;
A21Q、B29Q、B31Kヒトインスリン;
A-1K、desB30ヒトインスリン;
A-1K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A-3G、A-2G、A-1R desB30ヒトインスリン;(N末端A-3-ペグ化)
A22K、B28E、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22K、B28D、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22K、desB27、B28E、B29R、desB30ヒトインスリン;
B28E、B29Q、B31Kヒトインスリン;
desB27、B28E、B29Q、B31Kヒトインスリン;
A22K、B28R、desB29、desB30ヒトインスリン;
B28R、B29P、B31Kヒトインスリン;
A22K、B3Q、B28E、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、B3Q、B28E、B29Q、B31Kヒトインスリン;
A22K、B13Q、B29R、desB30ヒトインスリン;
A22K、desB1、B29R、desB30ヒトインスリン;
A14E、A22K、B25H、desB30ヒトインスリン;
A14E、B25H、B29Q、B31Kヒトインスリン;
A13E、A22K、B25H、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21A、A22K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21A、A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21A、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23G、A24K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21A、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21Q、A22K、B3Q、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21A、A22K、B3Q、B29R、desB30ヒトインスリン;
A21G、A22K、B3Q、B29R、desB30 ヒトインスリン。
発現ベクターの構築、酵母細胞の形質転換、及び本発明のインスリン前駆体の発現
全ての発現プラスミドは、出芽酵母におけるプラスミドの選択及び安定化を目的とし、分裂酵母トリオースリン酸イソメラーゼ遺伝子(POT)を含有することで特徴付けられる、欧州特許第171142号に記載のものに類似した、C-POT型のものである。またプラスミドは、出芽酵母トリオースリン酸イソメラーゼプロモータ及びターミネーターをさらに含有する。これらの配列は、インスリン生成物及びリーダーの融合タンパク質をコードするEcoRI-XbaIフラグメントの配列を除く全ての配列であるとして、プラスミドpKFN1003における対応配列に類似している(国際公開第90/10075号に記載)。種々の融合タンパク質を発現させるために、pKFN1003のEcoRI-XbaIフラグメントは、関心あるリーダー-インスリン融合体をコードするEcoRI-XbaIフラグメントで簡単に置き換えられる。このようなEcoRI-XbaIフラグメントは、標準的な手順に従い、合成オリゴヌクレオチド及びPCRを使用して合成されてよい。
MT663を、600nmでの光学密度が0.6になるまで、YPGaL(1%のバクト酵母抽出物、2%のバクトペプトン、2%のガラクトース、1%のラクタート)において増殖させた。100mlの培養体を遠心分離により収集し、10mlの水で洗浄し、再度遠心分離し、1.2Mのソルビトール、25mMのNa2EDTA、pH=8.0及び6.7mg/mlのジチオトレイトール(dithiotreitol)を含有する10mlの溶液に再懸濁させた。懸濁液を30℃で15分インキュベートし、遠心分離し、1.2Mのソルビトール、10mMのNa2EDTA、0.1Mのクエン酸ナトリウム、pH5.8、及び2mgのNovozym(登録商標)234を含有する10mlの溶液に、細胞を再懸濁させた。懸濁液を30℃で30分インキュベートし、遠心分離により細胞を収集し、10mlの1.2Mソルビトール及び10mlのCAS(1.2Mのソルビトール、10mMのCaCl2、10mMのTris HCl(pH=7.5))で洗浄し、2mlのCASに再懸濁させた。形質転換のために、1mlのCAS-懸濁細胞を、約0.1mgのプラスミドDNAと混合し、室温に15分間放置した。1mlの(20%のポリエチレングリコール4000、10mMのCaCl2、10mMのTris HCl、pH=7.5)を添加し、混合物をさらに30分、室温で放置した。混合物を遠心分離し、ペレットを、0.1mlのSOS(1.2Mのソルビトール、33%v/vのYPD、6.7mMのCaCl2)に再懸濁させ、30℃で2時間インキュベートした。ついで、懸濁液を遠心分離にかけ、ペレットを0.5mlの1.2Mソルビトールに再懸濁させた。ついで、6mlの上層寒天(1.2Mのソルビトールと2.5%の寒天を含有する、ShermanらのSC番地 (1982) Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory)を52℃で添加し、同様の寒天で凝固した、ソルビトール含有培地を収容するプレートの頂部に、懸濁液を注いだ。発現プラスミドで形質転換された出芽酵母株MT663を、30℃で72時間、YPDにおいて増殖させた。
上述したようにして多くのインスリン前駆体を生成し、培地から単離して、精製した。インスリン前駆体をペグ化させ、以下の実施例に記載したようにしてプロセシングし、最終的なインスリン誘導体を生成した(一般的手順(A))。場合によっては、ペグ化の前に、トリプシンにより、前駆体をプロセシングすることもできる(一般的手順(B))。これらのインスリン誘導体を、以下に記載するようなヒトインスリンと比較し、ヒトインスリンレセプターに対する結合親和性により測定されるように、生物学的インスリン活性についてテストした。
一般的手順(A)
A22K(Nε-mPEG2000-プロピオニル),B29R,desB30ヒトインスリン
インスリン前駆体A22K,B29R,desB30,B'A単鎖インスリンは、以下の精製工程AないしCに記載したようにして精製することができる。
工程Aにおいて、10.75リットルの清浄な培地を、4.5リットルの99%エタノールを添加することにより希釈し、30vol%のエタノールを含有する、全体容量15.25リットルとした(伝導率:2.7mS/cm、pH=3.4)。300mlのSPビッグ・ビーズセファロースカラム(100-300μm、Amersham Biosciences)を、朝まで、15.25リットルの調製された培養培地(流量近似(flow app.):10ml/分)を充填する前に、1リットルの0.1Mクエン酸、pH3.5(流量近似:20ml/分)で平衡にした。カラムに充填させた後、再度、1リットルの0.1Mクエン酸、pH3.5、続いて1リットルの40vol%エタノール(流量近似:20ml/分)で洗浄した。ついで、結合していたインスリン前駆体A22K,B29R,desB30,B'A単鎖インスリンを、1.5リットルの0.2M酢酸ナトリウム、35vol%のエタノール、pH 5.75で溶出させた(流量:1.5ml/分、溶出した前駆体容量:400ml、前駆体の量:220mg)。
工程Bにおいて、溶出液を所定の乾燥度になるまで蒸発させ、ペレットを0.25Mの酢酸に再溶解させた。C18カラム(ODDMS C18、20x250mm、200Å、10μm、FeF Chemicals A/S)において逆相HPLCにより精製する直前に、pHをさらに1.5まで低下させた。カラムに適用する前に、前駆体溶液を滅菌濾過した(22μm、Low Protein Binding Durapore(登録商標)(PVDF)、Millipore)。15%B〜50%Bの勾配をカラムに流し、ここでバッファーA:0.2Mの(NH4)2SO4、0.04Mのオルト-リン酸、10vol%のエタノール、pH2.5、及びバッファーB:70vol%のエタノールである。5ml/分の流量、40℃のカラム温度で、勾配を120分流した。インスリン前駆体A22K,B29R,desB30,B'A単鎖インスリンを溶出させ、プールした(全量量:75ml)。
工程Cにおいて、逆相HPLCからの溶出液におけるエタノール含有量を、ロータリーエバポレータを使用して、5vol%以下に低減させた(新規容量:〜50ml)。1000mlのG25セファデックスカラム(5x55cm、Amersham Biosciences)を、0.5Mの酢酸で洗浄し、ついでインスリン前駆体A22K,B29R,desB30,B'A単鎖インスリンをカラムに適用し、0.5Mの酢酸においてゲル濾過することにより脱塩した。ついで、インスリン前駆体を280nmでのUV検出にかけ、さらに、塩を伝導率測定にかけた。脱塩直後に、インスリン前駆体を凍結乾燥させた。
0.15mmolの凍結乾燥されたインスリン前駆体LysA22 ArgB29 desB30 B'Aを、炭酸ナトリウム水(3ml、100mM)に溶解させる。アセトニトリルにペグ化試薬mPEG2000-SPA-OSuが入った溶液(3mlに0.15mmol)を前駆体溶液に添加し、混合物をゆっくりと1時間攪拌する。混合物を凍結乾燥させ、HPLCにより精製し、凍結乾燥して、ペグ化された前駆体を提供する。
ペグ化インスリン前駆体A22K(Nε-mPEG2000-プロピオニル),desB30 B'A単鎖ヒトインスリン前駆体(3.9mmol)を、4.2mlの50mMグリシン、20vol%のエタノール、pH10.0に溶解させる。また、3.6mgの凍結乾燥されたブタトリプシン(Novo Nordisk A/S)を、3.5mlの50mMグリシン、20vol%のエタノール、pH10.0に溶解させる。ついで、このトリプシン溶液の0.5mlをインスリン前駆体溶液に添加する(よって、インスリン前駆体は200倍超になる)。ついで、混合物を室温で15分インキュベートし、その後、トリプシン活性をpH<3(0.5Mの酢酸を用いてpH=2.08)に低下させることにより停止される。ついで、ペグ化インスリンアナログA22K(Nε-mPEG2000-プロピオニル),B29R,desB30ヒトインスリンを、逆相HPLCにより精製(トリプシン、及び任意のアシル化されていない、二重にアシル化された、又は決断されていないインスリン分子を除去)し、凍結乾燥することで、表題のインスリンが提供される。
この手順は、一般的手順(A)と非常に類似している。個々の工程の順番は、B'A前駆体が、ペグ化の前にトリプシンにより切断されるように変えられる。一般的手順(B)は第1の実施例において例証される。
一般的手順(B):
A22K(NεmPEG2000-プロピオニル),B29R,desB30ヒトインスリン
MALDI-MS(マトリックス:シナピン酸);m/z:8114。
一般的手順(B):
A22G,A23G,A24G,A25K(NεmPEG750-プロピオニル),B29R,desB30ヒトインスリン
一般的手順(B):
A14E,A22K(NεmdPEG12-dPEG24-プロピオニル),B25H,B29R,desB30ヒトインスリン
オメガ-(メトキシ-PEG11-プロパノイルアミノ)-PEG24-プロパン酸(mdPEG12-dPEG24酸)の調製
LCMS:m/z:1718(M+1)+。
LCMS:m/z 1813.8(M+1)+。
一般的手順(B):
A14E,A22K(NεmdPEG24-dPEG12-プロピオニル),B25H,B29R,desB30ヒトインスリン
LCMS:m/z 1814(M+1)+。
一般的手順(B):
A14E,A22K(NεmPEG2000-プロピオニル),B25H,B29R,desB30ヒトインスリン
一般的手順(B):
A14E,A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル),B25H,B29R,desB30ヒトインスリン
このインスリンは、PEG試薬NHS-dPEG4-(m-dPEG12)3エステル(Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10401)を使用して調製した。
一般的手順(B):
A14E,A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4- イル-dPEG12-イル),B25H,B29R,desB30ヒトインスリン
このインスリンは、PEG試薬NHS-dPEG4-(m-dPEG12)3エステル(Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10401)及びアミノ-dPEG12 tert-ブチルエステル(Quanta BioDesign 製品番号10281)を使用して調製した。
一般的手順(B):
A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル-dPEG12-イル),B29R,desB30ヒトインスリン
このインスリンは、上述したようにして、PEG試薬NHS-dPEG4-(m-dPEG12)3エステル(Quanta BioDesign Ltd. 製品番号10401)及びアミノ-dPEG12 tert-ブチルエステル(Quanta BioDesign 製品番号10281)を使用して調製した。
一般的手順(B):
A22K(Nε(mdPEG24-プロピオニル),A14E,B25H,B29R,desB30ヒトインスリン
一般的手順(B):
A22K(Nε(mPEG5.000-プロピオニル)),A14E,B25H,B29R,desB30ヒトインスリン
この発明のインスリン誘導体のインスリンレセプター結合性
ヒトインスリンレセプターについての、この発明のインスリン誘導体の親和性は、SPAアッセイ(シンチレーション近接アッセイ)マイクロタイタープレート抗体捕捉アッセイにより測定される。SPA-PVT抗体-結合ビーズ、抗-マウス試薬(Amersham Biosciences、カタログ番号 PRNQ0017)を、25mlの結合バッファー(100mMのHEPES、pH7.8;100mMの塩化ナトリウム、10mMのMgSO4、0.025%のトゥイーン(Tween)-20)と混合した。単一のPackard Optiplate(Packard No.6005190)用の試薬混合物は、2.4μlの1:15000に希釈された精製組換えヒトインスリンレセプター(エクソン11を有する又は有さない)、100μlの試薬混合物当たり500cpmに相当するA14Tyr[125I]-ヒトインスリンの所定量の保存溶液、12μlの1:1000に希釈されたF12抗体、3mlのSPA-ビーズ、全体を12mlにする結合バッファーからなる。ついで、全体で100μlの試薬混合物を、Packard Optiplateの各ウェルに添加し、インスリン誘導体の希釈シリーズを、適切なサンプルからOptiplateにおいて作製する。ついで、ゆっくりと振揺させつつ、サンプルを16時間インキュベートする。ついで、1分間遠心分離することにより相分離させ、プレートをトップカウンターで計測する。GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software, San Diego、CA)における非線状回帰アルゴリズムを使用し、結合データを適合させた。
実施例番号 インスリンレセプター結合性
Aイソ型(エクソン11なし)
ヒトインスリンに対する
1,2 90%
3 123%
4 188%
6 120%
5 118%
7 44%
8 58%
9 128%
10 123%
15 20%
13 24%
14 16%
17 19%
18 16%
19 106%
20 24%
22 14%
16 15%
発明のインスリン誘導体のラットにおける静脈内ボーラス注射後の血中グルコース低下の影響
ハイプノルム-ドルミカム(Hypnorm-Dormicum)皮下注射(1.25mg/mlのドルミカム、2.5mg/mlのフルアニソン、0.079mg/mlのクエン酸フェンタニル)を、プライミング用量(試験物質の投与前〜30分の時点)として2ml/kg、及び付加的に20分毎に1ml/kgを使用し、オスのウィスターラット、200〜300g、18時間絶食に麻酔をかける。
動物に、1ml/kgの対照体及びテスト用化合物(通常の用量範囲:0.125-20nmol/kg)を、静脈注射(尾静脈)を用いて投与する。全血中グルコース濃度を決定するための血液サンプルを、−20分及び0分(投与前)、投与後10、20、30、40、60、80、120及び180分の時点で、尾端の毛細管の刺し傷より、ヘパリン処理された10μlのガラスチューブにて収集する。EBIO Plus自動分析器(Eppendorf, Germany)を使用する、固定化グルコースオキシダーゼ法により、分析バッファーにおいて希釈した後、血中グルコース濃度を測定する。平均血漿グルコース濃度コース(平均±SEM)を、各用量及び各化合物について作製する。
ヒトインスリンに対するこの発明のインスリン誘導体の作用強度
実験日に238-383gのオスのスプラーグドーリーラットを、クランプ実験に使用する。制御された周囲条件下、ラットは餌に自由に接近し、クランプ実験の前には一晩(3pmから)絶食させる。
外科手順の少なくとも1週間前に、ラットを動物施設に順化させる。クリンプ実験の約1週間前、ハロタン麻酔下で、頸静脈(注入のため)及び頸動脈(血液のサンプリングのため)にタイゴンカテーテルを挿入し、露出させ、頸部の後ろに固定する。外科手術後、ラットをStreptocilin vet.(Boehringer Ingelheim;0.15ml/ラット、筋肉内)に付与し、回復期間中、動物ケアユニット(25℃)におく。無痛覚とするために、麻酔中にアノルフィン(Anorphin)(0.06mg/ラット、皮下)を投与し、麻酔から十分に回復した後(2-3時間)、再度2日に1回、リマダイル(Rimadyl)(1.5mg/kg、皮下)を投与する。
ラットへのインスリン誘導体の肺送達
試験物質は、滴下注入法により肺投与されるであろう。簡単に述べると、雄ウィスターラット(約250g)に、6.6ml/kgの皮下プライミング用量で、続いて30分の間隔を開けて、3.3ml/kgの維持用量を3回投与する、約60mlのフェンタニル/デヒドロデンズペリドール/-ドルミカムで麻酔した。麻酔誘導の10分後、基礎試料を尾静脈(t=−20分)から得、続いて試験物質の投与直前(t=0)、基礎試料を得た。t=0において、試験物質を一方の肺に、気管内投与した。丸くなった端部を有する特別なカニューレを、200μlの空気と試験物質(1mg/kg)を含むシリンジに搭載する。開口を介して、カニューレを気管内に導入し、二分枝部を丁度通過するように、主気管支の一方に送る。挿入中、頸部を外側から触診し、気管内位置決めを担保する。シリンジの内容物を注射し、2秒中断する。その後、カニューレをゆっくりと引き抜く。試験中(4又は8時間までの血液試料)、ラットは麻酔をかけられたままであり、実験後、安楽死させる。
次の実施例のペグ化持続型インスリンは、上述と同様にして調製される:
実施例#:ペグ化持続型インスリン:
27 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
28 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
29 A22G A23K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
30 A22G A23K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
31 A22G A23K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
32 A22G A23K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
33 A22G A23K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
34 A22G A23K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
35 A22G A23K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
36 A22G A23K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
37 A22G A23G A24K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
38 A22G A23G A24K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
39 A22G A23G A24K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
40 A22G A23G A24K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
41 A22G A23G A24K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
42 A22G A23G A24K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
43 A22G A23G A24K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
44 A22G A23G A24K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
45 A22G A23G A24K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
46 A22G A23G A24G A25K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
47 A22G A23G A24G A25K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
48 A22G A23G A24G A25K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
49 A22G A23G A24G A25K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
50 A22G A23G A24G A25K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
51 A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
52 A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
53 A22G A23G A24G A25K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
54 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
55 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
56 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
57 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
58 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
59 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
60 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
61 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
62 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
63 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
64 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
65 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
66 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
67 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
68 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
69 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
70 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
71 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B3S B29R desB30ヒトインスリン;
72 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
73 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
74 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
75 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
76 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
77 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
78 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
79 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
80 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B3T B29R desB30ヒトインスリン;
81 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
82 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
83 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
84 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
85 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
86 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
87 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
88 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
89 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B1Q B29R desB30ヒトインスリン;
90 A18Q A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
91 A18Q A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
92 A18Q A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
93 A18Q A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
94 A18Q A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
95 A18Q A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
96 A18Q A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
97 A18Q A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
98 A18Q A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
99 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
100 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
101 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
102 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
103 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
104 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
105 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
106 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
107 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)desB1 B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
108 B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
109 B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
110 B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
111 B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
112 B29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
113 B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
114 B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
115 B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
116 B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
117 A21G B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
118 A21G B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
119 A21G B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
120 A21G B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
121 A21G B29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
122 A21G B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
123 A21G B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
124 A21G B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
125 A21G B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
126 A21A B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
127 A21A B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
128 A21A B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
129 A21A B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
130 A21A 29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
131 A21A B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
132 A21A B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
133 A21A B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
134 A21A B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
135 A21Q B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
136 A21Q B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
137 A21Q B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
138 A21Q B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
139 A21Q B29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
140 A21Q B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
141 A21Q B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
142 A21Q B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
143 A21Q B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
144 A-1K(NεmPEG750-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
145 A-1K(NεmPEG2.000-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
146 A-1K(NεmPEG5.000-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
147 A-1K(NεmPEG10.000-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
148 A-1K(NεmPEG20.000-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
149 A-1K(NεmPEG40.000-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
150 A-1K(NεmdPEG12-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
151 A-1K(NεmdPEG24-プロピオニル)desB30ヒトインスリン;
152 A-1K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)desB30ヒトインスリン;
153 A-1K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
154 A-1K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
155 A-1K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
156 A-1K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
157 A-1K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
158 A-1K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
159 A-1K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
160 A-1K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
161 A-1K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
162 A-3G(NαmPEG750-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
163 A-3G(NαmPEG2.000-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
164 A-3G(NαmPEG5.000-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
165 A-3G(NαmPEG10.000-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
166 A-3G(NαmPEG20.000-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
167 A-3G(NαmPEG40.000-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
168 A-3G(NαmdPEG12-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
169 A-3G(NαmdPEG24-プロピオニル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
170 A-3G(Na(mdPEG12)3-dPEG4-イル)A-2G A-1R desB30ヒトインスリン;
171 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
172 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
173 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
174 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
175 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
176 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
177 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
178 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
179 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B28E B29R desB30ヒトインスリン;
180 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
181 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
182 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
183 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
184 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
185 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
186 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
187 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
188 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B28D B29R desB30ヒトインスリン;
189 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
190 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
191 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
192 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
193 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
194 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
195 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
196 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
197 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)desB27 B28E B29R desB30ヒトインスリン;
198 B28E B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
199 B28E B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
200 B28E B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
201 B28E B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
202 B28E B29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
203 B28E B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
204 B28E B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
205 B28E B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
206 B28E B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
207 desB27 B28E B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
208 desB27 B28E B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
209 desB27 B28E B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
210 desB27 B28E B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
211 desB27 B28E B29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
212 desB27 B28E B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
213 desB27 B28E B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
214 desB27 B28E B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
215 desB27 B28E B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4- イル)ヒトインスリン;
216 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
217 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
218 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
219 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
220 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
221 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
222 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
223 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
224 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B28R desB29 desB30ヒトインスリン;
225 B28R B29P B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
226 B28R B29P B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
227 B28R B29P B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
228 B28R B29P B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
229 B28R B29P B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
230 B28R B29P B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
231 B28R B29P B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
232 B28R B29P B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
233 B28R B29P B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
234 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
235 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
236 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
237 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
238 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
239 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
240 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
241 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
242 A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B3Q B28E B29R desB30ヒトインスリン;
243 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
244 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
245 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
246 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
247 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
248 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
249 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
250 A21G B3Q B28E B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
251 A21G B3Q B28E B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
252 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
253 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
254 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
255 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
256 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
257 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
258 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
259 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
260 A22K(Nε((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B13Q B29R desB30ヒトインスリン;
261 A22K(NεmPEG750-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
262 A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
263 A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
264 A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
265 A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
266 A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
267 A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
268 A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
269 A22K(Nε((mdPEG12)3-dPEG4-イル)desB1 B29R desB30ヒトインスリン;
270 A14E A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
271 A14E A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
272 A14E A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
273 A14E A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
274 A14E A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
275 A14E A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
276 A14E A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
277 A14E A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
278 A14E A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B25H desB30ヒトインスリン;
279 A14E B25H B29Q B31K(NεmPEG750-プロピオニル)ヒトインスリン;
280 A14E B25H B29Q B31K(NεmPEG2.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
281 A14E B25H B29Q B31K(NεmPEG5.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
282 A14E B25H B29Q B31K(NεmPEG10.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
283 A14E B25H B29Q B31K(NεmPEG20.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
284 A14E B25H B29Q B31K(NεmPEG40.000-プロピオニル)ヒトインスリン;
285 A14E B25H B29Q B31K(NεmdPEG12-プロピオニル)ヒトインスリン;
286 A14E B25H B29Q B31K(NεmdPEG24-プロピオニル)ヒトインスリン;
287 A14E B25H B29Q B31K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)ヒトインスリン;
288 A13E A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
289 A13E A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
290 A13E A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
291 A13E A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
292 A13E A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
293 A13E A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
294 A13E A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
295 A13E A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B25H desB30ヒトインスリン;
296 A13E A22K(Nε(mdPEG12)3-dPEG4-イル)B25H desB30ヒトインスリン;
297 A21Q A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
298 A21Q A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
299 A21Q A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
300 A21Q A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
301 A21Q A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
302 A21Q A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
303 A21Q A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
304 A21Q A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
305 A21Q A22K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
306 A21Q A22G A23K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
307 A21Q A22G A23K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
308 A21Q A22G A23K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
309 A21Q A22G A23K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
310 A21Q A22G A23K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
311 A21Q A22G A23K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
312 A21Q A22G A23K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
313 A21Q A22G A23K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
314 A21Q A22G A23K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
315 A21Q A22G A23G A24K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
316 A21Q A22G A23G A24K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
317 A21Q A22G A23G A24K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
318 A21Q A22G A23G A24K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
319 A21Q A22G A23G A24K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
320 A21Q A22G A23G A24K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
321 A21Q A22G A23G A24K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
322 A21Q A22G A23G A24K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
323 A21Q A22G A23G A24K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
324 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
325 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
326 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
327 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
328 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
329 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
330 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
331 A21Q A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
332 A21Q A22G A23G A24G A25K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
333 A21A A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
334 A21A A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
335 A21A A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
336 A21A A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
337 A21A A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
338 A21A A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
339 A21A A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
340 A21A A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
341 A21A A22K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
342 A21A A22G A23K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
343 A21A A22G A23K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
344 A21A A22G A23K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
345 A21A A22G A23K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
346 A21A A22G A23K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
347 A21A A22G A23K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
348 A21A A22G A23K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
349 A21A A22G A23K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
350 A21A A22G A23K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
351 A21A A22G A23G A24K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
352 A21A A22G A23G A24K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
353 A21A A22G A23G A24K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
354 A21A A22G A23G A24K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
355 A21A A22G A23G A24K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
356 A21A A22G A23G A24K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
357 A21A A22G A23G A24K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
358 A21A A22G A23G A24K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
359 A21A A22G A23G A24K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
360 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
361 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
362 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
363 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
364 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
365 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
366 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
367 A21A A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
368 A21A A22G A23G A24G A25K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
369 A21G A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
370 A21G A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
371 A21G A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
372 A21G A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
373 A21G A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
374 A21G A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
375 A21G A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
376 A21G A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
377 A21G A22K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
378 A21G A22G A23K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
379 A21G A22G A23K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
380 A21G A22G A23K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
381 A21G A22G A23K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
382 A21G A22G A23K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
383 A21G A22G A23K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
384 A21G A22G A23K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
385 A21G A22G A23K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
386 A21G A22G A23K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
387 A21G A22G A23G A24K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
388 A21G A22G A23G A24K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
389 A21G A22G A23G A24K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
390 A21G A22G A23G A24K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
391 A21G A22G A23G A24K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
392 A21G A22G A23G A24K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
393 A21G A22G A23G A24K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
394 A21G A22G A23G A24K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
395 A21G A22G A23G A24K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
396 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmPEG750-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
397 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
398 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
399 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
400 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
401 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
402 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG12-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
403 A21G A22G A23G A24G A25K(NεmdPEG24-プロピオニル)B29R desB30ヒトインスリン;
404 A21G A22G A23G A24G A25K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B29R desB30ヒトインスリン;
405 A21Q A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
406 A21Q A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
407 A21Q A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
408 A21Q A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
409 A21Q A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
410 A21Q A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
411 A21Q A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
412 A21Q A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
413 A21Q A22K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
414 A21G A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
415 A21G A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
416 A21G A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
417 A21G A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
418 A21G A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
419 A21G A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
420 A21G A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
421 A21G A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
422 A21G A22K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
423 A21A A22K(NεmPEG750-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
424 A21A A22K(NεmPEG2.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
425 A21A A22K(NεmPEG5.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
426 A21A A22K(NεmPEG10.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
427 A21A A22K(NεmPEG20.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
428 A21A A22K(NεmPEG40.000-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
429 A21A A22K(NεmdPEG12-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
430 A21A A22K(NεmdPEG24-プロピオニル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン;
431 A21A A22K((mdPEG12)3-dPEG4-イル)B3Q B29R desB30ヒトインスリン
Claims (13)
- ヒトインスリンと比較して、A21又はB30位から伸長した一のPEG含有C末端伸長部を有するペグ化インスリンアナログであって、該伸長部がアミノ酸残基からなり、PEG部分がリンカーを介して伸長部のアミノ酸残基に結合しており、
伸長部が、次の式:
− x1が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(ここでKはリジンである)AA x1 K、
− x3が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(ここでCはシステインである)AA x3 C、
− x1が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(ここでG及びKは、それぞれグリシン及びリジンである)G x1 K、
− x3が、0、1、2、3、4、5、6、7又は8である(ここでG及びCは、それぞれグリシン及びシステインである)-G x3 C、
[ここで、AAは、各アミノ酸残基が同一又は異なっており、それぞれがLys及びCysを除く任意のコード可能アミノ酸残基であるペプチド鎖のアミノ酸残基を表す]
から選択され、PEG部分が、存在する場合はリジン又はシステイン残基の側鎖に結合している、
ペグ化インスリンアナログ。 - 親インスリンアナログがリジン残基を一つだけ含んでいる、請求項1に記載のペグ化インスリンアナログ。
- PEG部分を担持している伸長部が、A21位のC末端の位置に位置している、請求項1に記載のペグ化インスリンアナログ。
- PEG部分を担持している伸長部が、B30位のC末端の位置に位置している、請求項1に記載のペグ化インスリンアナログ。
- 親インスリンアナログが、A-3位のG、A-2位のG、A-1位のK又はR、A22位のG又はK、A23位のG又はK、A24位のG又はK、A25位のK、B31位のKである伸長部の一又は複数においてヒトインスリンから逸脱している、請求項1ないし4のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
- AAが、グリシン、アラニン又はグルタミンの残基を表す、請求項1ないし5のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
- AAがグリシン残基を表す、請求項6に記載のペグ化インスリンアナログ。
- AAがアラニン残基を表す、請求項6に記載のペグ化インスリンアナログ。
- AAがグルタミン残基を表す、請求項6に記載のペグ化インスリンアナログ。
- 親インスリンアナログが、
A22K、B29R及びdesB30;
A22G、A23K、B29R及びdesB30;
A22G、A23G、A24K、B29R及びdesB30;
A22G、A23G、A24G、A25K、B29R及びdesB30;
A22K、B3Q、B29R及びdesB30;
A22K、B3S、B29R及びdesB30;
A22K、B3T、B29R及びdesB30;
A22K、B1Q、B29R及びdesB30;
A18Q、A22K、B29R及びdesB30;
A22K、B3Q、B29R、desB1及びdesB30;
B29Q及びB31K;
A21G、B29Q及びB31K;
A21A、B29Q及びB31K;
A21Q、B29Q及びB31K;
A22K、B28E、B29R及びdesB30;
A22K、B28D、B29R及びdesB30;
A22K、B28E、B29R、desB27及びdesB30;
B28E、B29Q及びB31K;
B28E、B29Q、B31K及びdesB27;
A22K、B28R、desB29及びdesB30;
B28R、B29P及びB31K;
A22K、B3Q、B28E、B29R及びdesB30;
A21G、B3Q、B28E、B29Q及びB31K;
A22K、B13Q、B29R及びdesB30;
A22K、B29R、desB1及びdesB30;
A14E、A22K、B25H及びdesB;
A14E、B25H、B29Q及びB31K;
A13E、A22K、B25H及びdesB30;
A21Q、A22K、B29R及びdesB30;
A21Q、A22G、A23K、B29R及びdesB30;
A21Q、A22G、A23G、A24K、B29R及びdesB30;
A21Q、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R及びdesB30;
A21A、A22K、B29R及びdesB30;
A21A、A22G、A23K、B29R及びdesB30;
A21A、A22G、A23G、A24K、B29R及びdesB30;
A21A、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R及びdesB30;
A21G、A22K、B29R及びdesB30;
A21G、A22G、A23K、B29R及びdesB30;
A21G、A22G、A23G、A24K、B29R及びdesB30;
A21G、A22G、A23G、A24G、A25K、B29R及びdesB30;
A21Q、A22K、B3Q、B29R及びdesB30;
A21G、A22K、B3Q、B29R及びdesB30;
A21A、A22K、B3Q、B29R及びdesB30;又は
A14E、A22K、B25H、B29R及びdesB30;
を有することでヒトインスリンから逸脱しており、
該インスリンアナログにさらなる変異がない、
請求項1ないし9のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。 - nが、2から約1000の整数である、部分-(OCH2CH2)n-を含有する、請求項1ないし10のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
- ポリエチレングリコール部分が、約200〜約40000の範囲の名目上の分子量を有する、請求項1ないし10のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログ。
- 請求項1ないし12のいずれか一項に記載のペグ化インスリンアナログの治療的有効量を含む、糖尿病の治療のための医薬。
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