CN101784562B

CN101784562B - 具有酰基和亚烷基二醇部分的胰岛素类似物

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Publication number: CN101784562B
Application number: CN200880102999.3A
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Inventors: P·马德森; T·B·克尔德森; T·霍格-詹森; T·M·塔格摩斯; P·雅各布森; J·T·科德拉; P·W·加里贝; D·X·格拉姆
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Filing date: 2008-08-15
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Abstract

可以方便地通过肺施用酰化胰岛素类似物，其中所述胰岛素类似物包括连接于A21氨基酸残基C末端的赖氨酸残基、或包括赖氨酸残基的最高达4个氨基酸残基的肽残基，所述肽残基连接于A21氨基酸残基C末端，特征在于包括亚烷基二醇部分的酰基部分与A22位置中的赖氨酸残基附着、或与A21氨基酸残基的C末端附着的肽残基中存在的赖氨酸残基附着，并且其中在胰岛素类似物中仅存在一个赖氨酸(K，Lys)。

Description

具有酰基和亚烷基二醇部分的胰岛素类似物

发明领域

本发明涉及新酰化胰岛素类似物及其相关方面。

发明背景

胰岛素是由胰的β细胞分泌的多肽激素。胰岛素由命名为A和B链的2条多肽链组成，所述A和B链通过2个链间二硫键连接在一起。在人、猪和牛胰岛素中，A和B链分别包含21和30个氨基酸残基。然而，从物种到物种，在2条链中的不同位置中存在的氨基酸残基中存在变异。基因工程的广泛使用已使得可能通过交换一个或多个氨基酸残基来制备天然存在的胰岛素的类似物。

胰岛素用于治疗糖尿病和与之关联或起因于其的疾病。胰岛素在维持正常代谢调节中是必需的。通常，胰岛素通过注射施用。不幸的是，由于与维持葡萄糖水平的紧密控制所需的许多注射相关的不适，许多糖尿病患者不愿意采取强化治疗。在口部施用后，胰岛素在胃肠道中快速降解，并且不吸收到血流内。因此，已研究了用于施用胰岛素的可替代途径，例如口部、直肠、经皮和鼻途径。然而，迄今这些施用途径仍未导致足够有效的胰岛素吸收。

数十年来，长效胰岛素制剂和速效胰岛素制剂都是可获得的，并且许多患者每天采取2-4次注射。在过去数十年中，已证明维持血糖水平的紧密控制对于糖尿病患者是极其重要的。

于2007年8月30日公开且具有公开号WO2007/096431的国际专利申请号(NovoNordiskA/S)描述了具有不含亚烷基二醇部分的复合侧链的胰岛素。具有公开号WO2006/082205的国际专利申请(NovoNordiskA/S)描述了具有与B链中的氨基酸连接的复合侧链的胰岛素。根据权利要求1，US6,444,641B1涉及包含脂肪酰链通过酰胺键与之连接的胰岛素类似物的脂肪酸酰化胰岛素类似物，其中所述脂肪胰岛素类似物具有比胰岛素的等电点高的等电点。根据权利要求1，WO2006/082205(NovoNordiskA/S)涉及胰岛素衍生物，其具有与亲本胰岛素分子的B链的N末端氨基酸残基的α-氨基或B链中存在的Lys残基的ε-氨基附着的侧链。Pharm.Res.21(2004)，1498-1504涉及地特胰岛素(insulindetemir)的延长机制。

定义

此处，术语胰岛素包含天然存在的胰岛素，例如人胰岛素，以及胰岛素类似物。

此处，术语氨基酸残基包含从其中氢原子已从氨基中去除和/或羟基已从羧基中去除和/或氢原子已从巯基中去除的氨基酸。不精确地，氨基酸残基可以叫做氨基酸。

此处，术语肽残基包含从其中氢原子已从氨基中去除和/或羟基已从羧基中去除和/或氢原子已从巯基中去除的肽。不精确地，肽残基可以叫做肽。

此处，术语胰岛素类似物包含这样的多肽，其具有在形式上可以通过缺失和/或置换(替换)在天然胰岛素中存在的一个或多个氨基酸残基，并且通过给A21氨基酸残基添加一个或多个氨基酸残基，而得自天然存在的胰岛素例如人胰岛素的结构的分子结构。优选地，添加和/或置换的氨基酸残基是可编码氨基酸残基。例如，A链可以在其C末端处延伸例如1、2、3或4个氨基酸残基(与人胰岛素相比较)，其位置分别表示为A22、A23、A24和A25。即使胰岛素类似物具有在A21/A22位置处的延伸，在所述胰岛素类似物中的其他位置处也可能存在缺失。类似于在人胰岛素中，在本发明的胰岛素类似物中，A21氨基酸残基与在20位置的Cys残基连接，所述Cys残基参与链间二硫键的形成。此处，术语亲本胰岛素或亲本胰岛素类似物也用于胰岛素类似物。主要地，当与携带侧链的胰岛素类似物区分时，使用术语亲本，所述侧链例如可以通过酰化而化学引入。

此处，术语如A1、A2、A3等分别指示在胰岛素A链中的位置1、2和3(从N末端计数)。类似地，术语如B1、B2、B3等分别指示在胰岛素B链中的位置1、2和3(从N末端计数)。使用关于氨基酸的单字母密码，术语如A21A、A21G和A21Q指定A21位置中的氨基酸分别是A、G和Q。使用关于氨基酸的三字母密码，相应表达分别是AlaA21、GlyA21和GlnA21。

此处，术语如desB29和desB30分别指示缺乏B29或B30氨基酸残基的胰岛素类似物。

胰岛素类似物以及A和B链中的位置编号如此完成，从而使得亲本化合物是具有用于其的编号的人胰岛素。

此处，表达“可编码的”与术语如氨基酸、氨基酸残基、肽或肽残基结合用于指示可以由核苷酸三联体(“密码子”)编码的氨基酸、氨基酸残基、肽或肽残基，参见基因工程。

此处，术语突变包含氨基酸序列中的任何改变(用可编码氨基酸的置换和插入以及缺失)。

关于速效胰岛素或推注(bolus)胰岛素意指具有与正常人胰岛素类似或更快的作用快速发作和/或与正常人胰岛素的那种相似或仅略微更长的作用持续时间的胰岛素。

关于延效胰岛素或基础胰岛素意指具有比常态或正常人胰岛素更长的作用持续时间的胰岛素。

高物理稳定性意指小于人胰岛素那种的50％的原纤维形成趋势。原纤维形成可以通过在给定条件下起始的原纤维形成前的滞后时间描述。

具有胰岛素受体和IGF-1受体亲和力的多肽是在合适的结合测定中能够与胰岛素受体和人IGF-1受体相互作用的多肽。此种受体测定是本领域众所周知的，并且在实施例中进一步描述。本发明的酰化胰岛素类似物将不与IGF-1受体结合或将与所述受体具有相当低亲和力。更确切地，本发明的酰化胰岛素类似物将具有与人胰岛素的那种基本上相同量级或更少的针对IGF-1受体的亲和力。

为了方便起见，此处在氨基酸名称后在括号中为常见三字母密码和单字母密码：甘氨酸(Gly&G)、脯氨酸(Pro&P)、丙氨酸(Ala&A)、缬氨酸(Val&V)、亮氨酸(Leu&L)、异亮氨酸(Ile&I)、甲硫氨酸(Met&M)、半胱氨酸(Cys&C)、苯丙氨酸(Phe&F)、酪氨酸(Tyr&Y)、色氨酸(Trp&W)、组氨酸(His&H)、赖氨酸(Lys&K)、精氨酸(Arg&R)、谷氨酰胺(Gln&Q)、天冬酰胺(Asn&N)、谷氨酸(Glu&E)、天冬氨酸(Asp&D)、丝氨酸(Ser&S)和苏氨酸(Thr&T)。如果由于分型错误，存在与常用密码的偏离，那么应用常用密码。在本发明的胰岛素中存在的氨基酸优选是可以由核酸编码的氨基酸。氨基酸如Glu和Asp可以为α、γ、L或D形式。

在说明书和实施例中已使用下述缩写：Da是道尔顿(分子量)，kDa是千道尔顿(＝1000Da)，Mw是分子量，OSu是1-琥珀酰亚胺氧基＝2，5-二氧吡咯烷-1-基氧，RT是室温，SA是芥子酸和Su是1-琥珀酰亚胺基＝2，5-二氧吡咯烷-1-基，DCM是二氯甲烷，DIEA(和DIPEA)是N，N-二异丙基乙胺，TSTU是N，N，N’，N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲阳离子四氟硼酸盐，Tris是三(羟甲基)氨基甲烷，CV是柱体积，NMP是N-甲基吡咯烷-2-酮，OTBU是叔丁氧基，OEG是氨基酸8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，HSA是人血清清蛋白，TNBS是2，4，6-三硝基苯磺酸，HOBT(或HOBt)是1-羟基苯并三唑，HOAt是1-羟基-7-氮杂苯并三唑，NaOH是氢氧化钠，DMF是N，N-二甲基甲酰胺，THF是四氢呋喃，TFA是三氟乙酸，mmol是毫摩尔，Fmoc是芴-9-基甲氧羰基，OEG是8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(8-amino-3，6-dioxaoctanoicacid)(或其残基)，gGlu(此处也叫做γGlu)是γ-谷氨酸，并且在实施例48中，为了简便，下述注释用于指定本发明和现有技术的胰岛素的酰基部分序列：C18是十八烷二酰(octadecanedioyl)，C20是二十烷二酰(eicosanedioyl)，gGlu是γ-谷氨酸，PEG3是3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸，PEG5是3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸和PEG7是3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸(完整结构/序列可以在实施例中找到)。

发明目的

本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代物。

本发明的一个目的是提供具有良好生物利用率的胰岛素衍生物。

本发明的另一个目的是提供作为速效胰岛素有用的胰岛素衍生物。

本发明的另一个目的是提供可以肺施用的胰岛素衍生物。

本发明的另一个目的是提供具有延长的作用概况的胰岛素衍生物。

本发明的另一个目的是提供作为基础胰岛素有用的胰岛素衍生物。

本发明的另一个目的是提供具有高胰岛素受体结合亲和力的胰岛素衍生物。

本发明的另一个方面是改善胰岛素的体内半衰期。

本发明的另一个目的是提供具有比人胰岛素引起低血糖(hypoglycaemic)状况的更低(lover)趋势的胰岛素衍生物。

本发明的另一个方面是发现特别是在贮存2年后具有令人满意的物理稳定性的胰岛素。

本发明的另一个方面是发现特别是在贮存2年后具有令人满意的化学稳定性的胰岛素。

本发明的另一个方面是发现特别是在贮存2年后具有令人满意的蛋白水解稳定性的胰岛素。

本发明的另一个方面是发现具有令人满意的溶解度的胰岛素。

发明概述

简言之，本发明涉及酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括与A21氨基酸残基的C末端连接的氨基酸残基、或与A21氨基酸残基的C末端连接的最高达4个氨基酸残基的肽残基，特征在于包括亚烷基二醇部分的酰基部分与A22位置中的赖氨酸残基附着、或与A21氨基酸残基的C末端附着的肽残基中存在的赖氨酸残基附着。因此，胰岛素类似物包括A22位置中的氨基酸。

已令人惊讶地发现，当在高HSA(人血清清蛋白)浓度例如4.5％HSA的存在下进行的胰岛素受体结合测定中测量时，本发明的胰岛素(包含一个或多个亚烷基二醇部分的酰化胰岛素类似物)具有比不含亚烷基二醇部分的相似酰化胰岛素类似物更高的胰岛素受体结合亲和力。

优选实施方案描述

令人惊讶的是，本发明的酰化胰岛素类似物在高HSA浓度的存在下显示良好生物利用率和高胰岛素受体结合亲和力。

在根据本发明的酰化胰岛素类似物中存在的胰岛素类似物可以在形式上举例说明为具有连接于位置A21中的氨基酸残基C末端的一个氨基酸残基的人胰岛素、或具有连接于位置A21中的氨基酸残基C末端的最高达4个氨基酸残基的肽残基的人胰岛素，和任选地，其中位置A1-A21和B1-B30中的一个或多个氨基酸残基已缺失或由另一个氨基酸残基置换。关于命名，与位置A21中的氨基酸残基连接的氨基酸残基在A22位置中。类似地，与位置A21中的氨基酸残基连接的肽残基中存在的氨基酸残基在位置A22、A23、A24或A25中。

本发明的酰化胰岛素类似物可以在形式上由胰岛素类似物和具有集体公式(I)的含亚烷基二醇的酰基部分构建：Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如本文定义，例如，通过形式上去除来自胰岛素类似物中的氨基的氢原子且使其与式(I)的侧链附着。

在本发明的酰化胰岛素类似物中，式(I)的包含亚烷基二醇的酰基部分与在A21氨基酸残基的C末端侧面或末端上的位置中的赖氨酸残基连接。例如，式(I)的包含亚烷基二醇的酰基部分可以与位置A22中的赖氨酸残基连接。如果式(I)的包含亚烷基二醇的酰基部分与和位置A21中的氨基酸残基连接的肽残基连接，那么式(I)的包含亚烷基二醇的酰基部分与位置A22、A23、A24或A25的任何一个中的赖氨酸残基连接。

如本文提及的，式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-中存在的酰基源于脂肪酸或脂肪二酸。

此处，术语“脂肪酸”包含具有至少2个碳原子且饱和或不饱和的线性或分支、脂族羧酸。脂肪酸的非限制性例子是肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。

此处，术语“脂肪二酸”包含具有至少2个碳原子且饱和或不饱和的线性或分支、脂族二羧酸。脂肪二酸的非限制性例子是琥珀酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。

指定为AA1的中性环状氨基酸残基是包含饱和6-元碳环、任选包含氮杂原子的氨基酸，并且优选地环是环己烷环或哌啶环。优选地，这种中性环状氨基酸的分子量在约100至约200Da的范围中。

指定为AA2的酸性氨基酸残基是包含2个羧酸基团和1个伯或仲氨基、具有最高达约200Da的分子量的氨基酸。

指定为AA3的中性、包含亚烷基二醇的氨基酸残基是在一个末端处包含羧酸官能团和在另一个末端处包含氨基官能团的亚烷基二醇部分，任选寡或聚亚烷基二醇部分。

此处，术语亚烷基二醇包含寡和聚亚烷基二醇部分以及单亚烷基二醇部分。聚亚烷基二醇包括基于聚乙二醇、基于聚丙二醇和基于聚亚丁基二醇的链，即基于重复单位-CH₂CH₂O-、-CH₂CH₂CH₂O-或-CH₂CH₂CH₂CH₂O-的链。亚烷基二醇部分可以是单分散(具有定义明确的长度/分子量)以及多分散(具有定义较不明确的长度/平均分子量)。单亚烷基二醇部分包括在每个末端处包含不同基团的-OCH₂CH₂O-、-OCH₂CH₂CH₂O-或-OCH₂CH₂CH₂CH₂O-。

如本文提及的，AA1、AA2和AA3在具有式(I)(Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-)的酰基部分中出现的次序可以独立地互换。因此，式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-还包含部分如例如式Acy-AA2_m-AA1_n-AA3_p-和式Acy-AA3_p-AA2_m-AA1_n-，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如本文定义。

如本文提及的，部分Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺键(-CONH-其中-CO-源于部分Acy、AA1、AA2和AA3之一，并且-NH-源于部分AA1、AA2和AA3之一)。

本发明优选实施方案

在一个实施方案中，除位置A22中的赖氨酸外，和除连接于A21氨基酸残基C末端的最高达4个氨基酸的任何肽残基外，和除B29R和/或desB30突变外，本发明的亲本胰岛素可以包括一个或多个下述突变。此处，首先给出在A或B链中的位置，并且其后，可能的一个或多个氨基酸残基作为单字母密码给出。在一个实施方案中，存在5个突变，在另一个实施方案中，存在4个突变，在另一个实施方案中，存在3个突变，在另一个实施方案中，存在2个突变，在另一个实施方案中，存在1个突变，并且在另一个实施方案中，除位置A22中的赖氨酸外，和除连接于A21氨基酸残基C末端的最高达4个氨基酸的任何肽残基外，和除B29R和/或desB30突变外，不存在突变。

A4：A或Q。

A5：L。

A8：R、N、Q、E、H、L或W。

A9：R或L。

A14：E或D。

A15：A或T。

A16：M。

A17：D或F。

A18：R、L、I、D或V。

A21：G或A。

B3：A、R、H、I、L、M、F、W、Y、S或T。

B10：D或E。

B25：Y、H或desB25。

B26：Q、E、S或desB26。

B27：H、L、M、W或Y。

B28：D或E。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A4A或A4Q突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A5L突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A8L、A8N、A8Q、A8E、A8H、A8L或A8W突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A8H突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A9R或A9L突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A9L突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A14E或A14D突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A15A或A15T突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A16M突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A17D或A17F突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A18R、A18L、A18I、A18D或A18V突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A18L或A18V突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A18I突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A21G或A21A突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B3A、B3R、B3H、B3I、B3L、B3M、B3F、B3W、B3Y、B3S或B3T突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B10D或B10E突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B25Y、B25H或desB25突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B26Q、B26E、B26S或desB26突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B27H、B27L、B27M、B27W或B27Y突变。在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B27W或B27Y突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括B28D或B28E突变。

在另一个优选实施方案中，本发明的亲本胰岛素包括A21Q、B1Q、desB1、B3Q、B3S、B3T、B13Q或desB27突变。

可以在本发明的酰化胰岛素类似物中存在的亲本胰岛素类似物的非限制性具体例子包括下述的，其中给出与人胰岛素的偏离：

A22K，B29R，desB30
	A14E，A22K，B25H，B29R，desB30
A8H，A22K，B29R，desB30
	A18L，A22K，B29R，desB30
A18I，A22K，B29R，desB30
	A18D，A22K，B29R，desB30
A5L，A22K，B29R，desB30
	A8H，A18L，A22K，B29R，desB30
A8H，A18L，A22K，B10E，B29R，desB30
	A5L，A8H，A17D，A18L，A22K，B10E，B29R，desB30
A8H，A22K，B10E，B29R，desB30
	A5L，A8H，A17D，A22K，B10E，B29R，desB30
A22K，B27Y，B29R，desB30
	A9L，A22K，B29R，desB30
A4A，A22K，B29R，desB30
	A4Q，A22K，B29R，desB30
A16L，A22K，B29R，desB30
	A17F，A22K，B29R，desB30
A17D，A22K，B29R，desB30
	A18V，A22K，B29R，desB30
A22K，B10D，B29R，desB30
	A22K，B10E，B29R，desB30

A22K，B27W，B29R，desB30
	A22K，B27Y，B29R，desB30
A22K，B28E，B29R，desB30
	A22K，B27Y，B28E，B29R，desB30
A8H，A22K，B28E，B29R，desB30
	A22K，desB26，B28E，B29R，desB30
A22K，desB25，B29R，desB30
	A22K，desB26，B29R，desB30
A22K，B28E，B29R，desB30
	A22K，B28D，B29R，desB30
A9L，A22K，B28E，B29R，desB30
	A4A，A22K，B28E，B29R，desB30
A4Q，A22K，B28E，B29R，desB30
	A5L，A22K，B28E，B29R，desB30
A16L，A22K，B28E，B29R，desB30
	A17F，A22K，B28E，B29R，desB30
A17D，A22K，B28E，B29R，desB30
	A18V，A22K，B28E，B29R，desB30
A22K，B10D，B28E，B29R，desB30
	A22K，B10E，B28E，B29R，desB30
A22K，B27W，B28E，B29R，desB30
	A22G，A23K，B29R，desB30
A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
	A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
A21Q，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
	A21G，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
	A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
A21G，A22K，B29R，desB30人胰岛素
	A21G，A22G，A23K，B29R，desB30
A21G，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
	A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
A21Q，A22K，B29R，desB30
	A21Q，A22G，A23K，B29R，desB30
A21Q，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
	A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
A14E，A21Q，A22K，B25H，B29R，desB30

A14E，A21G，A22K，B25H，B29R，desB30
	A14E，A21Q，A22G，A23K，B25H，B29R，desB30
A14E，A21G，A22G，A23K，B25H，B29R，desB30
	A14E，A21Q，A22G，A23G，A24K，B25H，B29R，desB30
A14E，A21G，A22G，A23G，A24K，B25H，B29R，desB30
	A14E，A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B25H，B29R，desB30
A14E，A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B25H，B29R，desB30
	A22K，B3Q，B29R，desB30
A22K，B3S，B29R，desB30
	A22K，B3T，B29R，desB30
A22K，B1Q，B29R，desB30
	A18Q，A22K，B29R，desB30
A22K，desB1，B3Q，B29R，desB30
	A22K，B28D，B29R，desB30
A22K，desB27，B28E，B29R，desB30
	A22K，B28R，desB29，desB30
A22K，B3Q，B28E，B29R，desB30
	A22K，B13Q，B29R，desB30
A22K，desB1，B29R，desB30
	A21Q，A22G，A23K，B29R，desB30
A21Q，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
	A21Q，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
A21A，A22K，B29R，desB30
	A21A，A22G，A23K，B29R，desB30
A21G，A22G，A23K，B29R，desB30
	A21A，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
A21G，A22G，A23G，A24K，B29R，desB30
	A21G，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
A21A，A22G，A23G，A24G，A25K，B29R，desB30
	A21Q，A22K，B3Q，B29R，desB30
A21A，A22K，B3Q，B29R，desB30
	A21G，A22K，B3Q，B29R，desB30

可以存在于本发明的酰化胰岛素类似物中的式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的酰基部分的非限制性具体例子如下：

在一个实施方案中，指定为AA3的部分选自从其中氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除的下述化合物：

式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的酰基部分的上述非限制性具体例子中的任何一种都可以与胰岛素类似物的上述非限制性具体例子的任何一种中存在的赖氨酸残基的ε氨基附着，从而给出本发明的酰化胰岛素类似物的进一步具体例子。

亲本胰岛素可以以本身已知的方式进行制备。例如，它们可以通过如例如EP1,246,845中公开的众所周知技术，在合适的宿主细胞中表达编码所讨论的单链胰岛素的DNA序列进行生产。胰岛素在转化的宿主细胞中作为前体分子表达，所述前体分子通过酶促和化学体外过程转化成所需胰岛素分子，如例如EP163,529和EP214,826中公开的。前体分子可以与N末端延伸一起表达，所述N末端延伸随后如例如EP1246,845中公开的切割。在本发明中合适类型的N末端延伸的例子例如公开于美国专利号5,395,922和EP专利号765,395中。更具体而言，可以参考WO2006/082205，从第37页第31行到第39页第29行。

通过在胰岛素类似物中的赖氨酸残基中引入式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的所需基团，亲本胰岛素类似物可以转化成本发明的酰化胰岛素类似物。式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的所需基团可以通过任何方便的方法引入，并且许多方法公开于关于此种反应的现有技术中。更多细节由下述例子可见。

本发明的酰化胰岛素类似物可以以基本上不含锌的化合物的形式或以锌络合物的形式提供。当提供本发明的酰化胰岛素类似物的锌络合物时，2个Zn²⁺离子、3个Zn²⁺离子或4个Zn²⁺离子可以与每个胰岛素六聚物结合。这个酰化胰岛素类似物的锌络合物溶液将包含此种种类的混合物。

在进一步方面，本发明涉及药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的酰化胰岛素类似物连同药学上可接受的载体，所述药物组合物可以用于治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态。本发明的酰化胰岛素类似物可以用于制造药物组合物，用于在治疗1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态中使用。此种组合物以本身已知的方式进行制备。

在本发明的进一步方面，提供了用于治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的药物组合物，其包括与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的治疗有效量的本发明的酰化胰岛素类似物，连同药学上可接受的载体和添加剂。

在进一步方面，本发明涉及用于治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的肺应用，其包括任选与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的、治疗有效量的本发明的酰化胰岛素类似物，连同药学上可接受的载体和添加剂。

在一个方面，本发明提供了药物组合物，其为本发明的酰化胰岛素类似物以及选自AspB28人胰岛素；LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素的速效胰岛素类似物的混合物。

本发明的酰化胰岛素类似物和速效胰岛素类似物可以以约90/10％；约70/30％或约50/50％的比混合。

在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的方法，其包括给患者施用治疗有效量的本发明的酰化胰岛素类似物，连同药学上可接受的载体和药学上可接受的添加剂。

在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的方法，其包括给患者施用与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的治疗有效量的本发明酰化胰岛素类似物，连同药学上可接受的载体和药学上可接受的添加剂。

在本发明的进一步方面，提供了用于治疗在需要此种治疗的患者中的糖尿病的药物组合物，其包括与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的治疗有效量的本发明酰化胰岛素类似物，连同药学上可接受的载体。

在本发明的进一步方面，提供了预期用于肺施用的根据本发明的药物组合物。

在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的糖尿病的方法，其包括给患者施用治疗有效量的根据权利要求1的酰化胰岛素类似物，连同药学上可接受的载体。

在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的糖尿病的方法，其包括给患者施用与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的、治疗有效量的根据权利要求1的酰化胰岛素类似物，连同药学上可接受的载体。

在进一步方面，本发明涉及本发明的酰化胰岛素，其具有如本文描述的胰岛素受体结合亲和力，在HSA的存在下(例如在0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％HSA的存在下)测量的，相对于人胰岛素，所述结合亲和力测量为＞3％、更优选＞5％、更优选＞10％、更优选＞15％、更优选＞20％、更优选＞30％、更优选＞40％、更优选＞50％、更优选＞60％。

在进一步方面，本发明涉及本发明的酰化胰岛素类似物，其具有与人胰岛素的那种基本上相似的总体疏水性。

在进一步方面，本发明的酰化胰岛素类似物具有疏水指数k′_rel，其为约0.02-约10，约0.1-约5；约0.5-约5；约0.2-约2；约0.2-约1；约0.1-约2；或约0.5-约2。相对于人胰岛素，本发明的酰化胰岛素类似物的疏水性(疏水指数)k′_rel，通过在40℃下的等度洗脱在LiChrosorbRP18(5μm，250x4mm)HPLC柱上进行测量，其中使用A)包含10％乙腈的0.1M磷酸钠缓冲液，pH7.3，和B)溶于水的50％乙腈的混合物作为洗脱剂。通过跟踪洗脱物在214nm处的UV吸收监控洗脱。通过注射0.1mM硝酸钠发现空隙时间(voidtime)t₀。通过改变A和B溶液之间的比，使关于人胰岛素的保留时间t人调整为至少2t₀。k′_rel＝(t_衍生物-t₀)/(t_人-t₀)。

在另一个方面，本发明涉及包括本发明的酰化胰岛素类似物的药物组合物，其在生理pH值下是可溶的。

在另一个方面，本发明涉及包括本发明的酰化胰岛素类似物的药物组合物，其在约6.5至约8.5的间隔中的pH值下是可溶的。

在另一个方面，本发明涉及具有延长的作用概况的药物组合物，其包括本发明的酰化胰岛素类似物。

在另一个方面，本发明涉及具有肝选择性或肝优先性作用的胰岛素。

在另一个方面，本发明涉及这样的药物组合物，其为包含约120nmol/ml-约2400nmol/ml、约400nmol/ml-约2400nmol/ml、约400nmol/ml-约1200nmol/ml、约600nmol/ml-约2400nmol/ml、或约600nmol/ml-约1200nmol/ml本发明的酰化胰岛素类似物或本发明的酰化胰岛素类似物连同速效胰岛素类似物的混合物的溶液。

本发明化合物的用途

施用途径可以是使本发明的化合物有效转运到身体中的所需或合适位置的任何途径，例如肠胃外，例如，皮下、肌内或静脉内。可替代地，本发明的化合物可以经口、肺或鼻施用。

对于肠胃外施用，本发明的化合物与已知胰岛素的制剂类似地配制。此外，对于肠胃外施用，本发明的化合物与已知胰岛素的施用类似地施用，并且医生熟悉这种程序。

肠胃外施用可以借助于注射器，任选笔样注射器来执行。可替代地，肠胃外施用可以借助于输注泵来执行。

本发明的化合物的可注射组合物可以使用制药工业的常规技术进行制备，所述常规技术涉及适当时使成分溶解且混合，以给出所需最终产物。因此，根据一个程序，本发明的化合物溶解于略微少于待制备的组合物的最终体积的水量中。根据需要添加等渗剂、防腐剂和缓冲剂，并且根据需要，若需要则使用酸例如盐酸或碱例如含水氢氧化钠调整溶液的pH值。最后，用水调整溶液的体积，以给出成分的所需浓度。

更精确地，本发明的胰岛素制剂，例如溶液或悬浮液，可以通过在微酸性条件下以例如约240至约1200nmole/ml的浓度，使本发明的化合物溶解于含水介质中进行制备。含水介质例如用氯化钠或甘油制成等渗的。此外，含水介质可以包含浓度最高达约20μgZn⁺⁺/单位胰岛素活性的锌离子、缓冲液例如乙酸盐和柠檬酸盐以及防腐剂例如间甲酚或苯酚。溶液的pH值朝向中性进行调整，无需太接近本发明的化合物的等电点，以避免沉淀。最终胰岛素制剂的pH值依赖于任选地在本发明的化合物中已改变的电荷数目、锌离子浓度、本发明的化合物的浓度和选择的本发明的化合物。胰岛素制剂例如通过过滤除菌制成无菌的。

本发明的胰岛素制剂与已知胰岛素制剂的用途类似地使用。

待施用的本发明化合物的量、如何频繁施用本发明化合物的确定、和任选连同另一种抗糖尿病化合物施用的本发明一种或多种化合物的选择，在与熟悉糖尿病治疗的从业者的咨询中决定。

因此，本发明还涉及治疗糖尿病的方法，其包括给需要此种治疗的患者施用有效量的本发明的化合物。

药物组合物

本发明的酰化胰岛素类似物可以皮下、经口或肺施用。

对于皮下施用，本发明的酰化胰岛素类似物与已知胰岛素制剂类似地配制。此外，对于皮下施用，本发明的酰化胰岛素类似物与已知胰岛素的施用类似地施用，并且一般地，医生熟悉这种程序。

本发明的酰化胰岛素类似物可以通过吸入以有效增加循环胰岛素水平和/或降低循环葡萄糖水平的剂量进行施用。此种施用可以有效用于治疗病症例如糖尿病或高血糖症。达到胰岛素的有效剂量需要施用在约0.5μg/kg至约50μg/kg范围中的本发明酰化胰岛素类似物的吸入剂量。治疗有效量可以通过博知的从业者进行确定，所述从业者将考虑包括胰岛素水平、血糖水平、患者的身体健康状况、患者的肺状态等的因素。

本发明的酰化胰岛素类似物可以通过吸入进行递送，以达到其缓慢吸收和/或减少的全身清除。当比较相似颗粒大小和相似水平的肺沉积时，不同吸入设备一般提供类似药物代谢动力学。

本发明的酰化胰岛素类似物可以通过本领域已知用于通过吸入施用治疗剂的多种吸入设备中的任何一种进行递送。这些设备包括计量剂量吸入器、喷洒器、干粉发生器、喷雾器等。优选地，本发明的酰化胰岛素类似物通过干粉吸入器或喷雾器进行递送。存在用于施用本发明的酰化胰岛素类似物的吸入设备的几种所需特征。例如，通过吸入设备的递送有利地是可靠、可重复且精确的。对于良好适合呼吸性，吸入设备应递送小颗粒或气溶胶，例如小于约10μm，例如约1-5μm。适合于实践本发明的商购可得吸入设备的一些具体例子是Cyclohaler、Turbohaler^TM(Astra)、(Glaxo)、(Glaxo)、Spiros^TM吸入器(Dura)、由InhaleTherapeutics销售的设备、AERx^TM(Aradigm)、喷洒器(Mallinckrodt)、Acorn喷洒器(MarquestMedicalProducts)、计量剂量吸入器(Glaxo)、粉末吸入器(Fisons)等。

如本领域技术人员将认识到的，本发明的酰化胰岛素类似物制剂、递送的制剂量和单剂的施用持续时间依赖于采用的吸入设备类型。对于一些气溶胶递送系统，例如喷洒器，施用频率和系统激活的时间长度将主要依赖于气溶胶中的酰化胰岛素类似物浓度。例如，较短的施用时间段可以在喷洒器溶液中更高浓度的酰化胰岛素类似物下使用。设备例如计量剂量吸入器可以产生更高的气溶胶浓度，并且可以操作更短时间段，以递送所需量的本发明的酰化胰岛素类似物。设备例如粉末吸入器递送活性剂直至给定装填量的试剂从设备中排出。在这种类型的吸入器中，在给定量粉末中的本发明的胰岛素酰化胰岛素类似物量决定在单次施用中递送的剂量。

就胰岛素使其进入肺内并且优选进入下气道或肺泡内的能力而言，在通过吸入设备递送的制剂中本发明的酰化胰岛素类似物的颗粒大小是关键的。优选地，本发明的酰化胰岛素类似物如此配制，从而使得递送的至少约10％酰化胰岛素类似物沉积在肺中，优选约10至约20％或更多。通过吸入递送的酰化胰岛素类似物的颗粒具有优选小于约10μm、更优选约1μm至约5μm的颗粒大小。选择酰化胰岛素类似物的制剂，以在选择的吸入设备中产生所需颗粒大小。

对于作为干粉施用有利地，本发明的酰化胰岛素类似物以具有小于约10μm、优选约1μm至约5μm的颗粒大小的微粒形式进行制备。优选颗粒大小对于递送至患者肺的肺泡有效。优选地，干粉在很大程度上由产生的颗粒组成，从而使得大多数颗粒具有所需范围中的大小。有利地，至少约50％的干粉由具有小于约10μm直径的颗粒制成。此种制剂可以通过溶液的喷雾干燥、研磨、微粉化或临界点冷凝来达到，所述溶液包含本发明的酰化胰岛素类似物和其他所需成分。也适合于产生在本发明中有用的颗粒的其他方法是本领域已知的。

颗粒通常在容器中与干粉制剂分开，并且随后经由载体气流转运到患者的肺内。一般地，在目前的干粉吸入器中，用于破碎固体的力量通过患者的吸入单独提供。在另一种类型的吸入器中，由患者的吸入产生的气流激活使颗粒解凝集的叶轮发动机。

用于从干粉吸入器施用的本发明的酰化胰岛素类似物制剂一般包括包含衍生物的精细分开的干粉，但粉末还可以包括填充剂、载体、赋形剂、另一种添加剂等。添加剂可以包括在酰化胰岛素类似物的干粉制剂中，例如以根据需要稀释粉末用于从特定粉末吸入器递送，以促进制剂的处理，以给制剂提供有利的粉末性质，以促进粉末从吸入设备分散，以稳定制剂(例如，抗氧化剂或缓冲剂)，以给制剂提供味道等。有利地，添加剂不会不利地影响患者的气道。酰化胰岛素类似物可以与添加剂在分子水平下混合，或固体制剂可以包括与添加剂颗粒混合或在添加剂颗粒上包被的酰化胰岛素类似物颗粒。一般的添加剂包括单糖、二糖和多糖；糖醇和其他多元醇，例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、拉克替醇(lactitol)、麦芽糖醇(maltitol)、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉或其组合；表面活性剂，例如山梨糖醇、二磷脂酰胆碱或卵磷脂；等。一般地，添加剂例如填充剂以对于上述目的有效的量存在，通常为制剂的约50重量％至约90重量％。本领域已知用于配制蛋白质例如胰岛素类似物蛋白质的另外试剂也可以包括制剂中。

包括本发明的酰化胰岛素类似物的喷雾可以通过在压力下迫使酰化胰岛素类似物的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生。可以选择喷嘴大小和结构、应用的压力和液体进料速度，以达到所需输出和颗粒大小。电喷雾可以例如通过与毛细管或喷嘴进料结合的电场来产生。有利地，通过喷雾器递送的胰岛素缀合物的颗粒具有小于约10μm、优选在约1μm至约5μm范围中的颗粒大小。

适合于与喷雾器一起使用的本发明的酰化胰岛素类似物制剂一般将包括在约1mg至约500mg酰化胰岛素类似物/ml溶液的浓度下在水溶液中的酰化胰岛素类似物。依赖于选择的酰化胰岛素类似物和医学顾问已知的其他因素，上限可以更低，例如450、400、350、300、250、200、150、120、100或50mg酰化胰岛素类似物/ml溶液。制剂可以包括试剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂和优选地锌。制剂还可以包括赋形剂或用于稳定酰化胰岛素类似物的试剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质或碳水化合物。在配制胰岛素缀合物中有用的填充蛋白质包括清蛋白、鱼精蛋白等。在配制酰化胰岛素类似物中有用的一般碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。酰化胰岛素类似物制剂还可以包括表面活性剂，其可以减少或阻止通过溶液在形成气溶胶中的喷雾引起的表面诱导的胰岛素缀合物聚集。可以采用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇类、和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。量一般将为制剂的约0.001至约4重量％范围。

包含本发明的酰化胰岛素类似物的药物组合物还可以肠胃外施用于需要此种治疗的患者。肠胃外施用可以通过皮下、肌内或静脉内注射，借助于注射器任选地笔样注射器来执行。可替代地，肠胃外施用可以借助于输注泵来执行。

本发明的酰化胰岛素类似物的可注射组合物可以使用制药工业的常规技术进行制备，所述常规技术涉及适当时使成分溶解且混合，以给出所需最终产物。因此，根据一个程序，酰化胰岛素类似物溶解于略微少于待制备的组合物的最终体积的水量中。根据需要添加锌(Zink)、等渗剂、防腐剂和/或缓冲剂，并且根据需要，若需要则使用酸例如盐酸或碱例如含水氢氧化钠调整溶液的pH值。最后，用水调整溶液的体积，以给出成分的所需浓度。

在本发明的进一步实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二[羟乙基]甘氨酸(bicine)、N-[2-羟-1，1-二羟甲基乙基]甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、延胡索酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂中的每一种构成本发明的可替代实施方案。

在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包括药学上可接受的防腐剂，其可以选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷基脲、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、氯化苄乙铵、氯苯甘油醚(3-(4-氯苯氧基)-1，2-丙二醇)或其混合物。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体防腐剂中的每一种构成本发明的可替代实施方案。防腐剂在药物组合物中的使用对于本领域技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，第19版，1995。

在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包括等渗剂，其可以选自盐(例如，氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸或苏氨酸)、糖醇(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇或1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物。可以使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上文提及的糖或糖醇可以个别或组合使用。关于使用的量无固定限制，只要糖或糖醇在液体制剂中是可溶的，并且不会不利地影响使用本发明的方法达到的稳定作用。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度是约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约1mg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约1mg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约8mg/ml至24mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些具体等渗剂中的每一种构成本发明的可替代实施方案。等渗剂在药物组合物中的使用对于本领域技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy，第19版，1995。

一般的等渗剂是氯化钠、甘露糖醇、二甲砜和甘油，并且一般的防腐剂是苯酚、间甲酚、对羟基苯甲基甲酯和苯甲醇。

合适缓冲剂的例子是乙酸钠、甘氨酰甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和磷酸钠。

用于本发明的酰化胰岛素类似物的鼻施用的组合物可以例如如欧洲专利号272097中所述制备。

包含本发明的酰化胰岛素类似物的组合物可以在治疗对胰岛素敏感的状态中使用。因此，它们可以用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如，如有时在严重损伤的人和已经历大外科手术的人中可见。用于任何患者的最佳剂量水平将依赖于多种因素，包括采用的具体胰岛素衍生物的功效，患者的年龄、体重、身体活动性和饮食，与其他药物的可能组合，和待治疗状态的严重程度。推荐本发明的酰化胰岛素类似物的日剂量通过本领域技术人员以与关于已知胰岛素组合物相似的方式对于每个个别患者进行确定。

本发明的重要特征

总之，本发明的一些特征如下：

1.酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括连接于A21氨基酸残基C末端的赖氨酸残基、或包括赖氨酸残基的最高达4个氨基酸残基的肽残基，所述肽残基连接于A21氨基酸残基C末端，特征在于包括亚烷基二醇部分的酰基部分与A22位置中的赖氨酸残基附着、或与A21氨基酸残基的C末端附着的肽残基中存在的赖氨酸残基附着，并且其中在胰岛素类似物中仅存在一个赖氨酸(K，Lys)。

2.根据条款1的酰化胰岛素类似物，其中酰基部分具有通式I：

Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-(I)，

其中

n是0或1-3的整数，

m是0或1-6的整数，

p是1、2或3，

Acy是包括约8-24个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸，从其中在形式上羟基已从脂肪酸的羧基中或从脂肪二酸的羧基之一中去除，

AA1是中性环状氨基酸，从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除，

AA2是酸性氨基酸，从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除，

AA3是中性、包含亚烷基二醇的氨基酸，从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除，

AA1、AA2和AA3在式中出现的次序可以独立地互换，

Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键，和

与亲本胰岛素的附着可以来自式(I)的酰基部分中的AA1、AA2或AA3残基的C末端或来自式(I)的部分中存在的AA2残基的一条或多条侧链之一。

3.酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括连接于A21氨基酸残基C末端的赖氨酸残基、或包括赖氨酸残基的最高达4个氨基酸残基的肽残基，所述肽残基连接于A21氨基酸残基C末端，特征在于包括亚烷基二醇部分的酰基部分与A22位置中的赖氨酸残基附着、或与A21氨基酸残基的C末端附着的肽残基中存在的赖氨酸残基附着，并且其中在胰岛素类似物中仅存在一个赖氨酸(K，Lys)，并且其中包括亚烷基二醇部分的酰基部分具有通式I：Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-(I)，其中n是0或1-3的整数，m是0或1-6的整数，p是1、2或3，Acy是包括约8-24个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸，从其中在形式上羟基已从羧基中或从羧基之一中去除，AA1是中性环状氨基酸，从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除，AA2是酸性氨基酸，从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除，AA3是中性、包含亚烷基二醇的氨基酸，从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除，AA1、AA2和AA3在式中出现的次序可以独立地互换，Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键，和与亲本胰岛素的附着可以来自式(I)的酰基部分中的AA1、AA2或AA3残基的C末端或来自式(I)的部分中存在的AA2残基的一条或多条侧链之一。

4.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中Acy源于具有14-20个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸，优选16-20个碳原子、更优选16一18个碳原子、可替代地18-20个碳原子，并且具体是8、10、12、14、16、17、18、20、22或24个碳原子。

5.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中Acy源于二羧酸。

6.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中Acy是从其中羟基已去除的十四烷二酸、十五烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸。

7.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中Acy是从其中羟基已去除的十六烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸。

8.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中AA1选自

其中q是0、1、2、3或4，并且从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除。

9.根据前述条款的酰化胰岛素类似物，其中AA1是

从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除。

10.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中AA2选自Glu、Asp、D-Glu、D-Asp、γGlu、γAsp、γ-D-Glu、γ-D-Asp或下述化合物中的任何一种：

其中箭标指示与AA1、AA2或AA3的氨基的附着点，并且从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除。

11.根据前述条款的酰化胰岛素类似物，其中AA2是γGlu。

12.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中AA3选自下述化合物中的任何一种：

r是1-100的整数，优选1-10，

s是1-30的整数，优选1-10，

t是1-150的整数，优选20-70，

并且从其中在形式上氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除。

13.根据前述条款的酰化胰岛素类似物，其中r是1、2、3、4、5、7、11、23或27。

14.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中s是1、2、3、4、10、20或30。

15.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中整数t如此选择，从而使得其中整数t出现的上式的平均分子量是2000Da、3400Da或5000Da。

16.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的酰基部分与位置A22中的赖氨酸残基连接，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如上文定义。

17.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的酰基部分与位置A23中的赖氨酸残基连接，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如上文定义。

18.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的酰基部分与位置A24中的赖氨酸残基连接，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如上文定义。

19.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的酰基部分与位置A25中的赖氨酸残基连接，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如上文定义。

20.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括52个氨基酸残基。

21.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括51个氨基酸残基。

22.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括53个氨基酸残基。

23.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括54个氨基酸残基。

24.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括50个氨基酸残基。

25.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物包括49个氨基酸残基。

26.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物的位置A1-A21和B1-B30中的仅1个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的那些氨基酸残基。

27.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物的位置A1-A21和B1-B30中的仅2个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的那些氨基酸残基。

28.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物的位置A1-A21和B1-B30中的仅3个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的那些氨基酸残基。

29.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中胰岛素类似物的位置A1-A21和B1-B30中的仅4个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的那些氨基酸残基。

30.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中不存在与位置A1或B1中存在的氨基酸残基的N末端连接的氨基酸残基，并且不存在与位置B30中存在的氨基酸残基的C末端连接的氨基酸残基。

31.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A14位置中的氨基酸残基是E。

32.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A18位置中的氨基酸残基是Q。

33.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A21位置中的氨基酸残基是A、G或Q。

34.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A22位置中的氨基酸残基是K或G。

35.根据前述条款的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A22位置中的氨基酸残基是K。

36.根据前述条款的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A22位置中的氨基酸残基是K，并且不存在与所述A22K氨基酸残基的C末端连接的氨基酸残基。

37.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A23位置中的氨基酸残基是K或G。

38.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A24位置中的氨基酸残基是K或G。

39.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A25位置中的氨基酸残基是K。

40.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B1位置中的氨基酸残基是Q或不存在。

41.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B3位置中的氨基酸残基是Q或T。

42.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B13位置中的氨基酸残基是Q。

43.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B25位置中的氨基酸残基是H。

44.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B27位置中的氨基酸残基不存在。

45.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B28位置中的氨基酸残基是D、E或R。

46.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在B28位置中的氨基酸残基是R，并且在B29位置中的氨基酸残基是P。

47.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B29位置中的氨基酸残基是R。

48.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的B30位置中的氨基酸残基不存在。

49.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物的A14位置中的氨基酸残基是Y或E，在胰岛素类似物的A18位置中的氨基酸残基是N或Q，在胰岛素类似物的A21位置中的氨基酸残基是N、A、G或Q，在胰岛素类似物的A22位置中的氨基酸残基是K或G，在胰岛素类似物的A23位置中的氨基酸残基是不存在、K或G，在胰岛素类似物的A24位置中的氨基酸残基是不存在、K或G，在胰岛素类似物的A25位置中的氨基酸残基是不存在或K，在胰岛素类似物的B1位置中的氨基酸残基是F、Q或不存在，在胰岛素类似物的B3位置中的氨基酸残基是N、Q或T，在胰岛素类似物的B13位置中的氨基酸残基是E或Q，在胰岛素类似物的B25位置中的氨基酸残基是F或H，在胰岛素类似物的B27位置中的氨基酸残基是T或不存在，在胰岛素类似物的B28位置中的氨基酸残基是P、D、E或R，在胰岛素类似物的B29位置中的氨基酸残基是K或R，并且在胰岛素类似物的B30位置中的氨基酸残基是T或不存在。

50.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中在胰岛素类似物中的所有氨基酸残基都是可编码氨基酸的残基。

51.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中AA2是gGlu。

52.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其中通式Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-的酰基部分具有通式Acy-AA3-、Acy-AA2-AA3-、Acy-AA2-AA3-AA2-、Acy-AA2-(AA3)₂-、Acy-AA2-(AA3)₂-AA2或Acy-AA3-AA2-之一，其中Acy、AA2和AA3各自如本文定义。

53.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素类似物，其是本文具体提及的化合物中的任何一种，例如在本文具体实施例中描述的化合物。

54.根据前述可能产品条款中任一项的化合物，其用于作为药物使用或用于在药物中使用。

55.根据前述可能产品条款中任一项的化合物，其用于治疗糖尿病，或根据前述可能产品条款中任一项的化合物用于制备用于治疗糖尿病的药物的用途。

56.用于治疗糖尿病的方法，所述方法包括给有此需要的受试者施用治疗有效量的根据前述可能产品条款中任一项的化合物。

57.本文描述的任何新特征或特征组合。

使本文描述的一个或多个实施方案、任选地以及下文权利要求中的一项或多项和本文提及的一个或多个条款组合，导致进一步的实施方案，并且本发明涉及所述实施方案、条款和权利要求的所有可能组合。

本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均在此整体引入作为参考，并且其程度与每个参考文献个别且特别指出引入作为参考并且在本文中整体阐述一样(至法律允许的最大程度)。

所有标题和子标题在本文中都仅为了方便而使用，并且不应解释为以任何方式限制本发明。

本文提供的任何和所有例子或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意欲更好地举例说明本发明，并且除非另有说明，否则不对本发明的范围造成限制。说明书中的语言不应解释为将任何非请求保护的要素表示为本发明实践所必需的。

本文专利文件的引用和引入仅为了方便而完成，并且不反映此种专利文件的任何有效性、专利性和/或可实施性观点。参考文献在本文中的提及并非承认它们构成现有技术。

此处，单词“包含”应广泛地解释为意指“包括”、“含有”或“包含”(EPO指南C4.13)。

本发明包括如由可应用法律允许的与之附着的权利要求中叙述的主题的所有修饰和等同方案。

下述实施例为了举例说明提供，而不是为了限制。

实施例

一般程序：

本发明的表达载体构建、酵母细胞转化和胰岛素前体表达

所有表达质粒都是C-POT类型的，类似于EP171142中描述的那些，其特征在于包含粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomycespombe)丙糖磷酸异构酶基因(POT)用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中的质粒选择和稳定目的。质粒还包含啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子。这些序列类似于质粒pKFN1003(WO90/10075中描述)中的相应序列，因为是除编码前导区和胰岛素产物的融合蛋白的EcoRI-XbaI片段的序列外的所有序列。为了表达不同的融合蛋白，pKFN1003的EcoRI-XbaI片段通过编码目的前导区-胰岛素融合物的EcoRI-XbaI片段简单地替换。此种EcoRI-XbaI片段可以根据标准技术使用合成寡核苷酸和PCR来合成。

酵母转化体通过转化宿主菌株啤酒糖酵母菌株MT663(MATa/MATapep4-3/pep4-3HIS4/his4tpi::LEU2/tpi::LEU2Cir⁺)进行制备。酵母菌株MT663与提交WO92/11378结合保藏于DeutscheSammlungvonMikroorganismenundZellkulturen，并且给予保藏号DSM6278。

MT663在YPGaL(1％细菌用酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％半乳糖、1％乳酸盐)上生长至在600nm下0.6的O.D.。通过离心收获100ml培养物，用10ml水洗涤，再次离心且重悬浮于10ml溶液中，所述溶液包含1.2M山梨糖醇、25mMNa₂EDTApH＝8.0和6.7mg/ml二硫苏糖醇。使悬浮液在30℃下温育15分钟，离心并且使细胞重悬浮于10ml溶液中，所述溶液包含1.2M山梨糖醇、10mMNa₂EDTA、0.1M柠檬酸钠，pH05.8和2mg234。使悬浮液在30℃下温育30分钟，通过离心收集细胞，在10ml1.2M山梨糖醇和10mlCAS(1.2M山梨糖醇、10mMCaCl₂、10mMTrisHCl(pH＝7.5)中洗涤，并且重悬浮于2mlCAS中。为了转化，使1mlCAS悬浮的细胞与约0.1mg质粒DNA混合，并且在室温下静置15分钟。加入1ml(20％聚乙二醇4000、10mMCaCl₂、10mMTrisHCl，pH＝7.5)，并且使混合物在室温下静置另外30分钟。使混合物离心，并且使沉淀重悬浮于0.1mlSOS(1.2M山梨糖醇、33％v/vYPD、6.7mMCaCl₂)中，并且在30℃下温育2小时。随后使悬浮液离心，并且使沉淀重悬浮于0.5ml1.2M山梨糖醇中。随后，在52℃下加入6ml顶层琼脂(Sherman等人(1982)MethodsinYeastGenetics，ColdSpringHarborLaboratory)的SC培养基，其包含1.2M山梨糖醇加上2.5％琼脂)，并且将悬浮液倾注到包含相同琼脂固化的、含山梨糖醇的培养基的板之上。用表达质粒转化的啤酒糖酵母菌株MT663在YPD中在30℃下生长72小时。

本发明的酰化胰岛素类似物的产生、纯化和表征

下述实施例涉及说明书和实施例中鉴定的中间化合物和最终产物。本发明的酰化胰岛素类似物的制备使用下述实施例详细描述，但所描述的化学反应和纯化方案就其制备本发明的胰岛素衍生物的一般适用性而言公开。偶然地，反应可能不如所述的应用于本发明的公开范围内包括中的每种化合物。出现这种情况的化合物将通过本领域技术人员容易地识别。在这些情况下，反应可以通过本领域技术人员已知的常规修改成功地执行，即，通过干扰基团的合适保护，通过改变成其他常规试剂，或通过反应条件的常规修改。可替代地，本文公开或在其他方面常规的其他反应将可应用于制备本发明的相应化合物。在所有制备方法中，所有原材料都是已知的或可以使用本身已知的方法容易地由已知原材料制备。所有温度都以摄氏度阐述，并且除非另有说明，当提及得率时，所有份和百分比都按重量计，并且当提及溶剂和洗脱剂时，所有份都按体积计。

本发明的酰化胰岛素类似物可以通过采用一般在本领域内的一种或多种下述程序进行纯化。若需要，那么这些程序可以就梯度、pH、盐、浓度、流动、柱等进行修饰。依赖于因素例如杂质概况、所讨论的胰岛素溶解度等等，这些修改可以通过本领域技术人员容易地识别且进行。

关于通式(II)的酰化试剂的固相合成的一般程序：

(II)：Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-Act，

其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如上文定义，并且Act是活性酯的离去基团，例如N-羟基琥珀酰亚胺(OSu)、或1-羟基苯并三唑，酯和其中在酰基部分内的羧酸保护为叔丁酯。

根据本发明的通式(II)的化合物可以在固体支持物上合成，其中使用固相肽合成领域中的技术人员众所周知的程序。这个程序包括使Fmoc保护的氨基酸与聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂附着。附着可以例如使用游离N-保护的氨基酸在叔胺的存在下来完成，所述叔胺如三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(参见下文参考文献)。这个氨基酸的C末端(其与树脂附着)在与本发明的亲本胰岛素偶联的合成序列的末端处。在Fmoc氨基酸与树脂附着后，使用例如仲胺如哌啶或二乙胺使Fmoc基团脱保护，随后为另一个(或相同)Fmoc保护的氨基酸的偶联和脱保护。合成序列通过使单叔丁基保护的脂肪(α，ω)二酸偶联而终止，所述单叔丁基保护的脂肪(α，ω)二酸如十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸单叔丁酯。化合物从树脂中的切割使用稀酸来完成，所述稀酸如0.5-5％TFA/DCM(溶于二氯甲烷的三氟乙酸)、乙酸(例如溶于DCM的10％、或HOAc/三氟乙醇/DCM1∶1∶8)、或溶于DCM的六氟异丙醇(参见例如“OrganicSynthesisonSolidPhase”，F.Z.Wiley-VCH，2000.ISBN3-527-29950-5，“Peptides：ChemistryandBiology”，N.Sewald&H.-D.Jakubke，Wiley-VCH，2002，ISBN3-527-30405-3或“TheCombinatorialCheemistryCatalog”1999，NovabiochemAG，以及其中引用的参考文献)。这确保化合物中作为羧酸保护基团存在的叔丁酯未脱保护。最后，活化C末端羧基(从树脂中释放)，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺酯(OSu)，并且直接或在纯化后在与本发明的亲本胰岛素的附着中用作偶联剂。这个程序在实施例4中举例说明。

可替代地，上文通式(II)的酰化试剂可以通过如下所述的溶液相合成进行制备。

单叔丁基保护的脂肪二酸，例如十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸单叔丁酯，如下所述活化为例如OSu-酯或活化为本领域技术人员已知的任何其他活化酯，例如HOBt-或HOAt-酯。在合适溶剂例如THF、DMF、NMP(或溶剂混合物)中在合适碱例如DIPEA或三乙胺的存在下，使这种活性酯与氨基酸AA1、单叔丁基保护的AA2或AA3之一偶联。中间体例如通过提取程序或通过层析程序进行分离。再次如上所述对所得到的中间体实施活化(如上所述)，并且与氨基酸AA1、单叔丁基保护的AA2或AA3之一偶联。重复这个程序直至获得所需保护的中间体Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-OH。这依次活化以提供通式(II)Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-Act的酰化试剂。这个程序在实施例9中举例说明。

用于制备本发明的酰化胰岛素类似物的一般程序(A)

一般程序(A)在下文概述并且在第一个实施例中举例说明：

实施例1，一般程序(A)：

A22K(N^ε-十六烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰基-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素

这种胰岛素与WO2006/082205，实施例3中描述的胰岛素类似地制备，其中使用A22K，B29RdesB30人胰岛素代替desB30人胰岛素。

LC-MS(电喷雾)；m/z：1627(M+4)⁺/4；1302(M+5)⁺/5.

实施例2，一般程序(A)：

A22K(N^ε-十六烷二酰-(2-氨乙基-PEG2000-基乙酰基))，B29RdesB30人胰岛素

步骤1：

使十六烷二酸叔丁酯2，5-二氧吡咯烷-1-基酯(218mg，0.497mmol)溶解于DCM(10mL)中，加入丙胺-PEG-羧酸MW2000(来自NOF公司的PA-20HC，1000mg，约0.497mmol)，并且使混合物在氮下搅拌过夜。将反应混合物转移至硅胶柱，并且用DCM伴随乙醇梯度(0-10％)进行洗脱，以获得叔丁基十六烷二酰丙胺-PEG-羧酸(MW2000)中间体。

步骤2：A22K(N^ε-十六烷二酰-(2-氨乙基-PEG2000-基乙酰基))，B29R，desB30人胰岛素的合成。

使叔丁基十六烷二酰丙胺-PEG-羧酸(MW2000)(72mg，0.031mmol)溶解于THF(4mL)中，加入DIPEA(6.3μL，0.037mmol)和TSTU(11.1mg，0.037mmol)，并且使混合物在氮下搅拌过夜，加入DMSO(1mL)，并且将混合物加入A22K，B29RdesB30人胰岛素(180mg，0.031mmol)连同三乙胺(43μL，0.31mmol)一起溶解于DMSO(2mL)中的溶液中。使混合物在冰上冷却，并且加入水(15mL)，用1NHCl将pH首先调整至5.2，随后用溶于水的1％氨调整回pH7-8。混合物在制备型HPLC上进行纯化，其中使用在包含0.1％TFA的水中的35-75％乙腈梯度。在LC-MS上分析级分，并且使包含所需产物的级分合并，在真空中去除溶剂，并随后冻干。冻干材料用TFA/水95∶5处理30分钟，并且在真空中去除溶剂。使用阴离子交换层析(RessourceQ柱，1ml(AmershamBiosciences)纯化粗产物，并且用在42.5％EtOH，0.25％TRIS，pH7.5中的乙酸铵梯度(0.25％至1.25％经过25CV)洗脱，随后为使用JupiterC4，5μ柱的制备型HPLC，用包含0.1％TFA的30-70％乙腈/水梯度在90分钟内洗脱，以产生标题化合物。

HPLC-MS：m/z约1360(M⁺/6).

实施例3，一般程序(A)：

A22K(N^ε-3-(3-{4-[3-(5-羧基戊酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素

这种胰岛素与WO2006/082205，实施例8中描述的胰岛素类似地制备，其中使用A22K，B29RdesB30人胰岛素代替desB30人胰岛素，并且使用己二酸单叔丁酯代替辛二酸单叔丁酯。

MALDI-TOFMS(基质：芥子酸)；m/z：6411。

实施例4，一般程序(A)：

A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，B29R，desB30人胰岛素

MALDI-TOFMS(基质：芥子酸)；m/z：6581。

用于制备这种胰岛素的酰化试剂如下文中所述进行制备：

起始树脂：2-氯三苯甲基树脂，1.60mmol/g

使1.0g树脂在DCM(10ml)中膨胀30分钟。

1.用Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的酰化：

使0.39g(0.63eq，1.0mmol)Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(Fmoc-OEG-OH)溶解于DCM(15ml)中，并且加入树脂中。逐滴加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.44ml，2.5mmol)。使反应混合物涡旋30分钟，并且随后加入甲醇(2ml)，并且使混合物涡旋另外15分钟。使树脂过滤，并且用NMP(2x8ml)和DCM(8x8ml)洗涤。

加入20％哌啶/NMP(8ml)，静置10分钟，重复1次。

过滤且用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。

阳性TNBS测试给出红色树脂。

2.用Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的酰化：

使0.78g(2eq，2.0mmol)Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸溶解于NMP/DCM1∶1(10ml)中。加入0.28g(2.2eq，2.4mmol)HOSu，随后加入0.37ml(2.2eq，2.4mmol)DIC。允许反应混合物静置1小时，并且随后加入树脂中，并且最后加入0.407ml(2.2eq)DIEA。使反应混合物涡旋16小时，过滤且用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。

阳性TNBS测试给出无色树脂。

加入20％哌啶/NMP(10ml)，静置10分钟，重复1次。

过滤且用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。

阳性TNBS测试给出红色树脂。

用Fmoc-Glu-OtBu的酰化：

使0.86g(2eq，2.0mmol)Fmoc-Glu-OtBu溶解于NMP/DCM1∶1(10ml)。加入0.32g(2.2eq，2.4mmol)HOBT，随后加入0.37ml(2.2eq，2.4mmol)DIC。允许反应混合物静置20分钟，并且随后转移至树脂中，并且最后加入0.407ml(2.2eq)DIEA。使反应混合物涡旋16小时，过滤且用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。

阳性TNBS测试给出无色树脂。

加入20％哌啶/NMP(10ml)，静置10分钟，重复1次。

过滤且用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。

阳性TNBS测试给出红色树脂。

用十八烷二酸单叔丁酯的酰化：

使0.75g(2eq，2.0mmol)十八烷二酸单叔丁酯溶解于NMP/DCM1∶1(10ml)。加入0.32g(2.2eq，2.4mmol)HOBT，随后加入0.37ml(2.2eq，2.4mmol)DIC。允许反应混合物静置20分钟，并且随后转移至树脂中，并且最后加入0.41ml(2.2eq)DIEA。使反应混合物涡旋16小时，过滤且用NMP(2x8ml)、DCM(3x8ml)和NMP(5x8ml)洗涤。

用TFA切割：

将8ml5％TFA/DCM加入树脂中，并且使反应混合物涡旋2小时，过滤，并且收集滤液。再将5％TFA/DCM(8ml)加入树脂中，并且使混合物涡旋10分钟，过滤，并且用DCM(2x10ml)洗涤树脂。使用约800ulDIEA使组合的滤液和洗液pH调整至碱性。使混合物在真空中蒸发，提供油(3.5g)。加入二乙醚(30ml)，并且通过倾析分离不溶解的油，并且在真空中蒸发。这提供作为油的1.1g17-{(S)-1-叔丁氧-羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}-十七烷酸叔丁酯(替代名称：叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU)。

LC-MS(Sciex100API)：m/z＝846.6(M+1)⁺。

OSu活化：

使上述叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU(0.63g)溶解于THF(35ml)中。加入DIEA(0.255ml，2eq.)，随后为TSTU(0.45g，2eq.)，并且使混合物在室温下下搅拌16小时。混合物在乙酸乙酯(250ml)和含水NaHSO₄(3x100ml)之间分配。使有机相干燥(MgSO₄)，并且在真空中浓缩，以提供作为油的0.65g17-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧吡咯烷-1-基氧羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯(替代名称：叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OSu)-OTBU)。

LC-MS：m/z＝943.4(M+1)⁺。

实施例5，一般程序(A)：

A22K(N^ε-3-(3-{4-[3-(13-羧基十三烷酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素

LC-MS(电喷雾)：m/z＝1630，(M+4)⁺/4

实施例6，一般程序(A)：

A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(二十烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，B29R，desB30人胰岛素

MALDI-MS(基质：芥子酸)；m/z：6606

实施例7，一般程序(A)：

A14E，A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，B25H，B29R，desB30人胰岛素

LC-MS(电喷雾)：m/z＝1634，(M+4)⁺/4

实施例8，一般程序(A)：

A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，desB29，desB30人胰岛素

使63mgA22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素(实施例4)溶解于Tris缓冲液，pH8(50mM，10mL)中，并且加入固定在琼脂糖凝胶上的在包含20％乙醇的Tris缓冲液，pH8(50mM，0.2mL)中的羧肽酶B，并且使混合物于室温轻轻振荡16小时。再加入固定在琼脂糖凝胶上的在包含20％乙醇的Tris缓冲液，pH8(50mM，0.8mL)中的羧肽酶B，并且使混合物轻轻振荡24小时。过滤混合物，并且用包含20％乙醇的Tris缓冲液，pH8(50mM，0.8mL)洗涤过滤器。使组合的滤液和洗液冻干。通过HPLC纯化残渣，以提供标题胰岛素。

MALDI-TOFMS：m/z＝6424

实施例9，一般程序(A)：

A14E，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰基))，B25H，B29R，desB30人胰岛素

酰化试剂19-{1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九烷酸叔丁酯N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备和与亲本胰岛素的偶联：

二十烷二酸叔丁酯N-羟基琥珀酰亚胺酯：

使二十烷二酸单叔丁酯(5g，12.54mmol)和TSTU(4.53g，15.05mmol)在THF(50mL)中混合，加入DIPEA(2.62mL)，并且使所得到的混浊混合物在RT下搅拌2小时，随后加入DMF(30mL)，导致澄清溶液，使其进一步搅拌过夜。使所得到的混合物蒸发至几乎干燥，并且使残渣与冷乙腈混合，导致沉淀物的沉淀。过滤出沉淀物，并且在真空中干燥过夜，提供6.01g(97％)二十烷二酸叔丁酯N-羟基琥珀酰亚胺酯。

MS(电喷雾)：m/z：440(M-56(tBu))。

2-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯

使二十烷二酸叔丁酯2，5-二氧-吡咯烷-1-基酯(6.01g，12.124mmol)溶解于THF(150mL)中，并且与H-Glu-OtBu(2.71g，13.33mmol)在DMF/水(1/1，40mL)中的浆混合。

这导致凝胶样溶液，使所述凝胶样溶液加热，以产生澄清溶液，使所述澄清溶液在RT下搅拌3小时。随后蒸发溶液，加入100mL水，并且使混合物加热至60℃，这导致在冷却时结晶的溶液。沉淀由乙腈重结晶，并且使晶体在真空中干燥。得率6.82g(96％)。

MS(电喷雾)：m/z584(M+1)。

2-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2，5-二氧吡咯烷-1-基)酯

使2-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯(6.52g，11.17mmol)溶解于THF(100mL)，加入DIPEA(2.14mL)，随后为TSTU(3.70g，12.29mmol)溶于乙腈(25mL)的溶液。使混合物在RT下搅拌过夜，随后使其蒸发，从而导致由乙腈重结晶的呈褐色的残渣。在5℃冷却过夜后，形成粉末。使这溶解于THF中，并且用MgSO₄干燥，过滤并且蒸发至干燥，以提供6.17g(81％)标题化合物。

MS(电喷雾)：m/z：681(M+1)。

19-{1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九烷酸叔丁酯

使2-(19-叔丁氧羰基十九烷酰氨基)戊二酸1-叔丁酯5-(2，5-二氧吡咯烷-1-基)酯(0.56g，0.822mmol)溶解于THF(20mL)中，加入溶于THF(20mL)中的3-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸(0.22g，0.82mmol)，并且使混合物在RT下搅拌3小时。LCMS指示反应完成(MS：m/z831(M+1))，并且反应混合物直接用于与TSTU的下述反应。

19-(1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧羰基)乙氧基] 乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁酯

使19-{1-叔丁氧羰基-3-[2-(2-{2-[2-(2-羧基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}十九烷酸叔丁酯(0.68g溶于THF40mL的粗溶液，0.82mmol)和TSTU(0.296g，0.982mmol)混合，通过加入DIPEA(0.171mL)调整pH，并且使所得混合物在RT下搅拌过夜。这导致澄清溶液，使其蒸发至干燥，并且用二乙醚处理，这提供作为蜡状团块的1.2g标题化合物，其无需进一步纯化而使用。

MS(电喷雾)：m/z816(M-2tBu)(calcd.816)。

19-(1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧羰基)乙氧基] 乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁酯与A14E，A22K， B25H，B29R，desB30人胰岛素的偶联：

使A14E，A22K，B25H，B29R，desB30人胰岛素(0.3g，0.052mmol)溶解于乙腈(4mL)和Na₂CO₃(0.1M，10mL)的混合物中，用NaOH(1M)将pH调整至10.6。将溶于乙腈(4mL)的19-(1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-(2-{2-[2-(2，5-二氧-吡咯烷-1-基氧羰基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十九烷酸叔丁酯(0.048g，0.052mmol)加入溶液中，并且使混合物在RT下轻轻搅拌1小时。加入5滴甲胺溶液(溶于MeOH的40％)，并且使混合物搅拌另外5分钟。随后加入1份乙酸(冰的，5mL)，并且通过制备型HPLC(C18，3cm柱，梯度0-7分钟20％乙腈、7-32分钟20-100％乙腈、32-37分钟100％乙腈)纯化所得到的混合物。

使纯级分合并且冷冻干燥。

使所得到的化合物溶解于TFA(30mL)中，并且在RT下搅拌2小时，随后加入乙腈(20mL)和水(20mL)，并且通过制备型HPLC(C18，3cm柱，梯度0-7分钟20％乙腈、7-32分钟20-60％乙腈、32-37分钟60％乙腈)纯化混合物。

使纯级分合并且冷冻干燥。

通过HPLC(C18，3cm柱，梯度0-7分钟25％乙腈、7-47分钟25-60％乙腈、47-52分钟60％乙腈)纯化，使纯级分合并且冷冻干燥。

这产生13mg最终产物。

MS(电喷雾)：m/z6520(calcd.6520)。

实施例10，一般程序(A)：

A18L，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

MS(电喷雾)：m/z：6578(Calcd：6578)。

实施例11，一般程序(A)：

A8H，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

MALDI-TOFMS：m/z＝6615(Calcd.：6615)。

实施例12，一般程序(A)：

A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素

MS(电喷雾)：m/z＝1677(m+4)/4。

实施例13，一般程序(A)：

A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰基))，B29R，desB30人胰岛素

MS(电喷雾)：m/z＝6653(Calcd.：6653)。

实施例14，一般程序(A)：

A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰基))，B29R，desB30人胰岛素

MALDI-TOFMS：m/z＝6535(Calcd.：6535)

实施例15，一般程序(A)：

A14E，A22K(Nε-十八烷二酰-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基))，B25H，B29R，desB30人胰岛素

MS(电喷雾)：m/z＝1667.9(m+4)/4。

实施例16，一般程序(A)：

A14E，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰基))，B25H，B29R，desB30人胰岛素

实施例17，一般程序(A)：

A14E，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰)-γGlu)，B25H，B29R，desB30人胰岛素

MALDI-TOFMS：m/z＝6620(Calcd.：6621)

实施例18，一般程序(A)：

A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B28E，B29R，desB30人胰岛素

MALDI-TOFMS：m/z＝6610(Calcd.：6610)

实施例19，一般程序(A)：

A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

MALDI-TOFMS：m/z＝6724(Calcd.：6724)

下述实施例中的胰岛素可以使用相似程序进行制备：

实施例20：

A14E，A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(二十烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，B25H，B29R，desB30人胰岛素

实施例21：

A22K(N^ε-十八烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素

实施例22：

A22K(N^ε-二十烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素

实施例23：

A22K(N^ε-十八烷二酰-(2-氨乙基-PEG2000-基乙酰基))，B29RdesB30人胰岛素

实施例24：

A22K(N^ε-二十烷二酰-(2-氨乙基-PEG2000-基乙酰基))，B29RdesB30人胰岛素

实施例25：

A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(15-羧基十五烷酰氨基)丙氧基]丁氧基}-丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29RdesB30人胰岛素

实施例26：

A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(17-羧基十七烷酰氨基)丙氧基]丁氧基}-丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29RdesB30人胰岛素

实施例27：

A22K(N^ε-十四烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素

实施例28：

A8H，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例29：

A18L，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例30：

A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例31：

A8H，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例32：

A18L，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例33：

A8H，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例34：

实施例35：

A18L，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例36：

A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例37：

A8H，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例38：

A18L，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例39：

A8H，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例40：

实施例41：

A18L，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例42：

A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例43：

A8H，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例44：

A18L，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例45：

A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例46：

A8H，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例47：

A18L，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素

实施例48：

本发明的胰岛素衍生物的胰岛素受体结合

通过SPA测定(闪烁亲近测定法(ScintillationProximityAssay))微量滴定板抗体捕获测定，测定本发明的酰化胰岛素类似物对于人胰岛素受体的亲和力。使SPA-PVT抗体结合珠，抗小鼠试剂(AmershamBiosciences，目录号PRNQ0017)与25ml结合缓冲液(100mMHEPESpH7.8；100mM氯化钠，10mMMgSO₄，0.025％Tween-20)混合。关于单个PackardOptiplate(PackardNo.6005190)的试剂混合物由2.4μl1∶5000稀释的纯化重组人胰岛素受体(含或不合外显子11)、一些与5000cpm/100μl试剂混合物对应的A14Tyr[¹²⁵I]-人胰岛素母液、12μlF12抗体的1∶1000稀释物、3mlSPA珠和至总共12ml的结合缓冲液组成。随后向PackardOptiplate中的每个孔加入总共100μl试剂混合物，并且在Optiplate中制备来自合适样品的胰岛素衍生物稀释系列。随后使样品在轻轻振荡时温育16小时。随后通过离心1分钟分开相，并且在Topcounter中计数板。使用在GraphPadPrism2.01(GraphPadSoftware，SanDiego，CA)中的非线性回归算法拟合结合数据。

本发明所选择的胰岛素的胰岛素受体亲和力：

实施例49：

在大鼠中静脉内(i.v.)快速浓注本发明的胰岛素衍生物后的血糖降低作用

雄性Wistar大鼠，200-300g，禁食18小时，使用枸橼酸芬太尼-多美康s.c.(1.25mg/ml多美康、2.5mg/ml氟阿尼酮、0.079mg/ml枸橼酸芬太尼)2ml/kg作为先导剂量(至在测试物质给药前的时间点-30分钟)和每20分钟的另外1ml/kg进行麻醉。

动物用静脉内注射(尾静脉)1ml/kg对照和测试化合物(通常剂量范围0.125-20nmol/kg)进行给药。通过在尾尖中的毛细血管穿刺将用于测定整体血糖浓度的血样收集在肝素化的10μl玻璃管中，至时间-20分钟和0分钟(在给药前)，以及至给药后时间10、20、30、40、60、80、120和180分钟。使用EBIOPlus自动分析仪(Eppendorf，德国)，通过固定葡糖氧化酶法在分析缓冲液中稀释后测量血糖浓度。对于每个剂量和每种化合物制备平均血浆葡萄糖浓度线(平均值±SEM)。

实施例50：

本发明的酰化胰岛素类似物相对于人胰岛素的效力

在实验当天重238-383g的SpragueDawley雄性大鼠用于夹钳实验。大鼠在受控环境条件下自由接近饲料，并且在夹钳实验前禁食过夜(从3pm起)。

实验规程：

在外科手术程序前使大鼠在动物研究室中适应至少1周。在夹钳实验前约1周，在氟烷麻醉下将Tygon导管插入颈静脉(用于输注)和颈动脉(用于血液取样)内，并且外置(exteriorised)且固定在颈的背部。外科手术后对大鼠给予Streptocilinvet.(BoehringerIngelheim；0.15ml/大鼠，i.m.)，并且在恢复期过程中将其置于动物监护室(25℃)中。为了获得止痛，在麻醉过程中施用Anorphin(0.06mg/大鼠，s.c.)，并且在从麻醉完全恢复后(2-3小时)以及再次每天1次施用卡洛芬(Rimadyl)(1.5mg/kg，s.c.)，共2天。

在实验当天7am时，禁食过夜(从前一天3pm起)的大鼠进行称重，并且与取样注射器和输注系统(Harvard22Basic泵，Harvard，和PerfectumHypodermic玻璃注射器，Aldrich)连接，并且随后放置到个别夹钳笼内，在其中它们在实验开始前休息约45分钟。在整个实验期间大鼠能够在其通常垫草上自由移动，并且自由接近饮用水。30分钟基础期后，在这期间以10分钟时间间隔测量血浆葡萄糖水平，使待测试的胰岛素衍生物和人胰岛素(1个剂量水平/大鼠，n＝6-7只/剂量水平)以恒定速率输注(i.v.)300分钟。自始至终以10分钟时间间隔测量血浆葡萄糖水平，并且相应调整20％含水葡萄糖的输注，以维持血糖正常(euglyceamia)。使来自每只大鼠的重悬浮红细胞样品合并，并且经由颈动脉导管以约1/2ml体积送回。

在每次实验当天，在夹钳实验前和结束时获得待测试的个别胰岛素衍生物溶液和人胰岛素溶液的样品，并且通过HPLC证实肽的浓度。在研究前和结束时的相关时间点时测量大鼠胰岛素和C-肽以及待测试的胰岛素衍生物和人胰岛素的血浆浓度。在实验结束时使用超剂量戊巴比妥杀死大鼠。

实施例51：

胰岛素衍生物肺递送给大鼠

测试物质将通过滴注法进行肺给药。简言之，使雄性Wistar大鼠(约250g)在约60ml芬太尼/dehydrodenzperidol/-多美康中麻醉，其作为6.6ml/kgsc先导剂量并且随后为30分钟时间间隔的3.3ml/kgsc的3次维持剂量给予。诱导麻醉后10分钟，从尾静脉获得基础样品(t＝-20分钟)，随后为紧在测试物质给药前的基础样品(t＝0)。在t＝0时，使测试物质气管内给药到1个肺内。使具有圆形末端的专门插管封固在包含200ul空气和测试物质(1ml/kg)的注射器上。经由孔，将插管引入气管内，并且向前进入一个主支气管内-正好经过分叉(bifurcature)。在插入期间，从外部触摸颈以确保气管内定位。将注射器的内容物注射，随后为2秒暂停。其后，将插管慢慢抽回。在测试期间使大鼠保持麻醉(血样进行最多达4或8小时)，并且在实验后实施安死术。

序列表

SEQIDNO：1是实施例1-6、8、12-14、18和19的A1-A21链。SEQIDNO：2是实施例1-6、10-14和19的B1-B29链。SEQIDNO：3是实施例7、9和15-17的A1-A21链。SEQIDNO：4是实施例7、9和15-17的B1-B29链。SEQIDNO：5是实施例10的A1-A21链。SEQIDNO：6是实施例11的A1-A21链。SEQIDNO：7是实施例18的B1-B29链。SEQIDNO：8是实施例8的B1-B28链。

<110>NovoNordiskA/S

<120>具有酰基和亚烷基二醇部分的胰岛素类似物

<130>7701.204-WO

<160>8

<170>PatentInversion3.4

<210>1

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>A1-A21

<400>1

GlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu

151015

GluAsnTyrCysAsn

20

<210>2

<211>29

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>B1-B29

<400>2

PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr

151015

LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrProArg

2025

<210>3

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>A1-A21

<400>3

GlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuGluGlnLeu

151015

GluAsnTyrCysAsn

20

<210>4

<211>29

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>B1-B29

<400>4

PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr

151015

LeuValCysGlyGluArgGlyPheHisTyrThrProArg

2025

<210>5

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>A1-A21

<400>5

GlyIleValGluGlnCysCysThrSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu

151015

GluLeuTyrCysAsn

20

<210>6

<211>21

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>A1-A21

<400>6

GlyIleValGluGlnCysCysHisSerIleCysSerLeuTyrGlnLeu

151015

GluAsnTyrCysAsn

20

<210>7

<211>29

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>B1-B29

<400>7

PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr

151015

LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrGluArg

2025

<210>8

<211>28

<212>PRT

<213>人工的

<220>

<223>B1-B28

<400>8

PheValAsnGlnHisLeuCysGlySerHisLeuValGluAlaLeuTyr

151015

LeuValCysGlyGluArgGlyPhePheTyrThrPro

2025

Claims

1.一种人胰岛素的酰化类似物，其中所述胰岛素类似物是A8H，A22K，B29R，desB30；A14E，A22K，B25H，B29R，desB30；A18L，A22K，B29R，desB30；A22K，B28E，B29R，desB30；或A22K，B29R，desB30胰岛素；特征在于酰基部分与A22位置中的赖氨酸残基附着；且其中所述酰基部分具有通式I：

Acy-AA1_n-AA2_m-AA3_p-(I)，

其中

n是0；

m是0或1-6的整数；

p是1、2或3；

Acy是包括8-24个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸部分，从其中在形式上羟基已从脂肪酸的羧基中或从脂肪二酸的羧基之一中去除；

AA1不存在(即n＝0)；

AA2选自γGlu、βAsp或任一下述化合物：

从其中氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除，且其中箭标指示与AA1、AA2或AA3的氨基的附着点；

AA3选自

其中r是1-10的整数；或选自

其中t是20-70的整数；或选自

其中r是1-10的整数；或选自

其中s是1-10的整数；且

从其中氢原子已从氨基中去除和羟基已从羧基中去除；

AA1、AA2和AA3在式中出现的次序可以独立地互换；

Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键；和

2.根据权利要求1的酰化类似物，其中Acy是十六烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸，从其中羟基已去除。

3.根据权利要求1的酰化类似物，其中AA2是γGlu。

4.根据权利要求1的酰化类似物，其中AA3选自

其中r是3；或选自

其中r是1；或选自

其中t是43；或选自

其中r是5-7的整数；或选自

其中s是1，

5.根据权利要求1的酰化类似物，其选自下述化合物：A22K(N^ε-十六烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十六烷二酰-(2-氨乙基-PEG2000-基乙酰基))，B29RdesB30人胰岛素；A22K(N^ε-3-(3-{4-[3-(5-羧基戊酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-3-(3-{4-[3-(13-羧基十三烷酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(二十烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，B29R，desB30人胰岛素；A14E，A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，B25H，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}-乙氧基)乙氧基]乙酰基)，desB29，desB30人胰岛素；A14E，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰))，B25H，B29R，desB30人胰岛素；A18L，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)-乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-(3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基-乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酰))，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰))，B29R，desB30人胰岛素；A14E，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰))，B25H，B29R，desB30人胰岛素；A14E，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-γGlu-(3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酰))，B25H，B29R，desB30人胰岛素；A14E，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰)-γGlu)，B25H，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B28E，B29R，desB30人胰岛素；22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A14E，A22K(N^ε-[2-(2-[2-(2-[2-(二十烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)-乙酰基])，B25H，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十八烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-二十烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十八烷二酰-(2-氨乙基-PEG2000-基乙酰基))，B29RdesB30人胰岛素；A22K(N^ε-二十烷二酰-(2-氨乙基-PEG2000-基乙酰基))，B29RdesB30人胰岛素；A22K(N^ε-3-(3-{4-[3-(15-羧基十五烷酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29RdesB30人胰岛素；A22K(Nε-3-(3-{4-[3-(17-羧基十七烷酰氨基)丙氧基]丁氧基}丙基氨基甲酰基)丙酰-γGlu)，B29RdesB30人胰岛素；A22K(N^ε-十四烷二酰-(3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酰-γGlu)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]-乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A18L，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}-乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A18L，A22K(N^ε-十八烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A18L，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A18L，A22K(N^ε-二十烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]-乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A18L，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A18L，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素；A8H，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素和A18L，A22K(N^ε-十六烷二酰-γGlu-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，B29R，desB30人胰岛素。

6.根据权利要求1-5中任一项的人胰岛素的酰化类似物在制备用于治疗1型糖尿病或2型糖尿病的药物组合物中的用途。

7.包含根据权利要求1-5中任一项的人胰岛素的酰化类似物的药物组合物，其用于治疗1型糖尿病或2型糖尿病。