CN1163574A - 酰化的胰岛素类似物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及糖尿病领域。具体地说，本发明涉及单体胰岛素类似物，其中A链是人胰岛素A链的天然序列，B链是在位置B28或B29或两者同时进行修饰。所述类似物是在A链或B链的N-末端或在赖氨酸进行了单酰基化。酰化胰岛素类似物的作用时间延长。

Description

酰化的胰岛素类似物

本发明涉及糖尿病领域。更具体地说，本发明涉及作用时间延长的酰化胰岛素类似物。

现有的胰岛素替代疗法已经能够预防糖尿病急性并发症的死亡和发病。然而，由于持续性代谢紊乱(主要是因较差的血糖控制而引起的)，慢性糖尿病并发症仍是主要的健康问题。因糖尿病控制和并发症试验(DCCT)而带来的结果表明，Hb Alc降低1％相应地视网膜病的发病率改善35％以上。

为了达到正常糖血，必须设计治疗方法以便尽可能地使之类似于正常个体的内源胰岛素分泌模式。胰岛素每天的生理需求是波动的，而且可以分成两期：(a)吸收期，需要脉冲量的胰岛素以处置与饮食有关的血糖升高，和(b)吸收后期，需要维持量的胰岛素以调节肝葡萄糖的输出，用于维持最佳的禁食时的血糖。

因此，有效的治疗方法涉及两种外源胰岛素的组合使用：饮食时间使用的速效胰岛素和长效基础胰岛素。

为了获得长效的基本时间作用(time action)，目前，在有利于不溶的晶态，六聚体结构形成的条件下，配制胰岛素。这些长效制剂是Ultralente，Lente，和半-Lente。但是已经表明，现有长效制品的不溶性会引起剂量反应不一致以及在所述时间作用方面不可预测性的问题。另外，目前可得到的一种长效胰岛素制品即牛Ultralente是致免疫的。因牛Ultralente的免疫原性而产生的抗体会改变速效胰岛素的药物动力学。

尽管不可溶Ultralente制剂的所述时间作用可以得到方便的一天一次的基础胰岛素，但是许多医生实际上更喜欢使用中等时间作用的胰岛素，胰岛素-精蛋白制剂通常称为胰岛素-NPH。胰岛素-NPH作为基础胰岛素，一天用两次，因为用较短时间作用的药物调整最佳剂量相对更容易。结果，中等作用胰岛素占美国的70％，日本的64％，欧洲的45％，占全球胰岛素市场的55％。

但是，不可溶胰岛素-NPH和不可溶Ultralente胰岛素均是悬浮制剂。因此，该制剂本身比可溶制剂更难预测，导致对血糖控制较不稳定，从而更易产生危及生命的低血糖症状。因此仍需要可溶的长效基础胰岛素以得到成功的强胰岛素替代疗法。本发明提供了酰化胰岛素类似物，可对其进行配制以提供可溶的基础胰岛素疗法。

Muranishi和Kiso(日本专利申请1-254699)公开了猪，牛或人胰岛素的酰化。具体公开了下列化合物：B29-N^ε-棕榈酰胰岛素(ε-氨基被酰化)，B1-N^α-棕榈酰胰岛素(B链N末端的α-氨基被酰化)，B1，B29-N^α，N^ε-二棕榈酰胰岛素(ε-氨基和N-末端的α-氨基均被酰化)。Muranishi和Kiso公开了酰化胰岛素具有与胰岛素相似的生物学性能；但未能提供剂量，施用途径或其它能使本领域专业人员可以评估酰化胰岛素活性或作用的时间的体内模型的条件。

相似地，Hashimoto等人在药理学研究(Pharmaceutical Resarch)6：171-176(1989)中公开了B1-N^α-棕榈酰胰岛素(N末端的α-氨基被酰化)，和B1，B29-N^α，N^ε-二棕榈酰胰岛素(ε-氨基和N-末端的α-氨基均被酰化)。Hashimoto等人研究了25U/mL，一种超高剂量的B1-N^α-棕榈酰胰岛素和B1，B29-N^α，N^ε-二棕榈酰胰岛素在雄性大鼠中的降血糖作用。在这些剂量时，图5说明在静脉内施用时，活性很低。但肌肉内施用时，图6中表明，B1-N^α-棕榈酰胰岛素只有很短的降血糖作用，而B1，B29-N^α，N^ε-二棕榈酰胰岛素有可忽略的作用。

除Muranishi和Kiso以及Hashimoto等人进行的体内报道外，Walder等人在PCT申请WO92/01476中公开了通过将蛋白质与非极性基团，特别是与脂肪酸衍生物化学相连可以延长蛋白质和肽的体内半衰期。脂肪酸在蛋白质和白蛋白之间提供桥基团。Walder等人继续公开了非极性基团优选被限于蛋白质的特有一个或多个位点，并以血红蛋白Cys残基的结合作了举例说明。参考文献通常公开了胰岛素的脂肪酸衍生物。但是，并未具体公开或举例胰岛素的脂肪酸衍生物，而且没有任何资料公开说明保持了胰岛素脂肪酸衍生物的生物学活性。

已经发现，单体胰岛素类似物的游离氨基的选择性酰化可提供有效的基础胰岛素活性。对本文描述的非酰化胰岛素类似物进行了设计以便使作用迅速开始并迅速清除。这些类似物作为单体胰岛素类似物是本领域已知的。修饰所述类似物以提供基础活性的能力是很难预料的。

本发明提供单-酰化胰岛素类似物，使用后，其作用时间延长。可以将所述类似物制备成可溶性制剂，这种制剂因此优于目前基础胰岛素疗法。本发明类似物在剂量反应方面还具有极好的可预测性，在时间作用方面有极好的可预测性，在时间作用模式中没有特异峰，而且非常适用于制备含胰岛素类似物和酰化胰岛素类似物的混合物制剂。发明概述

本发明提供了分子式如下的单-酰化胰岛素类似物或其可药用盐：

SEQ ID NO：1Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                  10                  15Glu Asn Tyr Cys Asn

        20与SEQ ID NO：2适当交联：Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                  10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr

         20                  25                  30其中：

当SEQ ID NO：2位置1的Xaa是Phe，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Lys或Pro时，SEQ ID NO：1(胰岛素A链)位置1的Xaa是Gly；或酰化Gly；

当SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Lys或Pro时，SEQ ID NO：2(胰岛素B-链)位置1的Xaa是Phe；或酰化Phe。

当SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly，SEQ ID NO：2位置1的Xaa是Phe，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Pro时，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，Ala；或酰化Lys；和

当SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly，SEQ ID NO：2位置1的Xaa是Phe时，SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Lys，Pro；或酰化Lys。

本发明还提供了通过给需要所述治疗的患者施用一种药物组合物而治疗高血糖的方法，所述药物组合物含有有效量的本发明酰化胰岛素类似物和一种或多种可药用赋形剂。

还公开并要求了非经胃肠给药的制剂，其含有本发明的酰化胰岛素类似物和一种或多种可药用防腐剂，等渗剂或缓冲剂。

本说明书中所用的所有氨基酸缩写均是美国专利和商标局所接受的列于37 C.F.R.§1.822(B)(2)中的那些。

术语“交联”指在Cys残基之间形成二硫键。适当交联的人胰岛素或胰岛素类似物含有三个二硫键。在A链的位置6和11的Cys残基之间形成第一个二硫键。在A链的第7位Cys和B链的第7位Cys之间形成第二个二硫键。在A链的第20位Cys和B链第19位的Cys之间形成第三个二硫键。

术语“酰化Gly”“酰化Phe”和“酰化Lys”指用C₆-C₂₁脂肪酸酰化的Gly，Phe或Lys。术语“酰化基团”指于胰岛素类似物的α-氨基或ε-氨基化学键合的脂肪酸。在A1和B1位置的游离氨基是α-氨基。在B28或B29位置的Lys的游离氨基是ε-氨基。

术语“酰化”指引入与蛋白质的一个游离氨基共价结合的一个酰基基团。术语“选择性酰化”指ε-氨基优于α-氨基酰化。

术语“脂肪酸”指饱和的或不饱和的C₆-C₂₁脂肪酸。优选的脂肪酸是饱和的，包括肉豆蔻酸(C₁₄)，十五酸(C₁₅)，棕榈酸(C₁₆)，十七酸(C₁₇)和硬脂酸(C₁₈)。更优选的是，脂肪酸是棕榈酸。本发明的化合物表示单-酰化胰岛素类似物。用C₆-C₂₁脂肪酸在α-氨基或ε-氨基上酰化胰岛素类似物。优选，在赖氨酸的ε-氨基上单酰化所述类似物。

术语“活化的脂肪酸酯”指已经用在酶学方法(Methods ofEnzymology)25，494-499(1972)和Lapidot等人在脂研究杂志(J.of Lipid Res.)8：142-145(1967)中描述的常规技术活化的脂肪酸。活化的脂肪酸酯包括常用的酰化剂衍生物，如Hydroxybenzotriazide(HOBT)，N-羟基琥珀酰亚胺和其衍生物。优选的活化酯是N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯。

术语“可溶”指足够量的酯存在于液相中以酰化胰岛素类似物。优选，每摩尔类似物有1到2摩尔当量的酰化酯在液相中。

本文所用的术语“单体胰岛素类似物”或“胰岛素类似物”是不太易于二聚或自缔合的速效胰岛素类似物。单体胰岛素类似物是人胰岛素，其中用Asp，Lys，Leu，Val或Ala取代B28位的Pro，而且B29位的Lys是Lys或Pro。Chance等人在美国专利申请07/388201(EPO申请号383472)和Brange等人在EPO申请214826中描述了单体胰岛素类似物。本领域普通技术人员应认识到对单体胰岛素类似物的其它修饰也是可能的，而且为本领域所广泛接受。这些修饰包括用天冬氨酸取代B10位的组氨酸残基，用天冬氨酸取代B1位的苯丙氨酸残基；用丙氨酸取代B30位的苏氨酸残基；用天冬氨酸取代B9位的丝氨酸残基；仅缺失B1位的氨基酸或同时缺失B2位的氨基酸；从B30位缺失苏氨酸。

本文所用的术语“碱性条件”指反应的碱性。为了在ε-氨基上选择性地酰化胰岛素类似物，必须在基本上所有的游离氨基去质子化的条件下进行反应。在水溶剂或共溶剂中，碱性条件指在大于9.0的pH进行反应。在有机溶剂中，在碱存在下进行反应，保持其碱性相当于在水中大于或等于10.75的pKa值。

SEQ ID NO：1指序列表中的第一个序列，是指序列如下的人胰岛素A链的类似物：Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                  10                  15Glu Asn Tyr Cys Asn

         20其中当SEQ ID NO：2位置1的Xaa是Phe，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Lys或Pro时，SEQ ID NO：1(胰岛素A链)位置1的Xaa是Gly；或酰化Gly；

SEQ ID NO：2指序列表中的第二个序列，是指有如下序列的人胰岛素B链的类似物：Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                  10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr

         20                  25                  30其中：

当SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Lys或Pro时，SEQ ID NO：2(胰岛素B-链)位置1的Xaa是Phe；或酰化Phe；

当SEQ ID NO：1(胰岛素A链)位置1的Xaa是Gly，SEQ ID NO：2(胰岛素B链)位置1的Xaa是Phe，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Pro时，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，Ala；或酰化Lys；和

当SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，SEQ ID NO：1(胰岛素A-链)位置1的Xaa是Gly，SEQ IDNO：2(胰岛素B-链)位置1的Xaa是Phe时，SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Lys，Pro；或酰化Lys。

如上所述，本发明提供分子式如下的单酰化胰岛素类似物：与SEQ IDNO：2适当交联的SEQ ID NO：1，或其可药用盐。在SEQ ID NO：1(胰岛素A链)位置1的优选氨基酸残基是Gly。苯丙氨酸是SEQ IDNO：2(胰岛素B链)1位的优选氨基酸。当SEQ ID NO：2位置29的氨基酸残基是Pro时，SEQ ID NO：2位置28的优选氨基酸残基是Asp；或酰化Lys。当SEQ ID NO：2位置28的氨基酸残基是酰化Lys时，SEQ ID NO：2位置29的优选氨基酸残基是Lys；或Pro。在本领域普通技术人员已知的标准生物化学术语中，优选的类似物是单-酰化Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。最优选的酰化胰岛素类似物是用C₈-C₁₈脂肪酸，优选C₁₄-C₁₆脂肪酸单酰化的胰岛素类似物。因此优选的脂肪酸包括辛酰基(C8)，壬酰基(C9)，癸酰基(C10)，十一烷酰基(C11)，月桂酰基(C12)，十三烷酰基(C13)，肉豆蔻酰基(C14)，十五烷酰基(C15)，棕榈酰基(C16)。因此本发明优选的化合物包括B29-N^ε-Asp^B28-棕榈酰人胰岛素(B²⁸是Asp；B²⁹是酰化Lys)，B28-N^ε-棕榈酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素(B²⁸是酰化Lys；B²⁹是Pro)，B28-N^ε-辛酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素，B28-N^ε-癸酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素，B28-N^ε-肉豆蔻酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素，和B28-N^ε-十一烷酰基-Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

蛋白质(包括胰岛素)的游离氨基的酰化是本领域已知的。在酶学方法(Methods of Enzymology)，25：494-499(1972)中列出了常用的酰化方法，包括使用活化的酯，酰卤化物，或酸酐。使用脂肪酸的活化酯，特别是N-羟基琥珀酰亚胺酯是用脂肪酸酰化游离氨基的特别有效的方法。Lapidot等人，脂研究杂志，8：142-145(1967)。Lapidot等人描述了N-羟基琥珀酰亚胺酯的制备及其在制备N-月桂酰-甘油，N-月桂酰-L-丝氨酸和N-月桂酰-L-谷氨酸中的应用。

为了选择性地酰化ε-氨基，在偶联过程中，可以用各种保护基团保护α-氨基。适宜保护基团的选择是本领域专业人员熟知的，其包括对甲氧基苯甲酰氧羰基(pmZ)。优选在一个合成步骤中酰化ε-氨基而不使用氨基保护基。通过在极性溶剂中于碱性条件下，将活化脂肪酸酯与蛋白质的ε-氨基反应而完成酰化。反应的碱性必须足以使胰岛素类似物的所有游离氨基去质子化。在弱碱性条件下，不能将所有游离氨基去质子化，并优先酰化N-末端或α-氨基。在含水溶剂或共溶剂中，碱性条件指反应在大于9.0的pH下完成。由于蛋白质在pH12.0以上降解，所以反应混合物的pH优选是10.0-11.5，且最佳为10.5。在混合有机和含水溶剂中反应混合物的反应pH是在混合前测量的含水溶剂的pH。

在非含水溶剂中，在碱存在下进行ε-氨基的选择性酰化，保持其碱性相当于在水中大于或等于10.75的pKa值，以便足以使ε-氨基去质子化。即，碱必须至少与三乙胺一样强。优选碱是四甲基胍，二异丙基乙胺或四丁基氢氧化铵。使用弱碱会酰化α-氨基。

溶剂的选择并不重要，而且很大程度上依赖于胰岛素类似物和脂肪酸酯的溶解度。溶剂可以全部是有机的。普通可接受的有机溶剂包括DMSO，DMF等。水溶剂和水与有机溶剂的混合物也是可行的。极性溶剂的选择仅限于实际的溶解度。优选溶剂是DMSO；DMF；乙腈和水；丙酮和水；乙醇和水；异丙醇和水；异丙醇，乙醇，和水；以及乙醇，丙醇和水。优选溶剂是乙腈和水。最佳为50％的乙腈。本领域普通技术人员应认识到其它极性溶剂也是可行的。

一般地，优选活化的脂肪酸酯是摩尔过量的。优选用1-4摩尔当量，最佳为1-2摩尔当量的酯进行反应。本领域普通技术人员应认识到将会大量地产生很高水平的活化酯，双-或三-酰化产物。

反应温度不重要。在20-40℃之间进行反应，而且通常是在15分钟-24小时内完成。

酰化后，用标准方法，如反相或疏水层析纯化产物。此后，用标准方法如冷冻干燥或结晶来回收产物。

可以用各种现有的肽合成技术，包括传统(溶液)法，固相法，半合成法以及最新的重组DNA法制备本发明的单体胰岛素类似物。例如Chance等人(美国专利07/388210，EPO公开383472)以及Brange等人(EPO21482)公开了各种胰岛素类似物的制备，在此将上述文献引入本文作为参考。也可以使用重组DNA技术，经类似于胰岛素原的前体分子制备本发明胰岛素类似物的A链和B链。参见Frank等人，肽：合成-结构-功能(Peptides：Systhesis-Structure-Function)，Proc.Seventh Am.Pept.Symp.Eds.D，.Rich和E.Gross(1981)(该文献引入本文作为参考)。

下列实施例仅为了进一步说明本发明。本发明的范围不应仅由下列实施例来说明。实施例1在乙腈和水中用N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯酰化Lys^B28Pro^B29-人胰岛素

在pH2.5下将Lys^B28Pro^B29-人胰岛素晶体(2.22g)溶解在100ml50mM的硼酸溶液中。用10％HCl将溶液的pH调到2.5，搅拌溶液直到肉眼观察到晶体全部溶解。通过将270mg的固体活化酯加到27mL预加热到约50℃的乙腈中，然后剧烈搅拌直到肉眼观察到所有活化酯颗粒均溶解在溶液中，制备活化酯(N-琥珀酰亚胺基棕榈酸酯)溶液。通过加入10％NaOH将溶液的pH调到约10.22，然后将溶液在4℃搅拌15分钟。将乙腈(73ml)加到调整了pH的溶液中，然后预制备活化酯溶液。使反应在4℃进行85分钟，然后通过加入1N乙酸(600mL)猝冷，得到2.35的pH。反应产率以在猝冷反应中B28-N^ε-棕榈酰基Lys^B28Pro^B29-人胰岛素的量除以起始的Lys^B28Pro^B29-人胰岛素量计算，结果为72.5％。实施例2C8(B28)Lys^B28Pro^B29-人胰岛素

在pH2.5下将Lys(B28)，Pro(B29)-人胰岛素(KPB)晶体(2.0g)溶解在200ml 50mM的硼酸缓冲溶液中。用10％HCl将溶液的pH调到2.5，搅拌溶液直到肉眼观察到晶体全部溶解。通过将175mg的固体活化酯加到25.62mL的乙腈中，然后剧烈搅拌直到肉眼观察到所有活化酯颗粒均溶解在溶液中，制备活化酯(1-辛酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)溶液。通过加入10％NaOH将KPB溶液的pH调到约10.4，然后将溶液在室温搅拌约5分钟。将乙腈(176ml)加到调整了pH的溶液中，然后预制备活化酯溶液。使反应在环境温度进行90分钟，通过加入5.5ml 10％HCl(2.75％v/v)和3倍体积(1200ml)的冷dH₂O猝冷，得到2.70的pH。用猝冷反应中Lys B29(C8)KPB的量除以起始BHI的量来计算反应产率，为75.5％。将所述溶液分成两个800ml以用于通过疏水层析(SP20SS)纯化。柱层析后接着超滤和冻干。

如上所述，通过给需要所述治疗的患者施用有效量的单酰化胰岛素类似物，本发明的酰化胰岛素类似物可以有效地治疗高血糖。本文所用的术语“有效量”指所需的在治疗或预防上用以降低或保持血糖水平的一种或多种本发明酰化类似物的量。该量通常可从每天约10单位或更多的单位(或约0.3-约2mg，假定每mg约29单位)。然而，应理解实际施用的酰化类似物数量是由医生根据有关的情况而确定，所述情况包括待治疗的状态(即高血糖的原因)，待施用的具体类似物，所选的非经胃肠给药的途径，个体患者的年龄，体重和反应以及患者症状的严重程度。因此，上述剂量范围不以任何方式限定本发明的范围。

通过药物组合物给需要所述治疗的患者(即环高血糖的患者)施用本发明的酰化胰岛素类似物，所述药物组合物含有有效量的至少一种单酰化胰岛素类似物以及一种或多种可药用赋形剂或载体。为了这些目的，通常可以配制药物组合物以便使其每ml含约100单位或含有效量酰化胰岛素类似物的相似的浓度。尽管不需要，但通常这些组合物通常是非经胃肠给药的，而且可以用常规用于非经胃肠给药的产物的本领域熟知的赋形剂或载体，通过各种技术制备。参见，例如Remington′sPharmaceutical Sciences，第17版，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA(1985)，该文献引入本文作为参考。例如，通过将所需量的至少一种单-酰化胰岛素类似物悬浮或溶解在适用于注射的非毒性液体载体如水介质中，并将悬浮液或溶液灭菌，可以制备用于非经胃肠给药的剂量形式。另外，可以将测量量的化合物放在小瓶中；然后将小瓶和其内含物灭菌密封。施用前，可以提供用于混合目的的附带小瓶或载体。适用于非经胃肠给药的药物组合物使用稀释剂，赋形剂和载体如水和水可混的有机溶剂如甘油，芝麻油，花生油，含水丙二醇，N，N-二甲基甲酰胺等。所述药物组合物的实例包括无菌，等渗的，可以用可药用缓冲剂缓冲并是无热原的单-酰化胰岛素类似物的含水盐溶液。另外，非经胃肠给药的药物制剂可以含有防腐剂如间-甲酚或调整最终产物的pH的其它试剂如氢氧化钠或盐酸。

还可以将本发明的酰化胰岛素类似物配制成混合物。所述混合物制剂含有未酰化的胰岛素或胰岛素类似物，和酰化的胰岛素类似物。胰岛素或胰岛素类似物与酰化类似物的比例为1∶99到99∶1，以重量计。优选，比例为75∶25-25∶75；最佳为40∶60-60∶40；但最好是50∶50。通过将所需体积的组分混合在标准非经胃肠给药的制剂稀释剂中以制备混合物制剂。标准稀释剂包括等渗剂，锌，生理学耐受的缓冲剂和防腐剂。生理学耐受的缓冲剂优选是磷酸盐缓冲剂，如磷酸氢二钠。其它生理学耐受的缓冲剂包括TRIS或醋酸钠。缓冲剂的选择和浓度是本领域已知的。可药用防腐剂包括酚，间-甲酚，间苯二酚和对羟苯甲酸甲基酯。本发明的混合物制剂是特别有利的，因为相对速效胰岛素或胰岛素类似物以及单-酰化胰岛素类似物均可溶解在制剂中。因此，提供了可预测的作用时间模式。

下列制剂实施例仅是为了说明而不以任何方式限定本发明的范围。

制剂1

按如下制备非经胃肠给药的制剂：

                         数量酚                           30mM甘油                         16mg/ml酰化Lys^B28Pro^B29-人胰岛素  100U锌                           0.7％醋酸钠                       3.8mg/ml将上述组分的溶液注射给需要所述治疗的患者。

为了说明本发明化合物的效力，在有意识的狗模型中试验B28-N^ε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。用过夜禁食的有意识的体重为8-15kg的成年(1-2岁)雄性和雌性狗进行试验。在研究前至少10天，用异氟烷麻醉动物，在左或右腹沟切口。将硅橡胶导管插入到股动脉和近尾股静脉，然后用4-0丝线绑紧。用套针将导管的游离端经皮下通到背部。用甘油/肝素溶液(3∶1v/v；肝素终浓度为250KIU/ml)填充导管，将游离端打结，然后放在皮下囊中以使皮肤完全缝合。在手术前(20mg/kg，IV和20mg/kg，I.M)和手术后(250mg，p.o.每天一次，共7天)均施用头孢氨苄以防止感染。手术后施用torbugesic(1.5mg/kg，I.M)以控制疼痛。

在进行研究的那天抽血以确定动物的健康情况。只使用血细胞比容高于38％而且白细胞数少于16000/mm³的动物。在试验前的下午，从皮下囊中通过局部麻醉(2％利多卡因)作的一小切口将导管的游离端抽出，用固定用夹和颈套组合体将狗固定。

试验的早晨，抽吸导管中的内含物(在这些研究中仅使用导管线)，用盐水冲洗导管，将延伸线(由不锈钢外套保护的)与所述导管相连。将狗放在代谢笼中，将导管延伸线和外套与一旋转开关系统相连以使狗可以在笼周围自由走动。在15分钟的休息期后(45分钟，对照)，抽血(2-3.5ml)以确定血浆葡萄糖浓度。在15分钟后(0时)抽第二基线样品。在颈后皮下施用试验物质(磷酸盐缓冲的盐水或10.5mmol/kg的B28-N^ε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素；该剂量是1.75U/kg人胰岛素的摩尔等量)。

然后在以后的2(对照)-6(B28-Nε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素)小时，至少每隔30分钟取一次动脉血样品(2-3.5ml)。将样品收集在含EDTA二钠的真空血收集试管中，然后立即放在冰上。将样品离心，然后将所得的血浆转移到聚丙烯试验试管中，在冰上贮存或冷冻用于研究。

在试验结束时，麻醉(异氟烷)动物；用新鲜盐水冲洗导管，然后用甘油/肝素混合物填充；将导管的游离端打结，然后按前述放在皮下；施用抗生素(300mg头孢氨苄，I.M)。用贝克曼葡萄糖分析仪使用葡萄糖氧化酶方法确定研究那天的血浆葡萄糖浓度。数值列为均值±均值标准误差(SEM)。

在注射磷酸盐缓冲盐水后的2小时观察期内，血浆葡萄糖浓度与基线没有显著区别(表1)。在相同的时间期内，皮下施用B28-N^ε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素会使血浆葡萄糖浓度降低15％(17mg/dl)。在随后的4小时内，B28-N^ε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素治疗之动物的血浆葡萄糖浓度继续逐渐降低，在注射后6小时葡萄糖水平降到低于基线的41mg/dl(降到35％)。

从文献中知道，甚至在禁食后的一星期，正常狗的血浆葡萄糖浓度也不会明显降低。在所述研究中观察到的葡萄糖降低是由于施用了B28-N^ε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素，因此证实了该化合物的胰岛素样活性。

表1在皮下注射磷酸盐缓冲盐水(对照)或B28-N^ε-棕榈酰

Lys^B28Pro^B29-人胰岛素后的血浆葡萄糖的浓度。

         对照(n＝5)    B28-N^ε-棕榈酰-Lys^B28pro^B29-时间(分钟)    (mg/dL)      胰岛素(n＝1)(mg/dL)

-15       114±3               116

0         112±3               116

30        117±4               114

60        114±3               107

90        115±3               102

120       117±5                99

150                            101

180                            100

210                            100

240                             98

270                             87

300                             82

330                             79

360                             75

序列表(1)一般资料：

(I)申请人：Baker等人

(ii)发明题目：酰化的胰岛素类似物

(iii)序列数：2

(iv)相关地址：

    (A)受件人：Eli Lilly and Company.

               Patent Division/SPC

    (B)街道：Lilly公司中心

    (C)城市：印地安那波利斯

    (D)州：印地安那波利斯

    (E)国家：美国

    (F)邮政编码：46285

    (v)计算机可读形式：

    (A)介质类型：软盘，3.50英寸，1.4Mb内存

    (B)计算机：Macintosh

    (C)操作系统：Macintosh

    (D)软件：微软Word

(vi)当前申请资料：

    (A)申请号：

    (B)申请日：

    (C)分类号：

(vii)在先申请资料：

    (A)申请号：

    (B)申请日：

(viii)代理人/代理资料：

    (A)姓名：Steven P.Caltrider

    (B)登记号：36467

    (C)文档号：X9720

(ix)通讯资料：

    (A)电话：(317)276-0757

    (B)传真：(317)277-1917

   (C)电传：(2)SEQ ID NO：1的资料：

(I)序列特征：

  (A)长度：21个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：可变位点

  (B)位置：1

  (C)鉴定方法：

  (D)其它资料：“当SEQ ID NO：2位置1的Xaa是Phe，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，而SEQ IDNO：2位置29的Xaa是Lys或Pro时，SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly；或酰化Gly”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Xaa Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu1               5                  10                   15Glu Asn Tyr Cys Asn

         20(3)SEQ ID NO：2的资料：

(I)序列特征：

  (A)长度：30个氨基酸

  (B)类型：氨基酸

  (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：多肽

(ix)特征：

  (A)名称/关键词：可变位点

  (B)位置：1

  (C)鉴定方法：

  (D)其它资料：“当SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，而SEQ IDNO：2位置29的Xaa是Lys或Pro时，SEQ ID NO：2位置1的Xaa是Phe；或酰化Phe”

(ix)特征：

   (A)名称/关键词：可变位点

   (B)位置：28

   (C)鉴定方法：

   (D)其它资料：“当SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly，SEQ ID NO：2位置1的Xaa是Phe，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Pro时，SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，Ala；或酰化Lys”

(ix)特征：

   (A)名称/关键词：可变位点

   (B)位置：29

   (C)鉴定方法：

   (D)其它资料：“当SEQ ID NO：2位置28的Xaa是Asp，Lys，Leu，Val，或Ala，SEQ ID NO：1位置1的Xaa是Gly，SEQID NO：2位置1的Xaa是Phe时，SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Lys，Pro；或酰化Lys。”

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：Xaa Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr1               5                  10                  15Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Xaa Xaa Thr

         20                  25                  30

根据条约第19条修改时的声明

本申请的国际初步审查报告于1996年3月12日发出。根据《专利合作条约)》第19条的有关规定，申请人在此提交国际申请原始提交文本第23和24页的替换页(第23和24页)。(相当于该国际申请原始提交的中文本的权利要求书第1页)。

修改权利要求书是为了明确表明本发明胰岛素类似物是单酰化的。在说明书尤其是说明书第4页、第4-6行(相当于相应中文本的第3页第5行)的内容中有对所述修改的支持。根据第19条第2款规定，本发明所述修改没有超出原始国际申请的内容，因此，申请人请求提交所述国际申请原始提交文本的第23和24页的替换页(相当于中文本权利要求书第1页)。

权利要求书

按照条约第19条的修改

1.分子式如下的单-酰化胰岛素类似物：与SEQ ID NO：2适当交联的SEQ ID NO：1，或其可药用盐。

2.权利要求1的单-酰化胰岛素类似物，其中SEQ ID NO：2位置28的Xaa是酰化Lys，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Pro。

3.权利要求2的单-酰化胰岛素类似物，其中酰化基团是C₆-C₁₇脂肪酸。

4.权利要求2的单-酰化胰岛素类似物，其中酰化基团是C₁₃-C₁₇脂肪酸。

5.B28-N^ε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

6.B28-N^ε-肉豆蔻酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

7.非经胃肠给药的药物制剂，含有权利要求1-7中任一权项的单一酰化胰岛素类似物以及一种或多种可药用防腐剂，等渗剂或缓冲液。

8.非经胃肠给药的药物制剂，含有胰岛素或胰岛素类似物与权利要求1-7中任一权项的单一酰化胰岛素类似物的混合物，其中两种组分的重量比为约1-99∶99-1。

9.权利要求8的非经胃肠给药的药物制剂，其中混合物是Lys^B28Pro^B29-人胰岛素和B28-N^ε-酰化Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

10.治疗高血糖患者的方法，包括给所述患者施用一种药物组合物，所述组合物含有有效量的权利要求1-7中任一权项的单一酰化胰岛素类似物。

11.制备非经胃肠给药的药物制剂的方法，包括混合权利要求1-7中任一权项的化合物，等渗剂和生理学耐受的缓冲剂。

12.权利要求1-7中任一权项的用于治疗糖尿病的单一酰化胰岛素类似物。

13.基本上如任一实施例所述的单-酰化胰岛素类似物。

Claims (13)

1.分子式如下的单-酰化胰岛素类似物：与SEQ ID NO：2适当交联的SEQ ID NO：1，或其可药用盐。

2.权利要求1的胰岛素类似物，其中SEQ ID NO：2位置28的Xaa是酰化Lys，而SEQ ID NO：2位置29的Xaa是Pro。

3.权利要求2的酰化胰岛素类似物，其中酰化基团是C₆-C₁₇脂肪酸。

4.权利要求2的酰化胰岛素类似物，其中酰化基团是C₁₃-C₁₇脂肪酸。

5.B28-Nε-棕榈酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

6.B28-Nε-肉豆蔻酰Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

7.非经胃肠给药的药物制剂，含有权利要求1-7中任一权项的胰岛素类似物以及一种或多种可药用防腐剂，等渗剂或缓冲剂。

8.非经胃肠给药的药物制剂，含有胰岛素或胰岛素类似物与权利要求1-7中任一权项的酰化胰岛素类似物的混合物，其中两种组分的重量比为约1-99∶99-1。

9.权利要求8的非经胃肠给药的药物制剂，其中混合物是Lys^B28Pro^B29-人胰岛素和B28-Nε-酰化Lys^B28Pro^B29-人胰岛素。

10.治疗高血糖患者的方法，包括给所述患者施用一种药物组合物，所述组合物含有有效量的权利要求1-7中任一权项的酰化胰岛素类似物。

11.制备非经胃肠给药的药物制剂的方法，包括混合权利要求1-7中任一权项的化合物，等渗剂和生理学耐受的缓冲剂。

12.权利要求1-7中任一权项的用于治疗糖尿病的酰化胰岛素类似物。

13.基本上如任一实施例所述的酰化胰岛素类似物。