CN101784563B - 具有包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位的酰基部分的胰岛素 - Google Patents

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Abstract

当肺施用时，酰化胰岛素具有令人满意的性质，其中酰基部分与亲本胰岛素附着，并且其中所述酰基部分包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位，并且其中在亲本胰岛素中仅存在一个赖氨酸残基(K和Lys)。

Description

具有包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位的酰基部分的胰岛素
发明领域
本发明涉及新酰化胰岛素类似物及其相关方面。 
发明背景 
胰岛素是由胰的β细胞分泌的多肽激素。胰岛素由命名为A和B链的2条多肽链组成，所述A和B链通过2个链间二硫键连接在一起。在人、猪和牛胰岛素中，A和B链分别包含21和30个氨基酸残基。然而，从物种到物种，在2条链中的不同位置中存在的氨基酸残基中存在变异。基因工程的广泛使用已使得可能通过交换一个或多个氨基酸残基来制备天然存在的胰岛素的类似物。 
胰岛素用于治疗糖尿病和与之关联或起因于其的疾病。胰岛素在维持正常代谢调节中是必需的。通常，胰岛素通过注射施用。不幸的是，由于与维持葡萄糖水平的紧密控制所需的许多注射相关的不适，许多糖尿病患者不愿意采取强化治疗。在口部施用后，胰岛素在胃肠道中快速降解，并且不吸收到血流内。因此，已研究了用于施用胰岛素的可替代途径，例如口部、直肠、经皮和鼻途径。然而，迄今这些施用途径仍未导致足够有效的胰岛素吸收。 
数十年来，长效胰岛素制剂和速效胰岛素制剂都是可获得的，并且许多患者每天采取2-4次注射。在过去数十年中，已证明维持血糖水平的紧密控制对于糖尿病患者是极其重要的。 
蛋白质的有效肺递送依赖于将蛋白质递送给深层肺泡上皮的能力。沉积在上气道上皮中的蛋白质不吸收至显著程度。这是由于充当吸收屏障的上覆的粘液。此外，沉积在这个上皮上的蛋白质通过在气道上的粘膜纤毛输送清除，并且随后经由胃肠道消除。蛋白质不吸收并且相反由这些途径消除的程度依赖于其溶解度、其大小、以及其他了解较少的特征。肽的性质可以通过将有机链样分子嫁接到其上得到增强。此种嫁接可以改善药物性质例如在血清中的半衰期、针对蛋白水解降解的稳定性和减少的免疫原性。 
将于约2008年1月21日公开的国际专利申请号 PCT/EP2007/057321(我们的参考号：7460)描述了不含酰基基团的PEG化胰岛素。将于约2007年8月29日公开的国际专利申请号PCT/EP2007/(我们的参考号：7302)描述了具有不含亚烷基二醇部分的复合侧链的胰岛素。具有公开号WO 2006/082205的国际专利申请(我们的参考号：7142)描述了具有复合侧链的胰岛素。 
命名为MIH2的含糊定义的人胰岛素产物在Diabetes Technology&Therapeutics 4(2002)，459-66，和Metabolism 53(2004)，54-8中描述。类似和相关产物在美国专利6,858,580中描述。美国专利申请号2006/0183668在权利要求1中描述了其为天然存在的胰岛素或其类似物的胰岛素衍生物，其具有与亲本胰岛素的B链的N末端氨基酸残基的a-氨基或B链中存在的Lys残基的ε-氨基附着的侧链，侧链具有式-W-X-Y-Z，其各自如本文定义。 
定义 
此处，术语胰岛素包含天然存在的胰岛素，例如人胰岛素，以及其胰岛素类似物。 
此处，术语胰岛素类似物包含这样的多肽，其具有在形式上可以通过缺失和/或置换(替换)在天然胰岛素中存在的一个或多个氨基酸残基，而得自天然存在的胰岛素例如人胰岛素的结构的分子结构。优选地，置换的氨基酸残基是可编码氨基酸残基。此处，术语亲本胰岛素或亲本胰岛素类似物也用于胰岛素类似物。主要地，当与携带侧链的胰岛素类似物区分时，使用术语亲本，所述侧链例如可以通过酰化而化学引入。 
此处，术语如A1、A2、A3等分别指示在胰岛素A链中的位置1、2和3(从N末端计数)。类似地，术语如B1、B2、B3等分别指示在胰岛素B链中的位置1、2和3(从N末端计数)。使用关于氨基酸的单字母密码，术语如A21A、A21G和A21Q指定A21位置中的氨基酸分别是A、G和Q。使用关于氨基酸的三字母密码，相应表达分别是AlaA21、GlyA21和GlnA21。 
此处，术语如desB29和desB30分别指示缺乏B29或B30氨基酸残基的胰岛素类似物。 
胰岛素类似物中A和B链中的位置编号如此完成，从而使得在胰 岛素类似物和人胰岛素中具有相同编号的位置中存在的氨基酸残基之间存在最大同一性。 
此处，术语氨基酸残基包含从其中氢原子已从氨基中去除和/或羟基已从羧基中去除和/或氢原子已从巯基中去除的氨基酸。不精确地，氨基酸残基可以叫做氨基酸。 
此处，表达“可编码的”与术语如氨基酸、氨基酸残基、肽或肽残基结合用于指示可以由核苷酸三联体(“密码子”)编码的氨基酸、氨基酸残基、肽或肽残基，参见基因工程。 
此处，术语突变包含氨基酸序列中的任何改变(用可编码氨基酸的置换和插入以及缺失)。 
除非另有说明，本文提及的氨基酸都是L-氨基酸。 
关于速效胰岛素意指具有比常态或正常人胰岛素更快速的作用发作的胰岛素。 
关于与胰岛素结合的延长的作用概况以及术语基础胰岛素意指具有比常态或正常人胰岛素更长的作用持续时间的胰岛素。 
高物理稳定性意指小于人胰岛素那种的50％的原纤维形成趋势。原纤维形成可以通过在给定条件下起始的原纤维形成前的滞后时间描述。 
具有胰岛素受体和IGF-1受体亲和力的多肽是在合适的结合测定中能够与胰岛素受体和人IGF-1受体相互作用的多肽。此种受体测定是本领域众所周知的，并且在实施例中进一步描述。本发明的酰化胰岛素将不与IGF-1受体结合或将与所述受体具有相当低亲和力。更确切地，本发明的酰化胰岛素将具有与人胰岛素的那种基本上相同量级或更少的针对IGF-1受体的亲和力。 
为了方便起见，此处在氨基酸名称后在括号中为常见三字母密码和单字母密码：甘氨酸(Gly&G)、脯氨酸(Pro&P)、丙氨酸(Ala&A)、缬氨酸(Val&V)、亮氨酸(Leu&L)、异亮氨酸(Ile&I)、甲硫氨酸(Met&M)、半胱氨酸(Cys&C)、苯丙氨酸(Phe&F)、酪氨酸(Tyr&Y)、色氨酸(Trp&W)、组氨酸(His&H)、赖氨酸(Lys&K)、精氨酸(Arg&R)、谷氨酰胺(Gln&Q)、天冬酰胺(Asn&N)、谷氨酸(Glu&E)、天冬氨酸(Asp&D)、丝氨酸(Ser&S)和苏氨酸(Thr&T)。如果由于分型错误，存在与 常用密码的偏离，那么应用常用密码。在本发明的胰岛素中存在的氨基酸优选是可以由核酸编码的氨基酸。氨基酸如Glu和Asp可以为α、γ、L或D形式。 
在说明书和实施例中已使用下述缩写：Da是道尔顿(分子量)，kDa是千道尔顿(＝1000Da)，Mw是分子量，OSu是1-琥珀酰亚胺氧基＝2，5-二氧吡咯烷-1-基氧，RT是室温，SA是芥子酸和Su是1-琥珀酰亚胺基＝2，5-二氧吡咯烷-1-基，TFA是三氟乙酸，DCM是二氯甲烷，NMP是N-甲基吡咯烷酮(1-甲基-2-吡咯烷酮)，tBu是叔丁基，OTBU是叔丁氧基，DIEA(和DIPEA)是N，N-二异丙基乙胺，TSTU是N，N，N’，N’-四甲基-O-(N-琥珀酰亚胺基)脲阳离子四氟硼酸盐，Tris是三(羟甲基)氨基甲烷，CV是柱体积，OEG是氨基酸8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(8-amino-3，6-dioxaoctanoic acid)，HSA是人血清清蛋白，TNBS是2，4，6-三硝基苯磺酸，HOBT(或HOBt)是1-羟基苯并三唑，HOAt是1-羟基-7-氮杂苯并三唑，NaOH是氢氧化钠，DMF是N，N-二甲基甲酰胺，THF是四氢呋喃，TFA是三氟乙酸，mmol是毫摩尔，Fmoc是芴-9-基甲氧羰基，OEG是8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(或其残基)，gGlu(此处也叫做γGlu)是γ-谷氨酸，并且在实施例11中，为了简便，下述注释用于指定本发明和现有技术的胰岛素的酰基部分序列：C16是十六烷二酰(hexadecanedioyl)，C17是十七烷二酰(heptadecanedioyl)，C18是十八烷二酰(octadecanedioyl)，C20是二十烷二酰(eicosanedioyl)，gGlu是γ-谷氨酸，PEG3是3-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)丙酸，PEG5是3-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}丙酸和PEG7是3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]乙氧基}乙氧基)乙氧基]丙酸(完整结构/序列可以在实施例中找到)。 
发明目的 
本发明的目的是克服或改善现有技术的至少一个缺点，或提供有用的替代物。 
本发明的一个目的是提供具有良好生物利用率的胰岛素衍生物。 
本发明的一个方面是改善胰岛素通过人组织的吸收。 
本发明的另一个目的是提供可以肺施用的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个方面是改善胰岛素的体内半衰期。 
本发明的另一个方面是发现具有增加的效力的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个方面是发现具有令人满意的物理稳定性的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个方面是发现具有令人满意的化学稳定性的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个方面是发现具有令人满意的蛋白水解稳定性的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个方面是发现具有令人满意的溶解度的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个目的是提供具有延长的作用概况的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个目的是提供作为基础胰岛素有用的胰岛素衍生物。 
本发明的另一个目的是提供具有高胰岛素受体结合亲和力的胰岛素衍生物。 
发明概述 
简言之，本发明涉及酰化胰岛素，其中酰基部分与亲本胰岛素附着，并且其中所述酰基部分包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位。在另一个方面，本发明涉及酰化胰岛素，其中酰基部分是通式(I)的基团：Acy-AA1n-AA2m-AA3p-，其中n是0或1-3的整数，m是0或1-6的整数，p是2-30的整数，Acy是包括8-24个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除，AA1是中性环状氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除，并且在形式上氢原子已从氨基中去除，AA2是酸性氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除，并且在形式上氢原子已从氨基中去除，AA3是中性、包含亚烷基二醇的氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除，并且在形式上氢原子已从氨基中去除，并且Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键。 
优选实施方案描述 
令人惊讶的是，本发明的酰化胰岛素显示良好生物利用率。 
本发明的酰化胰岛素可以在形式上由胰岛素和具有集体公式(I)的包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位的酰基部分构建，即Acy-AA1n-AA2m-AA3p-，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如本文定义(例如，通过形式上去除来自胰岛素中的氨基的氢原子且使其与式(I)的侧链附着)。 
在本发明的酰化胰岛素中，包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位且具有式(I)的酰基部分与亲本胰岛素中存在的赖氨酸残基的ε氨基连接。例如，包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位且具有式(I)的酰基部分可以与亲本胰岛素的B29或B30位置中的赖氨酸残基连接。 
式(I)即Acy-AA1n-AA2m-AA3p-的基团中存在的酰基源于脂肪酸或脂肪二酸。 
此处，术语“脂肪酸”包含具有至少2个碳原子且饱和或不饱和的线性或分支、脂族羧酸。脂肪酸的非限制性例子是肉豆蔻酸、棕榈酸和硬脂酸。 
此处，术语“脂肪二酸”包含具有至少2个碳原子且饱和或不饱和的线性或分支、脂族二羧酸。脂肪二酸的非限制性例子是琥珀酸、己二酸、辛二酸、癸二酸、十二烷二酸、十四烷二酸、十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸和二十烷二酸。 
如本文提及的，其中AA1、AA2和AA3在具有式(I)(Acy-AA1n-AA2m-AA3p-)的酰基部分中出现的次序可以独立地互换。因此，式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-还包含部分如例如式Acy-AA2m-AA1n-AA3p-和式Acy-AA3p-AA2m-AA1n-，其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如本文定义。 
指定为AA1的与部分相关的中性环状氨基酸是包含饱和6-元碳环、任选包含氮杂原子的氨基酸，并且优选地环是环己烷环或哌啶环。优选地，这种中性环状氨基酸的分子量在约100至约200Da的范围中。 
指定为AA2的与部分相关的酸性氨基酸是包含2个羧酸基团和1个伯或仲氨基、具有最高达约200Da的分子量的氨基酸。 
指定为AA3的与部分相关的中性、包含亚烷基二醇的氨基酸是在一个末端处包含羧酸官能团和在另一个末端处包含氨基官能团的亚烷基二醇部分，任选寡或聚亚烷基二醇部分。 
此处，术语亚烷基二醇部分包含寡和聚亚烷基二醇部分以及单亚烷基二醇部分。聚亚烷基二醇包括基于聚乙二醇、基于聚丙二醇和基于聚亚丁基二醇的链，即基于重复单位-CH2CH2O-、-CH2CH2CH2O-或-CH2CH2CH2CH2O-的链。亚烷基二醇部分可以是单分散(具有定义明确的长度/分子量)以及多分散(具有定义较不明确的长度/平均分子量)。单亚烷基二醇部分包括在每个末端处包含不同基团的-OCH2CH2O-、-OCH2CH2CH2O-或-OCH2CH2CH2CH2O-。 
部分Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接在形式上通过酰胺(肽键)形成(-CONH-)而获得。 
本发明的酰化胰岛素中存在的亲本胰岛素的具体例子是下述(此处，但须氢原子已加入氨基中)：人胰岛素；desB30人胰岛素；B28D人胰岛素；B28D，desB30人胰岛素；B28K，B29P人胰岛素和B3K，B29E人胰岛素。 
与本发明的酰化胰岛素中存在的亲本胰岛素中存在的赖氨酸残基中的ε氨基附着的式Acy-AA1n-AA2m-AA3p-的酰基部分的具体例子是下述： 
式(I)(Acy-AA1n-AA2m-AA3p-)的酰基部分的上述非限制性具体例子中的任何一种都可以与胰岛素的上述非限制性具体例子的任何一种中存在的赖氨酸残基的ε氨基附着，从而给出本发明的酰化胰岛素的进一步具体例子。 
亲本胰岛素可以以本身已知的方式进行制备。例如，它们可以通过如例如EP 1,246,845中公开的众所周知技术，在合适的宿主细胞中表达编码所讨论的单链胰岛素的DNA序列进行生产。胰岛素在转化的宿主细胞中作为前体分子表达，所述前体分子通过酶促和化学体外过程转化成所需胰岛素分子，如例如EP 163,529和EP 214,826中公开的。前体分子可以与N末端延伸一起表达，所述N末端延伸随后如 例如EP 1246,845中公开的切割。在本发明中合适类型的N末端延伸的例子例如公开于美国专利号5,395,922和EP专利号765,395中。更具体而言，可以参考WO 2006/082205，从第37页第31行到第39页第29行。 
本发明的酰化胰岛素可以以基本上不含锌的化合物的形式或以锌络合物的形式提供。当提供本发明的酰化胰岛素的锌络合物时，2个Zn2+离子、3个Zn2+离子或4个Zn2+离子可以与每个胰岛素六聚物结合。本发明的酰化胰岛素的锌络合物溶液将包含此种种类的混合物。 
在进一步方面，本发明涉及药物组合物，其包括治疗有效量的本发明的酰化胰岛素连同药学上可接受的载体，所述药物组合物可以用于治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态。本发明的酰化胰岛素可以用于制造药物组合物，用于在治疗1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态中使用。此种组合物以本身已知的方式进行制备。 
在本发明的进一步方面，提供了用于治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的药物组合物，其包括与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的治疗有效量的本发明的酰化胰岛素，连同药学上可接受的载体和添加剂。 
在进一步方面，本发明涉及用于治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的肺应用，其包括任选与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的、治疗有效量的本发明的酰化胰岛素，连同药学上可接受的载体和添加剂。 
在一个方面，本发明提供了药物组合物，其为本发明的酰化胰岛素以及选自AspB28人胰岛素；LysB28ProB29人胰岛素和LysB3GluB29人胰岛素的速效胰岛素类似物的混合物。 
本发明的酰化胰岛素和速效胰岛素类似物可以以约90/10％；约70/30％或约50/50％的比混合。 
在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的方法，其包括给患者施用治疗有效量的本发明的酰化胰岛素，连同药学上可接受的 载体和药学上可接受的添加剂。 
在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的1型糖尿病、2型糖尿病和引起高血糖症的其他状态的方法，其包括给患者施用与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的治疗有效量的本发明酰化胰岛素，连同药学上可接受的载体和药学上可接受的添加剂。 
在本发明的进一步方面，提供了用于治疗在需要此种治疗的患者中的糖尿病的药物组合物，其包括与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的治疗有效量的本发明酰化胰岛素，连同药学上可接受的载体。 
在本发明的进一步方面，提供了预期用于肺施用的根据本发明的药物组合物。 
在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的糖尿病的方法，其包括给患者施用治疗有效量的根据权利要求1的酰化胰岛素，连同药学上可接受的载体。 
在本发明的进一步方面，提供了治疗在需要此种治疗的患者中的糖尿病的方法，其包括给患者施用与具有作用的快速发作的胰岛素或胰岛素类似物混合的、治疗有效量的根据权利要求1的酰化胰岛素，连同药学上可接受的载体。 
在进一步方面，本发明涉及本发明的酰化胰岛素，其具有如本文描述的胰岛素受体结合亲和力，在HSA的存在下(例如在0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％或4.5％HSA的存在下)测量的，相对于人胰岛素，所述结合亲和力为＞1％、更优选＞1.2％、更优选＞1.5％、更优选＞1.75％。 
在进一步方面，本发明涉及本发明的酰化胰岛素，其具有在本文描述的大鼠夹钳(clamp)实验中测定的效力，相对于人胰岛素，所述效力为＞40％、更优选＞45％、更优选＞50％、更优选＞55％、更优选＞60％、更优选＞65％、更优选＞70％、更优选＞75％。 
在进一步方面，本发明涉及本发明的酰化胰岛素，其具有与人胰岛素的那种基本上相似的总体疏水性。 
在进一步方面，本发明的酰化胰岛素具有疏水指数k′rel，其为约0.02-约10，约0.1-约5；约0.5-约5；约0.2-约2；约0.2- 约1；约0.1-约2；或约0.5-约2。相对于人胰岛素，本发明的酰化胰岛素的疏水性(疏水指数)k′rel，通过在40℃下的等度洗脱在LiChrosorb RP18(5μm，250x4mm)HPLC柱上进行测量，其中使用A)包含10％乙腈的0.1M磷酸钠缓冲液，pH 7.3，和B)溶于水的50％乙腈的混合物作为洗脱剂。通过跟踪洗脱物在214nm处的UV吸收监控洗脱。通过注射0.1mM硝酸钠发现空隙时间(void time)t0。通过改变A和B溶液之间的比，使关于人胰岛素的保留时间t人调整为至少2t0。k′rel＝(t衍生物-t0)/(t人-t0)。 
在另一个方面，本发明涉及包括本发明的酰化胰岛素的药物组合物，其在生理pH值下是可溶的。 
在另一个方面，本发明涉及包括本发明的酰化胰岛素的药物组合物，其在约6.5至约8.5的间隔中的pH值下是可溶的。 
在另一个方面，本发明涉及具有延长的作用概况的药物组合物，其包括本发明的酰化胰岛素。 
在另一个方面，本发明涉及这样的药物组合物，其为包含约120nmol/ml-约2400nmol/ml、约400nmol/ml-约2400nmol/ml、约400nmol/ml-约1200nmol/ml、约600nmol/ml-约2400nmol/ml、或约600nmol/ml-约1200nmol/ml本发明的酰化胰岛素或本发明的酰化胰岛素连同速效胰岛素类似物的混合物的溶液。 
本发明化合物的用途 
施用途径可以是使本发明的化合物有效转运到身体中的所需或合适位置的任何途径，例如肠胃外，例如，皮下、肌内或静脉内。可替代地，本发明的化合物可以经口、肺或鼻施用。 
对于肠胃外施用，本发明的化合物与已知胰岛素的制剂类似地配制。此外，对于肠胃外施用，本发明的化合物与已知胰岛素的施用类似地施用，并且医生熟悉这种程序。 
肠胃外施用可以借助于注射器，任选笔样注射器来执行。可替代地，肠胃外施用可以借助于输注泵来执行。 
本发明的化合物的可注射组合物可以使用制药工业的常规技术进行制备，所述常规技术涉及适当时使成分溶解且混合，以给出所需最终产物。因此，根据一个程序，本发明的化合物溶解于略微少于待 制备的组合物的最终体积的水量中。根据需要添加等渗剂、防腐剂和缓冲剂，并且根据需要，若需要则使用酸例如盐酸或碱例如含水氢氧化钠调整溶液的pH值。最后，用水调整溶液的体积，以给出成分的所需浓度。 
更精确地，本发明的胰岛素制剂，例如溶液或悬浮液，可以通过在微酸性条件下以例如约240至约1200nmole/ml的浓度，使本发明的化合物溶解于含水介质中进行制备。含水介质例如用氯化钠或甘油制成等渗的。此外，含水介质可以包含浓度最高达约20μg Zn++/单位胰岛素活性的锌离子、缓冲液例如乙酸盐和柠檬酸盐以及防腐剂例如间甲酚或苯酚。溶液的pH值朝向中性进行调整，无需太接近本发明的化合物的等电点，以避免沉淀。最终胰岛素制剂的pH值依赖于任选地在本发明的化合物中已改变的电荷数目、锌离子浓度、本发明的化合物的浓度和选择的本发明的化合物。胰岛素制剂例如通过过滤除菌制成无菌的。 
本发明的胰岛素制剂与已知胰岛素制剂的用途类似地使用。 
待施用的本发明化合物的量、如何频繁施用本发明化合物的确定、和任选连同另一种抗糖尿病化合物施用的本发明一种或多种化合物的选择，在与熟悉糖尿病治疗的从业者的咨询中决定。 
因此，本发明还涉及治疗糖尿病的方法，其包括给需要此种治疗的患者施用有效量的本发明的化合物。 
药物组合物 
本发明的酰化胰岛素可以皮下、经口或肺施用。 
对于皮下施用，本发明的酰化胰岛素与已知胰岛素制剂类似地配制。此外，对于皮下施用，本发明的酰化胰岛素与已知胰岛素的施用类似地施用，并且一般地，医生熟悉这种程序。 
本发明的酰化胰岛素可以通过吸入以有效增加循环胰岛素水平和/或降低循环葡萄糖水平的剂量进行施用。此种施用可以有效用于治疗病症例如糖尿病或高血糖症。达到胰岛素的有效剂量需要施用在约0.5μg/kg至约50μg/kg范围中的本发明酰化胰岛素的吸入剂量。治疗有效量可以通过博知的从业者进行确定，所述从业者将考虑包括胰岛素水平、血糖水平、患者的身体健康状况、患者的肺状态等的因素。 
本发明的酰化胰岛素可以通过吸入进行递送，以达到其缓慢吸收 和/或减少的全身清除。当比较相似颗粒大小和相似水平的肺沉积时，不同吸入设备一般提供类似药物代谢动力学。 
本发明的酰化胰岛素可以通过本领域已知用于通过吸入施用治疗剂的多种吸入设备中的任何一种进行递送。这些设备包括计量剂量吸入器、喷洒器、干粉发生器、喷雾器等。优选地，本发明的酰化胰岛素通过干粉吸入器或喷雾器进行递送。存在用于施用本发明的酰化胰岛素的吸入设备的几种所需特征。例如，通过吸入设备的递送有利地是可靠、可重复且精确的。对于良好适合呼吸性，吸入设备应递送小颗粒或气溶胶，例如小于约10μm，例如约1-5μm。适合于实践本发明的商购可得吸入设备的一些具体例子是Cyclohaler、TurbohalerTM(Astra)、 (Glaxo)、 (Glaxo)、SpirosTM吸入器(Dura)、由Inhale Therapeutics销售的设备、AERxTM(Aradigm)、 喷洒器(Mallinckrodt)、Acorn 喷洒器(Marquest MedicalProducts)、 计量剂量吸入器(Glaxo)、 粉末吸入器(Fisons)等。 
如本领域技术人员将认识到的，本发明的酰化胰岛素制剂、递送的制剂量和单剂的施用持续时间依赖于采用的吸入设备类型。对于一些气溶胶递送系统，例如喷洒器，施用频率和系统激活的时间长度将主要依赖于气溶胶中的本发明的酰化胰岛素浓度。例如，较短的施用时间段可以在喷洒器溶液中更高浓度的本发明的酰化胰岛素下使用。设备例如计量剂量吸入器可以产生更高的气溶胶浓度，并且可以操作更短时间段，以递送所需量的本发明的酰化胰岛素。设备例如粉末吸入器递送活性剂直至给定装填量的试剂从设备中排出。在这种类型的吸入器中，在给定量粉末中的本发明的胰岛素酰化胰岛素量决定在单次施用中递送的剂量。 
就胰岛素使其进入肺内并且优选进入下气道或肺泡内的能力而言，在通过吸入设备递送的制剂中本发明的酰化胰岛素的颗粒大小是关键的。优选地，本发明的酰化胰岛素如此配制，从而使得递送的至少约10％本发明的酰化胰岛素沉积在肺中，优选约10至约20％或更多。通过吸入递送的酰化胰岛素的颗粒具有优选小于约10μm、更优选约1μm至约5μm的颗粒大小。选择酰化胰岛素的制剂，以在选择的吸入设备中产生所需颗粒大小。 
对于作为干粉施用有利地，本发明的酰化胰岛素以具有小于约10μm、优选约1μm至约5μm的颗粒大小的微粒形式进行制备。优选颗粒大小对于递送至患者肺的肺泡有效。优选地，干粉在很大程度上由产生的颗粒组成，从而使得大多数颗粒具有所需范围中的大小。有利地，至少约50％的干粉由具有小于约10μm直径的颗粒制成。此种制剂可以通过溶液的喷雾干燥、研磨、微粉化或临界点冷凝来达到，所述溶液包含本发明的酰化胰岛素和其他所需成分。也适合于产生在本发明中有用的颗粒的其他方法是本领域已知的。 
颗粒通常在容器中与干粉制剂分开，并且随后经由载体气流转运到患者的肺内。一般地，在目前的干粉吸入器中，用于破碎固体的力量通过患者的吸入单独提供。在另一种类型的吸入器中，由患者的吸入产生的气流激活使颗粒解凝集的叶轮发动机。 
用于从干粉吸入器施用的本发明的酰化胰岛素制剂一般包括包含衍生物的精细分开的干粉，但粉末还可以包括填充剂、载体、赋形剂、另一种添加剂等。添加剂可以包括在酰化胰岛素的干粉制剂中，例如以根据需要稀释粉末用于从特定粉末吸入器递送，以促进制剂的处理，以给制剂提供有利的粉末性质，以促进粉末从吸入设备分散，以稳定制剂(例如，抗氧化剂或缓冲剂)，以给制剂提供味道等。有利地，添加剂不会不利地影响患者的气道。酰化胰岛素可以与添加剂在分子水平下混合，或固体制剂可以包括与添加剂颗粒混合或在添加剂颗粒上包被的酰化胰岛素颗粒。一般的添加剂包括单糖、二糖和多糖；糖醇和其他多元醇，例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、拉克替醇(lactitol)、麦芽糖醇(maltitol)、海藻糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉或其组合；表面活性剂，例如山梨糖醇、二磷脂酰胆碱或卵磷脂；等。一般地，添加剂例如填充剂以对于上述目的有效的量存在，通常为制剂的约50重量％至约90重量％。本领域已知用于配制蛋白质例如胰岛素类似物蛋白质的另外试剂也可以包括制剂中。 
包括本发明的酰化胰岛素的喷雾可以通过在压力下迫使酰化胰岛素的悬浮液或溶液通过喷嘴来产生。可以选择喷嘴大小和结构、应用的压力和液体进料速度，以达到所需输出和颗粒大小。电喷雾可以例如通过与毛细管或喷嘴进料结合的电场来产生。有利地，通过喷雾器递送的胰岛素缀合物的颗粒具有小于约10μm、优选在约1μm至约 5μm范围中的颗粒大小。 
适合于与喷雾器一起使用的本发明的酰化胰岛素制剂一般将包括在约1mg至约500mg酰化胰岛素/ml溶液的浓度下在水溶液中的本发明的酰化胰岛素。依赖于选择的酰化胰岛素和医学顾问已知的其他因素，上限可以更低，例如450、400、350、300、250、200、150、120、100或50mg酰化胰岛素/ml溶液。制剂可以包括试剂例如赋形剂、缓冲剂、等渗剂、防腐剂、表面活性剂和优选地锌。制剂还可以包括赋形剂或用于稳定酰化胰岛素的试剂，例如缓冲剂、还原剂、填充蛋白质或碳水化合物。在配制胰岛素缀合物中有用的填充蛋白质包括清蛋白、鱼精蛋白等。在配制酰化胰岛素中有用的一般碳水化合物包括蔗糖、甘露糖醇、乳糖、海藻糖、葡萄糖等。本发明的酰化胰岛素制剂还可以包括表面活性剂，其可以减少或阻止通过溶液在形成气溶胶中的喷雾引起的表面诱导的胰岛素缀合物聚集。可以采用各种常规表面活性剂，例如聚氧乙烯脂肪酸酯和醇类、和聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯。量一般将为制剂的约0.001至约4重量％范围。 
包含本发明的酰化胰岛素的药物组合物还可以肠胃外施用于需要此种治疗的患者。肠胃外施用可以通过皮下、肌内或静脉内注射，借助于注射器任选地笔样注射器来执行。可替代地，肠胃外施用可以借助于输注泵来执行。 
本发明的酰化胰岛素的可注射组合物可以使用制药工业的常规技术进行制备，所述常规技术涉及适当时使成分溶解且混合，以给出所需最终产物。因此，根据一个程序，酰化胰岛素溶解于略微少于待制备的组合物的最终体积的水量中。根据需要添加锌(Zink)、等渗剂、防腐剂和/或缓冲剂，并且根据需要，若需要则使用酸例如盐酸或碱例如含水氢氧化钠调整溶液的pH值。最后，用水调整溶液的体积，以给出成分的所需浓度。 
在本发明的进一步实施方案中，缓冲剂选自乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二[羟乙基]甘氨酸(bicine)、N-[2-羟-1，1-二羟甲基乙基]甘氨酸(tricine)、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、延胡索酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲剂中的每一种构成本发明的可替代实施方案。 
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包括药学上可接受的防腐剂，其可以选自苯酚、邻甲酚、间甲酚、对甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲醇、氯代丁醇和硫柳汞、溴硝丙二醇、苯甲酸、咪唑烷基脲、氯己定、脱氢乙酸钠、氯甲酚、对羟基苯甲酸乙酯、氯化苄乙铵、氯苯甘油醚(3-(4-氯苯氧基)-1，2-丙二醇)或其混合物。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约0.1mg/ml至20mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约0.1mg/ml至5mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约5mg/ml至10mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，防腐剂以约10mg/ml至20mg/ml的浓度存在。这些具体防腐剂中的每一种构成本发明的可替代实施方案。防腐剂在药物组合物中的使用对于本领域技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：The Science andPractice of Pharmacy，第19版，1995。 
在本发明的进一步实施方案中，制剂进一步包括等渗剂，其可以选自盐(例如，氯化钠)、糖或糖醇、氨基酸(例如，L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸或苏氨酸)、糖醇(例如甘油(丙三醇)、1，2-丙二醇(丙二醇)、1，3-丙二醇或1，3-丁二醇)、聚乙二醇(例如，PEG400)或其混合物。可以使用任何糖，例如单糖、二糖或多糖，或水溶性葡聚糖，包括例如果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、支链淀粉、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉和羧甲基纤维素-Na。在一个实施方案中，糖添加剂是蔗糖。糖醇定义为具有至少一个-OH基团的C4-C8烃，并且包括例如，甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇、半乳糖醇、卫矛醇、木糖醇和阿拉伯糖醇。在一个实施方案中，糖醇添加剂是甘露糖醇。上文提及的糖或糖醇可以个别或组合使用。关于使用的量无固定限制，只要糖或糖醇在液体制剂中是可溶的，并且不会不利地影响使用本发明的方法达到的稳定作用。在一个实施方案中，糖或糖醇浓度是约1mg/ml至约150mg/ml。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约1mg/ml至50mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约1mg/ml至7mg/ml的浓度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约8mg/ml至24mg/ml的浓 度存在。在本发明的进一步实施方案中，等渗剂以约25mg/ml至50mg/ml的浓度存在。这些具体等渗剂中的每一种构成本发明的可替代实施方案。等渗剂在药物组合物中的使用对于本领域技术人员是众所周知的。为了方便，参考Remington：The Science and Practice ofPharmacy，第19版，1995。 
一般的等渗剂是氯化钠、甘露糖醇、二甲砜和甘油，并且一般的防腐剂是苯酚、间甲酚、对羟基苯甲基甲酯和苯甲醇。 
合适缓冲剂的例子是乙酸钠、甘氨酰甘氨酸、HEPES(4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸)和磷酸钠。 
用于本发明的酰化胰岛素的鼻施用的组合物可以例如如欧洲专利号272097中所述制备。 
包含本发明的酰化胰岛素的组合物可以在治疗对胰岛素敏感的状态中使用。因此，它们可以用于治疗1型糖尿病、2型糖尿病和高血糖症，例如，如有时在严重损伤的人和已经历大外科手术的人中可见。用于任何患者的最佳剂量水平将依赖于多种因素，包括采用的具体胰岛素衍生物的功效，患者的年龄、体重、身体活动性和饮食，与其他药物的可能组合，和待治疗状态的严重程度。推荐本发明的酰化胰岛素的日剂量通过本领域技术人员以与关于已知胰岛素组合物相似的方式对于每个个别患者进行确定。 
本发明的重要特征 
总之，本发明的一些特征如下： 
1.酰化胰岛素，其中酰基部分经由酰胺键(-CONH-)与亲本胰岛素附着，并且其中所述酰基部分包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位，并且其中在亲本胰岛素中仅存在一个赖氨酸残基(K和Lys)，所述酰基部分与所述赖氨酸残基中的ε氨基连接。 
2.根据条款1的酰化胰岛素，其中酰基部分是通式(I)的基团： 
Acy-AA1n-AA2m-AA3p-  (I)， 
其中 
n是0或1-3的整数， 
m是0或1-6的整数， 
p是2-30的整数 
Acy是包括8-24个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸，从其中在形式上 羟基已从脂肪酸中去除，以及在形式上羟基已从脂肪二酸的羧基之一中去除， 
AA1是中性环状氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除， 
AA2是酸性氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除， 
AA3是中性、包含亚烷基二醇的氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除， 
其中AA1、AA2和AA3在式I的基团中出现的次序可以独立地互换， 
Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键。 
3.根据条款1的酰化胰岛素，其中酰基部分是通式(I)的基团： 
Acy-AA1n-AA2m-AA3p-  (I)， 
其中 
n是0或1-3的整数， 
m是0或1-6的整数， 
p是2-30的整数 
Acy是包括8-24个碳原子的脂肪酸或脂肪二酸，从其中在形式上羟基已从脂肪酸中去除，以及在形式上羟基已从脂肪二酸的羧基之一中去除， 
AA1是中性环状氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除， 
AA2是酸性氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除， 
AA3是中性、包含亚烷基二醇的氨基酸，从其中在形式上羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除， 
Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺(肽)键。 
4.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中n是0或1。 
5.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中m是1。 
6.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中p是2-20、优选2-10、更优选2-4，并且具体地2、3、4、10、20或30。 
7.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中酰基部分是具 有下述通式之一的通式(I)的基团：Acy-AA1-AA2-AA3-AA3-、Acy-AA2-AA3-AA3-、Acy-AA2-AA3-AA3-AA3-、Acy-AA2-AA3-AA3-AA3-AA3-或Acy-AA3-AA3-AA2，其中Acy、AA1、AA2和AA3各自如本文定义。 
8.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中Acy包含14-20个碳原子，优选16-20个碳原子、更优选16-18个碳原子、可替代地18-20个碳原子，并且具体地10、12、14、16、17、18、20或22个碳原子。 
9.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中Acy包含16-20个碳原子。 
10.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中Acy是从其中在形式上羟基已从羧基之一中去除的脂肪二酸。 
11.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中Acy是从其中羟基已从羧基之一中去除的十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸。 
12.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中AA1是 
从其中羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除，并且其中q是0、1、2、3或4。 
13.根据前述可能条款的酰化胰岛素，其中AA1是 
从其中羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除。 
14.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中AA2是Glu(α或γ、L或D)、Asp(α或β、L或D)， 
从其中羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除，并且其中箭标指示与AA2或AA3的氨基的附着点。 
15.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中AA2是γ-L-GIu(也注明为：γGlu)，从其中羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除。 
16.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中AA3是： 
从其中在形式上羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除。 
17.根据前述条款的酰化胰岛素，其中AA3是： 
从其中羟基已从羧基中去除和氢原子已从氨基中去除。 
18.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中亲本胰岛素是人胰岛素；desB30人胰岛素；B28D人胰岛素；B28D，desB30人胰岛素；B28K，B29P人胰岛素和B3K，B29E人胰岛素。 
19.根据前述条款的酰化胰岛素，其中亲本胰岛素是人胰岛素；desB30人胰岛素；B28D人胰岛素和B28D，desB30人胰岛素。 
20.根据前述条款的酰化胰岛素，其中亲本胰岛素是desB30人胰岛素。 
21.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中亲本胰岛素由51个氨基酸残基组成。 
22.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中亲本胰岛素由50个氨基酸残基组成。 
23.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中亲本胰岛素是人胰岛素。 
24.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在亲本胰岛素的位置B3中的氨基酸残基是K(Lys)，并且在亲本胰岛素的位置B29中的氨基酸残基是E(Glu)。 
25.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在亲本胰岛素的位置B28中的氨基酸残基是D(Asp)。 
26.根据前述除最后一项外可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在位置B28中的氨基酸是K，并且在位置B29中的氨基酸是P。 
27.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在亲本胰岛素的位置B29中的氨基酸残基是Lys。 
28.根据前述除最后一项外可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在亲本胰岛素的位置B29中的氨基酸残基是E或P(Glu或Pro)。 
29.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在亲本胰岛素的位置B30中不存在氨基酸残基(即，desB30胰岛素)。 
30.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在亲本胰岛 素中的所有氨基酸残基是可编码氨基酸的残基。 
31.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中在亲本胰岛素中的仅1个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的氨基酸残基。 
32.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中精确地在亲本胰岛素中的2个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的氨基酸残基。 
33.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中精确地在亲本胰岛素中的3个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的氨基酸残基。 
34.根据前述可能条款中任一项的酰化胰岛素，其中精确地在亲本胰岛素中的4个氨基酸残基偏离人胰岛素中存在的氨基酸残基。 
35.根据前述可能产品条款中任一项的酰化胰岛素，其用于作为药物使用、用于在药物中使用或用于在药物制备中使用。 
36.根据前述可能产品条款中任一项的酰化胰岛素，其用于治疗糖尿病，或根据前述可能产品条款中任一项的酰化胰岛素用于制备用于治疗糖尿病的药物的用途。 
37.本文描述的任何新特征或特征组合。 
使本文描述的一个或多个实施方案、任选地以及下文权利要求中的一项或多项组合，导致进一步的实施方案，并且本发明涉及所述实施方案和权利要求的所有可能组合。 
本文引用的所有参考文献，包括出版物、专利申请和专利均在此整体引入作为参考，并且其程度与每个参考文献个别且特别指出引入作为参考并且在本文中整体阐述一样(至法律允许的最大程度)。 
所有标题和子标题在本文中都仅为了方便而使用，并且不应解释为以任何方式限制本发明。 
本文提供的任何和所有例子或示例性语言(例如，“例如”)的使用仅意欲更好地举例说明本发明，并且除非另有说明，否则不对本发明的范围造成限制。说明书中的语言不应解释为将任何非请求保护的要素表示为本发明实践所必需的。 
本文专利文件的引用和引入仅为了方便而完成，并且不反映此种专利文件的任何有效性、专利性和/或可实施性观点。参考文献在本文中的提及并非承认它们构成现有技术。 
此处，单词“包含”应广泛地解释为意指“包括”、“含有”或“包含” (EPO指南C 4.13)。 
本发明包括如由可应用法律允许的与之附着的权利要求中叙述的主题的所有修饰和等同方案。 
下述实施例为了举例说明提供，而不是为了限制。 
实施例
一般程序： 
本发明的表达载体构建、酵母细胞转化和胰岛素前体表达
所有表达质粒都是C-POT类型的，类似于EP 171142中描述的那些，其特征在于包含粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)丙糖磷酸异构酶基因(POT)用于在啤酒糖酵母(S.cerevisiae)中的质粒选择和稳定目的。质粒还包含啤酒糖酵母丙糖磷酸异构酶启动子和终止子。这些序列类似于质粒pKFN1003(WO 90/10075中描述)中的相应序列，因为是除编码前导区和胰岛素产物的融合蛋白的EcoRI-XbaI片段的序列外的所有序列。为了表达不同的融合蛋白，pKFN1003的EcoRI-XbaI片段通过编码目的前导区-胰岛素融合物的EcoRI-XbaI片段简单地替换。此种EcoRI-XbaI片段可以根据标准技术使用合成寡核苷酸和PCR来合成。 
酵母转化体通过转化宿主菌株啤酒糖酵母菌株MT663(MATa/MATa pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi::LEU2/tpi::LEU2 Cir+)进行制备。酵母菌株MT663与提交WO 92/11378结合保藏于DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，并且给予保藏号DSM 6278。 
MT663在YPGaL(1％细菌用酵母提取物、2％细菌用蛋白胨、2％半乳糖、1％乳酸盐)上生长至在600nm下0.6的O.D.。通过离心收获100ml培养物，用10ml水洗涤，再次离心且重悬浮于10ml溶液中，所述溶液包含1.2M山梨糖醇、25mM Na2EDTA pH＝8.0和6.7mg/ml二硫苏糖醇。使悬浮液在30℃下温育15分钟，离心并且使细胞重悬浮于10ml溶液中，所述溶液包含1.2M山梨糖醇、10mMNa2EDTA、0.1M柠檬酸钠，pH 05.8和2mg 234。使悬浮液在30℃下温育30分钟，通过离心收集细胞，在10ml 1.2M山梨糖醇和10ml CAS(1.2M山梨糖醇、10mM CaCl2、10mM Tris HCl(pH＝7.5)中洗涤，并且重悬浮于2ml CAS中。为了转化，使1ml CAS 悬浮的细胞与约0.1mg质粒DNA混合，并且在室温下静置15分钟。加入1ml(20％聚乙二醇4000、10mM CaCl2、10mM Tris HCl，pH＝7.5)，并且使混合物在室温下静置另外30分钟。使混合物离心，并且使沉淀重悬浮于0.1ml SOS(1.2M山梨糖醇、33％v/v YPD、6.7mMCaCl2)中，并且在30℃下温育2小时。随后使悬浮液离心，并且使沉淀重悬浮于0.5ml 1.2M山梨糖醇中。随后，在52℃下加入6ml顶层琼脂(Sherman等人(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold SpringHarbor Laboratory)的SC培养基，其包含1.2M山梨糖醇加上2.5％琼脂)，并且将悬浮液倾注到包含相同琼脂固化的、含山梨糖醇的培养基的板之上。用表达质粒转化的啤酒糖酵母菌株MT663在YPD中在30℃下生长72小时。 
下述实施例涉及说明书和实施例中鉴定的中间化合物和最终产物。本发明的胰岛素衍生物的制备使用下述实施例详细描述，但所描述的化学反应和纯化方案就其制备本发明的胰岛素衍生物的一般适用性而言公开。偶然地，反应可能不如所述的应用于本发明的公开范围内包括中的每种化合物。出现这种情况的化合物将通过本领域技术人员容易地识别。在这些情况下，反应可以通过本领域技术人员已知的常规修改成功地执行，即，通过干扰基团的合适保护，通过改变成其他常规试剂，或通过反应条件的常规修改。可替代地，本文公开或在其他方面常规的其他反应将可应用于制备本发明的相应化合物。在所有制备方法中，所有原材料都是已知的或可以容易地由已知原材料制备。所有温度都以摄氏度阐述，并且除非另有说明，当提及得率时，所有份和百分比都按重量计，并且当提及溶剂和洗脱剂时，所有份都按体积计。 
本发明的胰岛素衍生物可以通过采用一般在本领域内的一种或多种下述程序进行纯化。如果需要，那么这些程序可以就梯度、pH、盐、浓度、流动、柱等进行修饰。依赖于因素例如杂质概况、所讨论的胰岛素溶解度等等，这些修改可以通过本领域技术人员容易地识别且进行。 
关于通式(II)的酰化试剂的固相合成的一般程序： 
(II)：Acy-AA1n-AA2m-AA3p-OSu， 
其中Acy、AA1、AA2、AA3、n、m和p如上文定义，并且OSu是1-琥珀酰亚胺氧基＝2，5-二氧吡咯烷-1-基氧(即，N-羟基琥珀酰亚胺酯)。 
根据本发明包含通式II的基团的化合物可以在固体支持物上合成，其中使用固相肽合成领域中的技术人员众所周知的程序。这个程序包括使Fmoc保护的氨基酸与聚苯乙烯2-氯三苯甲基氯树脂附着。附着可以例如使用游离N-保护的氨基酸在叔胺的存在下来完成，所述叔胺如三乙胺或N，N-二异丙基乙胺(参见下文参考文献)。这个氨基酸的C末端(其与树脂附着)在与本发明的亲本胰岛素偶联的合成序列的末端处。在Fmoc氨基酸与树脂附着后，使用例如仲胺如哌啶或二乙胺使Fmoc基团脱保护，随后为另一个(或相同)Fmoc保护的氨基酸的偶联和脱保护。合成序列通过使单叔丁基保护的脂肪(α，ω)二酸偶联而终止，所述单叔丁基保护的脂肪(α，ω)二酸如十六烷二酸、十七烷二酸、十八烷二酸或二十烷二酸单叔丁酯。化合物从树脂中的切割使用稀酸来完成，所述稀酸如0.5-5％TFA/DCM(溶于二氯甲烷的三氟乙酸)、乙酸(例如溶于DCM的10％、或HOAc/三氟乙醇/DCM 1∶1∶8)、或溶于DCM的六氟异丙醇(参见例如“OrganicSynthesis on Solid Phase”，F.Z. ，Wiley-VCH，2000.ISBN3-527-29950-5，“Peptides：Chemistry and Biology”，N.Sewald&H.-D.Jakubke，Wiley-VCH，2002，ISBN 3-527-30405-3或“The CombinatorialCheemistry Catalog”1999，Novabiochem AG，以及其中引用的参考文献)。这确保化合物中作为羧酸保护基团存在的叔丁酯未脱保护。最后，活化C末端羧基(从树脂中释放)，例如作为N-羟基琥珀酰亚胺酯(OSu)，并且直接或在纯化后在与本发明的亲本胰岛素的附着中用作偶联剂。这在实施例1中举例说明。 
用于制备本发明的酰化、延伸的胰岛素的一般程序(A) 
一般程序(A)在下文概述并且在第一个实施例中举例说明： 
实施例1，一般程序(A)： 
B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]--乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素 
使desB30人胰岛素(3.15g，0.55mmol)溶解于100mM含水Na2CO3(25mL)中，并且加入乙腈(25mL)。如果需要，那么通过加入1N NaOH将pH调整至pH 10-10.5。使叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OSu)-OTBU(650mg，0.7mmol，制备：参见下文)溶解于乙腈(10mL)中，并且缓慢加入胰岛素溶液中。使pH维持在10-10.5。在50分钟后，将反应混合物加入水(150mL)中，并且用1N含水HCl将pH调整至5.2。通过离心分离沉淀，并且冻干。将粗产物加入三氟乙酸(TFA，60mL)中，并且在室温下静置30分钟。将混合物倾注到冰冷的二乙醚(300mL)中，并且通过过滤分离沉淀的产物，并且用二乙醚洗涤2次。如果不完全脱保护，那么使TFA处理重复1次。产物通过HPLC(乙腈，水，1％TFA)纯化，随后为离子交换层析(Ressource Q，在42.5％乙醇中的0.25％-1.25％乙酸铵梯度，pH 7.5)。使纯化的级分合并，用1N HCl将pH调整至5.2，并且分离沉淀的材料且冻干以提供标题胰岛素。 
LC-MS(电喷雾)：m/z＝1285(M+5)/5和1606(M+6)/6。 
用于制备这种胰岛素的酰化试剂如下文中所述进行制备： 
起始树脂：2-氯三苯甲基树脂，1.60mmol/g 
使1.0g树脂在DCM(10ml)中膨胀30分钟。 
1.用Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的酰化：
使0.39g(0.63eq，1.0mmol)Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(Fmoc-OEG-OH)溶解于DCM(15ml)中，并且加入树脂中。逐滴加入N，N-二异丙基乙胺(DIEA)(0.44ml，2.5mmol)。使反应混合物涡旋30分钟，并且随后加入甲醇(2ml)，并且使混合物涡旋另外15分钟。使树脂过滤，并且用NMP(2×8ml)和DCM(8×8ml)洗涤。 
加入20％哌啶/NMP(8ml)，静置10分钟，重复1次。 
过滤且用NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)和NMP(5×8ml)洗涤。 
阳性TNBS测试给出红色树脂。 
2.用Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸的酰化：
使0.78g(2eq，2.0mmol)Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸溶解于NMP/DCM 1∶1(10ml)中。加入0.28g(2.2eq，2.4mmol)HOSu，随后加入0.37m1(2.2eq，2.4mmol)DIC。允许反应混合物静置1小时，并且随后加入树脂中，并且最后加入0.407ml(2.2eq)DIEA。使反应混合物涡旋16小时，过滤且用NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)和NMP(5×8ml)洗涤。 
阳性TNBS测试给出无色树脂。 
加入20％哌啶/NMP(10ml)，静置10分钟，重复1次。 
过滤且用NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)和NMP(5×8ml)洗涤。 
阳性TNBS测试给出红色树脂。 
用Fmoc-Glu-OtBu的酰化：
使0.86g(2eq，2.0mmol)Fmoc-Glu-OtBu溶解于NMP/DCM 1∶1(10ml)。加入0.32g(2.2eq，2.4mmol)HOBT，随后加入0.37ml(2.2eq，2.4mmol)DIC。允许反应混合物静置20分钟，并且随后转移至树脂中，并且最后加入0.407ml(2.2eq)DIEA。使反应混合物涡旋16小时，过滤且用NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)和NMP(5×8ml)洗涤。 
阳性TNBS测试给出无色树脂。 
加入20％哌啶/NMP(10ml)，静置10分钟，重复1次。 
过滤且用NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)和NMP(5×8ml)洗涤。 
阳性TNBS测试给出红色树脂。 
用十八烷二酸单叔丁酯的酰化：
使0.75g(2eq，2.0mmol)十八烷二酸单叔丁酯溶解于NMP/DCM1∶1(10ml)。加入0.32g(2.2eq，2.4mmol)HOBT，随后加入0.37ml(2.2eq，2.4mmol)DIC。允许反应混合物静置20分钟，并且随 后转移至树脂中，并且最后加入0.41ml(2.2eq)DIEA。使反应混合物涡旋16小时，过滤且用NMP(2×8ml)、DCM(3×8ml)和NMP(5×8ml)洗涤。 
用TFA切割：
将8ml 5％TFA/DCM加入树脂中，并且使反应混合物涡旋2小时，过滤，并且收集滤液。再将5％TFA/DCM(8ml)加入树脂中，并且使混合物涡旋10分钟，过滤，并且用DCM(2×10ml)洗涤树脂。使用约800ul DIEA使组合的滤液和洗液pH调整至碱性。使混合物在真空中蒸发，提供油(3.5g)。加入二乙醚(30ml)，并且通过倾析分离不溶解的油，并且在真空中蒸发。这提供作为油的1.1g 17-{(S)-1-叔丁氧-羰基-3-[2-(2-{[2-(2-羧基甲氧基乙氧基)-乙基氨基甲酰基]甲氧基}乙氧基)乙基氨基甲酰基]丙基氨基甲酰基}-十七烷酸叔丁酯(替代名称：叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU)。 
LC-MS(Scie×100API)：m/z＝846.6(M+1)+。 
OSu活化：
使上述叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OH)-OTBU(0.63g)溶解于THF(35ml)中。加入DIEA(0.255ml，2eq.)，随后为TSTU(0.45g，2eq.)，并且使混合物在室温下下搅拌16小时。混合物在乙酸乙酯(250ml)和含水NaHSO4(3×100ml)之间分配。使有机相干燥(MgSO4)，并且在真空中浓缩，以提供作为油的0.65g 17-((S)-1-叔丁氧羰基-3-{2-[2-({2-[2-(2，5-二氧吡咯烷-1-基氧羰基甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}甲氧基)乙氧基]乙基氨基甲酰基}丙基氨基甲酰基)十七烷酸叔丁酯(替代名称：叔丁基十八烷二酰-Glu(OEG-OEG-OSu)-OTBU)。 
LC-MS：m/z＝943.4(M+1)+。 
实施例2，一般程序(A)： 
B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(二十烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]-乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素 
使desB30人胰岛素(0.7g)溶解于100mM含水Na2CO3(25mL)中，并且加入乙腈(25mL)。如果需要，那么通过加入1N NaOH将pH调整至pH 10-10.7。使叔丁基二十烷二酰-Glu(OEG-OEG-OSu)-OTBU(140mg，类似于如上所述制备，其中使用二十烷二酸单叔丁酯代替十八烷二酸单叔丁酯)溶解于乙腈(3mL)中，并且缓慢加入胰岛素溶液中。使pH维持在10.5。在45分钟后，将反应混合物加入水(150mL)中，并且用1N含水HCl将pH调整至5.2。通过离心分离沉淀，并且冻干。将粗产物加入三氟乙酸(TFA，7mL)和水(0.35mL)中，并且在室温静置50分钟。将混合物加入二氯乙烷(20mL)中，并且在真空中浓缩。残渣用二氯乙烷反萃取2次。产物通过HPLC(乙腈，水，1％TFA)纯化。使纯级分合并，并且冻干以提供标题胰岛素。 
MALDI-TOF MS：m/z＝6449。 
实施例3，一般程序(A)： 
B28D，B29K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])人胰岛素 
LC-MS(电喷雾)：m/z：1635,9(M+4)/4 
实施例4，一般程序(A)： 
B29K(Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-(十八烷二酰-γGlu)氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，desB30人胰岛素 
LC-MS(电喷雾)：m/z：1642(M+4)/4 
实施例5，一般程序(A)： 
B29K(Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-(十八烷二酰-γGlu)氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)人胰岛素 
MALDI-TOF MS：6711 
实施例6，一般程序(A)： 
B29K(Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(十八烷二酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基-gGlu)，desB30人胰岛素 
MALDI-TOF MS：6428 
实施例7，一般程序(A)： 
B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(4-[(十八烷二酰氨基)甲基]-反式-环己烷羧基)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素 
MALDI-TOF MS：6563 
实施例8，一般程序(A)： 
B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(4-[(二十烷二酰氨基)甲基]-反式-环己烷羧基)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素 
MALDI-TOF MS：6594 
实施例9，一般程序(A)： 
B29K(N(eps)-[2-(2-[2-(2-[2-(十七烷二酰-gGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素 
LC-MS(电喷雾)：m/z：1603(M+4)/4 
实施例10，一般程序(A)： 
B29K(N(eps)-[2-(2-[2-(2-[2-(十六烷二酰-gGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素 
MALDI-TOF MS：6395 
实施例11： 
本发明的胰岛素衍生物的胰岛素受体结合 
通过SPA测定(闪烁亲近测定法(Scintillation Proximity Assay))微量滴定板抗体捕获测定，测定本发明的胰岛素衍生物对于人胰岛素受体的亲和力。使SPA-PVT抗体结合珠，抗小鼠试剂(AmershamBiosciences，目录号PRNQ0017)与25ml结合缓冲液(100mM HEPESpH 7.8；100mM氯化钠，10mM MgSO4，0.025％Tween-20)混合。关于单个Packard Optiplate(Packard No.6005190)的试剂混合物由2.4μl1∶5000稀释的纯化重组人胰岛素受体(含或不含外显子11)、 一些与5000cpm/100μl试剂混合物对应的A14Tyr[125I]-人胰岛素母液、12μl F12抗体的1∶1000稀释物、3ml SPA珠和至总共12ml的结合缓冲液组成。随后向Packard Optiplate中的每个孔加入总共100μl试剂混合物，并且在Optiplate中制备来自合适样品的胰岛素衍生物稀释系列。随后使样品在轻轻振荡时温育16小时。随后通过离心1分钟分开相，并且在Topcounter中计数板。使用在GraphPad Prism 2.01(GraphPad Software，San Diego，CA)中的非线性回归算法拟合结合数据。 
也修改结合缓冲液以包含4.5％HSA(人血清清蛋白)，以更好地模拟或“模仿”受体结合的生理学状况。 
本发明所选择的化合物的胰岛素受体(A-同种型)结合数据： 
  实施例  #   修改   亲本胰岛素  IR-A亲和力 0％HSA (％相对于人胰岛 素)  IR-A亲和力 4.5％HSA (％相对于人胰岛 素)
    C18-gGlu   desB30   9.2   0.16
  1   C18-gGlu-OEG-OEG   desB30   12.6   1.35
  2   C20-gGlu-OEG-OEG   desB30   8.6   1.96
  3   C18-gGlu-OEG-OEG   B28D   4.7   ND
  4   C18-gGlu-(OEG)3   desB30   10.0   ND
  5   C18-gGlu-(OEG)4   desB30   8.9   ND
  6   C18-OEG-OEG-gGlu   desB30   11.4   ND
  7   C18-Trx-gGlu-(OEG)2   desB30   10.1   ND
  8   C20-Trx-gGlu-(OEG)2   desB30   6.7   ND
  9   C17-gGlu-OEG-OEG   desB30   10.8   ND
  10   C16-gGlu-OEG-OEG   desB30   34.7   1.18
已包括上表中的“修改”为了更容易阅读。这些胰岛素的完整结构/序列可以在实施例中找到。 
如由表可见的，如在本发明的化合物中完成的，在侧链中包括含亚烷基二醇氨基酸的重复单位在4.5％HSA的存在下使胰岛素受体亲和力改善10倍。 
实施例12： 
在大鼠中静脉内(i.v.)快速浓注本发明的胰岛素衍生物后的血糖降低作用 
雄性Wistar大鼠，200-300g，禁食18小时，使用枸橼酸芬太尼-多美康s.c.(1.25mg/ml多美康、2.5mg/ml氟阿尼酮、0.079mg/ml枸橼酸芬太尼)2ml/kg作为先导剂量(至在测试物质给药前的时间点-30分钟)和每20分钟的另外1ml/kg进行麻醉。 
动物用静脉内注射(尾静脉)1ml/kg对照和测试化合物(通常剂量范围0.125-20nmol/kg)进行给药。通过在尾尖中的毛细血管穿刺将用于测定整体血糖浓度的血样收集在肝素化的10μl玻璃管中，至时间-20分钟和0分钟(在给药前)，以及至给药后时间10、20、30、40、60、80、120和180分钟。使用EBIO Plus自动分析仪(Eppendorf，德国)，通过固定葡糖氧化酶法在分析缓冲液中稀释后测量血糖浓度。对于每个剂量和每种化合物制备平均血浆葡萄糖浓度线(平均值±SEM)。 
实施例13： 
本发明的胰岛素衍生物相对于人胰岛素的效力 
在实验当天重238-383g的Sprague Dawley雄性大鼠用于夹钳实验。大鼠在受控环境条件下自由接近饲料，并且在夹钳实验前禁食过夜(从3pm起)。 
实验规程：
在外科手术程序前使大鼠在动物研究室中适应至少1周。在夹钳实验前约1周，在氟烷麻醉下将Tygon导管插入颈静脉(用于输注)和颈动脉(用于血液取样)内，并且外置(exteriorised)且固定在颈的背部。外科手术后对大鼠给予Streptocilin vet.(BoehringerIngelheim；0.15ml/大鼠，i.m.)，并且在恢复期过程中将其置于动物监护室(25℃)中。为了获得止痛，在麻醉过程中施用Anorphin(0.06mg/大鼠，s.c.)，并且在从麻醉完全恢复后(2-3小时)以及再次每天1次施用卡洛芬(Rimadyl)(1.5mg/kg，s.c.)，共2天。 
在实验当天7am时，禁食过夜(从前一天3pm起)的大鼠进行称重，并且与取样注射器和输注系统(Harvard 22Basic泵，Harvard， 和Perfectum Hypodermic玻璃注射器，Aldrich)连接，并且随后放置到个别夹钳笼内，在其中它们在实验开始前休息约45分钟。在整个实验期间大鼠能够在其通常垫草上自由移动，并且自由接近饮用水。30分钟基础期后，在这期间以10分钟时间间隔测量血浆葡萄糖水平，使待测试的胰岛素衍生物和人胰岛素(1个剂量水平/大鼠，n＝6-7只/剂量水平)以恒定速率输注(i.v.)300分钟。自始至终以10分钟时间间隔测量血浆葡萄糖水平，并且相应调整20％含水葡萄糖的输注，以维持血糖正常(euglyceamia)。使来自每只大鼠的重悬浮红细胞样品合并，并且经由颈动脉导管以约1/2ml体积送回。 
在每次实验当天，在夹钳实验前和结束时获得待测试的个别胰岛素衍生物溶液和人胰岛素溶液的样品，并且通过HPLC证实肽的浓度。在研究前和结束时的相关时间点时测量大鼠胰岛素和C-肽以及待测试的胰岛素衍生物和人胰岛素的血浆浓度。在实验结束时使用超剂量戊巴比妥杀死大鼠。 
测试的根据本发明的所有化合物都显示比已知化合物，即B29K(Nε-十八烷二酰-γGlu)，desB30人胰岛素的效力明显更高的效力，作为稳态iv输注夹钳效力给出。因此，本发明的化合物具有改善的效力。 
实施例14： 
胰岛素衍生物肺递送给大鼠 
测试物质将通过滴注法进行肺给药。简言之，使雄性Wistar大鼠(约250g)在约60ml芬太尼/dehydrodenzperidol/多美康中麻醉，其作为6.6ml/kg sc先导剂量并且随后为30分钟时间间隔的3.3ml/kg sc的3次维持剂量给予。诱导麻醉后10分钟，从尾静脉获得基础样品(t＝-20分钟)，随后为紧在测试物质给药前的基础样品(t＝0)。在t＝0时，使测试物质气管内给药到1个肺内。使具有圆形末端的专门插管封固在包含200ul空气和测试物质(1ml/kg)的注射器上。经由孔，将插管引入气管内，并且向前进入一个主支气管内-正好经过分叉(bifurcature)。在插入期间，从外部触摸颈以确保气管内定位。将注射器的内容物注射，随后为2秒暂停。其后，将插管慢慢抽回。在测试期间使大鼠保持麻醉(血样进行最多达4或8小时)，并且在 实验后实施安死术。 
序列表 
SEQ ID NO：1是实施例1-10的A1-A21链。SEQ ID NO：2是实施例1、2和4-10的B1-B28链。SEQ ID NO：3是实施例3的B1-B28链。 
附图 
图1给出来自实施例1的胰岛素的大鼠气管内滴注的结果。 
序列表
<110>Novo Nordisk A/S
<120>具有包括含亚烷基二醇的氨基酸的重复单位的酰基部分的胰岛素
<130>7702.204-WO
<160>3
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>21
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>A1-A21
<400>1
Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu
1               5                   10                  15
Glu Asn Tyr Cys Asn
            20
<210>2
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>B1-B28
<400>2
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro
            20                  25
<210>3
<211>28
<212>PRT
<213>人工的
<220>
<223>B1-B28
<400>3
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr
1               5                   10                  15
Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp
            20                  25

Claims (2)

1.一种酰化人胰岛素类似物，其中酰基部分与亲本胰岛素附着，并且其中在所述亲本胰岛素中仅存在一个赖氨酸残基，所述酰基部分与所述赖氨酸残基中的ε氨基连接，并且其中所述酰基部分是通式(I)的基团：
Acy-AA1n-AA2m-AA3p-   (I)，
其中
n是0或1，
m是0或1，
p是2、3或4，
Acy是包括16-20个碳原子的脂肪酸，从其中在形式上羟基已从所述脂肪酸中去除，
AA1是：
从其中羟基从羧基中去除，氢从氨基中去除；
AA2是：
从其中羟基从羧基中去除，氢从氨基中去除，且其中所述箭标指示与AA3的氨基的附着点；
AA3是：
从其中羟基从羧基中去除，氢从氨基中去除；
其中AA1、AA2和AA3在式I的基团中出现的次序可以独立地互换，和
Acy、AA1、AA2和/或AA3之间的连接是酰胺键。
2.根据权利要求1的酰化胰岛素类似物，其选自B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素；B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(二十烷二酰-γGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素；B28D，B29K(Nε-[2-(2-[2-(2-[2-(十八烷二酰-γGlu)-氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])人胰岛素；B29K(Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-(十八烷二酰-γGlu)氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)，desB30人胰岛素；B29K(Nε-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-(十八烷二酰-γGlu)氨基乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰氨基}乙氧基)乙氧基]乙酰基)人胰岛素；B29K(Nε-{2-[2-(2-{2-[2-(十八烷二酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰氨基)乙氧基]乙氧基}乙酰基-gGlu)，desB30人胰岛素；B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(4-[(十八烷二酰氨基)甲基]-反式-环己烷羧基)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素；B29K(Nε[2-(2-[2-(2-[2-(4-[(二十烷二酰氨基)甲基]-反式-环己烷羧基)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素；B29K(N(eps)-[2-(2-[2-(2-[2-(十七烷二酰-gGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素；和B29K(N(eps)-[2-(2-[2-(2-[2-(十六烷二酰-gGlu)氨基]乙氧基)乙氧基]乙酰氨基)乙氧基]乙氧基)乙酰基])，desB30人胰岛素。
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