CN102675452B - 具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种利用甲醇酵母表达重组人胰岛素前体，经过纯化、酶切、层析或合成制得的重组人胰岛素及其DesB30类似物，并在其B链第29位赖氨酸的侧链氨基与聚乙二醇以酰胺键偶联而制成的重组人胰岛素及其类似物偶联物的方法。经本发明制备的重组人胰岛素偶联物具有与胰岛素受体结合率高、持续降血糖效果显著、体内半衰期长的特性，适用于治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。

Description

具持续降血糖和受体高结合的人胰岛素及类似物的偶联物
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地讲，本发明涉及人胰岛素及类似物的重组制备、修饰、纯化及其应用。
背景技术
胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质，含有51个氨基酸，分子量约5800，胰岛素分子有靠两个二硫键结合的A链(21个氨基酸)与B链(30个氨基酸)，如果二硫键被打开则失去活性。B细胞先合成一个大分子的前胰岛素原，以后加工成八十六肽的胰岛素原，再经水解成为胰岛素与连接肽。胰岛素的主要生理作用是调节代谢过程：1、促进组织细胞对葡萄糖的摄取和利用，促进糖原合成，抑制糖异生，降低血糖；2、促进脂肪酸合成和脂肪贮存，减少脂肪分解；3、促进氨基酸进入细胞，增加蛋白质合成速度。
糖尿病(DM，Diabetes Mellitus)是一种胰腺功能病变的代谢疾病，特点是慢性高血糖，伴随因胰岛素(Insulin)分泌或作用缺陷引起糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，其主要特征是高血糖。主要分为两种病型：Ⅰ型(IDDM)，胰岛素绝对不足引起；Ⅱ型(NIDDM)，胰岛素相对不足引起。糖尿病已成为一种常见病、多发病，且成为继癌症、心脑血管病之后，第三大威胁人类生命的疾病。
胰岛素通过与体内细胞膜上胰岛素受体的相互作用，调节血糖维持在正常水平，是最有效的糖尿病治疗药物之一。胰岛素受体是一种四聚体的跨膜糖蛋白，由两个α亚基和两个β亚基通过二硫键连接。两个α亚基位于细胞质膜的外侧，有胰岛素结合位点；两个β亚基是跨膜蛋白，起信号转导作用。无胰岛素结合时，受体的酪氨酸蛋白激酶没有活性。当胰岛素与受体的α亚基结合时，改变β亚基的构型，酪氨酸蛋白激酶被激活，激活后催化两个反应：①使四聚体复合物中β亚基特异位点的酪氨酸残基磷酸化，即自我磷酸化；②磷酸化的酪氨酸残基IRSs结合并激活第二信使，放大、级联信号，引起代谢调节。胰岛素与受体结合的程度取决于受体数目与亲和力，此二者又受血浆胰岛素浓度调节。当胰岛素浓度增高时胰岛素受体数下降，即下降调节。肥胖的非胰岛素依赖型糖尿病人由于脂肪细胞膜上受体数下降，对胰岛素不敏感性，称胰岛素抵抗。经饮食控制、体育锻炼后体重减轻，脂肪细胞膜上胰岛素受体数增多，与胰岛素结合力加强而使血糖利用改善，调节血糖恢复到正常水平。
胰岛素与受体结合率越高，调节血糖的效果越明显，结合率的检测采用竞争结合试验法：受体与I125-胰岛素一起孵育，在反应体系中加或不加饱和浓度的未标记的待测胰岛素(或胰岛素类似物)，放射性标记和未标记的待测胰岛素一起得到总的胰岛素结合量，单独加入放射性标记的I125-胰岛素得到非特异性结合量。总结合量减去非特异性结合量得到胰岛素的特异性结合量，特异性结合量除以反应体系中胰岛素总浓度得到特异性结合率。竞争结合试验中的受体优选经过麦胚凝集素-琼脂糖凝胶柱(WGA)层析后得到的大鼠肝脏的胰岛素受体，原因是大鼠肝脏中胰岛素受体含量高，提取方便，且与胰岛素受体高度同源的胰岛素样生长因子-1受体在肝脏中的表达水平低，对检测干扰极小(马歇克等著 蛋白质纯化与鉴定实验指南.科学出版社，1999，P141-192；程宁莉等.新生小牛肝组织胰岛素受体的功能.上海第二医科大学学报，1997，12(2)：23-25；Sinha MK.Subunit structure，autophosphorylation，and tyrosine-specificprotein kinase activity of hepatic insulin receptors in fetal，neonatal，and adultrats.Diabetes，1987；36(1)：1161)。
正常人体内胰岛素的生理分泌受血糖浓度的调控，进餐后的30-60分钟后血胰岛素浓度达到峰值，2-4小时后恢复到正常值，保证了血糖浓度不因进餐而又引起较大的波动。糖尿病患者皮下注射天然人胰岛素后，胰岛素在注射位置扩散并进入体内循环发挥作用，但有效作用时间短；频繁地注射胰岛素，也给糖尿病患者带来诸多的不便和痛苦，临床上需要注射有效时间更长的长效胰岛素。化学修饰是获得长效胰岛素的途径之一，经过化学修饰，可使胰岛素在保持生物活性的同时，半衰期延长，抗原性降低。化学修饰剂的结构必须稳定、无毒性、无抗原性并具有合适大小的分子量。聚乙二醇(PEG)是一种具有较好生物相容性的高分子化合物，对人体无毒性。PEG若与目的蛋白质结合，需要对PEG分子一端或两端进行活化，根据要连接分子的特性来选择所需要的功能基团。常见的生物相容连接基团包括酯基、酰胺基、酰亚胺基、氨基甲酸酯基、琥珀酰亚胺基(例如琥珀酰亚胺基琥珀酰酯(SS)、琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)、琥珀酰亚胺基羧甲基化物(SSA)、N-羟基-琥珀酰亚胺(NHS)、环氧基)、半胱氨酸基团、组氨酸基团或伯胺。活化后的PEG理论上可以与蛋白质中主要的氨基酸如赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸等反应，反应可以在N端，也可在C端，但选择和赖氨酸或N端的基团反应最常见。重组人胰岛素或类似物分子中有三个裸露的氨基，即GlyA1(pKa≈8.0)、PheB1(pKa＜7.0)的α-氨基和LysB29(pKa≈9.5)的ε-氨基，都可作为胰岛素的化学修饰位点。由于人胰岛素的B29位不直接参与与受体结合，与人胰岛素LysB29的共价修饰不会影响蛋白的生物活性(Murray-Rust J et al.，BioEssays1992，14(5)：325-331)。在pH值＞9.5时LysB29上ε-氨基的修饰是主要的，且修饰率高(Hinds K et al.，Bioconjug Chem 2000，11(2)：195-201)。郁正艳等(CN200410089050.8)发明了一种单甲氧基聚乙二醇-胰岛素复合物，胰岛素和单甲氧基聚乙二醇通过前者的游离氨基和后者的具有活性的丙醛基团连接在一起，分子量介于10.8～25.8KD，但修饰工艺复杂，且为修饰混合物。印春华等(CN200610118923.2)发明了一种单修饰的聚乙二醇化胰岛素(PheB1-PEG-胰岛素)，聚乙二醇与胰岛素的B链第一位Phe以碳氮键相连，分子量范围6.55～10.8KD，但在体内作用时间短，降血糖效果不明显。专利CN1964899A公开了将含马来酸基团的PEG修饰胰岛素的B29，给药后与体内白蛋白结合的长效胰岛素衍生物。专利CN10721712A公开了一种双链聚乙二醇修饰胰岛素B30复合物的方法；专利CN101573173A公开了PEG化延长的胰岛素，其主要修饰A21和或B30的C末端羧基的PEG化，以及A1、B1的N末端氨基的PEG化；专利CN101045166A公开了一种化学修饰胰岛素的肺部给药，该专利中化学修饰胰岛素包括A1、B1、B29的至少一个位点的聚乙二醇修饰；专利CN101743252A公开了蛋白酶稳定的PEG化的胰岛素类似物，该专利中的胰岛素类似物具有不同人胰岛素的结构，要求至少含有两个疏水氨基酸被亲水氨基酸取代，然后再进行B29赖氨酸的PEG化，并实现肺部给药的目的。专利CN 200810232828.4公开了用聚乙二醇在胰岛素A1位单修饰或在胰岛素A1位和B29位双修饰的工艺，但在体内持续降血糖时间不长且出现波动。Novo Nordisk公司长效地特胰岛素由脂肪酸myristic fatty acid偶联在胰岛素类似物B链第29位赖氨酸上(CN101784563A，CN101389650A和EP2008/060734)，体内降血糖效果明显，人体内可实现降血糖24小时，但动物体内仅维持12小时以内的降血糖作用。本发明选用聚乙二醇作为修饰剂与人胰岛素或DesB30胰岛素类似物的单一位点B29赖氨酸的ε-氨基以酰氨键偶联，经纯化工艺获得无其他修饰位点的单一偶联物，修饰产物性质稳定。分子量大小不同的修饰偶联物与人胰岛素受体结合率达40-90％之间，体内半衰期显著延长，在实验动物体内(家兔和犬)降血糖效果可实现从24至72小时不等。本发明公开的重组人胰岛素及类似物偶联物具有作为治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的新型长效胰岛素的治疗药物或其药物组合物的价值。
发明内容
本发明的目的是提供重组人胰岛素或其类似物的B29赖氨酸的ε-氨基与聚乙二醇以酰氨键连接形成的偶联物。
本发明的另一目的是提供制备上述偶联物的方法，该方法包括制备重组人胰岛素或其类似物的单体、PEG偶联和偶联后的蛋白纯化。
本发明的另一目的是提供上述偶联物的应用。该偶联物修饰位点专一，包括含5kDa、10kDa、20kDa分子量的三种PEG的偶联物，与胰岛素受体结合率高，在体内能显著延长半衰期，持续降血糖效果明显，可作为治疗药物或药物组合物治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。
在本发明的第一方面，首先界定了用于PEG偶联的重组人胰岛素及其类似物的氨基酸序列或组成。所述的重组人胰岛素的氨基酸序列特征为(SEQ ID No：1)：Gly Ile Val Glu Gln CysCys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn Gln His Leu Cys GlySer His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr，其中1-21位氨基酸组成重组人胰岛素的A链，22-51位氨基酸组成重组人胰岛素的B链，第6位和第11位、第7位和第28位、第20位和第40位分别形成二硫键。
所述的重组人胰岛素类似物的序列是SEQ ID NO：1中B链末端缺失第30位苏氨酸的人胰岛素类似物，可以命名为DesB30重组人胰岛素，氨基酸序列特征为SEQ ID NO：2：Gly IleVal Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn Phe Val Asn GlnHis Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr ThrPro Lys，其中1-21位氨基酸组成DesB30重组人胰岛素的A链，22-50位氨基酸组成DesB30重组人胰岛素的B链，第6位和第11位、第7位和第28位、第20位和第40位的半胱氨酸分别形成二硫键。
所述的重组人胰岛素以及类似物DesB30是指利用基因工程重组技术而制备获得。具体为利用酵母的表达载体构建含重组人胰岛素原前体基因的重组子，转化酵母后筛选表达株经发酵罐表达重组人胰岛素原前体，分离和纯化该前体蛋白，再利用胰蛋白酶酶切除去前导肽和短C肽，层析分离制备而得DesB30重组人胰岛素类似物。该类似物采用化学C末端的缩合反应(Gurramkonda et al.，Microbial Cell Factories 2010，9：31；US4916212)，再经分离纯化获得重组人胰岛素。如实例中所详述，制备的重组人胰岛素及DesB30重组人胰岛素类似物，纯度均达98.0％以上，具有27.5IU/mg的胰岛素活性，完全正确配对的三对二硫键结构。采用本专利公开的酵母制备的重组人胰岛素及DesB30重组人胰岛素类似物可进一步利用结晶方法制备相应的结晶胰岛素。
本发明的第二方面，重组人胰岛素的PEG修饰氨基位点包含了胰岛素分子中两个N端的α氨基(Ala(A1)、Phe(B1))和赖氨酸的ε氨基(B29)，但在本专利中，PEG修饰位点仅限于B29位赖氨酸的ε氨基。胰岛素中B29赖氨酸的ε氨基与活化的单甲氧基聚乙二醇通过苏酯键、仲胺键或酰胺键进行共价连接，更优的酰胺键共价连接。
活化的PEG连接基团包括但不局限于琥珀酰亚胺基、硝基苯、酰胺基、酰胺亚基、胺基甲酸酯基、醛基等。更优的，PEG连接基团为琥珀酰亚胺基丙酸酯(SPA)。其中聚乙二醇的封闭基团包括但不局限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、半乳糖或葡萄糖等。更优的，聚乙二醇的封闭基团为单甲氧基。聚乙二醇分子可以是支链的或直链的，更优的，为直链的聚乙二醇。聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯(mPEG-SPA)作为修饰偶分子，分子量为5kDa、10kDa、20kDa。本专利所述的偶联物中每个重组人胰岛素及DesB30人胰岛素类似物仅偶联1个聚乙二醇分子，无多个和非B29位修饰位点的其他偶联物。
本发明第三方面，提供了制备重组人胰岛素及类似物的偶联物的方法，是指制备的重组人胰岛素或DesB30类似物蛋白浓度为2-4mg/ml，缓冲20mmol/L Tris-HCl(pH10.5)，连续两次分别加入蛋白与mPEG-SPA摩尔质量比为1∶1.5-1∶2.5不等的mPEG-SPA(分子量为5kDa或10kDa或20kDa)，室温，100rpm，搅拌20-40min，1.0mol/L HCl调pH到3.0终止反应。修饰后的样品经反相和离子柱层析除去未修饰的胰岛素及PEG，除去非单一B29的偶联物，获得纯度大于98.0％的重组人胰岛素及DesB30类似物偶联物。本制备方法经过实例证明，修饰率达40％以上，修饰特异性专一，修饰产物均一稳定，且利于实施。
本发明的第四方面指通过本发明制备的重组人胰岛素偶联物与胰岛素受体通过竞争结合试验，结果表明两者具有较高的结合率。对家兔、犬以及小鼠Ⅰ型糖尿病模型(IDDM)皮下注射适量的剂量，持续降低血糖效果明显，可作为一种治疗药物或药物组合物疗治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病。其中含5kDa聚乙二醇的偶联物保留了与胰岛素受体75％以上结合率，能持续体内降血糖12小时以上；含10kDa聚乙二醇的偶联物保留了与胰岛素受体60％以上结合率，能持续体内降血糖24小时以上；含20kDa聚乙二醇的偶联物保留了与胰岛素受体40％以上结合率，能持续体内降血糖48小时以上。
本发明的第五方面，提供了用于治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的重组人胰岛素偶联物的药物及组合物。根据实施例的研究以及临床的可参照治疗的剂量，本专利发现偶联物在0.01-0.5mg/kg治疗剂量下的药物配方。含本发明偶联物的给药方式以皮下注射和静脉注射为主，但不排除并包括经公开已知制备技术制成肺部给药、口服给药。作为注射给药的配方，除含有有效治疗的剂量的重组人胰岛素偶联物外，需包括一定的pH范围(3.0～8.0之间)，适当的溶液缓冲(包括但不限于磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐、甘氨酸及盐、组氨酸及盐)以及保护剂(包括但不限于氨基酸、锌离子、单糖或多糖、防腐剂(包括但不限于苯酚和间甲苯酚)。作为组合物，可将本专利所述人胰岛素偶联物与鱼精蛋白、或其他人胰岛素(包括但不限于已上市胰岛素，如门冬胰岛素、赖脯胰岛素、普通胰岛素、地特胰岛素、甘精胰岛素)进行一定量效浓度组合。
至此已对本发明进行了详细的描述，通过参考以下实例，能够对本发明有更清晰的理解，所述实例仅为说明目的而不是旨在对本发明进行限制。
附图说明
图1为重组人DesB30胰岛素前体和重组人DesB30胰岛素的HPLC图：A为重组人DesB30胰岛素前体的HPLC图谱；B为重组人DesB30胰岛素前体用胰蛋白酶酶切后的HPLC图谱；C为重组人DesB30胰岛素的HPLC图谱。
图2为重组人DesB30胰岛素及重组人DesB30胰岛素不同分子量偶联物的电泳图：1为未修饰DesB30；2为DesB30-5K；3为DesB30-5K；4为DesB30-10K；5为DesB30-10K；6为DesB30-20K；7为DesB30-20K；M为蛋白分子量标准，从下往上依次为14.4KD、20KD、26KD、33KD、45KD、66.2KD、94KD。
图3重组人DesB30胰岛素和重组人DesB30-20K经V8酶酶切的还原肽图：A为重组人DesB30胰岛素的V8酶酶切还原肽图；B为重组人DesB30-20K的V8酶酶切还原肽图。
图4为重组人DesB30胰岛素偶联物在Ⅰ型糖尿病模型昆明小鼠上持续降血糖的时效曲线，其中X轴为测定Ⅰ型糖尿病模型小鼠空腹血糖值的时间(Hr)，Y轴为血糖值(mMol/L)，◆为对照组，■为DesB30-5K组，▲为DesB30-10K组，×为DesB30-20K组。
图5为重组人胰岛素Ins偶联物在Ⅰ型糖尿病模型昆明小鼠上持续降血糖时效曲线，其中X轴为测定Ⅰ型糖尿病模型小鼠空腹血糖值的时间(Hr)，Y轴为血糖值(mMol/L)，◆为对照组，■为Ins-5K组，▲为Ins-10K组，×为Ins-20K组。
图6为重组人DesB30胰岛素偶联物在Ⅰ型糖尿病模型新西兰大白兔上持续降血糖时效曲线，其中X轴为测定Ⅰ型糖尿病模型新西兰大白兔空腹血糖值的时间(Hr)，Y轴为血糖值(mMol/L)，◆为对照组，■为DesB30-5K组，▲为DesB30-10K组，×为DesB30-20K组。
图7为重组人胰岛素Ins偶联物在Ⅰ型糖尿病模型新西兰大白兔上持续降血糖时效曲线，其中X轴为测定Ⅰ型糖尿病模型新西兰大白兔空腹血糖值的时间(Hr)，Y轴为血糖值(mMol/L)，◆为对照组，■为Ins-5K组，▲为Ins-10K组，×为Ins-20K组。
图8为DesB30-20k偶联物在Ⅰ型糖尿病模型Beagle犬上剂量梯度持续降血糖时效曲线(单次给药)，其中X轴为测定Ⅰ型糖尿病模型Beagle犬空腹血糖值的时间(Hr)，Y轴为血糖值(mMol/L)，◆为对照组，■为剂量0.05mg/kg组，▲为剂量0.1mg/kg组。
图9为以0.1mg/kg剂量对Ⅰ型糖尿病模型Beagle犬单次皮下注射DesB30-20k偶联物后测定的血药浓度曲线，其中X轴为测定时间Hr，Y轴为DesB30-20k偶联物浓度uU/ml。
图10为以0.1mg/kg剂量对Ⅰ型糖尿病模型Beagle犬连续6次皮下注射DesB30-20k偶联物后测定的血药浓度曲线，其中X轴为测定时间Hr，Y轴为DesB30-20k偶联物浓度uU/ml。
具体实施方式：
通过下面的具体实施例可进一步了解本发明，但它们不是对本发明的限定。以下实例所涉及的重组人胰岛素(Ins)及类似物(DesB30)均采用基因工程技术获得的，氨基酸序列分别为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
实例1.重组人胰岛素类似物(DesB30)的重组表达和纯化
在本实施例中，根据所涉及的人胰岛素类似物DesB30氨基酸序列(Seq ID NO.2)，设计酵母偏爱密码子的对应cDNA序列，其中含有前导肽序列EVFK和中间短C肽AAK相对应的cDNA序列，同时包含5′端和3′端分别设计限制性内切酶Xho I和Not I位点。将全部的cDNA序列如下(Seq ID NO.3)：
CTCGAGAAGAGAGAAGTCTTCAAGTTTGTTAACCAACATTTGTGTGGTTCCCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGTGGTGAAAGAGGTTTCTTCTACACTCCAAAGGCTGCTAAGGGTATCGTTGAACAATGTTGTACTTCCATCTGTTCCTTGTACCAATTGGAAAACTACTGTAACTGATAAGCGGCCGC，委托宝生物(大连)有限公司人工合成Seq ID NO.3的cDNA基因片段，并嵌入pUC18载体且命名为pUC18-DesB30。质粒pUC18-DesB30和表达载体质粒pICZαA用限制性内切酶Xho I和Not I双酶切后，经胶回收、T4酶连接，构建并筛选含DesB30前体基因的表达载体pICZαA-DesB30。重组质粒用Avr II线性化，用电转仪将线性化的重组质粒导入GS115毕赤酵母(Invitrogen)中，经His+和Zeocin筛选，获得抗Zeocin1000μg/ml的高拷贝克隆菌。挑表达菌，接种于5ml YPD培养基中，30℃过夜培养，转接入250ml YPD培养基中，表达96小时。筛选高表达菌株，液氮-80℃保存。
发酵及表达：取一支保存于-80℃的种子液，划线YPD平板(Glucose 20g/L，Polypeptone20g/L，Yeast extract10g/L，Agar20g/L)，30℃培养3-4d即可。从活化好的YPD平板上挑取菌落，接种于装有25mLYPD(Glucose 20g/L，Polypeptone 20g/L，Yeast extract10g/L)液体培养基的250mL三角瓶中，30℃，250rpm，培养24h，即成一级种子液。将一级种子液以1％的接种量接种于装有250mLYPD液体培养基的1000mL三角瓶中，30℃，250rpm，培养过夜，即成上罐种子液。上罐种子液以10％的接种量接入发酵培养基BSM(BSM每1000ml中含：85％的H3PO426.7mL，CaSO4·2H2O 0.93g，MgSO4·7H2O 14.9g，KOH 4.13g，K2SO418.2g，甘油40g，微量元素(PTM1)4.4mL，消泡剂0.5mL)，其中PTM1每1000ml含：CuSO4·5H2O6g，KCl 0.08g，MnSO4 2.68g，H3BO4 0.029，Na2MoO4·2H2O 0.2g，ZnSO4·7H2O 20g，FeSO4·7H2O65g，CoCl2·6H2O 0.916g，H2SO4 5mL，Biotin 0.2g，培养温度控制在25℃-30℃，用28％氨水调节pH至5.0，设定初始转速为400rpm，初始通气量(无菌空气)10L/min，设定溶氧为96％左右。菌体开始生长阶段，耗氧量增加导致溶氧降低，通过调节通气量和搅拌转速以及通纯氧，维持溶氧水平在30％以上。培养至甘油耗尽(20-24h左右，所需时间与初始接种量和培养条件有关)，此时溶氧、pH上升。然后限制性地根据菌体生长状态流加含12mL/LPTM1的甘油，流加2-30小时；再限制性地根据菌体生长状态变速流加含12mL/L PTM1的甲醇，用气相色谱检测控制甲醇终浓度维持在0.5～1.0％，直到发酵结束，甲醇诱导表达周期维持48～96小时之间，温度控制在20℃-30℃，优选22℃；pH值用氨水控制在4-6之间。发酵结束后，10000rpm，离心收集发酵液上清，-20℃保存备用。
粗纯化：取发酵液在4℃、12000rpm离心10分钟，弃沉淀，收集上清。将收集的上清调pH到8.0，通过Ni螯合层析柱纯化回收DesB30前体。平衡液条件为20mmol/L Trisl-HCl、300mmol/L NaCl、pH8.0，洗脱液条件为20mmol/L Tris-HCl、50mmol/L咪唑、300mmol/LNaCl、pH8.0；洗脱的目的蛋白用A液稀释三倍后，再进行Source 30Q纯化，流动相A液为20mmol/L Tris-HCl(pH8.0)，流动相B液为20mmol/L Tris-HCl、1000mmol/L NaCl(pH8.0)，0-100％的B液线性洗脱，收集含DesB30前体的洗脱峰(图1A)。
DesB30前体酶切：Source 30Q洗脱蛋白加入按质量比1∶1000的胰酶(Trypsin，购于Novagen公司)，调节pH7.5-8.0，室温缓慢搅拌12小时，酶切效率不低于90％(图1B)。
精纯化：酶切后样品用反相制备型C18柱进一步纯化，流动相A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，流动相B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，0-100％的B液线性洗脱，收集含人胰岛素类似物DesB30的洗脱峰。获得的DesB30重组人胰岛素经RP-HPLC分析纯度为98.1％(图1C)，MALDI-TOF质谱测定分子量为5705.56，与理论值一致。
实例2.重组人胰岛素类似物偶联物(DesB30-5K)的制备
取浓度为2mg/ml的重组人胰岛素类似物(DesB30)溶液100ml(含20mmol/L Tris-HCl)，调节pH到10.5，室温下100rpm搅拌，首先按摩尔质量比1∶1.5加入mPEG-SPA(分子量为5K，购于北京健凯科技有限公司)，反应30分钟后，再按摩尔质量比1∶1.5加入mPEG-SPA，继续反应30分钟，用1％的三氟乙酸调节pH到3.0终止反应，修饰后样品经反相制备型C18柱层析，分离除去未修饰的DesB30、游离PEG分子、非B29位修饰的其它偶联物。分离条件为：A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，线性梯度洗脱收集DesB30-5K偶联物，该偶联物经冷冻干燥成干粉保存(图2)。
实例3.重组人胰岛素类似物偶联物(DesB30-10K)的制备
取浓度为2mg/ml的重组人胰岛素类似物(DesB30)溶液100ml(含20mmol/L Tris-HCl)，调节pH到10.5，室温下100rpm搅拌，首先按摩尔质量比1∶2加入mPEG-SPA(分子量为10K，购于北京健凯科技有限公司)，反应30分钟后，再按摩尔质量比1∶2加入mPEG-SPA，继续反应30分钟，用1％的TFA调节pH到3.0终止反应，修饰后样品经反相制备型C18柱层析，分离除去未修饰的DesB30、游离PEG分子、非B29位修饰的其它偶联物。分离条件为：A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，线性梯度洗脱收集DesB30-10K偶联物，该偶联物经冷冻干燥成干粉保存(图2)。
实例4.重组人胰岛素类似物偶联物(DesB30-20K)的制备
取浓度为2mg/ml的重组人胰岛素类似物(DesB30)溶液100ml(含20mmol/L Tris-HCl)，调节pH到10.5，室温下100rpm搅拌，首先按摩尔质量比1∶2.5加入mPEG-SPA(分子量为20K，购于北京健凯科技有限公司)，反应30分钟后，再按摩尔质量比1∶2.5加入mPEG-SPA，继续反应30分钟，用1％的TFA调节pH到3.0终止反应，修饰后样品经反相制备型C18柱层析，分离除去未修饰的DesB30、游离PEG分子、非B29位修饰的其它偶联物。分离条件为：A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，线性梯度洗脱收集DesB30-20K偶联物，该偶联物经冷冻干燥成干粉保存(图2)。
实例5.重组人胰岛素(Insulin)的制备
反应体系为：10mmol/L DesB30胰岛素前体(实例1中经过Source 30Q纯化所得)，200μmol/LTPCK处理的胰蛋白酶和0.8mol/L Thr(tBu)-OtBu、7.0mmol/L CaCl2、50％二甲基亚砜/乙醇1∶1(v/v)和26％的水，用醋酸调pH至6.0，该体系在12℃反应24hrs。然后加丙酮(用等体积的浓盐酸酸化)使蛋白沉淀，用制备型反相C18柱分离B30 Thr(tBu)-OtBu人胰岛素，然后用三氟乙酸(TFA)去保护基。再经阳离子(SP Sepharose FF)层析，平衡液为20mmol/L NaAC(pH3.0)，洗脱液为20mmol/LNa2HPO4(pH9.5)，获得纯度大于98.0％的重组人胰岛。经MALDI-TOF质谱测定分子量为5824.66，与理论值一致。
实例6.重组人胰岛素偶联物(Ins-5K、Ins-10K、Ins-20K)的制备
重组人胰岛素偶联物(Ins-5K)的制备，方法同实例2，经制备的Ins-5K偶联物的纯度大于98.0％。
重组人胰岛素偶联物(Ins-10K)的制备，方法同实例3，经制备的Ins-10K偶联物的纯度大于98.0％。
重组人胰岛素偶联物(Ins-20K)的制备，方法同实例4，经制备的Ins-20K偶联物的纯度大于98.0％。
实例7.重组人胰岛素偶联物修饰位点的分析
目的：为了证明实例中制备的偶联物Ins-5K、Ins-10K、Ins-20以及DesB30-5K、DesB30-10K和DesB30-20K的修饰位点仅是重组人胰岛素B链的第29位赖氨酸侧链氨基，通过选用专一性强的V8酶，进行质量肽图分析，该酶特异性酶解Glu残基的C端肽键。分别对未修饰胰岛素和修饰后胰岛素偶联物的酶切肽图液质分析，并结合修饰肽段的氨基酸序列分析，从而确定修饰位点及位点的专一性。
方法：将DesB30和DesB30-20K二种样品冻干除盐后用1％NH4HCO3溶解成2mg/ml，每个样品取0.9ml，再补入50uL V8酶(质量比1∶50，sigma公司)，37℃反应24小时。再补入0.4M TCEP 10ul，37℃反应30min，经RP-HPLC液质(Agilent 1100)分析二者的质量肽图，记录每个峰的保留时间和分子量。
分析：通过对DesB30(图3A)和DesB30-20K(图3B)还原肽图比较分析发现，其中下表中的序号为6的肽段RGFFYTPK在DesB30-20K还原肽图中消失，其它相应5个肽段在两者的还原肽图中完全一致。DesB30-20K还原肽图中出现的42.834分钟的肽段为被PEG修饰了的肽段(该肽段用蒸发光检测为PEG化物质)，证明PEG修饰位点位于该片段上。
随后采用半制备型C18柱RP-HPLC色谱纯化保留时间为42.834分钟的肽段，并委托中科院上海生化所对该肽段进行氨基酸测序分析。测序结果为：RGFFYTPX，其中X表示未测出氨基酸，表明该片段中Lys被PEG化。该结果证明DesB30-20K修饰位点仅为B29的氨基酸。同样方法分析了其他5种偶联物(Ins-5K、Ins-10K、Ins-20K、DesB30-5K和DesB30-10K)，均获得相同结论。
实例8.在小鼠Ⅰ型糖尿病模型中降血糖实验
取健康昆明种雄性SPF级小鼠70只，体重25-30g，禁食不禁水14小时，以剂量120mg/kg快速腹腔注射用柠檬酸-柠檬酸三钠缓冲液配制好的链脲霉素(STZ)溶液(4.8mg/ml)，建立Ⅰ型糖尿病模型，注射后立即给饲料和水。造模48小时后，尾静脉取血，用血糖仪检测禁食后2h血糖值，血糖值≥11.1mmol/L为造模成功。取成模小鼠40只，随机分为4组，每组10只：A组模型对照、B组DesB30-5K、C组DesB30-10K、D组DesB30-20K，B、C、D组分别都以剂量0.25mg/kg皮下给药，A组注射等体积溶媒。给药前(即0小时)和给药后的第1、2、6、10、15、18、24小时分别取尾静脉血测定空腹(禁食2小时)血糖值(拜耳的快速血糖仪测定)，计算平均血糖值后绘制时效曲线(附图4)
结果显示，DesB30-5K、DesB30-10K、DesB30-20K均有明显的降血糖作用。其中DesB30-5K的降血糖可维持8小时左右，DesB30-10K的降血糖可维持12小时左右，DesB30-20K的降血糖可维持18小时作用。
重组人胰岛素偶联物(INS-5K、INS-10K、INS-20K)在昆明小鼠Ⅰ型糖尿病模型上持续降血糖的实验方法同上，计算平均血糖值后绘制时效曲线(附图5)。结果显示，其中INS-5K的降血糖可维持8小时左右，INS-10K的降血糖可维持12小时左右，INS-20K的降血糖可维持18小时作用。
实例9.在家兔Ⅰ型糖尿病模型(IDDM)中降血糖实验
取雄性新西兰大耳白兔40只，体重2-3kg，禁食不禁水24h，一次性耳缘静脉以5ml/kg剂量注射四氧嘧啶溶液(浓度为20mg/ml)造模，注药后立即给饲料和水。造模3天后，每天耳缘静脉取空腹6h血，用血糖仪测定血糖值，血糖值≥11.1mmol/L为造模成功。取成模兔24只，每组6只，随机分为4组：A组模型对照、B组DesB30-5K、C组DesB30-10K组、D组DesB30-20K，B、C、D组分别都以剂量0.2mg/kg皮下给药，A组注射等体积溶媒。给药前(即0小时)和给药后的第1、2、4、8、12、24、36、48、60、72、84、96小时分别取耳静脉血测定空腹6小时血糖值(拜耳的快速血糖仪测定)，计算平均血糖值后绘制时效曲线(附图6)。结果显示，DesB30-5K、DesB30-10K、DesB30-20K在家兔Ⅰ型糖尿病模型(IDDM)上均有明显的降血糖作用。其中DesB30-5K的降血糖作用可维持15小时，DesB30-10K的降血糖作用可维持30小时左右，DesB30-20K的降血糖作用可维持55小时左右。
重组人胰岛素偶联物(Ins-5k、Ins-10k、Ins-20k)在兔Ⅰ型糖尿病模型(IDDM)上持续降血糖实验方法同上，计算平均血糖值后绘制时效曲线(附图7)。结果显示，其中Ins-5K的降血糖作用可维持15小时左右，Ins-10K的降血糖作用可维持35小时左右，Ins-20K的降血糖作用可维持55小时左右。
实例10.与胰岛素受体结合率测定
大鼠肝胰岛素受体提取和受体结合率测定参照文献进行(Sinha MK.Subunitstructure，autophosphorylation，and tyrosine-specific protein kinase activity of hepatic insulinreceptors in fetal，neonatal，and adult rats.Diabetes，1987；36(1)：1161)：在4℃取2周龄大鼠肝组织200g，加入缓冲液A(25mmol/L Hepes，0.25mol/L Sucrose，5mmol/L EDTA-Na 10mmol/LPMSF)制成匀浆，2000×g离心10min，，吸取上清液，再50000×g离心45min后，取沉淀物加入缓冲A，混匀后加入10∶1的溶解液(2mg/ml Bacitracin，2mmol/L PMSF，2％Triton X-100)，37℃孵育30min，120000×g离心30min，吸取上清液。用WGA-Sepharose 3.0ml预装柱，将洗涤液(含25mm/L Hepes，0.05％Triton X-100，100mm/L NaCl，2.5mmol/L KCL，1.0mmol/L CaCl2)洗涤层析柱。用洗脱液(含0.3mmol/L N-乙酰葡萄糖胺，10％丙三醇)洗脱，洗脱后以Lowry法测定大鼠肝胰岛素受体蛋白浓度并调整为2.0mg/ml。随后在7个微量离心管中建立如下的反应体系：其中I125Insulin购于中国原子能研究中心，结合缓冲液为25mmol/L Hepes，0.05％Triton X-100，0.1％BSA。4℃反应16小时后加入0.04％γ-球蛋白100ul，20％聚乙二醇(8000)400ul，混匀后12000×g离心30min后去上清，用γ-闪烁计数仪中测定各管放射性强度cpm值，分别从第1至6管的cpm值减去第7管的cpm值(非特异性和本底cpm值)，得到特异结合的cpm值。将各管的特异性结合cpm值除以总cpm值，得到与受体结合的胰岛素所占的份额，该值乘以各管中胰岛素浓度，即得配体-受体复合物的浓度(HR)，从管中的胰岛素浓度减去配体-受体复合物，得到游离配体浓度(H)，最后将HR和H作斯卡查德图(Scatchard)，以重组人胰岛素(中检所标准品，每支20mg)与受体结合率为100％，计算出其它每一种重组胰岛素偶联物与受体的结合率。
经计算的各种重组人胰岛素偶联物与胰岛素受体的结合率
实例11.DesB30-20k偶联物在Beagle犬Ⅰ型糖尿病模型中降血糖实验
取健康Beagle犬20只，体重5-8kg，禁食不禁水24h，以50mg/kg和30mg/kg剂量在前肢皮下静脉分别推注四氧嘧啶溶液(200mg/ml)和STZ溶液(120mg/ml)，建立Ⅰ型糖尿病模型，注射后立即给饲料和水。造模72小时后，多食、多饮、多尿、体重减轻，后肢静脉血糖值≥11.1mmol/L为造模成功。取成模犬12只，随机分为3组，每组4只：A组为对照组，B组给药剂量为0.05mg/kg、C组给药剂量为0.10mg/kg，皮下给药一次，给药后的第0、2、6、12、18、24、36、48、72、96、120小时分别取后肢静脉血测定空腹(禁食6小时)血糖值(GOD-POD法)，计算平均血糖值后绘制单次给药时效曲线(附图8)。单次给药实验数据显示DesB30-20k在0.10mg/kg剂量能有效降血糖72小时，随后对模型实验动物进行多次给药实验，间隔72小时皮下给药一次，连续给药6次，于给药后的第1天至第21天期间，每三天测定一次空腹血糖值，于末次给药后取血做药代动力学实验。结果显示：DesB30-20K在Beagle犬Ⅰ型糖尿病模型上有明显的降血糖作用和量效关系，单次和多次给药后的降血糖作用持续时间基本一致，均可维持在72小时；连续多次给药期间给药组动物空腹血糖值平均维持在5mMol/L左右，而对照组动物空腹血糖值平均维持在25mMol/L左右。
实例12.重组人胰岛素DesB30-20K偶联物在犬中药代动力学实验
实例11单次给药实验中给药后第0、2、6、12、18、24、36、48、72小时和多次给药实验中第6次给药后第0、2、6、12、18、24、36、48、72小时分别取血，用犬胰岛素的放免试剂盒(购于北京北方生物研究所)测定和计算4只犬平均血药浓度，采用DAS2.0软件计算药代动力学参数、绘制血药浓度曲线(附图9、附图10)。
实验结果表明，DesB30-20K单次给药的t1/2为9.2hr，AUC(0-tn)为15215.8uIU/ml*h，Cmax为930.1uIU/ml*h；多次给药(间隔72小时给药1次，连续给药6次)的t1/2为9.4hr，AUC(0-tn)为15391.6uIU/ml*h，Cmax为953.2uIU/ml*h。该药代实验结果与降血糖药效实验结果相符，证明DesB30-20K具有体内半衰期长的特点，且间隔72小时连续给药6次，在体内未出现DesB30-20K药物累积效应。

Claims (9)

1.DesB30的B链第29位赖氨酸ε氨基共价结合聚乙二醇的偶联物，其中，
SEQ ID NO：2的1-21位氨基酸组成DesB30的A链，SEQ ID NO：2的22-50位氨基酸组成DesB30的B链，而且第6位和第11位、第7位和第28位、第20位和第40位的半胱氨酸分别形成二硫键；并且，聚乙二醇的分子量为20K道尔顿。
2.权利要求1所述的偶联物，其特征在于，聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯。
3.权利要求1所述的偶联物，其通过如下方法制备：
取含20mmol/L Tris-HCl的浓度为2mg/ml的DesB30溶液100ml，调节pH到10.5，室温下100rpm搅拌，首先按摩尔质量比1∶2.5加入分子量为20K的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯，反应30分钟后，再按摩尔质量比1∶2.5加入分子量为20K的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯，继续反应30分钟，用1％的TFA调节pH到3.0终止反应，修饰后样品经反相制备型C18柱 层析，分离除去未修饰的DesB30、游离PEG分子、非B29位修饰的其它偶联物，其中分离条件为：A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，线性梯度洗脱收集DesB30-20K偶联物。
4.权利要求1-3任何一项所述的偶联物的制备方法，其包括：
取含20mmol/L Tris-HCl的浓度为2mg/ml的DesB30溶液100ml，调节pH到10.5，室温下100rpm搅拌，首先按摩尔质量比1∶2.5加入分子量为20K的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯，反应30分钟后，再按摩尔质量比1∶2.5加入分子量为20K的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯，继续反应30分钟，用1％的TFA调节pH到3.0终止反应，修饰后样品经反相制备型C18柱 层析，分离除去未修饰的DesB30、游离PEG分子、非B29位修饰的其它偶联物，其中分离条件为：A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，线性梯度洗脱收集DesB30-20K偶联物。
5.用于治疗Ⅰ型和Ⅱ型糖尿病的药物，其包含有有效治疗的剂量的权利要求1-3任何一项所述的偶联物。
6.权利要求5所述的药物，其是注射药物。
7.权利要求1-3任何一项所述的偶联物在制备能持续体内降血糖48小时以上并且与胰岛素受体结合率高于等摩尔量的重组人胰岛素的B链第29位赖氨酸ε氨基共价结合聚乙二醇的偶联物与胰岛素受体结合率的药物中的应用，其中所述重组人胰岛素的B链第29位赖氨酸ε氨基共价结合聚乙二醇的偶联物中，
SEQ ID NO：1的1-21位氨基酸组成重组人胰岛素的A链，SEQ ID NO：1的22-51位氨基酸组成重组人胰岛素的B链，而且第6位和第11位、第7位和第28位、第20位和第40位的半胱氨酸分别形成二硫键；并且，聚乙二醇的分子量为20K道尔顿。
8.权利要求7所述的应用，其特征在于聚乙二醇为单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯。
9.权利要求7所述的应用，其中所述重组人胰岛素的B链第29位赖氨酸ε氨基共价结合聚乙二醇的偶联物通过如下方法制备：
取含20mmol/L Tris-HCl的浓度为2mg/ml的重组人胰岛素溶液100ml，调节pH到10.5，室温下100rpm搅拌，首先按摩尔质量比1∶2.5加入分子量为20K的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯，反应30分钟后，再按摩尔质量比1∶2.5加入分子量为20K的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺基丙酸酯，继续反应30分钟，用1％的TFA调节pH到3.0终止反应，修饰后样品经反相制备型C18柱 层析，分离除去未修饰的重组人胰岛素、游离PEG分子、非B29位修饰的其它偶联物，其中分离条件为：A液为0.1％三氟乙酸和5％乙腈，B液为0.1％三氟乙酸和95％乙腈，线性梯度洗脱收集Ins-20K偶联物。
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