CN103957926B - 具有增强的作用持续时间和降低的免疫原性的工程改造的多肽 - Google Patents

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Abstract

提供具有特别良好的作用持续时间、高效能和/或方便的给药方案(包括每周一次给药)的化合物。所述化合物是工程改造的多肽，其包含白蛋白结合结构域与一种或多种生物活性多肽的组合。还提供治疗疾病和病症的药物组合物和方法，所述疾病和病症包括脂质营养不良、血脂障碍、高血脂、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病或糖尿病(包括I型和II型)。可通过本文所述的化合物和方法治疗的其它疾病和病症包括非酒精性脂肪肝炎(NASH)和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X和亨廷顿氏病。

Description

具有增强的作用持续时间和降低的免疫原性的工程改造的 多肽
序列表
本申请包含序列表，其通过EFS-Web以ASCII格式提交，并通过引用以其整体予以结合。所述ASCII副本创建于2012年7月3日，命名为1320USPR.txt，大小为450,377字节。
发明背景
本申请涉及具有良好的作用持续时间、高效能和/或方便的给药方案的化合物以及其使用方法。本文提供了工程改造的多肽，其包含白蛋白结合结构域与生物活性肽的组合。不希望被任何理论所束缚，认为因为本文所述的工程改造的多肽可结合白蛋白，因此当在循环时所述化合物可被螯合(例如，结合到白蛋白)，由于例如肾清除率和/或降解减少而导致作用持续时间增加。可顺从所述治疗的疾病包括脂质营养不良、血脂障碍、高血脂、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病、糖尿病(包括I型和II型)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X和亨廷顿氏病或其组合。
仍有需要开发可用于上文所述代谢疾病、病况和病症的多肽。因此，本发明的一个目标是提供可用于治疗上述病况的具有延长的半寿期的工程改造的多肽和制备及利用所述多肽的方法。
本文引用的每个专利、专利申请和出版物通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
发明简述
提供了具有对白蛋白的结合亲和力和另外治疗效用的工程改造的多肽化合物。所述化合物是工程改造的多肽，其包含能够结合白蛋白的白蛋白结合结构域(ABD)多肽和激素结构域(HD)多肽，所述HD多肽与ABD共价连接，可具有生物学活性并且可诱发有益的生物学反应。本文所述的ABD或HD多肽中的任一个可任选在工程改造的多肽中通过接头L (例如，如本文所述的L1)共价键合。不希望受任何理论的束缚，认为因为本文所述的工程改造的多肽可结合白蛋白，所述化合物可在受试者中被螯合，导致在受试者中的作用持续时间增加。
在第一方面，提供如本文所述的工程改造的多肽。所述工程改造的多肽包含白蛋白结合结构域多肽(ABD)和激素结构域(HD1)。所述激素结构域包含其为瘦蛋白、瘦蛋白的类似物或其活性片段的多肽。
在另一方面，提供用于在需要治疗的受试者中治疗疾病或病症的方法。所述方法包括将如本文所述的工程改造的多肽给予受试者。
在仍另一方面，提供药物组合物，其包含与药学上可接受的赋形剂组合的本文所述的工程改造的多肽化合物。
在仍另一方面，提供编码工程改造的多肽的多核苷酸和它们的中间体、带有所述多核苷酸的表达载体、表达所述多核苷酸的宿主细胞和用于它们表达、合成、翻译后修饰和分离的手段。
附图简述
图1是可用于本文公开的工程改造的多肽的白蛋白结合多肽(SEQ ID NO:301-452、SEQ ID NO:454-463、SEQ ID NO:500-593)、通过N-端甘氨酸残基而延长的来自链球菌菌株G148的蛋白G的GA3结构域(SEQ ID NO:453)和先前由Jonsson等所述的源自G148-GA3的白蛋白结合多肽(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527；SEQ ID NO:454)的实例的氨基酸序列列表。
图2显示在Biacore仪器上进行的结合分析的结果，用于研究白蛋白结合多肽PEP07912 (SEQ ID NO: 456)与人血清白蛋白的结合。将三个不同浓度的纯化蛋白(40 nM，粗灰线；10 nM，黑线；2.5 nM，灰线)注入到具有955 RU的固定人血清白蛋白的表面上。
图3A-C显示通过ELISA进行的结合分析的结果，其用于研究白蛋白结合多肽PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968 (即，与PEP07911 (SEQ ID NO:459)缀合的DOTA)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)与存在于126份单独的正常人血清中的IgG分子的结合，其中A)显示平均OD值，B)显示阴性血清的百分比(由OD <0.15定义)，和C)显示阳性血清的百分比(由OD >1.0定义)。
图4A-C为显示在CD3+ CD4+细胞增殖测定法中白蛋白结合多肽PEP07913 (SEQ IDNO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (即，与PEP07911 (SEQ ID NO:459)缀合的DOTA)的免疫原性评估的图示。A)显示，在52个高加索人供体中，与重组人白蛋白比较，响应所述白蛋白结合多肽的个体的数量。B)显示与含有重组人白蛋白的阴性对照相比，PEP07913、PEP07912、PEP07914和PEP07968的平均刺激指数(SI)。C)显示与缓冲液对照相比，对研究中所有蛋白有响应的个体的数量。
图5描述在白蛋白存在下由化合物2产生的瘦蛋白功能活性，如实施例7所描述。
图6A-6B描述如实施例8所述给予大鼠后，单一给予本文所述的指定工程改造多肽对食物摄取和体重变化的影响(%溶媒-校正)。图6A：食物摄取。图6B：体重变化(%溶媒-校正)。
图7A-7B描述如实施例9所述给予大鼠后，单一给予本文所述的指定工程改造多肽对食物摄取和体重变化的影响(%溶媒-校正)。图7A：食物摄取。图7B：体重变化(%溶媒-校正)。
图8描述如实施例10所述给予大鼠后，单一给予本文所述的指定工程改造多肽对体重变化的影响(%溶媒-校正)。
图9描述如实施例11所述给予大鼠后，单一给予本文所述的指定工程改造多肽对体重变化的影响(%溶媒-校正)。
图10为描述在两组大鼠中单独或组合给予瘦蛋白(125 μg/kg/天)和胰岛淀粉样多肽(1500 μg/kg/天)对体重影响的图：一组为极肥胖大鼠，另一组为热量限制下降至中等肥胖的范围。
图11为描述单独或组合给予化合物64 (120 nmol/kg)和PEG-大鼠胰岛淀粉样多肽(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 148) (125 nmol/kg))经4周对体重影响的图。
图12描述如实施例16所述给予STZ-诱导的T1DM小鼠后，本文所述的指定工程改造多肽对血糖的影响。
图13描述如实施例16所述给予STZ-诱导的T1DM小鼠后，本文所述的指定工程改造多肽对血红蛋白A1C的影响。
图14描述如实施例16所述给予STZ-诱导的T1DM小鼠后，本文所述的指定工程改造多肽对食物摄取和体重的影响。
图15描述如实施例16所述给予STZ-诱导的T1DM小鼠后，本文所述的指定工程改造多肽(含和不含低剂量的胰岛素)对血糖的影响。
图16描述如实施例16所述给予STZ-诱导的T1DM小鼠后，本文所述的指定工程改造多肽(含和不含低剂量的胰岛素)对血红蛋白A1C的影响。
图17描述如实施例16所述给予STZ-诱导的T1DM小鼠后，本文所述的指定工程改造多肽(含和不含低剂量的胰岛素)对食物摄取(%溶媒-校正)和体重变化(%溶媒-校正)的影响。
发明详述
I. 定义
“肥胖”和“超重”是指体重大于正常预期的哺乳动物，并且可通过例如身体外观、本领域已知的体重指数(BMI)、腰臀围比率、皮褶厚度、腰围等确定。疾病控制与预防中心(CDC)将超重定义为具有25-29.9 BMI的成人；并将肥胖定义为具有30或更高BMI的成人。存在确定肥胖的其他测定法。例如，CDC规定腰臀围比率大于1.0的人为超重。
“瘦体重”是指身体的无脂肪质量，即总体重减去身体脂肪重量为瘦体重。瘦体重可通过例如本领域已知的流体静力学称重(hydrostatic weighing)、计算机化室(computerized chamber)、双能X-射线吸收测定法、皮肤测径器、磁共振成像(MRI)和生物电阻抗分析(BIA)等方法测量。
“哺乳动物”是指通常具有毛皮或毛发的温血动物，其活胎产后代并用乳喂养其后代。哺乳动物包括人类、伴侣动物(例如狗、猫)、农畜(例如奶牛、马、绵羊、猪、山羊)、野生动物等。在一个实施方案中，所述哺乳动物为雌性。在一个实施方案中，所述哺乳动物为女人。在一个实施方案中，所述哺乳动物为猫或狗。在一个实施方案中，所述哺乳动物是糖尿病哺乳动物，例如具有2型糖尿病的人类。在一个实施方案中，所述哺乳动物是肥胖型糖尿病哺乳动物，例如具有2型糖尿病的肥胖哺乳动物。在本文所述方法的背景下，术语“受试者”是指哺乳动物。
多肽背景下的“片段”在惯例的化学意义上在本文是指多肽的一部分。例如，片段可由母体多肽N-端缺失或C-端缺失一个或多个残基产生，和/或片段可由母体多肽内部缺失一个或多个残基产生。抗体背景下的“片段”是指抗体的一部分，其可与生物学活性分子连接以调节在受试者内的溶解性、分布等。例如，本文所述的瘦蛋白A200是Fc抗体片段与瘦蛋白的缀合物，如本领域已知。参见例如WO 98/28427和US2007/002084。多肽背景下的术语“母体”在惯例意义上是指作为修饰(例如插入、缺失和/或取代)前的参照结构的多肽。本文所述的工程改造的多肽背景下的术语“缀合物”是指组分多肽(例如ABD、HD1等)之间的共价连接。本文所述的工程改造的多肽背景下的术语“融合物”是指组分多肽(例如ABD、HD1等)之间通过肽骨架的末端氨基或羧基官能团的任一个或两者的共价连接。工程改造的多肽可合成制备或重组制备。通常，融合物使用重组生物技术制备，然而还可通过本领域已知的化学合成和缀合方法制备。
多肽背景下本文所用的“类似物”是指相对于母体化合物，具有氨基酸的插入、缺失和/或取代的化合物。类似物可具有优良的稳定性、溶解性、功效、半寿期等。在一些实施方案中，类似物是与母体化合物具有至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性的化合物。
在比较两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，“同一性”、“序列同一性”等是指相同的或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当在比较窗或指定区域内比较和比对最大一致性时，在特定区域内约50%同一性、优选50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高同一性)的两个或更多个序列或亚序列，如使用本领域已知的序列比较算法例如BLAST或BLAST 2.0所测定。该定义包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列，以及天然存在的例如多态性或等位基因变体和人工变体。在优选的算法中，如本领域已知的，计算空位等。对于序列比较，通常一个序列作为参照序列，测试序列与其比较。当使用序列比较算法时，将测试和参照序列输入计算机，如果必要的话指定亚序列的坐标，并指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数，或者可指定备选参数。然后，基于程序参数，序列比较算法计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。可例如通过Smith & Waterman, 1981, Adv. Appl. Math. 2:482的局部同源性算法，通过Needleman & Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48:443的同源性比对算法，通过Pearson & Lipman, 1988, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444的类似性检索方法，通过这些算法(Wisconsin Genetics Software Package, GeneticsComputer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)的计算机化执行，或通过人工比对和目测进行序列比较的最优比对。参见例如Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel等编辑，1995年增刊)。适于确定百分比序列同一性和序列类似性的算法的优选实例包括BLAST和BLAST 2.0算法，其描述于Altschul等, 1977, Nuci. Acids Res. 25:3389-3402和Altschul等, 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410。如本领域已知，使用BLAST和BLAST 2.0确定本发明的核酸和蛋白质的百分比序列同一性。用于进行BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(National Center forBiotechnology Information)的网站公开可得的。该算法包括首先通过鉴定查询序列中长度W的短的字码(word)来确定高得分序列对(HSP)，所述查询序列当与数据库序列中相同长度的字码进行比对时，匹配或满足某一正值阈值得分T。将T称为邻近字码得分阈值(Altschul等，同上)。这些起始的邻近字码命中(hit)作为用于开始检索发现含有它们的更长HSP的种子。字码命中在两个方向上沿每个序列延伸，直到累积的比对得分可增加。使用例如用于核苷酸序列的参数M (对于匹配残基对的奖分；总是大于0)和N (对于错配残基的罚分；总是小于0)计算累积的得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积的得分。在以下情况时，停止在每个方向上字码命中的延伸：累积比对得分从其最大获取值减少了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的积聚，累积得分转为零或零以下；或者到达任一个序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(用于核苷酸序列)默认使用字长(W)为11，期望值(E)为10，M=5，N=-4，以及双链比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序默认使用字长为3，期望值(E)为10，和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff &Henikoff, 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915)比对(B)为50，期望值(E)为10，M=5，N=-4以及双链比较。
在数值背景下术语“约”是指数值的+/- 10%，除非明确另外指明。
在本文所述的工程改造的多肽的组分的背景下，术语“肽”和“多肽”是同义的。
II. 化合物
在第一方面，提供工程改造的多肽化合物，其包含白蛋白结合结构域(ABD)多肽和至少一个多肽激素结构域(HD1)。术语“白蛋白结合结构域”、“ABD”等是指能够结合本文所述的白蛋白的多肽。术语“激素结构域”、“激素结构域多肽”等是指能够在受试者中诱发生物学反应的多肽。示例性激素结构域包括但不限于瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段，但还可以是瘦蛋白衍生物例如PEG化衍生物。
令人惊讶地发现，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、活性瘦蛋白片段或其瘦蛋白衍生物可与极高亲和力的白蛋白结合结构域(ABD)融合(所述ABD源自本文所述的细菌蛋白的白蛋白结合结构域)，同时保留足够的瘦蛋白生物学活性和具有延长的作用持续时间，例如在啮齿动物中至少3天和甚至5天，其在人受试者中转变为至少1周或更长的持续时间。这令人吃惊，部分是因为所述ABD肽未曾广泛证实作为治疗蛋白载体是一个稳健的平台，它们相对疏水，其可不利地与所连接的治疗肽相互作用，并且对于至少一个家族的肽激素而言其不能作为载体。例如，大鼠胰岛淀粉样多肽化合物(例如SEQ ID NO:108)当与本文所述的ABD缀合或融合时，在相同的啮齿动物模型未显示出任何明显的或长效的体内活性，其中发现本发明的各种瘦蛋白工程改造多肽构建体具有活性和长的作用持续时间。
此外，本文的治疗缀合物或融合物化合物令人惊讶地保留了白蛋白结合亲和力和特异性，同时具有较低的免疫原性和瘦蛋白治疗活性。所述化合物令人惊讶地具有活性，尽管在瘦蛋白、瘦蛋白类似物、活性瘦蛋白片段或瘦蛋白衍生物和ABD之间缺少血浆蛋白酶切割位点。更令人惊讶的是，认为所述治疗化合物即使当与白蛋白结合时也具有活性。本文所述的ABD化合物提供白蛋白结合亲和力和特异性，同时具有比之前所述的ABD化合物更低的免疫原性，所述之前所述的ABD化合物基于链球菌G蛋白菌株148 (G148)的白蛋白结合区并在Jonsson 等(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527)中。最近，在链球菌G蛋白菌株148 (G148)的白蛋白结合区内通过实验鉴定了几个T-细胞和B-细胞表位(Goetsch等, Clin. Diagn. Lab. Immunol. 10:125-32, 2003)。作者对在疫苗中利用G148的T-细胞表位感兴趣，即利用白蛋白结合区的固有免疫刺激特性。Goetsch等另外在G148序列中发现一个B-细胞表位，即免疫后与抗体结合的区域。在用于人给予的药物组合物中，无免疫反应是合乎需要的。因此，由于白蛋白结合结构域G148的上述免疫刺激特性，从而不优选用于所述组合物中。
生物学活性组分。预期用于本文所述的化合物和方法的生物学活性化合物组分包括瘦蛋白。术语“生物学活性化合物”等在惯常意义上是指化合物例如多肽等，其可诱发生物学反应。
瘦蛋白。“瘦蛋白”和“一种瘦蛋白”分别指：瘦蛋白、瘦蛋白活性片段、瘦蛋白类似物和瘦蛋白衍生物；一种瘦蛋白、一种瘦蛋白活性片段、一种瘦蛋白类似物和一种瘦蛋白衍生物。因此，除非另外说明，否则提及“瘦蛋白”是指包括瘦蛋白、瘦蛋白活性片段、瘦蛋白类似物和瘦蛋白衍生物，如本文所公开。同样地，除非另外说明，提及“一种瘦蛋白”是指包括一种瘦蛋白、一种瘦蛋白活性片段、一种瘦蛋白类似物和一种瘦蛋白衍生物，如本文所公开。在设计、制备和利用本文所公开的工程改造多肽中可使用的示例性所述瘦蛋白包括诱发一种或多种本领域已知的生物学反应(当将瘦蛋白给予受试者时而诱发)的那些(参见例如，公布的美国专利申请号US 2007/0020284和US 2008/0207512，美国专利号6,309,853和US 7,183,254，以及PCT公布申请号WO 96/005309、WO 98/28427和WO 2009/064298)，所述生物学反应例如：减少食物摄取、减少体重、减少体重增加、诱导饱食感、减少热量利用度、减少热量效率、降低代谢平台、增加胰岛素敏感度、减少高脂血症、纠正血脂障碍、减少高甘油三酯血症、改善肥胖、改善超重、改善糖尿病(包括I型糖尿病、II型糖尿病和妊娠期糖尿病)、改善胰岛素抵抗、改善与其相关的脂质营养不良病况以及本领域已知的给予瘦蛋白后而诱发的其它生物学反应(参见例如，公布的美国专利申请号US 2007/0020284和US 2008/0207512，美国专利号6,309,853和US 7,183,254，以及PCT公布申请号WO 96/005309、WO98/28427和WO 2009/064298)。
适合用于设计、制备和利用本文所述的工程改造多肽的示例性瘦蛋白包括但不限于描述于美国专利号US 5,594,101、US 5,851,995、US 5,691,309、US 5,580,954、US 5,554,727、US 5,552,523、US 5,559,208、US 5,756,461、US 6,309,853，公布的美国专利申请号US 2007/0020284，以及PCT公布申请号WO 96/23517、WO 96/005309、WO 98/28427、WO2004/039832、WO 98/55139、WO 98/12224和WO 97/02004中的化合物，其各自通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。在体内和体外测定瘦蛋白活性和生物学反应(包括饱食感、食物摄取抑制活性和体重减轻活性)的方法是本领域已知的，在本文中并且还在上述参考文献和本文引用的其它参考文献中描述。
可使用本领域已知的任何瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物，以制备和利用本文全文所公开的工程改造多肽。预期用于本文所述的工程改造多肽和方法的代表性瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段和瘦蛋白衍生物还包括以下：
成熟鼠瘦蛋白：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC，其中第28位的Xaa是Q或不存在(SEQ IDNO:1)。
成熟鼠瘦蛋白1型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ IDNO:143)。
成熟鼠瘦蛋白2型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ IDNO:144)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟鼠瘦蛋白：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC，其中第29位的Xaa为Q或不存在(SEQ IDNO:2)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟鼠瘦蛋白1型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQID NO:145)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟鼠瘦蛋白2型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSAKQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQVLTSLPSQNVLQIANDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTSGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQ IDNO:146)。
成熟猪瘦蛋白：
VPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQ IDNO:3)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟猪瘦蛋白：
MVPIWRVQDDTKTLIKTIVTRISDISHMQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLASSKSCPLPQARALETLESLGGVLEASLYSTEVVALSRLQGALQDMLRQLDLSPGC (SEQID NO:4)。
成熟牛瘦蛋白：
VPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC，其中第28位的Xaa是Q或不存在(SEQ IDNO:5)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟牛瘦蛋白：
MVPICKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHT-Xaa-SVSSKQRVTGLDFIPGLHPLLSLSKMDQTLAIYQQILTSLPSRNVVQISNDLENLRDLLHLLAASKSCPLPQVRALESLESLGVVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLRQLDLSPGC，其中第29位的Xaa是Q或不存在(SEQ IDNO:6)。
未加工的全长人瘦蛋白(即，包含21残基的N-端信号序列):
MHWGTLCGFLWLWPYLFYVQAVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ ID NO: 7)。
成熟人瘦蛋白(去除了N-端21氨基酸的信号序列)：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，其中：第27位的Xaa为T或A；和第28位的Xaa为Q或不存在(SEQ ID NO:8)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISH-Xaa-Xaa-SVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC，其中：第28位的Xaa为T或A；和第29位的Xaa是Q或不存在(SEQ ID NO:9)。
成熟恒河猴(rhesus)瘦蛋白：
VPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:10)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟恒河猴瘦蛋白：
MVPIQKVQSDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQRVTGLDFIPGLHPVLTLSQMDQTLAIYQQILINLPSRNVIQISNDLENLRDLLHLLAFSKSCHLPLASGLETLESLGDVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQID NO:11)。
成熟大鼠瘦蛋白：
VPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQ IDNO:12)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟大鼠瘦蛋白：
MVPIHKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSARQRVTGLDFIPGLHPILSLSKMDQTLAVYQQILTSLPSQNVLQIAHDLENLRDLLHLLAFSKSCSLPQTRGLQKPESLDGVLEASLYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO:13)。
成熟鸭嘴兽(platypus)瘦蛋白：成熟鸭嘴兽瘦蛋白序列如下：
ISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ IDNO:14)。
未加工的全长鸭嘴兽瘦蛋白(即，包含21残基的N-端信号序列)：包含21残基N-端信号序列的全长序列的鸭嘴兽瘦蛋白如下：
MRCILLYGFLCVWQHLYYSHPISIEKIQADTKTLTKTIITRIIQLSTQNGVSTDQRVSGLDFIPGNQQFQNLADMDQTLAVYQQILSSLPMPDRTQISNDLENLRSLFALLATLKNCPFTRSDGLDTMEIWGGIVEESLYSTEVVTLDRLRKSLKNIEKQLDHIQG (SEQ ID NO:15)。
成熟人瘦蛋白1型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:16)。
成熟人瘦蛋白2型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:17)。
成熟人瘦蛋白3型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:18)。
成熟人瘦蛋白4型：
VPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:19)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白1型(亦称为美曲普汀或A100)：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQID NO:20)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白2型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHAQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQID NO:21)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白3型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:22)。
具有N-端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白4型：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHASVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:23)。
海豹瘦蛋白：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ IDNO:24)。
海豹瘦蛋白，其氨基酸71-92分别被美曲普汀的氨基酸73-94 (螺旋3)置换：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ IDNO:25)。
海豹瘦蛋白，其氨基酸30和71-92分别被美曲普汀的氨基酸32和73-94 (螺旋3)置换：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ IDNO:26)。
具有N-端甲硫氨酸的海豹瘦蛋白：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRSVVQIANDLANLRALLRLLASAKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ IDNO:27)。
具有N-端甲硫氨酸的海豹瘦蛋白，并且其氨基酸71-92分别被美曲普汀的氨基酸73-94 (螺旋3)置换：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVCSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ IDNO:28)。
具有N-端甲硫氨酸的海豹瘦蛋白，并且其氨基酸30和71-92分别被美曲普汀的氨基酸32和73-94 (螺旋3)置换：
MPIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISPPQGVSSRPRVAGLDFIPRVQSVRTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ IDNO:29)。
海豹瘦蛋白，其氨基酸71-92分别被美曲普汀的氨基酸73-94 (螺旋3)置换，并且其氨基酸23-49分别被美曲普汀的氨基酸25-51 (AB环)置换：
PIQRVQDDTKTLIKTIITRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSGMDQILATYQQILTSLQSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCPVPRARGSDTIKGLGNVLRASVHSTEVVALSRLKAALQDMLRQLDRNPGC (SEQ IDNO:680)。
瘦蛋白A200：瘦蛋白A200是Fc抗体片段与瘦蛋白的缩合产物，如本领域已知。参见例如，Lo等, 2005, Protein Eng. Design & Selection, 18:1-10。A200的氨基酸序列如下：
MDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQ IDNO:30)。
瘦蛋白A300：瘦蛋白A300是具有W101Q和W139Q取代的美曲普汀(N-端1Met计为残基1)：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQID NO:31)。
瘦蛋白A400：瘦蛋白A400是其第78位丝氨酸残基被半胱氨酸残基置换的美曲普汀，如下所示：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQICNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPWASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPGC (SEQID NO: 32)；20千道尔顿(KDa)的PEG部分通过第78位的半胱氨酸残基连接于其上。
瘦蛋白A500：包括本发明人在内的大量研究人员的研究集中在对瘦蛋白中残基取代的聚集的影响上。参见例如，Ricci等, 2006. “Mutational approach to improvephysical stability of protein therapeutics susceptible to aggregation: Roleof altered conformation in irreversible precipitation (改进对聚集敏感的蛋白治疗剂的物理稳定性的突变方法：改变的构象在不可逆沉淀中的作用),” Book Chapter.In: Misbehaving Proteins: Protein (Mis)Folding, Aggregation, and Stability,Murphy RM, Tsai AM主编, New York. Springer. 第331-350页，其通过引用结合到本文中并用于所有目的。因此，具有以下序列的瘦蛋白A500已用于本文所述的某些化合物和方法中：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLESLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQID NO:33)。
瘦蛋白A100变体：具有下列残基取代的瘦蛋白A100变体如下：
D41E、H98S、W101Q、D109E、G113E、M137I、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLEFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO: 664)。
H98S、W101Q、A102T、G113E、M137I、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO: 665)。
H98S、W101Q、G113E、M137I、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO: 666)。
W101Q、G113E、M137I、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO: 667)。
H98S、W101Q、M137I、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO: 668)。
W101Q、G113E、M137I、W139Q、L143V和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQID NO: 669)。
H98S、W101Q、A102T、M137I、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO: 670)。
H98S、W101Q、D109E、G113E和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQASGLETLESLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC (SEQID NO: 671)。
W101Q、M137I、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDLSPEC (SEQID NO: 672)。
W101Q、M137I、W139Q、L143V和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQID NO: 673)。
H98S、W101Q、A102T、M137I、W139Q、L143V和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGGVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDILQQLDVSPEC (SEQID NO: 674)。
H98S、W101Q、A102T、G113E和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCSLPQTSGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLWQLDLSPEC (SEQID NO: 675)。
W101Q、G113E和W139Q：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPGC (SEQID NO: 676)。
W101Q、G113E、W139Q和G146E：
MVPIQKVQDDTKTLIKTIVTRINDISHTQSVSSKQKVTGLDFIPGLHPILTLSKMDQTLAVYQQILTSMPSRNVIQISNDLENLRDLLHVLAFSKSCHLPQASGLETLDSLGEVLEASGYSTEVVALSRLQGSLQDMLQQLDLSPEC (SEQID NO: 677)。
上述瘦蛋白、瘦蛋白类似物或它们的活性片段以及下文所述瘦蛋白中的任何一种适合用于本发明的工程改造多肽，其带有或不带有连接到ABD的接头。
白蛋白结合结构域(ABD)肽。对于之前所公开的源自链球菌G蛋白菌株148 (G148)的白蛋白结合结构域和对于对白蛋白具有高亲和力的一些变体，例如WO09/016043，较高的亲和力以降低热稳定性为代价获得。此外，已报道在G148的白蛋白结合区内实验性地鉴定了T-细胞和B-细胞表位(Goetsch等, Clin Diagn Lab Immunol 10:125-32, 2003)。研究背后的作者对在疫苗中利用G148的T-细胞表位感兴趣，即利用白蛋白结合区的固有免疫刺激特性。Goetsch等另外发现了在G148序列中的一个B-细胞表位，即免疫后与抗体结合的区域。因此，白蛋白结合结构域G148和源自G148的多肽以及由此含有它们的融合物/缀合物，具有上述免疫刺激特性的风险。在用于人类给予的药物组合物中，没有(或降低)免疫反应是合乎需要的。
所述融合物和/或缀合物的上述缺点和缺陷通过使用本文所公开的用于本发明的工程改造的多肽的白蛋白结合结构域(ABD)肽来克服或降低。因此，在一个实施方案中，包含本文所述的长持续时间的工程改造的多肽缀合物或融合物的白蛋白结合结构域多肽是一个三螺旋束蛋白结构域，其包含白蛋白结合基序和包括三螺旋构象的其他序列。所述ABD为具有可比较的高白蛋白亲和力的那些，并源自链球菌菌株G148的细菌G蛋白的白蛋白结合结构域，还按本文所述进行修饰以进一步提供合乎需要的免疫学特性，例如降低的免疫原性。所述ABD描述于PCT公布申请号WO 2012/004384，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。同样地，预期用于本文所述的工程改造的多肽的ABD肽优于如Jonsson等(Protein Eng. Design & Selection, 2008, 21:515-527)所述具有白蛋白结合序列的那些，并且那些ABD肽还描述于PCT公布申请号WO2009/016043。将本文所述的白蛋白结合结构域多肽与瘦蛋白或其类似物或其活性片段融合以创建本文所述的工程改造的多肽。适合用于与瘦蛋白化合物缀合或融合的白蛋白结合结构域多肽可包含ABD氨基酸序列，其包含选自以下的序列：
式(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300)
其中彼此独立地，
X3选自E、S、Q和C；
X6选自E、S和C；
X7选自A和S；
X10选自A、S和R；
X14选自A、S、C和K；
X26选自D和E；
X39选自D和E；
X40选自A和E；
X43选自A和K；
X44选自A、S和E；
第45位上的亮氨酸是存在或不存在的；并且
第46位上的脯氨酸是存在或不存在的；和
式(ii) 与(i)中定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，
条件是X7不是L、E或D；
或者备选地，
条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L、E和D；
Xc选自N、L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；和
X5选自Y和F；
X8选自N、R和S；
X9选自V、I、L、M、F和Y；
X11选自N、S、E和D；
X12选自R、K和N；
X14选自K和R；
X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；
X23选自K、I和T；
X24选自A、S、T、G、H、L和D；和
X25选自H、E和D。
在根据上文第一方面的白蛋白结合多肽—式(i)或(ii)的其他实施方案中，X6为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X7为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为C。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为R。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X26为D。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X39为D。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X39为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X40为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X43为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X44为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X44为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，第45位上的亮氨酸是存在或不存在的。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，第46位上的脯氨酸是不存在的。
在其他优选的实施方案中，适合于与瘦蛋白化合物缀合或融合的白蛋白结合结构域多肽可包含选自以下的ABD氨基酸序列：
式(iii) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 678)
其中彼此独立地，
X3选自E、S、Q和C；
X6选自E、S和C；
X7选自A和S；
X10选自A、S和R；
X14选自A、S、C和K；
第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和
第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和
式(iv) 与(iii)中定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，
条件是X7不是L、E或D；
或者备选地，
条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，其中彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L、E和D；
Xc选自N、L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；和
X5选自Y和F；
X8选自N、R和S；
X9选自V、I、L、M、F和Y；
X11选自N、S、E和D；
X12选自R、K和N；
X14选自K和R；
X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；
X23选自K、I和T；
X24选自A、S、T、G、H、L和D；和
X25选自H、E和D。
在根据该方面的白蛋白结合多肽—式(iii)或(iv)的其他实施方案中，X6为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X3为E。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X7为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X14为C。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为A。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为S。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，X10为R。在根据该方面的白蛋白结合多肽的另一实施方案中，第45位上的亮氨酸是存在或不存在的。在其他实施方案中，C-端脯氨酸是存在的。在其他实施方案中，脯氨酸是不存在的。
在式(i)-(iv)中的任一个的其他实施方案中，ABD包含一个或多个N-端螺旋封端的氨基酸，并且在其他实施方案中，所述螺旋封端的氨基酸可以是丝氨酸，或者可以是甘氨酸-丝氨酸。因此对于本文所公开的每个白蛋白结合结构域序列，包括在附图和序列表中的那些，对在工程改造的多肽中如本文公开的所有方面所特别预期的还为对应于包含在其中的式(i)-(iv)中任一个的ABD、它们的Ser-ABD、Gly-Ser-ABD、Gly-ABD、Ala-ABD和它们的脱C-端-脯氨酸序列的白蛋白结合结构域。
因此，还包括(i)或(iii)的修饰变体，其使得得到的序列与属于(i)或(iii)所定义的类别的序列具有至少95%同一性。例如，有可能的是，属于氨基酸残基的某一功能性分类(例如疏水性、亲水性、极性等)的氨基酸残基可替换为来自相同功能组的其他氨基酸残基。
对白蛋白具有结合亲和力的上文定义的序列相关ABD多肽类别源自共同的母体多肽序列，其折叠成三α螺旋束结构域。更具体地，上述多肽源自基于血清白蛋白和白蛋白结合结构域(G148-GA3)之间的复合物结构的模型构建(Lejon等, J. Biol. Chem. 279:42924-8, 2004)，以及共同母体多肽序列的大量突变变体的结合和结构特征分析。与母体多肽序列相比，式(i)-(iv)中任一个的上文定义的氨基酸序列包含氨基酸取代，其产生了一类多肽，所述多肽期望折叠成几乎相同的三螺旋束结构域。当母体多肽序列已经包含与白蛋白相互作用的结合表面时，所述结合表面通过一些上文定义的取代来修饰。与母体多肽序列相比，上文定义的取代提供改进的白蛋白结合能力。重要及令人惊讶的是，除了保留和/或改进对白蛋白的强亲和力之外，上文定义的取代还提供增强的免疫学特性。
因此，根据公开内容的第一方面，白蛋白结合多肽显示一组特性，所述特性例如使它们适合用作用于人类给予的治疗性分子的融合物或缀合物配偶体。重要及令人惊讶的是，例如与相关的白蛋白结合多肽例如白蛋白结合结构域G148-GA3和公开于WO09/016043中的白蛋白结合多肽相比较，本公开内容的白蛋白结合多肽显示下列6个特性中的至少5个：
(1)与例如G148-GA3和其他细菌来源的白蛋白结合结构域相比，所述多肽显示不同的表面。该差异可降低或消除对受试者(例如人)中抗体反应的任何风险，所述受试者先前已暴露于这类细菌蛋白。
(2)所述多肽包含比，例如，G148-GA3和共同母体多肽序列的其他相关但不同的突变变体更少的潜在T-表位，由此当给予受试者(例如人)时显示低和/或较低的免疫原性。
(3)所述多肽当给予受试者(例如人)时，显示较低的与循环抗体的反应性。因此，通过在暴露于循环抗体的多肽表面上(即，在不涉及与白蛋白结合相互作用的多肽表面上)的氨基酸取代，如在测试组的人血清中所测量，与例如由G148-GA3引起的抗体交叉反应性相比，降低了抗体交叉反应性。
(4)根据比，例如，已知天然存在的白蛋白结合多肽(例如源自细菌蛋白的白蛋白结合结构域)更高的由KD值定义的结合亲和力和更慢的由koff值定义的解离速率两者，所述多肽具有高白蛋白结合能力。
(5)所述多肽包含比，例如，已知天然存在的白蛋白结合多肽(例如源自细菌蛋白的白蛋白结合结构域)更少的氨基酸残基，所述氨基酸残基与多肽的稳定性问题相关。因此，例如所述多肽不包含氧化倾向的甲硫氨酸或色氨酸，和仅包含一个天冬酰胺。
(6)所述多肽具有比先前的白蛋白结合多肽(例如在WO09/016043中公开的那些)更高的结构稳定性，如由大于55℃的熔点所定义。
在一个实施方案中，根据第一方面的缀合物/融合物的白蛋白结合多肽显示所有6个上文所述的特性。在另一实施方案中，根据第一方面的白蛋白结合多肽当与白蛋白结合时，显示比，例如，先前的白蛋白结合多肽(例如在WO09/016043中公开的那些)更具亲水性的特征。当所述多肽与白蛋白相互作用时，暴露于环境的白蛋白结合多肽的表面包含较少的赋予表面疏水性的氨基酸残基。
ABD肽与白蛋白以至多1 x 10-6 M、甚至更优选至多1 x 10-9 M (甚至更紧密的亲和力)的相互作用的KD值结合。更优选相互作用的KD值为至多1 x 10-10 M、甚至更优选至多1x 10-11 M、甚至更优选至多1 x 10-12 M和甚至进一步至多1 x 10-13 M。所述值最优选是对人血清白蛋白(“HSA”)的亲和力。
在本发明的实施方案中(其中基序“形成三螺旋束蛋白结构域的一部分”)，这理解为是指白蛋白结合基序的序列“插入”或“移植”或“融合”至天然存在(或其他方式来源)的三螺旋束结构域序列中，使得所述基序置换了原始结构域中的类似结构基序。例如并且不希望受理论的束缚，认为所述基序构成三螺旋束的三个螺旋中的两个，并且可置换任何三螺旋束内的两螺旋基序。用本文所公开的两个基序螺旋对三螺旋束结构域中的两个螺旋进行置换，使得不影响多肽的基本结构。即，本发明的该实施方案的多肽骨架的总体折叠基本上与它形成其一部分的三螺旋束蛋白结构域的总体折叠相同，例如具有相同顺序的相同二级结构元件等。因此，可用于本文工程改造多肽的基序可形成三螺旋束结构域的一部分，如果该实施方案的多肽具有与原始结构域相同的折叠，这意味着基础结构特性是共享的，所述特性例如产生类似的CD谱。
本说明书中所用的术语“白蛋白结合”和“白蛋白结合亲和力”是指多肽的一种性质，其可通过例如使用表面等离振子共振技术，例如在Biacore仪器上检测。例如，如下文实施例中所述，白蛋白结合亲和力可在这样的实验中检测，在所述实验中，将白蛋白或其片段固定在仪器的传感器芯片上，并且使含有待检测多肽的样品通过所述芯片。或者，将待检测的多肽固定在仪器的传感器芯片上，并使含有白蛋白或其片段的样品通过所述芯片。在这点上，白蛋白可以是来自哺乳动物的血清白蛋白，例如人血清白蛋白。然后，技术人员可分析通过所述实验获得的结果，以至少建立多肽对白蛋白的结合亲和力的定性测量。如果需要定量测量，例如测定相互作用的KD值，也可使用表面等离振子共振方法。可例如在Biacore2000仪器(GE Healthcare)上确定结合值。将白蛋白合适地固定在测量的传感器芯片上，通过连续稀释制备其亲和力待测定的多肽样品，并将其注入。然后，可使用例如由仪器制造商(GE Healthcare)提供的BIAevaluation 4.1软件的1:1 Langmuir结合模型从结果计算KD值。
在一个实施方案中，根据该方面的白蛋白结合多肽与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-5 s-1、例如至多5 x 10-6 s-1。
在另一实施方案中，白蛋白结合多肽的氨基酸序列选自SEQ ID NO:301-452、SEQID NO:455-463和SEQ ID NO:500-593中的任一个。更具体的，氨基酸序列选自SEQ ID NO:304-305、SEQ ID NO:307-308、SEQ ID NO:310-311、SEQ ID NO:313-314、SEQ ID NO:316-317、SEQ ID NO:319-320、SEQ ID NO:322-323、SEQ ID NO:325-326、SEQ ID NO:328-329、SEQ ID NO:331-332、SEQ ID NO:334-335、SEQ ID NO:337-338、SEQ ID NO:341-342和SEQID NO:349-350。
在一个实施方案中，根据该方面的白蛋白结合多肽还包含一个或多个另外的氨基酸残基，其位于在(i)或(iii)中定义的序列的N-端和/或C-端。这些另外的氨基酸残基可起增强白蛋白与多肽结合和改进所折叠的白蛋白结合结构域的构象稳定性的作用，但可等同地良好用于其他目的，例如涉及多肽的生产、纯化、体内或体外的稳定性、偶联、标记或检测中的一个或多个以及其任何组合。所述另外的氨基酸残基可包含添加至例如HD1用于化学偶联目的的一个或多个氨基酸残基。
在一个实施方案中，紧接氨基酸序列(i)或(iii)的N-端或C-端上的α螺旋之前或之后的氨基酸可由此影响构象的稳定性。可有助于改善构象稳定性的氨基酸残基的一个实例是位于上文所定义的氨基酸序列(i)或(iii)的N-端的丝氨酸残基。在某些情况下，N-端丝氨酸残基可通过包括丝氨酸侧链的γ氧原子和谷氨酸残基的多肽骨架NH之间的氢键，形成典型的S-X-X-E封端盒。该N-端封端可有助于构成本公开内容第一方面的白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第一α螺旋的稳定。
因此，在一个实施方案中，所述另外的氨基酸残基包含在多肽的N-端上的至少一个丝氨酸残基。换言之，一个或多个丝氨酸残基在ABD氨基酸序列之前。在白蛋白结合多肽的另一实施方案中，所述另外的氨基酸包含在多肽的N-端上的甘氨酸残基。应理解，氨基酸序列(i)或(iii)的前面可以有1个、2个、3个、4个或任何合适数量的氨基酸残基。因此，氨基酸序列的前面可以有单一的丝氨酸残基、单一的甘氨酸残基或两者的组合，例如甘氨酸-丝氨酸(GS)组合或甘氨酸-丝氨酸-丝氨酸(GSS)组合。在N-端包含另外的氨基酸残基的白蛋白结合多肽的实例在SEQ ID NO:445-463、例如SEQ ID NO:445-448和SEQ ID NO:462-463中列出。在又一实施方案中，所述另外的氨基酸残基包含在如序列式(i)或(iii)所定义的多肽的N-端上的谷氨酸。
类似地，可利用C-端封端以提高构成白蛋白结合多肽的三螺旋结构域的第三α螺旋的稳定性。在(i)或(iii)定义的氨基酸序列的C-端存在的C-端脯氨酸残基可至少部分起到封端残基的作用。C-端上脯氨酸残基后的赖氨酸残基通过赖氨酸残基的ε氨基和在多肽骨架上位于赖氨酸之前的两个和三个残基的氨基酸的羰基(例如(i)或(iii)定义的氨基酸序列的亮氨酸和丙氨酸残基的羰基)之间的氢键，可有助于白蛋白结合多肽的第三螺旋的进一步稳定。因此，在一个实施方案中，所述另外的氨基酸包含在多肽的C-端上的赖氨酸残基。
如上所述，所述另外的氨基酸可与白蛋白结合多肽的生产有关。具体而言，当通过化学肽合成来生产第一方面的白蛋白结合多肽时，C-端脯氨酸后的一个或多个可选的氨基酸残基可提供优势。所述另外的氨基酸残基可例如阻止形成非所需的物质，例如在合成的二肽阶段的二酮哌嗪。所述氨基酸残基的一个实例是甘氨酸。因此，在一个实施方案中，所述另外的氨基酸包含在多肽C-端的甘氨酸残基，其紧接脯氨酸残基或紧接如上文所说明的另外的赖氨酸和/或甘氨酸残基之后。
在C-端包含另外的氨基酸残基的白蛋白结合多肽的实例在SEQ ID NO:445-452、例如SEQ ID NO:449-450中列出。技术人员知道实现C-端修饰的方法，例如通过用于肽合成的不同类型的预制基质。
在另一实施方案中，所述另外的氨基酸残基包含在多肽的N-端和/或C-端上的半胱氨酸残基。所述半胱氨酸残基可紧接(i)或(iii)定义的氨基酸序列之前和/或之后，或者可在上述任何其他另外的氨基酸残基之前和/或之后。在多肽链的N-端和/或C-端包含半胱氨酸残基的白蛋白结合多肽的实例在SEQ ID NO:449-450 (C-端)和SEQ ID NO:451-452(N-端)中列出。通过将半胱氨酸残基添加到多肽链中，可获得用于白蛋白结合多肽的位点定向缀合的巯基。或者，可将硒代半胱氨酸残基以与引入半胱氨酸残基类似的方式引入到多肽链的C-端，以利于位点特异性缀合(Cheng等, Nat Prot 1:2, 2006)。
在一个实施方案中，白蛋白结合多肽包含不超过两个半胱氨酸残基。在另一实施方案中，白蛋白结合多肽包含不超过一个半胱氨酸残基。
在另一实施方案中，白蛋白结合多肽的另外的氨基酸残基包含用于纯化或检测多肽的“标签”，例如六组氨酰基(His6)标签、(SEQ ID NO: 34)、或“myc”(“c-Myc”)标签或“FLAG”标签，用于与特异性针对标签的抗体相互作用和/或用于纯化。技术人员知道其他替代物。
因为白蛋白结合基序的存在，ABD肽与白蛋白结合的相互作用K值为至多1 x 10-6M，甚至更优选至多1 x 10-9 M (甚至更紧密的亲和力)。更优选相互作用K值为至多1 x 10-10 M，甚至更优选为至多1 x 10-11 M，甚至更优选为至多1 x 10-12 M，且甚至更进一步为至多1 x 10-13 M。
适合用于与本文所述的活性激素结构域肽融合的各个白蛋白结合结构域多肽的序列优于Jonsson等(同上)和在WO09/016043中呈现的那些。所选的化合物公开于下表1中。还参见PCT公布申请号WO 2012/004384。本发明还包括具有与选自SEQ ID NO:301-452、SEQID NO:454-463和SEQ ID NO:500-593的序列具有95%或更大同一性的氨基酸序列的白蛋白结合多肽。在具体的实施方案中，白蛋白结合多肽的序列选自SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:463、SEQ ID NO:500、SEQ ID NO:501、SEQ ID NO:502和与其具有95%或更大同一性的序列。在本发明的其他实施方案中，白蛋白结合多肽的序列选自SEQ ID NO:454-463和与其具有95%或更大同一性的序列。在又一实施方案中，白蛋白结合多肽的序列选自SEQ ID NO:500-593和与其具有95%或更大同一性的序列。
示例性ABD种类包括但不限于以下表1和实施例中所述的化合物。
表1 所选的ABD肽。
在优选的工程改造的多肽实施方案中，ABD包含LAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 313)和其N-端延伸的ABD序列形式，所述延伸形式包括SLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO: 500)和GSLAEAKEAANAELDSYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALP (SEQ ID NO:463；PEP07986)。在第2位的丝氨酸将序列封端，与在该位置上具有甘氨酸或丙氨酸相比，提高Tm约2℃。
在优选的工程改造的多肽实施方案(其中Cys-缀合物是合乎需要的)中，优选的ABD包含LAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG (SEQ ID NO: 501)和其N-端延伸的ABD序列形式，所述延伸形式包括SLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG (SEQ ID NO: 502)和GSLAEAKEAANAELDCYGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDAILAALPG(SEQ ID NO: 448；PEP08185)。
在本文所述的工程改造的多肽、特别是在其C-端以脯氨酸或多肽合成期间已知外消旋的其他氨基酸结尾的那些多肽的一个实施方案中，可将甘氨酸添加到C-端以克服与C-端氨基酸残基的外消旋有关的潜在问题。或者，C-端氨基酸可呈其(α-氨基)酰胺化形式，例如脯氨酸vs.脯氨酰胺，而非以甘氨酸结尾。然而，如果需要通过重组而非化学合成来产生酰胺化多肽，那么C-端氨基酸的酰胺化可通过本领域已知的数种方法进行，例如使用酰胺化PAM酶。
本文的ABD完全可逆地折叠，即它们可变性并自发再折叠成所需的活性三级结构。这通过例如ABD SEQ ID NO:463的圆二色性波谱分析进行评价，其中比较在20℃下(折叠状态)采集的波谱和在加热到90℃后(热变性)采集的第二波谱以及在回到20℃后(重折叠状态)采集的第三波谱。在该程序期间可测定Tm。
工程改造的多肽的另一方面是ABD可提供在溶解性差或低的瘦蛋白变体的水性溶液中溶解度增加。该特性可通过ABD自身或因为在体内或体外与高溶解性白蛋白结合的工程改造的多肽的后续复合物而赋予，该结合增加了在水性溶液中工程改造的多肽的溶解度。因此，在该又一方面的一个实施方案中，提供包含与白蛋白结合结构域(作为如本文所述的融合蛋白或缀合物)共价偶联的瘦蛋白或瘦蛋白类似物化合物的组合物，所述化合物本身具有在水中不超过1 mg/ml或者不超过2 mg/ml或不超过5 g/ml的溶解度，其中所述化合物和所述白蛋白结合多肽、融合蛋白或缀合物共价偶联，并且工程改造的多肽的溶解度大于未融合的(或未缀合的)天然瘦蛋白或瘦蛋白类似物化合物的溶解度。
与白蛋白的结合。血清白蛋白是哺乳动物血清中最丰富的蛋白质(40 g/L；在人类中约0.7 mM)，其中它结合多种分子，包括但不限于脂质和胆红素(Peters T, 1985,Advances in Protein Chemistry37:161)。已观察到血清白蛋白的半寿期与动物的大小成正比，例如人血清白蛋白(HSA)具有19天的半寿期，而兔血清白蛋白具有约5天的半寿期(McCurdy TR等, J. Lab. Clin. Med. 143:115,2004)。人血清白蛋白广泛分布于整个身体，特别是在肠区室和血液区室，其中它主要涉及摩尔渗透压浓度的维持。在结构上，白蛋白是单链蛋白，包含三个同源结构域和总共584或585个氨基酸(Dugaiczyk L等, 1982,Proc. Natl. Acad. Sci. USA79:71)。白蛋白含有17个二硫桥和单一的反应性巯基C34，但缺少N-连接和O-连接的糖部分(Peters, 1985, Id.; Nicholson JP等, 2000, Br J Anaesth85:599)。缺少糖基化简化了白蛋白的重组表达。白蛋白的该性质以及其三维结构已知的事实(He, XM和Carter, DC, Nature358:209 1992)使其成为用于重组融合蛋白的有吸引力的候选物。所述融合蛋白通常在单一的多肽链中组合了治疗性蛋白(给予该蛋白本身后将快速地从机体中清除)和血浆蛋白(其显示天然的慢清除率)。参见例如，Sheffield WP, 2001, Curr. Drug Targets Cardiovacs. Haematol. Disord.1:1。所述蛋白可在需要较不频繁注射以及体内较高水平的治疗性蛋白中提供临床益处。然而，本文的工程改造的多肽不与白蛋白缀合，而是改为含有允许与白蛋白非共价结合的基序。
白蛋白半寿期。已观察到，在不同物种中白蛋白的半寿期通常遵循基于动物体重的异速生长比例分析(allometric scaling)。例如，已估计在小鼠、大鼠、兔和人中的白蛋白半寿期分别为1、1.9、5.6和19天。实际上，幂拟合分析(Davies & Morris, 1993, Pharm. Res. (N.Y.)10:1093-1095)提供公式：
白蛋白半寿期(天数)=3.75*体重(kg)0.368。
其他实施方案。应理解，本文公开的多肽中的每个还预期在N-端上包含甲硫氨酸，该甲硫氨酸与其天然存在的第一个氨基酸是符合读框的。例如，美曲普汀(瘦蛋白A100)由其上添加有N-端甲硫氨酸的成熟人瘦蛋白组成，如SEQ ID NO:20所公开。同样地，甲硫氨酸残基可包含在本文全文所公开的氨基酸序列和式的任一个的N端。还应理解，当在本文所述的工程改造多肽序列内出现C-端Gly时，该残基可在随后的酰胺化期间丢失。
在一些实施方案中，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可具有相对于母体瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性。在一些实施方案中，母体瘦蛋白为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ IDNO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQID NO:676、SEQ ID NO:677或SEQ ID NO:680中所示的瘦蛋白。因此，在一些实施方案中，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可具有相对于选自以下的任一瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性：SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22和SEQ ID NO:23。在一些实施方案中，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可具有相对于SEQ IDNO:20中所示瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物可具有相对于选自以下的任一瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的序列同一性：SEQ ID NO:24、SEQ ID NO: 25、SEQ IDNO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO: 28或SEQ ID NO:29。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:20中所示瘦蛋白至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于以下所示瘦蛋白至少50%的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ IDNO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ IDNO:676、SEQ ID NO:677或SEQ ID NO:680。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于以下所示瘦蛋白至少90%的序列同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO: 2、ID NO:143、SEQ IDNO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ IDNO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677或SEQ ID NO:680。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:15中所示瘦蛋白至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15中所示瘦蛋白至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:32中所示瘦蛋白至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:32中所示瘦蛋白至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:33中所示瘦蛋白至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:33中所示瘦蛋白至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:10或SEQID NO:11中所示瘦蛋白至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:11中所示瘦蛋白至少90%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示瘦蛋白至少50%的序列同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物可具有相对于SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13中所示瘦蛋白至少90%的序列同一性。此外，可根据本发明设计、制备和应用瘦蛋白，其中选自以下的瘦蛋白的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或甚至21个氨基酸被另一氨基酸(例如保守的氨基酸或非保守的氨基酸)取代或以其他方式改变：SEQID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ IDNO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ IDNO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680。按本领域惯例，在氨基酸取代的背景下，术语“保守的”是指保持电荷类型(例如阴离子、阳离子、中性、极性等)、疏水性或亲水性、体积(bulk) (例如范德华接触等)和/或功能性(例如羟基、胺、巯基等)的特性的取代。术语“非保守的”是指非保守的氨基酸取代。
此外，如本领域所理解，例如鼠瘦蛋白、大鼠瘦蛋白、牛瘦蛋白、猪瘦蛋白和恒河猴瘦蛋白，例如本文所公开的那些，各自基本上与人瘦蛋白同源；具体而言，这些瘦蛋白的成熟形式基本上与成熟瘦蛋白同源，并且此外，尤其是在该蛋白的N-端部分附近。可制备所述瘦蛋白的类似物，例如成熟人瘦蛋白1型(SEQ ID NO:16)和美曲普汀(SEQ ID NO:20)，例如通过取代或以其他方式改变所述序列上的一个或多个位置的氨基酸残基，在这些位置上观察到相应的成熟小鼠、大鼠、牛、猪或恒河猴瘦蛋白中的差异。例如，成熟人瘦蛋白(例如SEQID NO:20)在例如小鼠、大鼠和猴中诱发生物学反应。参见例如，WO 98/28427、WO 2009/064298、US2007/0020284、US2008/0207512和Murakami等, 1995, Biochem. Biophys. Res. Comm.209: 944-952。因为人成熟瘦蛋白在例如所述物种中具有生物学活性，所以可设计和制备瘦蛋白，其中在来自一个或多个所述物种的瘦蛋白的对应位置上具有差异的位置上的一个或多个氨基酸被在所述对应的有差异的位置上的氨基酸取代。
例如，使用SEQ ID NO:16的人成熟瘦蛋白(其中第一个氨基酸是缬氨酸且第146位氨基酸是半胱氨酸)，可用另一氨基酸取代第32、35、50、64、68、71、74、77、89、97、100、101、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142和145位上的氨基酸中的一个或多个(相应的氨基酸存在于SEQ ID NO:143的相应位置上)，以设计、制备和利用按照本发明的工程改造多肽。此外，还可将另一氨基酸(例如保守的氨基酸或非保守的氨基酸)取代至例如SEQ IDNO:16的第32、35、50、64、68、71、74、77、89、97、100、101、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142和145位中的一个或多个，以设计、制备和应用按照本发明的工程改造多肽。
还可根据成熟大鼠瘦蛋白序列(SEQ ID NO:12)制备另外的瘦蛋白。参见例如WO98/28427、US2007/0020284和Murakami等, 1995，同上，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。成熟大鼠瘦蛋白在以下位置上不同于成熟人瘦蛋白1型(SEQ ID NO:16)：4、32、33、35、50、68、71、74、77、78、89、97、100、101、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138和145。因此，在SEQ ID NO:16的所述位置的一个或多个上，可取代在成熟大鼠瘦蛋白(SEQ ID NO:12)中存在的相应位置上存在的氨基酸，以设计、制备和应用根据本发明的工程改造多肽。此外，还可将另一氨基酸(例如保守的氨基酸或非保守的氨基酸)取代至例如SEQ ID NO:16的第4、32、33、35、50、68、71、74、77、78、89、97、100、101、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138和145位中的一个或多个，以设计、制备和应用根据本发明的工程改造多肽。
与成熟人瘦蛋白1型(SEQ ID NO:16)具有差异的来自成熟大鼠瘦蛋白(SEQ IDNO:12)和成熟鼠瘦蛋白1型(SEQ ID NO:143)两者的位置为：4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142和145。因此，在SEQID NO:16的所述位置的一个或多个上，可取代在成熟大鼠瘦蛋白序列(SEQ ID NO:12)或成熟鼠1型序列(SEQ ID NO:143)中存在的相应位置上存在的氨基酸，以设计、制备和应用根据本发明的工程改造多肽。因此，还可将另一氨基酸(例如保守的氨基酸或非保守的氨基酸)取代至第4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142和145位中的一个或多个，以设计、制备和应用根据本发明的工程改造多肽。
此外，与成熟人瘦蛋白1型(SEQ ID NO:16)具有差异的恒河猴成熟瘦蛋白(SEQ IDNO:10)中存在的氨基酸为(在括弧中记录的氨基酸残基为单字母氨基酸缩写)：8 (S)、35(R)、48(V)、53(Q)、60(I)、66(I)、67(N)、68((L)、89(L)、100(L)、108(E)、112 (D)和118(L)。因为人成熟瘦蛋白诱发猴的生物学反应，因此瘦蛋白例如具有恒河猴差异氨基酸中的一个或多个被置换为另一氨基酸例如在括弧中的氨基酸的成熟人瘦蛋白1型(SEQ ID NO:16)，可用于设计、制备和应用根据本发明的工程改造多肽。应注意，某些恒河猴差异氨基酸还为存在于例如上述成熟鼠瘦蛋白1型中的那些(第35、68、89、100和112位)。因此，可制备瘦蛋白，其中在例如成熟人瘦蛋白1型(SEQ ID NO:16)的第4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142和145位的一个或多个氨基酸被置换为在鼠或恒河猴瘦蛋白(例如SEQ ID NO:143和/或SEQID NO:10)中所述位置上的相应的氨基酸。
可通过删除瘦蛋白氨基酸序列的一部分来制备其它瘦蛋白，只要这样的瘦蛋白氨基酸序列可诱发生物学反应。这样的瘦蛋白氨基酸序列为瘦蛋白活性片段。例如，成熟鼠瘦蛋白、成熟恒河猴瘦蛋白、成熟人瘦蛋白和成熟大鼠瘦蛋白以及其它瘦蛋白都缺少N-端21个氨基酸信号序列，其在所述瘦蛋白的未加工全长形式中存在。
可制备所述成熟瘦蛋白的下列活性瘦蛋白片段：
(a)氨基酸98-146
(b)氨基酸1-32
(c)氨基酸40-116
(d)氨基酸1-99和(连接至)112-146
(e)氨基酸1-99和(连接至)112-146，其中氨基酸100-111中的一个或多个置于氨基酸99和112之间。
此外，还可制备这样的活性瘦蛋白片段，其中在例如成熟人瘦蛋白1型的位置上的一个或多个氨基酸被取代为在如上文所公开的例如大鼠、鼠、猴、猪和/或牛成熟瘦蛋白中存在的相应位置上存在的氨基酸。此外，任何取代或改变可以为改变的氨基酸形式，例如拟肽或D-氨基酸。
此外，本发明包括工程改造的多肽，其包括如上文所述的瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物，其中瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物选自：
(a)选自以下的瘦蛋白的氨基酸序列1-146：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、EQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ IDNO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676和SEQ ID NO:677；其中在以下位置的一个或多个上的不同氨基酸被取代并保留相同的编号(甚至在缺少第28位的谷氨酰基残基的情况下)：4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、112、118、136、138、142和145；
(b)子部分(a)的氨基酸序列，其中第28位的谷氨酰基残基是不存在的；
(c)子部分(a)或(b)的氨基酸序列，其中将甲硫氨酰基添加到N-端；
(d)由选自以下的(a)、(b)或(c)的氨基酸序列片段组成的瘦蛋白：
(i)氨基酸98-146
(ii)氨基酸1-32
(iii)氨基酸40-116
(iv)氨基酸1-99和112-146
(v)氨基酸1-99和112-146，其中将氨基酸100-111中的一个或多个置于氨基酸99和112之间；和
(vi)子部分(i)的氨基酸序列，其中氨基酸100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142和145中的一个或多个被另一氨基酸取代；
(vii)子部分(ii)的氨基酸序列，其中氨基酸4、8和32中的一个或多个被另一氨基酸取代；
(viii)子部分(iii)的氨基酸序列，其中氨基酸50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111和112中的一个或多个被另一氨基酸置换；
(ix)子部分(iv)的氨基酸序列，其中氨基酸4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、112、118、136、138、142和145中的一个或多个被置换为另一氨基酸；和
(x)子部分(v)的氨基酸序列，其中氨基酸4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142和145中的一个或多个被置换为另一氨基酸；
(xi)子部分(i)-(x)中任一个的瘦蛋白，其中在N-端添加甲硫氨酸；和
(e)子部分(a)至(e)中任一个的瘦蛋白，化学部分连接于其上。
(f)子部分(g)的瘦蛋白，其中所述化学部分是水溶性聚合物部分；
(g)子部分(f)的瘦蛋白，其中所述水溶性聚合物部分是聚乙二醇；
(h)子部分(f)的瘦蛋白，其中所述水溶性聚合物部分是多聚氨基酸部分；和
(i)子部分(e)至(h)中任一个的瘦蛋白，其中所述部分仅连接在所述蛋白部分的N-端。
关于上文，化学部分所连接的瘦蛋白是瘦蛋白衍生物。已发现瘦蛋白通过连接一个或多个化学部分的衍生在某些情况下提供某些益处，例如增加治疗性蛋白的稳定性和循环时间，和降低免疫原性和对例如产生中和抗体和/或发生注射部位反应的倾向。参见例如，WO 98/28427、US2007/0020284、美国专利号4,179,337、Davis等,1979年12月18日出版。对于综述，参见Abuchowski等，载于Enzymes as Drugs. (J. S. Holcerberg和J. Roberts主编，第367-383页(1981))；Francis等，同上。因此，当使用衍生的瘦蛋白和ABM或ABD时，可有利地产生本发明的工程改造多肽，其具有由两个实体提供的益处。
瘦蛋白衍生物可构成对其以下一个或多个进行化学修饰的瘦蛋白：其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基团。化学修饰包括但不限于连接一个或多个化学部分、建立新键和除去一个或多个化学部分。氨基酸侧基上的修饰包括但不限于烷基化；酰化；酯形成；酰胺形成；马来酰亚胺偶联；赖氨酸ε-氨基的酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化；和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰，例如烷基酰基、支链烷基酰基、烷基芳基-酰基。末端羧基的修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺、芳基酰胺、烷基芳基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基为C1-C4烷基。此外，一个或多个侧基或末端基团可受合成化学普通技术人员已知的保护基团保护。氨基酸的α-碳可以被单甲基化或二甲基化。
所述衍生物包括通过添加多聚氨基酸(例如多聚-his、多聚-arg、多聚-lys和多聚-ala)或通过添加小分子取代基(包括短的烷基和限制性烷基(例如支链的、环状的、稠合的、金刚烷基)以及芳香基)，与一种或多种水溶性聚合物分子(例如聚乙二醇(“PEG”)或各种长度的脂肪酸链(例如硬脂酰基、棕榈酰基、辛酰基))缀合的瘦蛋白。在一些实施方案中，水溶性聚合物分子的分子量范围在约500道尔顿至约60,000道尔顿。
所述聚合物-缀合可特别发生在本文所公开的瘦蛋白序列内的N-端或C-端或氨基酸残基的侧链上。或者，沿所述瘦蛋白的氨基酸序列，可存在多个衍生化位点。用赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的一个或多个氨基酸的取代可提供另外的衍生化位点。参见例如，美国专利号5,824,784和5,824,778。在一些实施方案中，瘦蛋白可与一个、两个或三个聚合物分子缀合。
在一些实施方案中，水溶性聚合物分子与氨基、羧基或巯基连接，并且可通过N-端或C-端或在赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链上连接。或者，水溶性聚合物分子可用二胺和二羧基连接。在一些实施方案中，瘦蛋白与一个、两个或三个PEG分子通过赖氨酸氨基酸上的ε氨基缀合。
瘦蛋白衍生物还包括具有一个或多个氨基酸残基化学改变的瘦蛋白。所述化学改变包括酰胺化、糖基化、酰化、硫酸化、磷酸化、乙酰化和环化。化学改变可特别发生在瘦蛋白序列内的N-端或C-端或氨基酸残基的侧链上。在一个实施方案中，这些肽的C-端可具有游离–OH或–NH2基团。在另一实施方案中，N-端末端可被异丁氧羰基、异丙氧羰基、n-丁氧羰基、乙氧羰基、异己酰基(“isocap”)、辛酰基、辛基甘氨酸基团(称为“G(Oct)”或“辛基Gly”)、8-氨基辛酸基团、丹酰基和/或Fmoc基团封端。在一些实施方案中，可通过形成二硫桥进行环化。或者，沿瘦蛋白氨基酸序列可存在多个化学改变位点。
在某些实施方案中，瘦蛋白经化学改变以包含Bolton-Hunter基团。Bolton-Hunter试剂是本领域已知的(“Radioimmunoassay and related methods,” A. E. Bolton和W. M. Hunter, Handbook of Experimental Immunology的第26章, 卷I,Immunochemistry, D. M. Weir主编, Blackwell Scientific Publications, 1986)，并且可用于通过氨基端α-氨基或赖氨酸的ε-氨基引入具有中性键的酪氨酸样部分。在一些实施方案中，瘦蛋白的N-端末端用Bolton-Hunter基团修饰。在一些实施方案中，内部的赖氨酸残基用Bolton-Hunter基团修饰。在一些实施方案中，沿瘦蛋白氨基酸序列，可存在多个Bolton-Hunter修饰位点。用于多肽修饰的Bolton-Hunter试剂是市售可得的，并可包括但不限于水溶性Bolton-Hunter试剂——磺基琥珀酰亚胺-3-[4-氢苯基]丙酸盐(PierceBiotechnology, Inc., Rockford, IL)和Bolton-Hunter试剂-2——N-琥珀酰亚胺3-(4-羟基-3-碘苯基)丙酸盐(Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Japan, 目录199-09341)。通过酰胺键与瘦蛋白缀合的示例性Bolton-Hunter基团显示于下文，其中虚线经过酰胺键：
瘦蛋白可在Bolton-Hunter修饰之前或之后碘化(例如用125I放射性标记)。
为制备本发明的工程改造多肽，用于制备所述多肽的瘦蛋白衍生物可包括“非基本的”氨基酸残基的一种或多种修饰。在本发明的情况下，“非基本的”氨基酸残基是可被改变(例如衍生化)而未废除或显著降低瘦蛋白的活性(例如激动剂活性)的残基。本发明的工程改造多肽可包括瘦蛋白部分的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基的衍生；在这些残基中，一个或多个氨基酸残基可以是非基本的氨基酸残基。此外，本发明的多肽可被衍生化使得它们在瘦蛋白部分包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸添加，而未废除或显著降低多肽的活性。此外，所述非基本的氨基酸残基可以被顺从全文所述的衍生化的氨基酸残基取代。
如全文所用，“氨基酸”、“氨基酸残基”等是指天然氨基酸、非天然氨基酸和修饰的氨基酸。除非有相反的说明，否则通常或特定地通过名称对氨基酸的任何提及，包括提及D立体异构体和L立体异构体两者，只要它们的结构允许所述立体异构体形式。天然氨基酸包括丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、苯丙氨酸(Phe)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)和缬氨酸(Val)。非天然氨基酸包括但不限于高赖氨酸、高精氨酸、高丝氨酸、铃兰氨酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2,4-二氨基异丁酸、锁链素、2,2’-二氨基庚二酸、2,3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别-羟基赖氨酸、3-羟基脯氨酸、4-羟基脯氨酸、异锁链素、别-异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、戊基甘氨酸、哌可酸和硫代脯氨酸。另外的非天然氨基酸包括修饰的氨基酸残基，其在它们的N-端氨基或它们的侧链基团上被可逆或不可逆化学封闭或化学修饰，例如N-甲基化D和L氨基酸或残基，其中侧链官能团被化学修饰成另一官能团。例如，修饰的氨基酸包括甲硫氨酸亚砜；甲硫氨酸砜；天冬氨酸-(β-甲基酯)，其为天冬氨酸的修饰氨基酸；N-乙基甘氨酸，其为甘氨酸的修饰氨基酸；或丙氨酸甲酰胺，其为丙氨酸的修饰氨基酸。可掺入的其它残基描述于Sandberg等, J. Med. Chem.41: 2481-91, 1998。
如上文所述，适于瘦蛋白和其他多肽的所述衍生的化学部分包括例如多种水溶性聚合物。优选地，对于终产物制剂的治疗用途，聚合物是药学上可接受的。本领域的技术人员能够选择合乎需要的聚合物，基于这样的考虑：聚合物/蛋白缀合物是否将在治疗上应用，并且如果是的话，所需的剂量、循环时间、蛋白酶水解抵抗和其他考虑。对于工程改造多肽和瘦蛋白，衍生物的有效性可通过以所需形式(即，通过渗透泵，或更优选通过注射或输注，或进一步配制用于例如口服递送、肺部递送或鼻递送)给予衍生瘦蛋白或衍生工程改造多肽并观察本文所述的生物学作用和生物学反应来确定，
这样的水溶性聚合物可选自例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、多聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)、和葡聚糖或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇和聚乙烯醇。聚乙二醇丙醛由于其在水中的稳定性而可在制备中具有益处。同样还可使用琥珀酸盐、苯乙烯和羟乙基淀粉。
在设计和制备本发明的工程改造多肽中使用的瘦蛋白衍生物可通过将多聚氨基酸或分支点氨基酸连接到瘦蛋白部分来制备。例如，多聚氨基酸可以是另外的载体蛋白，例如Fc部分，其除了通过连接ABM或ABD而获得的益处之外，还可用来增加瘦蛋白或工程改造多肽的循环半寿期。此外，这样的多聚氨基酸可选自血清白蛋白(例如人血清白蛋白)、另外的抗体或其部分(例如Fc区)、或其他多聚氨基酸例如多聚赖氨酸。如下文所述，多聚氨基酸连接的位置可以在瘦蛋白部分的N-端或C-端或之间的其它位置，并且还可通过化学“接头”部分连接至瘦蛋白，例如肽接头或非肽接头。
聚合物可具有任何分子量，且可以是支链或非支链的。对于聚乙二醇，优选的分子量介于约2千道尔顿(kDa)和约100 kDa之间(术语“约”是指在聚乙二醇的制备中，一些分子的分子量可比所规定的分子量更大或更小)以易于操作和制备。在某些实施方案中，聚乙二醇介于约2 kDa和约60 kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇介于约2 kDa和约40 kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇介于约5 kDa和约40 kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇介于约10 kDa和约40 kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇介于约5 kDa和约30 kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇介于约5 kDa和约20 kDa之间。在某些实施方案中，聚乙二醇介于约10 kDa和约20 kDa之间。根据所需的治疗概况(例如，所需的持续释放持续时间、溶解度特征、对生物学活性的影响(如果有的话)、操作的容易度、连接到瘦蛋白或本发明的工程改造多肽的聚乙二醇的抗原性和其它已知作用的程度或缺乏)，可使用其它大小。可影响特定分子量的PEG(其可连接到瘦蛋白以产生本发明的瘦蛋白衍生物)的选择的另外考虑包括：当存在于药学上可接受的组合物或制剂中时或当给予受试者(例如通过注射)后暴露于生理流体或组织时，所述分子量的PEG可减少瘦蛋白和/或工程改造多肽的聚集和/或增加其溶解度所至的程度；通过注射给予受试者时，所述分子量的PEG可减少通过给予瘦蛋白或工程改造多肽造成的注射部位反应发生的程度；所述分子量的PEG可减少产生中和抗体的程度，所述中和抗体可因为将瘦蛋白或工程改造多肽给予受试者而针对所述瘦蛋白或工程改造多肽而产生；等等。
如此连接的聚合物分子的数量可改变，并且本领域技术人员能够确定所产生的对功能的影响。可单衍生化，或者可提供具有相同或不同的化学部分(例如，聚合物例如不同分子量的聚乙二醇)的二衍生化、三衍生化、四衍生化或衍生化的一些组合。聚合物分子与所衍生化的瘦蛋白分子或工程改造多肽分子的比例可改变，它们在反应混合物中的浓度亦是如此。通常，就其中不存在过量未反应瘦蛋白(或情况可能为工程改造多肽)或聚合物的反应效率而言，最佳比率将通过以下因素来确定：例如所需的衍生化程度(例如单、二、三等)、所选聚合物的分子量、聚合物是支链还是非支链的以及反应条件。
化学部分应在考虑对瘦蛋白和/或工程改造多肽的功能结构域或抗原结构域的影响的情况下与瘦蛋白和/或工程改造多肽连接。存在本领域技术人员可获得的大量连接方法。例如EP 0 401 384，其通过引用结合到本文中(将PEG与G-CSF偶联)，还参见Malik等,1992, Exp. Hematol. 20:1028-1035 (报道了使用三氟乙磺酰氯(tresyl chloride)将GM-CSF聚乙二醇化)。例如，聚乙二醇可经由反应基团(例如游离的氨基或羧基)通过氨基酸残基而共价结合。反应基团为活化的聚乙二醇分子可与其结合的那些。具有游离氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N-端氨基酸残基。具有游离羧基的那些可包括天冬氨酸残基、谷氨酸残基和C-端氨基酸残基。巯基也可用作反应基团以连接聚乙二醇分子。优选用于治疗目的的是在氨基上的连接，例如在N-端或赖氨酸基团上的连接。如果受体结合是需要的，则对受体结合重要的残基上的连接应当避免。
在某些实施方案中，1-30或更少的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬氨酸或谷氨酸。在又一实施方案中，受体结合是需要的。
可特别期望设计和制备N-端化学修饰的瘦蛋白，用于制备本发明的工程改造多肽。使用聚乙二醇作为本发明组合物的举例，可自多种聚乙二醇分子(根据分子量、支链化等)选择反应混合物中的聚乙二醇分子与瘦蛋白或工程改造多肽分子的比例(视情况而定)、待进行的聚乙二醇化反应的类型和获得所选N-端聚乙二醇化蛋白的方法。获得N-端聚乙二醇化制备物的方法(即，如有必要，将该部分与其它单聚乙二醇化部分分离)可以是通过自聚乙二醇化蛋白分子群中纯化N-端聚乙二醇化的物质。选择的N-端化学修饰可以通过还原性烷化来完成，其利用在具体蛋白中可用于衍生化的不同类型的伯氨基(赖氨酸相对于N-端)的不同反应性。在合适的反应条件下，使用含羰基聚合物，实现蛋白在N-端上的充分选择性衍生化。例如，通过在以下pH下进行反应，可选择性地在N-端将蛋白质聚乙二醇化：该pH允许利用赖氨酸残基的ε-氨基和蛋白的N-端残基的α-氨基之间的pKa差异。通过这样的选择性衍生化，水溶性聚合物与蛋白的连接受到控制：与聚合物的缀合主要发生在蛋白的N-端，并且其它反应基团(例如赖氨酸侧链氨基)没有发生显著修饰。使用还原性烷化，水溶性聚合物可为上文所述的类型，并且应具有用于偶联蛋白的单一反应醛。可使用含有单一反应醛的聚乙二醇丙醛。
在一些实施方案中，提供具有接头的化合物，所述接头例如本文所述的L1，其将多肽激素结构域与ABD肽共价连接。在一些实施方案中，第一接头(L1)在工程改造的多肽内共价连接HD1。在一些实施方案中，本文所述的多肽激素结构域(例如HD1)可经过肽接头共价连接到ABD肽。任何接头都是可选择的；即，任何接头可仅为键。当存在时，键的化学结构不是关键的，因为其主要起间隔基的作用。在一个实施方案中，接头包含1-30个或更少的通过肽键连接的氨基酸。氨基酸可选自20种天然存在的氨基酸。或者，可通过化学合成、翻译后化学修饰或通过宿主细胞内重组表达的体内掺入将非天然的氨基酸掺入。这些氨基酸中的一些可以被糖基化。
在某些实施方案中，1-30个或更少的氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、天冬氨酸和谷氨酸。在其他实施方案中，接头由大部分无空间位阻的氨基酸组成，例如甘氨酸、丙氨酸和/或丝氨酸。特别可使用多聚甘氨酸，例如(Gly)3、(Gly)4(SEQ ID NO:116)、(Gly)5 (SEQ ID NO:117)，同样可使用多聚丙氨酸、多聚(Gly-Ala)、多聚(Glyn-Ser)、多聚(Glyn-Glu)、多聚(Glyn-Lys)、多聚(Glyn-Asp)和多聚(Glyn-Arg)基序。接头的其他具体实例为(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO:118)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQID NO:119)、(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO:120)和GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO:121)。特别可使用Gly和Ala的组合，Gly和Ser的组合同样如此。因此，在另外的实施方案中，肽接头选自富含甘氨酸的肽，例如Gly-Gly-Gly；序列[Gly-Ser]n(SEQ ID NO:122)、[Gly- Gly-Ser]n(SEQ ID NO:123)、[Gly-Gly-Gly- Ser]n (SEQ ID NO:124)和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO:125)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10，例如[Gly-Gly-Gly-Ser]1 (SEQID NO: 149)、[Gly-Gly-Gly-Gly Ser]1 (SEQ ID NO: 150)、[Gly-Gly-Gly Ser]4 (SEQ IDNO: 151)或[Gly-Gly-Gly-Gly Ser]3 (SEQ ID NO: 152)。
在某些实施方案中，可使用带电接头。所述带电接头可包含大量的酸性残基(例如Asp、Glu等)，或者可包含大量的碱性残基(例如Lys、Arg等)，使得接头分别具有低于7或高于7的pI。如技术人员所理解，并且其他条件都相同，给定接头中的酸性或碱性残基的相对量越大，接头的pI将分别越低或越高。所述接头可赋予本文公开的工程改造多肽益处，例如在特定的pH、例如生理pH (例如pH 7.2和pH 7.6之间，包括pH 7.2和pH 7.6)或者包含所述多肽的药物组合物的pH下，改进所述多肽的溶解度和/或稳定性特征。
例如，“酸性接头”是具有以下pI的接头：小于7；6-7，包括6和7；5-6，包括5和6；4-5，包括4和5；3-4，包括3和4；2-3，包括2和3；或1-2，包括1和2。同样的，“碱性接头”是具有以下pI的接头：大于7；7-8，包括7和8；8-9，包括8和9；9-10，包括9和10；10-11，包括10和11；11-12，包括11和12；或12-13，包括12和13。在某些实施方案中，酸性接头包含选自以下的序列：[Gly-Glu]n (SEQ ID NO:126)、[Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO:127)、[Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO:128)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO:129)、[Gly-Asp]n (SEQ IDNO:130)、[Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO:131)、[Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO:132)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO:133)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如[Gly-Gly-Glu]6 (SEQ ID NO: 153)。在某些实施方案中，碱性接头包含选自以下的序列：[Gly-Lys]n (SEQ ID NO:134)、[Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO:135)、[Gly-Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO:136)、[Gly-Gly-Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO:137)、[Gly- Arg]n (SEQ IDNO:138)、[Gly-Gly- Arg]n (SEQ ID NO:139)、[Gly-Gly-Gly- Arg]n (SEQ ID NO:140)、[Gly-Gly-Gly-Gly- Arg]n (SEQ ID NO:141)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如[Gly-Gly-Lys]6 (SEQ ID NO:154)。
此外，接头可被制备为具有某些结构基序或特征，例如α螺旋。例如，接头可包含选自[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n (SEQ ID NO:142)的序列，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更大，例如[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3 (SEQ ID NO:155)、[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4 (SEQ IDNO: 156)或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5 (SEQ ID NO: 157)。
此外，可使用非肽接头作为本文所述的工程改造多肽的L1部分。例如，如本领域所理解，可如此使用示例性非肽接头例如PEG接头。参见例如WO2000024782。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至1000 kDa。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至500 kDa。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至100 kDa。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至50 kDa。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至10 kDa。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至5 kDa。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至1 kDa。在某些实施方案中，所述PEG接头的分子量为100 Da至500 Da。
还应理解，根据本发明适于使用的接头可具有上文所述特征和基序中的一个或多个。例如，接头可包含酸性接头以及结构基序例如α螺旋。同样地，接头可包含碱性接头和接头基序例如α螺旋。接头可包含酸性接头、碱性接头和接头基序例如α螺旋。此外，还应理解，根据本发明的工程改造的多肽可具有超过一个接头，每个这样的接头可具有上文所述特征中的一个或多个。
本文所述接头为示例性的，并且本发明范围内的接头可更长以及可包含其他残基。在一个实施方案中，特别排除以下工程改造的多肽：其中瘦蛋白化合物直接连接到ABD上而没有接头。
在一些实施方案中，工程改造的多肽包含N-端上的ABD和C-端上的HD1。相反，在一些实施方案中，工程改造的多肽包含C-端上的ABD和N-端上的HD1。在一些实施方案中，N-端或C-端都是瘦蛋白、瘦蛋白片段或瘦蛋白类似物。优选地，ABD在瘦蛋白化合物的N-端。对包含ABD和HD1的实施方案的补充，工程改造的多肽可具有结构ABD-HD1或HD1-ABD (两者都从N-端至C-端的方向阅读)。
应理解，在缺少明确指示本文所述工程改造的多肽的N-端和/或C-端的情况下，工程改造的多肽在N-端至C-端方向上读出。例如，当HD1是瘦蛋白或其类似物时，术语HD1-ABD、HD1-L1-ABD、HD1-ABD等在缺少明确指示N-端和/或C-端的情况下，意指瘦蛋白化合物位于工程改造的多肽的N-端以及ABD残基在C-端。反过来，如果明确指出N-端和/或C-端，则工程改造的多肽根据末端的明确指示读出。例如，术语HD1C-端ABD、HD1-L1-ABDN-端等意指ABD位于工程改造的多肽的N-端以及HD1位于C-端。
在上文所述的工程改造多肽的一些实施方案中，HD1是人瘦蛋白或美曲普汀。在一些其它实施方案中，HD1是本文所述的瘦蛋白类似物。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物是瘦蛋白A100、A300或A500。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的多肽对血清白蛋白具有不同于单独ABD多肽(即，在缺少缀合的激素结构域的情况下)的亲和力的亲和力。为获得有效的结合，工程改造的多肽可具有对血清白蛋白的结合亲和力，使得离解常数KD为例如小于约10-6 M、10-7 M、10-8 M、10-9 M、10-10 M、10-11 M、10-12 M、10-13 M、10-14 M或甚至10-15 M。在一些实施方案中，亲和力不是过度紧密，使得工程改造的多肽可从白蛋白离解并诱发生物学反应，例如结合到受体，例如瘦蛋白受体。可按PCT公布申请号WO 2009/016043中所述，优选测量对人血清白蛋白的亲和力，所述申请通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的，包括但不限于测定法和分析法。
在一些实施方案中，本文所述的工程改造的多肽优于具有不同部分的相应化合物，所述部分与激素结构域缀合并可延长血浆半寿期(例如PEG或Fc或白蛋白)。在该背景下，术语“优于”是指各种功能性性质，其可在疾病或病症的治疗评价中衡量。例如，本文所述的工程改造的多肽可需要比具有与激素结构域缀合的不同部分的相应化合物更少的生物学活性(激素结构域)组分，例如1X、1/2、1/3、1/4、1/5或甚至更少。对于其他实例，本文所述的工程改造的多肽可具有更高的效能，例如 1.5X、2X、3X、4X、5X、10X、20X、50X或甚至更高的效能。
本文预期的工程改造的多肽化合物包括在以下表2中所示的化合物。
表2 所选的示例性工程改造的多肽。
其中不存在N-端甲硫氨酸的上述序列的化合物是特别预期的，例如，对于瘦蛋白化合物，N-端以例如VPIQKV (SEQ ID NO: 158)或LAEAK (SEQ ID NO: 159)或GSLAEAK(SEQ ID NO: 35)开始。可存在N-端甲硫氨酸主要便于细菌表达。然而，本发明的缀合物肽可在真核宿主细胞(例如酵母(例如毕赤酵母)、哺乳动物、杆状病毒)或具有翻译后N-端蛋白水解加工的其他宿主细胞中表达，以得到如同在所需激素或ABD序列天然存在的成熟肽对应物中存在的N-端氨基酸。或者，用于表达和/或分泌的N-端序列可以是在翻译后除去(例如通过使用蛋白酶例如TEV)的N-端序列。
III. 设计和生产方法
构建体设计。本文所述的工程改造的多肽可在氨基酸水平上进行设计。然后可使用本领域已知的多种软件产品将这些序列逆翻译，使得核苷酸序列对所需的表达宿主(例如基于其的蛋白质表达)、密码子优化、限制性位点含量而言是最优化的。例如，核苷酸序列可对基于大肠杆菌(E.coli)的蛋白质表达和对限制性位点含量而言是最优化的。根据目的核苷酸序列，如本领域已知，可提供重叠寡核苷酸用于多级PCR。这些寡核苷酸可在本领域熟知的条件下用于多重PCR反应，以构建编码目的蛋白的cDNA。一个实例是1X Amplitaq缓冲液、1.3 mM MgCl2、200uM dNTPs、4 U Amplitaq Gold、0.2 uM各引物(AmpliTaq Gold,ABI)，循环参数：(94C:30s、58C:1 min、72C:1min)、35个循环。
可将限制性位点添加到PCR产物的末端，用于本领域已知的载体连接。特定的位点可包括Nde1和Xho1，使得cDNA可随后在pET45b表达载体(Novagen)中处于正确的阅读框内。通过使用这些位点，在该载体中的任何N-端His标签可被除去，因为翻译起始位点将在所述标签的下游。一旦表达构建体完成，可通过使用例如本领域已知的T7启动子引物、T7终止子引物和标准的ABI BigDye Term v3.1方案测序进行鉴定。序列信息可自例如ABI 3730 DNA分析仪获得，并且可使用Vector NTI v.10软件(Invitrogen)进行分析。表达构建体可以模块化方式设计，使得接头序列可容易切除和改变，如本领域已知。
可将本领域已知或本文所述的蛋白酶识别位点掺入到可用于本文所述重组工程改造的多肽的设计、构建、操作和生产的构建体中。
一般生产方法。本文所述的工程改造的多肽可使用本领域已知的生物学、化学和/或重组DNA技术制备。示例性方法在本文以及美国专利号6,872,700、WO 2007/139941、WO2007/140284、WO 2008/082274、WO 2009/011544和美国公布号2007/0238669中描述，它们的公开内容通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。用于制备该化合物的其他方法在本文中列出。
本文所述的工程改造的多肽化合物可使用标准固相肽合成技术制备，例如自动化或半自动化肽合成仪。简要且概括地讲，ABD和治疗性激素肽可单独制备，然后缀合在一起，或者可作为单一多肽制备。因此，白蛋白结合多肽、治疗性激素或工程改造的多肽可备选使用氨基酸和/或具有受保护的反应性侧链的氨基酸衍生物通过非生物学肽合成生产，所述非生物学肽合成包括逐步偶联氨基酸和/或氨基酸衍生物以形成具有受保护的反应性侧链的第一方面的多肽，从多肽的反应性侧链上除去保护基，以及在水溶液中折叠多肽。因此，使用正常氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸和缬氨酸)和预保护的氨基酸衍生物以在溶液中或在有机溶剂中的固体载体上序贯构建多肽序列。当构建了完整多肽序列时，除去保护基并使多肽在水溶液中折叠。本公开内容的每个多肽可逆折叠，其中ABD结构域无附加因素而可逆折叠成三螺旋束结构域，因此自发折叠。工程改造的缀合物可通过以下方法生产，包括：根据例如本文所述的任何方法(例如通过非生物学肽合成)生产白蛋白结合多肽，和将所生产的ABD多肽与本文所定义的治疗性激素缀合。本文的ABD完全可逆地折叠。这通过圆二色性波谱分析进行评价；一个波谱在20℃采集，而另一波谱在加热到90℃然后返回到20℃后采集。在该程序期间，测定本领域已知的Tm，发现其在变性多肽的折叠后未改变。通常，使用所述技术，将α-N-氨甲酰基保护的氨基酸与连接到树脂上成长中的肽链的氨基酸在RT下在惰性溶剂(例如二甲酰胺、N-甲基吡咯烷酮、亚甲基氯等)中在偶联剂(例如二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑等)的存在下在碱(例如二异丙基乙胺等)存在下偶联。使用试剂(例如三氟乙酸、哌啶等)将α-N-氨甲酰基保护基从得到的肽-树脂上除去，并且用待加入到肽链的下一个所需N-保护的氨基酸重复偶联反应。合适的N-保护基是本领域熟知的，例如叔-丁氧羰基(tBoc)、芴甲氧羰基(Fmoc)等。用于肽合成仪的溶剂、氨基酸衍生物和4-甲基二苯甲基-胺树脂可购自Applied Biosystems Inc. (Foster City,CA)。
对于化学合成，可将固相肽合成用于工程改造的多肽，因为通常固相合成是直接的方法，对于工业规模具有优良的可伸缩性，并且其通常与相对长的工程改造的多肽相容。可用自动化肽合成仪(430A型, Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)进行固相肽合成，使用带封端的NMP/HOBt (选项1)系统和tBoc或Fmoc化学(参见AppliedBiosystems User's Manual for the ABI 430A Peptide Synthesizer, 版本1.3B Jul.1, 1988, 第6章, 第49-70页, Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA)。可用HF裂解Boc-肽-树脂(-5℃-0℃，1小时)。可交替使用水和乙酸从树脂中提取肽，并将滤液冻干。可按标准方法(例如，Introduction to Cleavage Techniques, Applied Biosystems,Inc., 1990, 第6-12页)裂解Fmoc-肽树脂。还可用Advanced Chem Tech Synthesizer(Model MPS 350, Louisville, Ky.)将肽装配。
本文所述的化合物还可使用本领域已知的方法利用重组DNA技术制备，所述方法例如Sambrook等, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., ColdSpring Harbor。非肽化合物可通过本领域已知的方法制备。例如含磷酸基的氨基酸和含有所述氨基酸的肽可使用本领域已知的方法制备，例如在Bartlett等, 1986, Biorg. Chem., 14:356-377中所描述。
或者，可通过本领域熟知的重组技术生产工程改造的多肽。参见例如Sambrook等,1989 (同上)。通过重组技术生产的这些工程改造的多肽可自多核苷酸表达。本领域技术人员将理解，编码所述工程改造的多肽的多核苷酸，包括DNA和RNA，可获自野生型cDNA，例如人瘦蛋白，考虑到密码子使用的简并性，并且可进一步按所需进行工程改造以掺入所指示的取代。这些多核苷酸序列可包括利于mRNA在微生物宿主中转录和翻译的密码子。这样的生产序列可易于按本领域熟知的方法构建。参见例如WO 83/04053，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。上文的多核苷酸还可任选编码N-端甲硫酰胺残基。可用于本发明的非肽化合物可通过本领域已知的方法制备。例如含磷酸基的氨基酸和含所述氨基酸的肽可使用本领域已知的方法制备。参见例如Bartlett和Landen, 1986, Bioorg. Chem.14: 356-77。
可利用多种表达载体/宿主系统以包含和表达工程改造的多肽的编码序列。这些包括但不限于微生物例如用重组噬菌体、质粒或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用酵母表达载体转化的酵母；用病毒表达载体(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用病毒表达载体(例如花椰菜花叶病毒CaMV、烟草花叶病毒TMV)转染或用细菌表达载体(例如Ti或pBR322质粒)转化的植物细胞系统；或动物细胞系统。可用于重组蛋白生产的哺乳动物细胞包括但不限于VERO细胞、HeLa细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系、COS细胞(例如COS-7)、WI38、BHK、HepG2、3T3、RIN、MDCK、A549、PC12、K562和293细胞。用于蛋白质的重组表达的示例性方案在本文描述和/或是本领域已知的。
同样地，多核苷酸序列可用于产生新的和有用的病毒和质粒DNA载体、新的和有用的转化和转染的原核和真核宿主细胞(包括在培养中生长的细菌、酵母和哺乳动物细胞)以及用于培养生长能够表达本发明工程改造的多肽的所述宿主细胞的新的和有用的方法。在工程改造的多肽生产不足可被减轻或者可满足对于增加水平的所述多肽的需要情况下，编码本文工程改造的多肽的多核苷酸序列可用于基因疗法。
本发明还提供用于重组DNA生产本发明工程改造的多肽的方法。提供了用于从包含编码工程改造的多肽的核酸的宿主细胞中生产工程改造的多肽的方法，包括：(a)在利于DNA分子表达的条件下，培养包含编码工程改造的多肽的多核苷酸的宿主细胞；和(b)获得工程改造的多肽。
宿主细胞可以是原核或真核的，并且包括细菌、哺乳动物细胞(例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、猴细胞、幼地鼠肾细胞、癌细胞或其他细胞)、酵母细胞和昆虫细胞。
用于表达重组蛋白的哺乳动物宿主系统亦为本领域技术人员所熟知。宿主细胞株可针对加工所表达的蛋白或产生某些翻译后修饰的特定能力进行选择，所述修饰可用于提供蛋白质活性。所述多肽的修饰包括但不限于乙酰化、羧化、糖基化、磷酸化、脂化和酰化。切割蛋白的“前-原(pre-pro)”形式的翻译后加工对于正确插入、折叠和/或功能亦可为重要的。不同的宿主细胞，例如CHO、HeLa、MDCK、293、WI38等，对所述翻译后活性具有特定的细胞机构和特有的机制，并且可选择以确保所引入的异种蛋白的正确修饰和加工。
或者，可使用酵母系统以产生本发明的工程改造的多肽。工程改造的多肽的DNA的编码区通过PCR扩增。在PCR反应中将编码酵母前-原-α前导序列的DNA从酵母基因组DNA中扩增，使用一个包含α交配因子基因的核苷酸1-20的引物和另一与该基因的核苷酸255-235互补的引物(Kurjan和Herskowitz, 1982, Cell, 30: 933-43)。将前-原-α前导编码序列和工程改造的多肽的编码序列片段连接到包含酵母醇脱氢酶(ADH2)启动子的质粒中，使得启动子指导由与成熟工程改造的多肽融合的前-原-α因子组成的融合蛋白的表达。如Rose和Broach, Meth. Enz., 185: 234-79, Goeddel编辑, Academic Press, Inc., SanDiego, California (1990)所教导，所述载体还包含在克隆位点下游的ADH2转录终止子、酵母“2-micron”复制起点、酵母leu-2d基因、酵母REP1和REP2基因、大肠杆菌β-内酰胺酶基因和大肠杆菌复制起点。β-内酰胺酶和leu-2d基因分别提供细菌和酵母的选择。Leu-2d基因还利于增加酵母中质粒的拷贝数，诱导更高水平的表达。REP1和REP2基因编码与质粒拷贝数的调节有关的蛋白质。
使用已知的方法将上述段落中描述的DNA构建体转化到酵母细胞中，所述方法例如醋酸锂处理(Steams等, 1990,. Meth. Enz. 185: 280-297)。生长培养基中的葡萄糖耗尽后，ADH2启动子受诱导(Price等, 1987, Gene55:287)。前-原-α序列影响融合蛋白从细胞中的分泌。同时，酵母KEX2蛋白从成熟的工程改造的多肽切割前-原序列(Bitter等,1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5330-5334)。
遵循制造商的说明书，使用市购的表达系统例如毕赤酵母表达系统(Invitrogen,San Diego, CA)，本发明的工程改造的多肽还可在酵母、例如毕赤酵母中重组表达。该系统亦依赖于前-原-α序列以指导分泌，但插入物的转录受醇氧化酶(AOX1)启动子(经甲醇诱导)的驱动。所分泌的工程改造的多肽通过例如用于从细菌和哺乳动物细胞上清液中纯化所述工程改造的多肽的方法从酵母生长培养基中纯化。
或者，可将编码工程改造的多肽的DNA克隆至杆状病毒表达载体，例如pVL1393(PharMingen, San Diego, California)。随后根据制造商说明书(PharMingen)或已知技术，用工程改造的多肽的编码载体感染培养在例如无sF9蛋白的培养基中的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，并生产重组蛋白。使用本领域已知的方法，例如肝素-琼脂糖柱(Pharmacia, Piscataway, New Jersey)和连续分子筛分柱(Amicon, Beverly,Massachusetts)，从培养基中纯化并浓缩蛋白质，并将其重悬浮于合适溶液(例如PBS)中。可使用SDS-PAGE分析，例如通过显示证实所需工程改造的多肽的大小的单一条带来表征蛋白质，同样可使用例如在Proton 2090 Peptide Sequencer上的Edman测序进行全长的氨基酸序列分析，或者证实其N-端序列。
例如，可将编码所预测的成熟工程改造的多肽的DNA序列克隆至含有所需启动子和任选前导序列的质粒中(参见例如Better等, 1988, Science240:1041-1043)。可通过自动化测序来证实该构建体的序列。然后使用利用CaCl2孵育和热激处理细菌的标准程序(Sambrook等, Id.)，将质粒转化到大肠杆菌菌株MC1061中。将转化的细菌在添加有羧苄青霉素的LB培养基中培养，通过在合适的培养基中生长来诱导产生所表达的蛋白质。如果存在的话，前导序列将影响成熟的工程改造的多肽的分泌，因而其将在分泌期间被切除。通过本文所述方法从细菌培养基中纯化所分泌的重组的工程改造的多肽。
或者，工程改造的多肽可在昆虫系统中表达。用于蛋白质表达的昆虫系统是本领域技术人员所熟知的。在一个这样的系统中，使用苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)作为载体在草地贪夜蛾细胞中或在粉纹夜蛾(Trichoplusia)幼虫中表达外源基因。将工程改造的多肽的编码序列克隆至病毒的非必需区，例如多角体蛋白基因，并置于多角体蛋白启动子的控制下。成功插入工程改造的多肽将使多角体蛋白基因失活，并产生缺少外壳蛋白外壳的重组病毒。然后使用重组病毒感染草地贪夜蛾(S. frugiperda)细胞或粉纹夜蛾幼虫，在其中表达本发明的工程改造的多肽(Smith等,1983, J. Virol. 46:584; Engelhard等, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 91:3224-3227)。
在另一实例中，编码工程改造的多肽的DNA序列可通过PCR扩增并克隆至合适的载体，例如pGEX-3X (Pharmacia, Piscataway, New Jersey)。设计pGEX载体以产生包含由载体编码的谷胱甘肽-S-转移酶和由插入到载体克隆位点的DNA片段编码的蛋白的融合蛋白。可产生用于PCR的引物，其包含例如合适的切割位点。然后可将重组的融合蛋白从融合蛋白的GST蛋白上切割下来。将pGEX-3X/工程改造的多肽的构建体转化到大肠杆菌XL-1 Blue细胞(Stratagene, La Jolla, California)，分离单独的转化株并于37℃在LB培养基(添加有羧苄青霉素)中生长至600 nm波长下的光密度为0.4，然后在0.5 mM异丙基β-D-硫代半乳吡喃糖苷(Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri)的存在下进一步孵育4小时。纯化来自单独的转化株的质粒DNA，并使用自动化测序仪部分地测序以证实在正确的方向上存在所需的工程改造的多肽的编码基因插入物。
当融合蛋白在细菌中预期以不可溶的包涵体产生时，其可按上文所述或如下进行纯化。通过离心收获细胞；在0.15 M NaCl、10 mM Tris pH 8、1 mM EDTA中洗涤；并用0.1mg/mL溶菌酶(Sigma Chemical Co.)在室温下处理15分钟。通过超声处理使裂解物变澄清，并且通过在12000xg下离心10分钟使细胞碎片沉淀。将包含融合蛋白的沉淀物重悬于50 mMTris pH 8和10 mM EDTA中，经50%甘油分层，并在6000xg离心30分钟。将沉淀物重悬于无Mg++和Ca++的标准磷酸盐缓冲盐水溶液(PBS)中。通过使重悬的沉淀物在变性SDS聚丙烯酰胺凝胶中分级进一步纯化融合蛋白(Sambrook等, 上述)。将凝胶浸泡在0.4 M KCl中以显现蛋白，其经切除并在缺少SDS的凝胶运行缓冲液中电洗脱。如果GST/工程改造的多肽的融合蛋白在细菌中作为可溶蛋白产生，则其可使用GST Purification Module (PharmaciaBiotech)纯化。
可将融合蛋白经受消化以将GST从成熟的工程改造的多肽上切割。将消化反应物(20-40 µg融合蛋白、20-30单位人凝血酶(4000 U/mg (Sigma)，在0.5 mL PBS中)在室温下孵育16-48小时，并加载到变性SDS-PAGE凝胶上以将反应产物分级。将凝胶浸泡在0.4 MKCl中使蛋白条带显现。可使用自动化测序仪(Applied Biosystems Model 473A, FosterCity, California)通过部分氨基酸序列分析，证实对应于工程改造的多肽的期望分子量的蛋白条带的身份。
在本发明的工程改造的多肽的重组表达的一个具体示例性方法中，可通过磷酸钙方法，用在pCMV载体(5’ CMV启动子、3’ HGH聚A序列)和pSV2neo (包含neo抗性基因)中包含工程改造的多肽的cDNA的质粒共转染293细胞。在一个实施方案中，在转染之前应该用ScaI将载体线性化。同样地，可使用备选的构建体(使用掺入neo基因的类似pCMV载体)。通过在包含0.5 mg/mL G418 (新霉素样抗生素)的生长培养基中限制性稀释10-14天，从单一细胞克隆中选择稳定的细胞系。通过ELISA或蛋白质印迹针对工程改造的多肽表达而筛选细胞系，将高表达细胞系扩增以大规模生长。
优选的是，将转化的细胞用于长期高产率的蛋白生产，并且稳定表达同样是所需的。一旦这样的细胞用包含选择标记连同所需表达盒的载体转化，可允许所述细胞在富集培养基中生长1-2天，然后将其转换到选择培养基。选择标记设计为赋予选择抗性，并且其存在允许成功表达所引入序列的细胞的生长和回收。可使用适于所述细胞的组织培养技术扩增稳定转化的细胞的抗性团(Resistant clump)。
可使用多种选择系统以回收经转化用于重组蛋白生产的细胞。这样的选择系统包括但不限于分别在tk-细胞、hgprt-细胞或aprt-细胞中的HSV胸苷激酶基因、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因和腺嘌呤磷酸核糖转移酶基因。同样，可使用抗代谢物抗性作为对赋予甲氨蝶呤抗性的dhfr、赋予霉酚酸抗性的gpt、赋予氨基糖苷G418抗性的neo、赋予氯磺隆(chlorsulfuron)抗性的also和赋予潮霉素抗性的hygro的选择基础。可使用的另外的选择基因包括允许细胞利用吲哚代替色氨酸的trpB或允许细胞利用组氨醇(histinol)代替组氨酸的hisD。产生用于鉴定转化株的可见指示的标记物包括花色素苷、β-葡糖苷酸酶及其底物GUS和荧光素酶及其底物荧光素。
可使用自动化肽合成和重组技术两者的组合来生产本发明的工程改造的多肽。例如，可合成或重组制备在制备本文所公开的工程改造多肽中使用的：瘦蛋白和瘦蛋白类似物、活性瘦蛋白片段或瘦蛋白衍生物中的任一个或两者；和ABD；以及任选接头，然后使用本领域已知的方法例如“天然化学连接”和其已知的变化将其连接在一起，其中形成酰胺键将母体化合物连接。参见例如美国专利号6,326,468，其通过引用结合到本文中用于所有目的。或者，例如，本发明的工程改造的多肽可包含修饰的组合，所述修饰包括缺失、取代、插入和通过PEG化(或其他部分，例如聚合物、脂肪酰基链、C-端酰胺化)的衍生。这样的工程改造的多肽可在多个阶段中产生。在第一阶段，包含缺失、取代、插入和其任何组合的修饰的工程改造的中间体多肽可通过所述的重组技术产生。然后，在本文所述的任选纯化步骤之后，使用合适的PEG化试剂(例如，来自NeKtar Transforming Therapeutics, San Carlos,California)通过化学修饰，将该工程改造的中间体多肽PEG化(或经受其他化学衍生，例如酰化、C-端酰胺化)，得到所需的工程改造的多肽衍生物。本领域的技术人员将理解，上述程序可普遍化以应用于包含选自以下修饰的组合的工程改造的多肽：缺失、取代、插入、衍生和本领域熟知并且本发明所预期的其他修饰方式。
肽可通过本领域已知的多种方法纯化，包括如本文所述。在一个方法中，使用Waters Delta Prep 3000系统，通过RP-HPLC (制备型和分析型)纯化肽。可使用C4、C8或C18制备型柱(10 μ，2.2X25 cm；Vydac, Hesperia, Calif.)分离肽，并且可使用C4、C8或C18分析型柱(5 μ, 0.46X25 cm；Vydac)测定纯度。溶剂(A=0.1% TFA/水和B=0.1% TFA/CH3CN)可以1.0 ml/min的流速递送到分析型柱，以15 ml/min递送到制备型柱。氨基酸分析可在Waters Pico Tag系统上进行，并且使用Maxima程序处理。肽可通过蒸气相酸水解法(115℃，20-24小时)水解。水解产物可通过标准方法(Cohen等, The Pico Tag Method: AManual of Advanced Techniques for Amino Acid Analysis, 第11-52页, MilliporeCorporation, Milford, Mass. (1989))衍生和分析。可通过M-Scan，Incorporated (WestChester, Pa.)进行快速原子轰击分析。可使用碘化铯或碘化铯/甘油进行质量校准。可在Applied Biosystems Bio-Ion 20质谱仪上进行使用飞行时间检测的等离子体解吸电离分析。
工程改造的多肽的表达测定。可使用用于测定宿主细胞的蛋白表达水平的方法。可用于测定宿主细胞的蛋白表达水平的程序例示于以下代表性的方案。用2 ul质粒DNA(用于工程改造的多核苷酸的表达载体)转化约25 μl BL21大肠杆菌细胞。将细胞涂板并在37℃下孵育过夜或在室温(RT)下孵育48小时。选择单菌落并用于在4 ml LB培养基(带有合适的抗生素)中生长起子培养物约6小时。可通过将100 ul 80%无菌甘油加入到900 ul储液中制备甘油储液，然后可将其轻轻混合并储存于-80℃。移出250 μl样品用于TCP非诱导样品。可用5 μl的起子培养物接种等份试样例如2 ml的Magic培养基(含有适当的抗生素)，然后将其在37℃下以300 rpm孵育过夜(至多24小时)。如本领域已知，Magic培养基是自身诱导的。或者，可用250 ml或125 ml Thompson烧瓶中的60 μl起子培养物接种60 ml含有适当抗生素的Magic培养基，然后将其在30℃下以300 rpm孵育过夜(至多24小时)。孵育后，可从每个管中移出250 μl培养物，并将细胞沉淀。可将细胞重悬于1 ml 50 mM Tris pH 8、150mM NaCl中，可向其中加入0.1体积(100 ul)的POP培养试剂和1 μl r-溶菌酶(1:750稀释于r-溶菌酶缓冲液)。可将混合物充分混合并在RT下孵育至少10分钟。然后可将制备物以14000 x G离心10分钟。可将上清液(可溶部分)移出并保留，并且可将样品准备用于凝胶分析(15 μl + 5 μl LDS)。可将剩余的包涵体沉淀重悬于1 ml 1% SDS中超声处理。可将样品准备用于凝胶分析(15 μl + 5 μl LDS)。对于非诱导样品，可加入1.0体积POP培养试剂和1μl r-溶菌酶(1:750稀释于r-溶菌酶缓冲液)。将混合物充分混合并在RT下孵育至少10分钟。这些样品可不需要离心。然后可将样品准备用于凝胶分析(15 μl + 5 μl LDS)。可将在1XMES缓冲液中的非还原NU-PAGE (4-12%)凝胶运行并用SimplyBlue微波方案染色。可进行脱染色过夜，如本领域已知。可保留凝胶成像，并分析以确定蛋白表达水平。
包涵体制备。对于在包涵体部分中存在的工程改造的多肽，可使用下列程序。将细胞沉淀重悬于对每50 ml培养物最小100 ml的裂解缓冲液中。加入30 ml后，可使用10 ml移液管重悬，然后用另外70 ml洗涤管。通过微流化器以100 PSI (min)多次(例如4次)运行所重悬的细胞液，在整个过程期间小心保持室在冰水中。可以14000 x g离心流化浆液20分钟(例如JLA 10.5，10,000rpm，使用250 ml Nalgene®瓶)。用移液管头破坏后，于4℃用搅拌棒和搅拌板将包涵体沉淀在冰上重悬于冷却的裂解缓冲液中1小时。用移液管头破坏后，于4℃将沉淀物再次用搅拌棒和搅拌板重悬于蒸馏水中1小时，然后以14000 x g离心15分钟。移除上清液并丢弃。将所得物储存于-80℃。
蛋白纯化。如本文所述，已知多种方法用于分离所表达的多肽。以下是一个实例。可将包涵体沉淀在RT下溶解于合适体积的溶解缓冲液(8M尿素或8M胍、50 mM Tris、10 mMDTT、pH 7.75)中1小时。将所溶解的沉淀以27000 g离心20分钟。将过滤(例如0.4 um)的上清液在RT下逐滴转移至合适体积的重折叠缓冲液(50 mM Tris-HCl、1 M尿素、0.8 M精氨酸、4 mM半胱氨酸、1 mM 胱胺；pH 8)中。然后可将所得物于4℃在轻微混合下放置过夜或更长。将样品浓缩，并使用GE Healthsciences AKTAFPLCTM，在4℃环境中以1-2 ml/min在凝胶过滤柱(SuperdexTM 75 26/60)上运行。适当的含蛋白流分可通过SDS-PAGE鉴定，合并并通过另一凝胶过滤柱运行。然后将合并的蛋白在Amicon过滤器上浓缩至适当浓度，并使用例如本领域已知的Endosafe PTS Reader (Charles River)测定内毒素水平。一旦蛋白样品通过内毒素标准，可将其无菌过滤，分配成等分试样并进行质量控制测定。质量控制测定可包括分析型HPLC-SEC，非还原型SDS PAGE和RP HPLC-MS以得到近似质量。可在1xPBS (137mM氯化钠、2.7 mM氯化钾、4.3 mM磷酸二钠、1.4 mM磷酸一钾、pH7.2)中获得蛋白，分配成等分试样并急速冷冻以储存在-70至-80℃。
IV. 使用和治疗疾病的方法
适应症。预期多种疾病和病症将通过本文所述的多肽化合物和方法而受益地治疗。
肥胖和超重。在美国和全球，肥胖和其相关的病症(包括超重)是常见及严重的公众健康问题。上身肥胖是对2型糖尿病已知的最强风险因素，并且是对心血管疾病的强风险因素。肥胖是以下疾病的公认风险因素：高血压、动脉硬化、充血性心力衰竭、中风、胆囊疾病、骨关节炎、睡眠性呼吸暂停、生殖病症例如多囊卵巢综合征、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和增加发病率的全身麻醉并发症。参见例如Kopelman, 2000, Nature404:635-43。
肥胖降低寿命和带有严重风险的上文所列共发病以及病症例如感染、静脉曲张、黑棘皮病、湿疹、运动不耐(exercise intolerance)、胰岛素抵抗、高血压、血胆固醇过多、胆石症、矫形外科损伤和血栓栓塞性疾病。参见例如Rissanen等, 1990, Br. Med. J.,301:835-7。肥胖还是对一组称为胰岛素抵抗综合征或“X综合征”和代谢综合征的病况的风险因素。肥胖和相关病症的全球医疗费用是巨大的。
认为肥胖的发病机理是多因素的。一个问题是在肥胖受试者中，营养利用率和能量支出失去平衡，直到产生过量的脂肪组织。中枢神经系统(CNS)控制能量平衡，并协调适于动物的代谢状态的各种行为活动、自主活动和内分泌活动。控制这些活动的机制或系统广泛分布在前脑(例如下丘脑)、后脑(例如脑干)和脊髓中。最终，来自这些系统的代谢(即，能量利用率)和认知(即，学习偏好)信息被整合，并且开启(进食获取并起始)或关闭(进食终止)参与食欲(食物寻觅)和消费(摄食)行为的决定。认为下丘脑主要负责整合这些信号并随后发出指令给脑干。脑干神经核控制消费型运动控制系统的元件(例如，肌肉负责咀嚼和吞咽)。因此，这些CNS神经核已完全被称为构成摄食行为的“最终共同途径”。
神经解剖学和药理学证据支持能量和营养稳态信号整合在前脑神经核中，并支持消费型运动控制系统存在于脑干神经核，可能在三叉神经运动神经核周围的区域。在下丘脑和脑干之间存在广泛的交互连接。各种CNS定向的抗肥胖疗法(例如，小分子和肽)主要聚焦在存在于下丘脑中的前脑基质和/或存在于脑干中的后脑基质。
肥胖仍是一种难以治疗、慢性、基本难治的代谢性病症。因此，存在用于在受试者中体重减轻和/或体重维持的新疗法的需求。这样的疗法将对受试者的健康产生深远的有益影响。单独或与其他抗肥胖剂(参见例如，WO 2009064298和US 20080207512)组合使用本文所公开的工程改造多肽的方法和疗法可提供这样的有益效果。
瘦蛋白不足。已显示瘦蛋白不足导致肥胖。瘦蛋白不足的一种形式是先天性瘦蛋白不足，其为一种罕见的遗传病症。参见Montaque等, 1997, Nature387: 903-908。严重的瘦蛋白不足可为不受控的胰岛素不足糖尿病的结果，所述糖尿病由分泌胰岛素的β-细胞的破坏产生。理论上，胰岛素不足导致甘油三酯合成并储存于脂肪组织，其阻止体重增加并因为瘦蛋白在脂肪组织中合成而反过来显著降低血浆瘦蛋白水平。这些和其它瘦蛋白不足以及由这样的不足引起的疾病和病症可通过瘦蛋白置换疗法治疗，例如通过每天注射瘦蛋白或瘦蛋白激动剂。本文所述的工程改造多肽可对所述疾病和病症提供更方便和更有利的治疗性治疗。
糖尿病和心血管病。认为糖尿病是一种复杂的慢性疾病，其中糖尿病患者中所有死亡病例的60%至70%是心血管并发症的结果。糖尿病不仅被认为是冠心病风险的等价物，而且还被鉴定为不良事件的独立预测因子，所述不良事件包括复发性心肌梗死、充血性心力衰竭和心血管意外后的死亡。预期对心血管风险因素采用较严格的葡萄糖控制和强力治疗将降低冠心病并发症的风险和提高糖尿病患者中的总体存活率。至今，糖尿病患者经历急性心肌梗死的可能性是非糖尿病患者的2-3倍，并且糖尿病患者比非糖尿病患者少活8-13年。
理解糖尿病/极性心肌梗死患者的高风险性质，美国心脏病学会/美国心脏病协会(“ACC/AHA”)对处理患有不稳定心绞痛或非-ST-上升的心肌梗死(统称为“ACS”)的住院患者的临床实践指导方针最近认为住院的糖尿病患者是需要强力处理高血糖症的特殊群体。特别是，指导方针规定对住院的糖尿病/ACS患者的葡萄糖降低疗法的目标应为实现餐前葡萄糖低于10 mg/dL，最大每日目标低于180 mg/dL，和出院后血红蛋白A1c低于7%。
在全国性的老年ACS患者样品中，证实糖尿病患者中30天死亡率的增加与住院后具有较高葡萄糖值的患者一致。参见“Diabetic Coronary Artery Disease &Intervention,” Coronary Therapeutics 2002, Oak Brook, IL, September 20, 2002。存在越来越多的证据表明，住院后持续的高血糖症而非短暂升高的葡萄糖与严重的不良事件有关。尽管对患者中高血糖症和血管风险的理想量度不易知道，但似乎在住院期间的平均葡萄糖值对死亡率最具预测性。在来自美国超过40家医院的ACS患者的单独研究中发现，与住院后的随机葡萄糖值相反，持久性高血糖症对住院期间的死亡率更具预测性。参见Acute Coronary Syndrome Summit: A State of the Art Approach, Kansas City, MO,September 21, 2002。与住院后的葡萄糖值相比，在整个住院期间葡萄糖控制的对数回归模型对死亡率最具预测性。在住院期间对超过120 mg/dL葡萄糖中每10 mg/dL的增加，存在几乎2倍增加的死亡率风险。在较小组的连续糖尿病/ACS患者中，随着住院后葡萄糖水平增加，一年死亡率存在分级增加。在医院环境中，ACC/AHA指导方针建议开始强力胰岛素疗法以实现住院期间较低的血糖。
已报道，在存在或不存在肥胖的情况下，瘦蛋白可对治疗糖尿病具有直接益处，特别是对I型糖尿病和II型糖尿病，并且更特别是在低血清瘦蛋白的条件下。已报道，在1型和2型糖尿病的多种动物模型(伴随有或没有肥胖)中，瘦蛋白补充减少或阻止高胰岛素血症、胰岛素抵抗和高血糖症。例如，在STZ诱导的糖尿病中，通过药理学给予瘦蛋白或通过腺病毒基因疗法产生的高瘦蛋白血浆水平降低高血糖症和相关增加的血浆胰高血糖素水平，尽管其产生持久的低胰岛素水平。
脂质调节疾病。如本领域已知，脂质营养不良表征为机体脂肪组织的异常或变性病况。血脂障碍是血液中正常脂质组分的破坏。认为胰岛素水平的长时间上升可导致血脂异常。高血脂是血液中存在升高或异常水平的脂质和/或脂蛋白。下丘脑性闭经是由于与下丘脑有关的问题引起的月经停止数月的病况。已发现，在具有下丘脑性闭经的女性中瘦蛋白置换疗法改进生殖、甲状腺和生长激素轴和骨形成标记，而不引起不良反应。参见例如，Oral等, N Engl J Med. 2004, 351: 959-962, 987-997。脂肪肝病，例如非酒精性脂肪肝病(NAFLD)，是指广谱的肝病，范围从简单性脂肪肝(脂肪变性)到非酒精性脂肪肝炎，到肝硬化(肝脏的不可逆、晚期瘢痕化)。所有阶段的NAFLD在肝脏细胞(肝细胞)中共同具有脂肪的积聚(脂肪侵润)。认为瘦蛋白是在多种慢性肝病(包括NASH)中炎症和纤维化进行的关键调节剂之一。参见例如，Ikejima等, Hepatology Res. 33:151-154。
此外，不希望受任何理论束缚，认为2型糖尿病中相对的胰岛素缺乏、葡萄糖毒性和通过从腹内脂肪组织经由门静脉提高递送而增加的肝游离脂肪酸负载涉及作为脂肪肝病症的可能原因。实际上，已推测进食行为是驱动肥胖的代谢综合征与其许多结果(包括NASH)的关键因素。因此，目的在于减少食物摄取和增加少量进餐数量的治疗，如已在2型糖尿病中所证实，可有效治疗和预防NASH。促进胰岛素分泌和体重减轻以及延缓胃排空的药物亦对提高葡萄糖耐受有效，并因此可改善脂肪肝与其伴随的高胰岛素血症。因此，使用瘦蛋白、瘦蛋白类似物(例如美曲普汀)或其活性片段，可很好地适于作为对该病况的治疗方式。因此，本文所述的工程改造的多肽，其包括瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段，可用于治疗脂肪肝病症。
阿尔茨海默氏病。阿尔茨海默氏病(AD)，如本领域已知，与脑中的斑块和缠结有关，其包括A-β蛋白的失调。认为脑脂质复杂地涉及A-β-相关致病途径，并且认为脂质稳态的重要调节剂是瘦蛋白。因此，瘦蛋白可调节双向A-β动态，在细胞外减少其水平。事实上已证实，长期将瘦蛋白给予AD-转基因动物减少脑A-β负荷，这成为其治疗潜能的基础。参见Fewlass等, 2004, FASEB J., 18:1870-1878。此外，2型糖尿病和AD共有流行病学和生物化学特征，在于两者的特征为在2型DM胰岛和AD脑的Aβ中具有纤维状结构的不溶性蛋白聚集体——胰岛淀粉样多肽。不希望受任何理论束缚，认为类似的毒性机制可表征2型DM和AD。参见Lim等,FEBS Lett., 582:2188-2194。
代谢综合征X。代谢综合征X被表征为胰岛素抵抗、血脂障碍、高血压和脂肪组织的内脏分布，并在2型糖尿病的病理生理学中起关键的作用。还发现其与肝脏的NASH、纤维化和肝硬化强相关。因此，本文所述的工程改造的多肽可用于治疗代谢综合征X。
亨廷顿氏病。亨廷顿氏病是常染色体显性的神经发生性疾病。该疾病的特征包括运动障碍、痴呆、精神病问题和无意识的体重减轻。本文所述的工程改造多肽可用于治疗亨廷顿氏病。
因此，一个方面，提供用于治疗受试者中疾病或病症的方法。所述受试者有治疗所述疾病或病症的需要。所述疾病或病症可以是脂质营养不良、血脂障碍、高脂血症、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病或糖尿病(b包括I型和II型)。通过本文所述的化合物和方法可治疗的其他疾病和病症包括非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X和亨廷顿氏病。治疗方法包括以有效治疗所述疾病或病症的量给予受试者本文所述的工程改造多肽。所述工程改造的多肽包含作为HD1的瘦蛋白、瘦蛋白片段或瘦蛋白类似物。因此，所述工程改造的多肽可具有以下结构之一：ABD-HD1、HD1-ABD、ABD-L1-HD1或HD1-L1-ABD。
在所有的本文所述治疗实施方案中，瘦蛋白可以是人瘦蛋白或美曲普汀。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物具有与人瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物具有与小鼠瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物具有与大鼠瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物具有与鸭嘴兽瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物具有与海豹瘦蛋白至少50%、例如50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或甚至更高的同一性。在一些实施方案中，瘦蛋白类似物是瘦蛋白A100、A300或A500。
V. 测定法
用于生产和测定本文所述的工程改造的多肽的方法通常是技术人员可得的。此外，特定的方法在本文以及本文引用的专利公布和其他参考文献中描述，所述专利公布和参考文献通过引用予以结合用于该另外目的。
食物摄取量。不希望受任何理论的束缚，认为食物摄取量可用于评价本文所述的组合物的效用。例如，已知大量的代谢病理与食物摄取量有关(例如糖尿病、肥胖)。因此，可进行初始筛查以确定食物摄取量受给予本文所述化合物所调整的程度，并且阳性的初始筛查可用于化合物的后续开发。
对本领域技术人员而言，可获得多种食物摄取量测定法。例如，在食物摄取量的所谓“饲养笼模型(home cage model)”中，受试者(例如大鼠)保持在它们的饲养笼中，注射测试化合物后测量食物摄取量以及受试者的总体重。在食物摄取量测定法的所谓“喂养模式模型”中，受试者(例如大鼠)习惯于喂养室和测试前的注射。在测试化合物给予后，立即将受试者置于喂养室中，自动化测定食物摄取量随时间的变化(例如，1分钟的间隔)。对于这两种测试，食物是标准饲料(chow)或本领域已知的各种饲料中的任一种(例如高脂肪)。在所谓的“小鼠食物摄取量”测定法中，可测试测试化合物在膳食诱导肥胖(DIO)小鼠中的食欲抑制或对体重增加的影响。在典型的小鼠食物摄取量测定法中，将雌性NIH/Swiss小鼠(8-24周龄)在12:12光亮：黑暗周期(在0600光亮打开)下群养。水和标准颗粒小鼠饲料可任意获得，除非有所说明。实验前1天，在大约1500 hr时开始禁食动物。实验的早上，将动物分成实验组。在典型的研究中，n=4笼，其中3小鼠/笼。在时间=0分钟时，将所有动物给予腹膜内注射溶媒或化合物(通常以范围为约10 nmol/kg至75 nmol/kg的量)，并立即给予预称重量(10-15 g)的标准饲料。在多个时间(通常30、60和120分钟)将食物移出并称重，以确定消耗的食物的量。参见例如，Morley等, 1994, Am. J. Physiol.267:R178-R184。通过从在时间=0时起始提供的食物重量中减去在例如30、60、120、180和/或240分钟时间点时剩余的食物重量，计算食物摄取量。通过ANOVA确定显著的治疗效果(p<0.05)。在存在显著差异的情况下，使用Dunnett's检验(Prism v. 2.01, GraphPad Software Inc., San Diego,Calif.)比较测试方法和对照方法。对于本文所述的任何测试，可通过任何方法给予测试化合物，包括注射(例如皮下、腹膜内等)、口服或本领域已知的其它给予方法。
体外测定法。不希望受任何理论和作用机制的束缚，认为体外(例如受体)测定法的结果和用于治疗代谢疾病和病症的药剂的效用之间存在相关性。因此，体外测定法(例如，基于细胞的测定法)可用作对例如本文所述的潜在代谢药剂的筛选策略。本领域已知多种体外测定法，包括以下所述的那些。
瘦蛋白结合测定法。可通过由32D OBECA细胞系呈现的测试化合物从表达嵌合瘦蛋白(Hu)-EPO (Mu)受体的表面膜置换125I-重组-瘦蛋白(鼠)的效能来测量瘦蛋白的结合(J Biol Chem 1998; 273(29): 18365-18373)。可通过自收获的32D OBECA细胞的汇合细胞培养物匀浆而制备纯化的细胞膜。可在96孔聚苯乙烯板上在环境温度下用125I-rec-鼠-瘦蛋白和递增浓度的测试化合物孵育膜3小时。然后可通过快速过滤至96孔GF/B板(在0.5%PEI (聚乙烯亚胺)中预封闭至少60')来分离结合和未结合的配体部分。然后可将玻璃纤维板干燥，加入闪烁剂，并通过在多孔闪烁计数器(其能够读出放射性标记碘)上读数来测定CPM。
瘦蛋白功能测定法。用测试化合物处理异位表达嵌合Hu-瘦蛋白/Mu-EPO受体的32D-Keptin细胞后，可测量增加水平的磷酸化STAT5 (信号转导子和转录激活子5)。可将32D-Keptin细胞(与32D-OBECA细胞相同，但保持在具有瘦蛋白的培养物中)戒断瘦蛋白过夜，然后在96孔板中在37℃下用测试化合物处理30分钟，然后细胞提取。可以384孔形式(Proxiplate™ 384 Plus)使用Perkin Elmer AlphaScreen® SureFire® pSTAT5测定试剂盒，测定细胞裂解物中的pSTAT5水平。可相对于在来自用人瘦蛋白处理的细胞的细胞裂解物的最大信号，测定测试化合物的功效。
VI. 药物组合物
一方面，提供包含与药学上可接受的赋形剂(例如载体)组合的本文所述化合物的药物组合物。本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指药学上的赋形剂，例如适于肠或胃肠外应用的药学上、生理学上可接受的有机或无机载体物质，其不与活性剂起有害反应。合适的药学上可接受的载体包括水、盐溶液(例如林格溶液等)、乙醇、油、凝胶和碳水化合物例如乳糖、直链淀粉或淀粉、脂肪酸酯、羟甲基纤维素和聚乙烯吡咯烷。这样的制剂可以是无菌的，并且如果需要的化，其与辅剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、湿润剂、乳化剂、影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂和/或芳香物质等混合，所述辅剂不与本发明的化合物起有害反应。
在又一方面，提供包含与药学上可接受的赋形剂组合的本文所述工程改造多肽的药物组合物。在一些实施方案中，药物组合物为长效的药物组合物。在给予药物组合物的背景下，术语“长效的”是指作用持续时间。因此，长效的药物组合物可以例如1小时、2小时、4小时、8小时、12小时、1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周、1个月或甚至更长的间隔给予。在优选的实施方案中，1天给予一次(即每天1次)。在更优选的实施方案中，1周给予一次(即，每周1次)。
A. 方法
本文所述的工程改造多肽可单独给予或可共给予受试者。共给予意思是包括同时或序贯给予化合物(单独地或组合(超过一种化合物))。例如，已发现用组合疗法可有利地治疗肥胖，所述组合疗法包含瘦蛋白(例如美曲普汀)和某些其它的抗肥胖化合物。参见例如美国公布申请号2008/0207512。因此，本文所述的包含ABD和瘦蛋白的工程改造多肽可用于治疗肥胖。或者，单独的工程改造多肽可与其他抗肥胖剂(例如艾塞那肽(exenatide)和利拉鲁肽(liraglutide))共给予。
在一些实施方案中，本文所述的制剂和方法进一步提供将瘦蛋白或瘦蛋白类似物工程改造多肽与一种或多种抗糖尿病剂共给予，所述抗糖尿病剂例如抗高血糖剂，例如胰岛素、胰岛淀粉样多肽、普兰林肽、二甲双胍。
在一些实施方案中，本文所述的制剂和方法进一步提供将瘦蛋白或瘦蛋白类似物工程改造多肽与一种或多种胆固醇和/或甘油三酯降低剂共给予。示例性药剂包括HMG CoA还原酶抑制剂(例如，阿伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、普伐他汀、罗苏伐他汀、辛伐他汀)；胆酸多价螯合剂(例如，考来维仑、考来烯胺、考来替泼)；贝特类(fibrate) (例如，非诺贝特、安妥明、吉非贝齐)；依泽替米贝、烟酸、普罗布考、洛伐他汀/尼克酸的组合；阿伐他汀/氨氯地平的组合；和辛伐他汀/依泽替米贝的组合。
本公开内容提供用作药物(即，用于治疗)的组合物，这是因为瘦蛋白化合物是治疗上的活性化合物，并当与ABD融合时令人惊讶地保留有活性。还特别预期包含工程改造多肽(液体或干燥形式)和任选至少一种药学上可接受的载体和/或赋形剂的组合物，并在本文中作为例示。
所述组合物具有与白蛋白在体内或体外结合的能力。在某些情况下，与在活生物体外部的白蛋白形成组合物复合体的益处(即，将外源性白蛋白添加到组合物中)可具有益处。这样的组合物可冻干，提供适于在环境温度储存的制剂。因此，本公开内容还提供上文定义的组合物，其还包含白蛋白例如人血清白蛋白，并且其可任选呈干燥形式。
通过分别给予瘦蛋白、瘦蛋白类似物或瘦蛋白类似物激动剂工程改造多肽与第二药剂，或通过给予包含瘦蛋白、瘦蛋白类似物或瘦蛋白类似物激动剂工程改造多肽和第二药剂的单一药物制剂，可实现共给予。第二药剂的合适给药方案通常是本领域已知的。
当需要时，还可将所述制剂与本领域已知的其它活性物质(例如以减少代谢降解)或其他治疗上的活性剂共给予。
胰岛淀粉样多肽。胰岛淀粉样多肽是通过胰β-细胞合成的肽激素，其与胰岛素共分泌以响应营养摄取。胰岛淀粉样多肽的序列在哺乳动物物种间高度保守，与降钙素基因相关肽(CGRP)、降钙素、垂体中间叶激素和肾上腺髓质素具有结构类似性，如本领域已知。通过调节循环中葡萄糖出现的速率(通过抑制营养刺激的胰高血糖素分泌和减慢胃排空)，胰岛淀粉样多肽的糖调节作用补充胰岛素的糖调节作用。在胰岛素治疗的糖尿病患者中，普兰林肽(人胰岛淀粉样多肽的合成的等效类似物)通过抑制不适当升高的餐后胰高血糖素分泌和减慢胃排空，来降低餐后葡萄糖偏移。大鼠胰岛淀粉样多肽、人胰岛淀粉样多肽和普兰林肽的序列如下：
大鼠胰岛淀粉样多肽：KCNTATCATQRLANFLVRSSNNLGPVLPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:108)；
人胰岛淀粉样多肽：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGAILSSTNVGSNTY (SEQ ID NO:109)；
普兰林肽：KCNTATCATQRLANFLVHSSNNFGPILPPTNVGSNTY (SEQ ID NO:110)。
Davalintide。Davalintide，亦称为“AC-2307”，是可用于治疗多种疾病适应症的有效胰岛淀粉样多肽激动剂。参见WO 2006/083254和WO 2007/114838，其各自通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。Davalintide是嵌合肽，具有胰岛淀粉样多肽或降钙素和其类似物的N-端环区、降钙素或其类似物的α-螺旋区的至少一部分的α-螺旋区或具有胰岛淀粉样多肽α-螺旋区和降钙素α-螺旋区或其类似物的至少一部分的α-螺旋区、和胰岛淀粉样多肽或降钙素的C-端尾区。人降钙素、鲑鱼降钙素和davalintide的序列如下：
人降钙素：CGNLSTCMLGTYTQDFNKFHTFPQTAIGVGAP (SEQ ID NO:111)；
鲑鱼降钙素：CSNLSTCVLGKLSQELHKLQTYPRTNTGSGTP (SEQ ID NO:112)；
davalintide：KCNTATCVLGRLSQELHRLQTYPRTNTGSNTY (SEQ ID NO:113)。
不希望受任何理论的束缚，认为胰岛淀粉样多肽和davalintide及其片段和类似物可需要C-端酰胺化以诱发完整的生物学反应。应理解，胰岛淀粉样多肽化合物例如本文所述的那些，其包括胰岛淀粉样多肽和/或davalintide及其片段和类似物，可在C-端被酰胺化。
“胰岛淀粉样多肽激动剂化合物”包括天然的胰岛淀粉样多肽的肽、胰岛淀粉样多肽类似物的肽和具有胰岛淀粉样多肽激动剂活性的其它化合物(例如小分子)。“胰岛淀粉样多肽激动剂化合物”可源自于天然来源，可以是合成的，或者可源自于重组DNA技术。胰岛淀粉样多肽激动剂化合物具有胰岛淀粉样多肽激动剂受体结合活性，并可包含氨基酸(例如，天然的、非天然的或其组合)、拟肽、化学部分等。使用胰岛淀粉样多肽受体结合测定法或通过在比目鱼肌测定法中测量胰岛淀粉样多肽激动剂活性，技术人员识别胰岛淀粉样多肽激动剂化合物。在一个实施方案中，在胰岛淀粉样多肽受体结合测定法(例如本文、美国专利号 5,686,411和美国公布号2008/0176804中所述的测定法，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的)中，胰岛淀粉样多肽激动剂化合物的IC50为约200 nM或更低、约100 nM或更低、或约50 nM或更低。在一个实施方案中，在比目鱼肌测定法(例如本文和美国专利号5,686,411中所述的测定法)中，胰岛淀粉样多肽激动剂化合物的EC50为约20 nM或更低、约15 nM或更低、约10 nM或更低、或约5 nM或更低。在一个实施方案中，胰岛淀粉样多肽化合物具有与25,28,29Pro-人-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 53)至少90%或100%的序列同一性。在一个实施方案中，胰岛淀粉样多肽激动剂化合物为胰岛淀粉样多肽(例如，人胰岛淀粉样多肽、大鼠胰岛淀粉样多肽等)和降钙素(例如，人降钙素、鲑鱼降钙素等)的肽嵌合体。合适的和示例性的胰岛淀粉样多肽激动剂化合物还描述于美国公布号2008/0274952，其公开内容通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
本文所用的“胰岛淀粉样多肽类似物”是指具有与大鼠或人或任何其它物种来源的天然存在形式的胰岛淀粉样多肽至少50%的序列同一性、优选至少70%的序列同一性的胰岛淀粉样多肽激动剂，并且其通过包括以下的修饰而源自于它们：参考氨基酸序列的插入、取代、延伸和/或缺失。
胰岛淀粉样多肽类似物序列可具有与参考胰岛淀粉样多肽至少50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、90%或95%的氨基酸序列同一性。在一方面，相对于参考化合物，所述类似物具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或甚至16个氨基酸取代、插入、延伸和/或缺失。在一个实施方案中，胰岛淀粉样多肽类似物可包含保守或非保守的氨基酸取代(包括非天然氨基酸和L和D型)。这些类似物优选是肽、肽衍生物或拟肽。典型的胰岛淀粉样多肽类似物是肽，尤其是具有32-37个氨基酸，例如27-45、尤其28-38和甚至31-36。
与大鼠和人胰岛淀粉样多肽具有同一性的胰岛淀粉样多肽类似物包括25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(普兰林肽) (SEQ ID NO: 110)、脱-1Lys-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ IDNO: 161)、25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 162)、18Arg,25,28Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 163)、脱-1Lys,18Arg,25,28Pro-h 胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO:164)、18Arg,25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 165)、脱-1Lys,18Arg,25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 166)、脱-1,Lys25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO:167)、25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 168)、28Pro-h-胰岛淀粉样多肽, 2,7-环-[2Asp,7Lys]-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 169)、2-37h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 170)、1Ala-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 171)、2Ala-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 172)、2,7Ala-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 173)、1Ser-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 174)、29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 175)、25,28Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 176)、脱-1Lys,25,28Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 177)、23Leu,25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 178)、23Leu25Pro26Val28Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 179)、脱-1Lys,23Leu,25Pro,26Val,28Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ IDNO: 180)、18Arg,23Leu,25Pro,26Val,28Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 181)、18Arg,23Leu,25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 182)、18Arg23Leu,25,28Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 183)、17Ile,23Leu,25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 184)、17Ile,25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 185)、脱-1Lys,17Ile,23Leu,25,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 186)、17Ile,18Arg,23Leu-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO:187)、17Ile,18Arg,23Leu,26Val,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 188)、17Ile,18Arg,23Leu,25Pro,26Val,28,29Pro-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 189)、13Thr,21His,23Leu,26Ala,28Leu,29Pro,31Asp-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 190)、13Thr,21His,23Leu,26Ala,29Pro,31Asp-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 191)、脱-1Lys,13Thr,21His,23Leu,26Ala,28Pro,31Asp-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 192)、13Thr,18Arg,21His,23Leu,26Ala,29Pro,31Asp-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 193)、13Thr,18Arg,21His,23Leu,28,29Pro,31Asp-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 194)和13Thr,18Arg,21His,23Leu,25Pro,26Ala,28,29Pro,31Asp-h-胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 195)。
合适的和示例性的胰岛淀粉样多肽激动剂化合物还描述于PCT专利公布WO2010/085700。
胰岛淀粉样多肽类似物包含下列式(I)的残基1-37的氨基酸序列，其中式(I)中所述氨基酸的至多25%可以缺失或被不同氨基酸取代：
X’-Xaa1-Cys2-Asn3-Thr4-Ala5-Thr6-Cys7-Ala8-Thr9-Gln10-Arg11-Leu12-Ala13-Asn14-Phe15-Leu16-Val17-His18-Ser19-Ser20-Xaa21-Asn22-Phe23-Xaa24-Xaa25-Xaa26-Xaa27-Xaa28-Xaa29-Thr30-Xaa31-Val32-Gly33-Ser34-Asn35-Thr36-Tyr37-X (SEQ ID NO:800) (I)。
在式(I)中，X’为氢、N-端封端基团、或与延长持续时间的部分的接头。Xaa1为Lys或键，Xaa21为Lys、Cys或Asn，Xaa24为Lys、Cys、或Gly，Xaa25为Lys、Cys或Pro，Xaa26为Lys、Cys或Ile，Xaa27为Lys、Cys或Leu，Xaa28为Lys、Cys或Pro，Xaa29为Lys、Cys或Pro，且Xaa31为Lys、Cys或Asn。此外对于式(I)，可变X代表C-端官能团(例如，C-端封端)。X是取代或未取代的氨基、取代或未取代的烷基氨基、取代或未取代的二烷基氨基、取代或未取代的环烷基氨基、取代或未取代的芳基氨基、取代或未取代的芳烷基氨基、取代或未取代的烷基氧基、取代或未取代的芳基氧基、取代或未取代的芳烷基氧基或羟基。如果具有式(I)的残基1-37序列的多肽组分的C-端被官能团X封端，则X优选是胺，由此形成C-端酰胺。在一些实施方案中，在式(I)的多肽组分中，式(I)的残基1-37的多达5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%或甚至50%的氨基酸缺失或被取代。在一些实施方案中，相对于式(I)所述的氨基酸序列，胰岛淀粉样多肽类似物组分具有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或甚至16个氨基酸取代。在一些实施方案中，胰岛淀粉样多肽类似物具有这样的序列，其与式(I)的氨基酸序列的残基1-37具有所定义的序列同一性。在一些实施方案中，本文所述的胰岛淀粉样多肽类似物和式(I)的残基1-37之间的序列同一性为50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或甚至更高。在一些实施方案中，式(I)的残基1-37中所述的至多50%、45%、40%、35%、30%、25%、20%、15%、10%、5%或甚至更少的氨基酸可缺失或被取代为不同的氨基酸。在一些实施方案中，序列同一性在75%-100%的范围内。在一些实施方案中，序列同一性在75%-90%的范围内。在一些实施方案中，序列同一性在80%-90%的范围内。在一些实施方案中，序列同一性为至少75%。在一些实施方案中，胰岛淀粉样多肽类似物具有式(I)的残基1-37的序列。
在一些实施方案中，胰岛淀粉样多肽类似物，其包含式(I)的那些，构成多肽组分的基础，其中一个或多个延长持续时间的部分任选通过接头连接于所述多肽组分上，以形成胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物。因此，多肽组分作为模板(“多肽模板”)，其中一个或多个延长持续时间的部分优选通过共价连接连接于所述模板上。延长持续时间的部分与所述多肽组分的连接可通过本文所述的接头进行。或者，延长持续时间的部分与所述多肽组分的连接可通过直接的共价键进行。延长持续时间的部分可以是本文所述的水溶性聚合物。在一些实施方案中，将多个延长持续时间的部分连接到所述多肽组分上，在该情况下对每个延长持续时间的部分的每个接头独立地选自本文所述的接头。
可用作本文所述的多肽组分的胰岛淀粉样多肽类似物包括但不限于式(I)的残基1-37中所述的化合物，其提供于下表3。除非有相反的指示，否则本文所述的所有肽，包括具有明确提供序列的肽，预期呈游离的羧化或酰胺化形式。
表3. 可用于本文所述的化合物的多肽组分。
在连接延长持续时间的部分与本文所述的胰岛淀粉样多肽缀合物中的多肽组分的背景下，术语“接头”等是指依次与具有可用于键合的配价的多肽组分和具有可用于键合的配价的延长持续时间的部分共价键合的二价物类(-L-)。多肽组分上可用的键合位点合宜地是侧链残基(例如，赖氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸及其同源物)。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是赖氨酸或半胱氨酸残基的侧链。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是N-端胺。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是C-端羧基。在一些实施方案中，多肽组分上可用的键合位点是其骨架原子。本文所用的术语“连接氨基酸残基”是指式(I)的残基1-37内的氨基酸，延长持续时间的部分任选通过接头连接于其上。
在一些实施方案中，提供具有接头的化合物，所述接头将多肽组分和延长持续时间的部分共价连接。所述接头是任选的；即，任何接头可仅为键。在一些实施方案中，接头连接到多肽组分的侧链。在一些实施方案中，接头连接到多肽组分的骨架原子。
在另一方面，提供胰岛淀粉样多肽类缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且第2-37位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基或半胱氨酸残基，和其中所述赖氨酸残基或半胱氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物，其中氨基酸编号与SEQ ID NO:110中的氨基酸编号一致。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，和其中第2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、31、32、33、34、35、36或37位的任一个上氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第21、24-29或31位中任一个上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第21位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第24位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第25位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第26位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第27位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第28位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第29位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在另一方面，本发明涉及胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物，其为SEQ ID NO:110的普兰林肽的衍生物或其类似物，其中第1位的氨基酸残基是不存在的(即，脱-Lys1)，并且其中第31位上的氨基酸残基被取代为赖氨酸残基，并且其中所述赖氨酸残基任选通过接头连接到聚乙二醇聚合物。
在一些实施方案中，延长持续时间的部分为水溶性聚合物。“水溶性聚合物”是指在例如本领域已知的温度、离子浓度等生理条件下足以溶于水以用于本文所述方法的聚合物。水溶性聚合物可增加所述水溶性聚合物连接于其上的肽和其它生物分子的溶解度。实际上，已提出这样的连接为用于改进所给予的蛋白在体内的循环寿命、水溶解度和/或抗原性的方法。参见例如，美国专利号4,179,337；美国公布申请号2008/0032408。许多不同的水溶性聚合物和连接化学物已用于该目的，例如聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、多聚氨基酸(同聚物或随机共聚物)等。
在一些实施方案中，所连接的延长持续时间的部分包括聚乙二醇。聚乙二醇(“PEG”)已尝试用于获得治疗上可用的多肽。参见例如，Zalipsky, S., 1995,Bioconjugate Chemistry, 6:150-165; Mehvar, R., 2000, J. Pharm. Pharmaceut. Sci., 3:125-136。如本领域技术人员所理解，PEG骨架[(CH2CH2-O-)n，n：重复单体的数量]具有柔性和两亲性。不希望受任何理论和作用机制的束缚，认为当在水性介质中时，长的链状PEG分子或部分被高度水合并快速运动。认为该快速运动使PEG延伸很大体积并阻止其它分子的接近和干扰。因此，当与另一化学实体(例如，肽)连接时，PEG聚合物链可保护这样的化学实体免于免疫反应和其他清除机制。因此，聚乙二醇化可通过优化药代动力学、增加生物利用度和降低免疫原性和给药频率而产生改进的药物功效和安全性。“聚乙二醇化”在惯常意义上是指PEG部分与另一化合物的缀合。例如，已显示，PEG连接保护蛋白免于蛋白水解。参加例如，Blomhoff, H. K.等, 1983, Biochim Biophys Acta, 757:202-208。除非明确有相反的指示，否则术语“PEG”、“聚乙二醇聚合物”等是指聚乙二醇聚合物和其衍生物，包括甲氧基-PEG (mPEG)。
已使用多种方法将聚合物部分例如PEG和相关的聚合物连接至蛋白上存在的反应基团。参见例如，美国专利号4,179,337；美国专利号4,002,531；Abuchowski等, 1981, 载于"Enzymes as Drugs," J. S. Holcerberg和J. Roberts (主编),第367-383页；Zalipsky, S., 1995, Bioconjugate Chemistry, 6:150-165。已论述了PEG和其它聚合物在修饰蛋白中的用途。参见例如，Cheng, T.-L.等, 1999m, Bioconjugate Chem., 10:520-528；Belcheva, N.等,1999, Bioconjugate Chem., 10:932-937；Bettinger, T.等,1998, Bioconjugate Chem., 9:842-846；Huang, S.-Y.等, 1998, Bioconjugate Chem.,9:612-617；Xu, B.等1998, Langmuir, 13:2447-2456；Schwarz, J. B.等, 1999, J. Amer. Chem. Soc., 121:2662-2673；Reuter, J. D.等, 1999, Bioconjugate Chem.,10:271-278；Chan, T.-H.等, 1997, J. Org. Chem., 62:3500-3504。蛋白中的典型连接位点包括伯氨基(例如在赖氨酸残基或在N-端上的那些)、巯基(例如在半胱氨酸侧链上的那些)和羧基(例如在谷氨酸或天冬氨酸残基或在C-端上的那些)。常见连接位点连接到糖蛋白的糖残基、半胱氨酸或靶多肽的N-端和赖氨酸。术语“聚乙二醇化”等是指将聚乙二醇任选通过本文所述和/或本领域已知的接头共价连接到多肽或其它生物分子。
在一些实施方案中，本文所述的胰岛淀粉样多肽的多肽缀合物中的PEG部分具有特定范围内的标称分子量。按本领域的惯例，PEG部分的大小通过参照标称分子量来表示，通常以千道尔顿(kD)提供。以本领域已知的多种方法计算分子量，包括数量、重量、粘度和“Z”平均分子量。应理解，聚合物例如PEG等，作为围绕标称平均值的分子量分布而存在。
PEG分子量的术语的实例，术语“mPEG40KD”是指具有40千道尔顿标称分子量的甲氧基聚乙二醇聚合物。对其它分子量的PEG的提及遵循这一惯例。在一些实施方案中，PEG部分具有范围在10-100 KD、20-80 KD、20-60 KD或20-40 KD标称分子量。在一些实施方案中，PEG部分具有10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或甚至100 KD的标称分子量。优选PEG部分具有20、25、30、40、60或80 KD的分子量。
可用于多肽的衍生化的PEG分子通常分类为本领域已知的线性、支链和Warwick(即，PolyPEG®)类PEG。除非有明确相反的指示，本文所述的PEG部分是线性PEG。此外，术语“双臂支链”、“Y-形”等是指本领域已知的支链PEG部分。在PEG的背景下，术语“Warwick”，亦称为“梳”或“梳-形”PEG，是指与骨架连接的多种多臂PEG，通常为聚(丙烯酸甲酯)，如本领域已知。关于包括本文提供的表中所使用的惯例的命名法，在缺少相反指示的情况下，PEG部分与肽骨架连接。例如，Cmpd 119是mPEG40KD与Cmpd 101的N-端氮缀合的结果。同样地，Cmpd 120是mPEG40KD与Cmpd 102的N-端氮缀合的结果。可使用氨基酸的标准单字母缩写，同样可使用标准三字母缩写。例如，Cmpd 124是Cmpd 110的类似物，其中Cmpd 109的第26位的残基被取代为赖氨酸，赖氨酸26 (即，K26)的侧链胺官能团与PEG40KD部分缀合。示例性化合物提供于下表4中。
表4. 聚乙二醇化化合物
Cmpd 描述
119 mPEG40KD-Cmpd 101 (SEQ ID NO: 196)
120 mPEG40KD-Cmpd 102 (SEQ ID NO: 197)
121 [K21(mPEG40KD)]-Cmpd 103 (SEQ ID NO: 198)
122 [K21(mPEG40KD)]-Cmpd 104 (SEQ ID NO: 199)
123 [K26(mPEG40KD)]-Cmpd 105 (SEQ ID NO: 200)
124 [K26(mPEG40KD)]-Cmpd 106 (SEQ ID NO: 201)
125 [K31(mPEG40KD)]-Cmpd 107 (SEQ ID NO: 202)
126 [K31(mPEG40KD)]-Cmpd 108 (SEQ ID NO: 203)
127 [K26(Y型-mPEG40KD)]-Cmpd 105 (SEQ ID NO: 204)
128 [K21(mPEG40KD)]-Cmpd 111 (SEQ ID NO: 205)
129 [K26(mPEG40KD)]-Cmpd 112 (SEQ ID NO: 206)
130 [K31(mPEG40KD)]-Cmpd 113 (SEQ ID NO: 207)
131 [K26(Y型-mPEG40KD)]-Cmpd 112 (SEQ ID NO: 208)
132 [K24(mPEG40KD)]-Cmpd 114 (SEQ ID NO: 209)
133 [K25(mPEG40KD)]-Cmpd 115 (SEQ ID NO: 210)
134 [K27(mPEG40KD)]-Cmpd 116 (SEQ ID NO: 211)
135 [K28(mPEG40KD)]-Cmpd 117 (SEQ ID NO: 212)
136 [K29(mPEG40KD)]-Cmpd 118 (SEQ ID NO: 213)
化学部分连接于其上的胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽类似物是胰岛淀粉样多肽衍生物。胰岛淀粉样多肽衍生物可构成已对其进行以下一个或多个的化学修饰的胰岛淀粉样多肽：其氨基酸侧基、α-碳原子、末端氨基或末端羧酸基团。化学修饰包括但不限于连接一个或多个化学部分、形成新键和去掉一个或多个化学部分。氨基酸侧基上的修饰包括但不限于烷基化；酰化；酯形成；酰胺形成；马来酰亚胺偶联；赖氨酸ε-氨基的酰化；精氨酸、组氨酸或赖氨酸的N-烷基化；谷氨酸或天冬氨酸羧酸基团的烷基化；和谷氨酰胺或天冬酰胺的脱酰胺化。末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰。末端氨基的修饰包括但不限于脱氨基、N-低级烷基、N-二-低级烷基和N-酰基修饰，例如烷基酰基、支链烷基酰基、烷基芳基-酰基。末端羧基的修饰包括但不限于酰胺、低级烷基酰胺、二烷基酰胺、芳基酰胺、烷基芳基酰胺和低级烷基酯修饰。低级烷基为C1-C4烷基。此外，一个或多个侧基或末端基团可受合成化学普通技术人员已知的保护基团保护。氨基酸的α-碳可以被单甲基化或二甲基化。
胰岛淀粉样多肽衍生物包括通过添加多聚氨基酸(例如多聚-his、多聚-arg、多聚-lys和多聚-ala)或通过添加小分子取代基(包括短的烷基和限制性烷基(例如支链的、环状的、稠合的、金刚烷基)以及芳香基)，与上文所述的一种或多种水溶性聚合物分子(例如聚乙二醇(“PEG”))和各种长度的脂肪酸链(例如，硬脂酰基、棕榈酰基、辛酰基)缀合的胰岛淀粉样多肽和胰岛淀粉样多肽类似物。在一些实施方案中，水溶性聚合物分子的分子量范围为约500道尔顿至约60,000道尔顿。对于适合与本发明的工程改造多肽联合用作抗肥胖剂的胰岛淀粉样多肽衍生物，参见例如PCT专利公布WO 2007/104789、WO 2009/034119和WO 2010/046357。
这样的聚合物-缀合可特别发生在本文所公开的胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物序列的N-端或C-端或氨基酸残基的侧链上。或者，沿所述胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物的氨基酸序列可存在多个衍生化位点。一个或多个氨基酸被取代为赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸可提供另外的衍生化位点。在一些实施方案中，胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物可与一个、两个或三个聚合物分子缀合。
在一些实施方案中，水溶性聚合物分子与氨基、羧基或巯基连接，并可通过N-端或C-端或在赖氨酸、天冬氨酸、谷氨酸或半胱氨酸的侧链上连接。或者，水溶性聚合物分子可与二胺或二羧基连接。在一些实施方案中，胰岛淀粉样多肽或胰岛淀粉样多肽类似物与一个、两个或三个PEG分子通过赖氨酸氨基酸的ε氨基缀合。
令人惊讶地发现，当与某些其它抗肥胖化合物联合给予时，本发明的工程改造多肽为中度肥胖(BMI等于或大于30)和重度肥胖(BMI等于或大于35)受试者提供有益的协同抗肥胖作用。如先前在例如美国公布申请号2008/0207512中所述，已发现瘦蛋白抵抗的状态存在于肥胖受试者中。亦参见例如Tenenbaum, D., HHMI Bulletin, 第25-27页(2003年3月)；Chicurel, M., Nature, 第404卷, 第538-540页(2000)；Scarpace等,Diabetalogia, 第48卷, 第1075-1083页(2005)；和Bays等, Obesity Research, 第12卷,(8), 第1197-1211页(2004)。特征至少部分为在肥胖受试者中存在异常高的血清瘦蛋白水平的瘦蛋白抵抗，使这些受试者不能有效响应瘦蛋白(无论是内源的还是外源性给予)。先前已发现，瘦蛋白抵抗可在中度肥胖受试者中用包含瘦蛋白(例如，美曲普汀)和某些其它抗肥胖化合物的组合疗法来克服。参见例如美国公布申请号2008/0207512。还已发现，瘦蛋白组合疗法在重度肥胖、高BMI受试者中不存在协同抗肥胖作用，这可能是由于重度瘦蛋白抵抗。本发明人出乎意料地发现，当与某些其它抗肥胖化合物组合给予时，本发明的工程改造化合物能够克服甚至重度瘦蛋白抵抗。因此，本发明还提供通过给予至少两种不同的抗肥胖剂来治疗受试者(包括高BMI受试者)中肥胖和肥胖相关病况、病症和疾病的方法，其中一种抗肥胖剂是本发明的工程改造多肽，另一种抗肥胖剂是胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽类似物、胰岛淀粉样多肽激动剂或胰岛淀粉样多肽衍生物(即，胰岛淀粉样多肽药剂)。
在某些实施方案中，本发明提供在有需要的受试者中治疗肥胖的方法，包括与选自胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽类似物、胰岛淀粉样多肽激动剂或胰岛淀粉样多肽衍生物的第二抗肥胖剂组合给予选自本发明工程改造多肽的第一抗肥胖剂，其中与单独给予任一药剂相比，这些药剂的给予导致协同作用。
在一方面，本发明的方法提供所给予药剂的协同抗肥胖作用。因此，在某些实施方案中，抗肥胖剂的组合给予导致以下的作用，例如营养利用率降低、体重降低、食物摄取降低、代谢增加，其大于单独给予抗肥胖剂(单一疗法)的结果的组合。
“营养利用率降低”是指包括机体减少机体可利用以储存为脂肪的营养的任何方法。换句话说，营养利用率降低可以是通过以下方法，包括但不限于减少食欲、增加饱食感、影响食物选择/味觉厌恶、增加代谢和/或减少或抑制食物吸收。可受影响的示例性机制包括延迟胃排空或减少肠内的食物吸收。
本文所用的“有需要的受试者”包括超重、肥胖或渴望体重减轻的受试者。肥胖受试者包括中度肥胖、低BMI群体和重度肥胖、高BMI群体两者。此外，胰岛素抵抗、葡萄糖不耐受或具有任何形式的糖尿病(例如1型、2型或妊娠期糖尿病)的受试者可自本发明的方法中获益。
“代谢速率”是指每单位时间释放/消耗的能量的量。每单位时间的代谢可通过食物消耗、释放为热的能量或代谢过程中使用的氧来评价。当某人想减轻体重时，通常期望具有较高的代谢速率。例如，与对某项活动具有低代谢速率的人相比，具有高代谢速率的人可能够消耗更多的能量(例如，身体燃烧更多的热量)以进行该项活动。
本文所用的“瘦质量”或“瘦体重”是指肌肉和骨。瘦体重并不必然指无脂肪质量。瘦体重包含在中枢神经系统(脑和脊髓)、骨髓和内脏内的小百分比脂肪(大概3%)。根据密度测量瘦体重。测量脂肪质量和瘦质量的方法包括但不限于水下称重、空气置换体积描记法、x-射线、DEXA扫描、MRI和CT扫描。在某些实施方案中，使用本领域已知的水下称重来测量脂肪质量和瘦质量。
“脂肪分布”是指体内脂肪沉着的位置。所述脂肪沉着的位置包括例如皮下、内脏和异位脂肪库。
“皮下脂肪”是指刚好在皮肤表面以下的脂质沉着。可使用皮下脂肪测量可用的任何方法测量受试者中皮下脂肪的量。测量皮下脂肪的方法是本领域已知的，例如描述于美国专利号6,530,886中的那些，其整体通过引用结合到本文中。
“内脏脂肪”是指作为腹内脂肪组织的脂肪沉着。内脏脂肪包围着生命器官，并且可通过肝脏代谢产生血液胆固醇。内脏脂肪与例如多囊性卵巢综合征、代谢综合征和心血管病等病症的风险增加有关。
“异位脂肪储藏”是指构成瘦体重的组织和器官(例如，骨骼肌、心、肝、胰腺、肾、血管)内和周围的脂质沉着。一般而言，异位脂肪储藏是体内典型脂肪组织库以外的脂质积聚。
如本文所用以及本领域所充分理解的，“治疗”是用于获得有益或所需结果(包括临床结果)的方法。“治疗”或“减轻”疾病、病症或病况是指与未治疗病症相比，病况、病症或疾病状态的程度和/或不合需要的临床表现被减轻，和/或进展的时程被减慢或延长。例如，在治疗肥胖中，体重减少，例如体重减少至少5%，是所需治疗结果的实例。用于本发明的目的，有益或所需的临床结果包括但不限于一种或多种症状的减轻或改善、疾病的程度减弱、疾病状态稳定(即，未恶化)、疾病进展延迟或减慢、疾病状态改善或减轻、和缓解(无论是部分还是全部)，无论是可检测还是不可检测。“治疗”还可意指与如果未接受治疗所预期的存活相比，存活延长。此外，通过给予一个剂量并不必然发生治疗，而经常是给予一系列剂量后才发生。因此，可在一次或多次给药中给予治疗有效量、足以减轻疾病、病症或病况的量或足以治疗疾病、病症或病况的量。
本文所用的术语“治疗有效量”是指组合物中活性化合物的量，其在组织、系统、受试者或人中诱发研究者、兽医、医生或其他临床医师所寻求的生物学或医学反应，包括所治疗病症的症状缓解。本发明的新治疗方法是针对本领域技术人员已知的病症。
本文所用的术语“预防有效量”是指组合物中活性化合物的量，其在组织、系统、受试者或人中诱发研究者、兽医、医生或其他临床医师所寻求的生物学或医学反应，以预防在具有肥胖或肥胖相关病症、病况或疾病风险的受试者中肥胖或肥胖相关病症、病况或疾病的发生。
本发明的另一方面，提供用于降低发展代谢病症的风险的方法，其中所述方法包括给予受试者有效量的抗肥胖剂组合，以减轻受试者的体重。
在本发明的一些实施方案中，本发明的方法用于增加受试者的代谢速率、降低受试者代谢速率的减少或保持受试者的代谢速率。在某些实施方案中，代谢速率可涉及相对于无脂肪身体组织，优先利用身体的脂肪作为能量来源。在一方面，给予抗肥胖剂组合后瘦体重未减少。在另一方面，给予抗肥胖剂组合后瘦体重的减少被降低或阻止。在又一实施方案中，给予抗肥胖剂组合后瘦体重增加。所述优先选择脂肪作为能量来源可通过比较脂肪组织与无脂肪身体组织的量来确定，所述无脂肪身体组织的量通过测量在治疗期开始和结束时的总体重和脂肪含量来确定。代谢速率增加是指与在基本类似或相同条件下未给予抗肥胖剂组合在另一段时间内受试者利用热量或其他能量来源的水平相比，在一段时间内受试者更高水平地利用热量或其他能量来源。与在基本类似或相同条件下未给予抗肥胖剂组合在另一段时间内受试者利用热量或其他能量来源的水平相比，在某些实施方案中，在受试者中代谢速率增加至少约5%，在其它实施方案中，在受试者中代谢速率增加至少约10%、15%、20%、25%、30%或35%。可使用例如呼吸热量计来测量代谢速率的增加。在这些实施方案中，与未接受药剂或仅接受一种药剂的受试者相比，当组合给予时使用的抗肥胖剂的有效量为各种药剂有效增加受试者代谢速率的量。
在另一实施方案中，提供降低受试者代谢速率减少的方法。代谢速率的所述减少可能是由于导致代谢速率减少的任何病况或营养疗法或物理疗法，例如由于热量膳食减少、限制性饮食或体重减轻。限制性饮食包括膳食中所允许的食物类型或食物量或两者的允许或禁止或两者(并非一定基于热量)。例如，在个体膳食中，机体基于较低热量摄取而用减少的代谢速率来补偿。基本上，机体下调对食物的需求，由此靠较少的食物生存。随着持续限定饮食，热量摄取的阈值降低。当结束饮食限定时，在吃正常膳食时由于降低的热量摄取阈值和较低的基础代谢速率，个体通常增加体重(NIH Technology AssessmentConference Panel (1992) Ann. Intern. Med. 116:942-949; Wadden (1993) Ann. Intern. Med. 119:688-693)。一方面，提供减少受试者代谢速率降低的方法，其中代谢速率降低是由于减少的热量膳食或体重减轻。通过使用这样的方法，在受试者中降低受试者的代谢速率减少至少约10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或95%。对于这样的方法，在病况或营养疗法或物理疗法(其导致代谢速率的降低或减少)开始的时间给予抗肥胖剂的组合是合乎需要的。然而，还预期在病况或营养疗法或物理疗法开始之前开始药剂的给予。在一个例子中，使用呼吸量热计测量代谢速率。该实施方案中所用的抗肥胖剂的有效量是各种药剂在组合给予时有效降低受试者中代谢速率减少的量。
在另一方面，提供用于降低代谢平台(metabolic plateau)的方法，其中方法包括组合给予受试者有效量的抗肥胖剂。在某些实施方案中，受试者正在减轻体重或已减轻体重，例如由于减少热量膳食、增加锻炼或其组合。“代谢平台”是指当机体适应热量或能量输入改变时，稳定代谢速率的时间间隔。热量输入或消耗的改变可由于例如减少热量膳食或增加体力活动。例如在体重减轻疗法期间当体重减轻变慢或停止时，可观察到这样的平台。在某些实施方案中，与在基本类似或相同条件下未给予抗肥胖剂组合在相同的一段时间内另外相同受试者中代谢平台的持续时间相比，本发明的方法减少受试者中代谢平台的持续时间。在其它实施方案中，与在基本类似或相同条件下未给予抗肥胖剂组合在相同的一段时间内另外相同受试者中代谢平台的频率相比，本发明的方法减少代谢平台的频率。在仍其它实施方案中，与在基本类似或相同条件下未给予抗肥胖剂组合在相同的一段时间内另外相同受试者中代谢平台的起始相比，本发明的方法延迟代谢平台的起始。在某些实施方案中，通过对降低体重减轻或无体重减轻的时期作图，来确定代谢平台。在某些实施方案中，降低至少一个代谢平台。在其它实施方案中，降低至少2、3、4、5、6、7、8、9或10个代谢平台。在另一方面，与相同或类似条件下未给予抗肥胖剂组合的受试者相比，延迟代谢平台1天。在其它方面，在受试者中延迟代谢平台2天、3天、4天、5天、6天、1周、10天、2周或3周。
在仍其它实施方案中，提供方法以保持受试者中的代谢速率。在某些实施方案中，受试者可能具有降低代谢速率的风险，例如由于开始减少热量膳食、限制性饮食或期望体重减轻。保持代谢速率是与在基本类似或相同条件下未给予抗肥胖剂组合在一段时间内另外相同受试者的热量或其他能量来源的使用水平相比，在相同一段时间内受试者维持热量或其它能量来源的使用水平。在一方面，代谢速率维持在造成代谢速率降低的事件开始之前受试者的代谢速率的15%以内。在其它方面，代谢速率维持在受试者代谢速率的10%以内、7%以内、5%以内、3%以内或更低。在一方面，在减少热量膳食、限制性饮食或锻炼疗法开始时给予抗肥胖剂的组合。
可使用可用于测定所述速率的任何方法评价代谢速率，例如通过使用呼吸热量计。用于测定代谢速率的所述方法和设备是本领域已知的，并描述于例如美国专利号4,572,208、4,856,531、6,468,222、6,616,615、6,013,009和6,475,158。或者，可通过测量瘦组织相对于限制饮食期之后动物代谢分解的脂肪组织的量来评价动物的代谢速率。因此，可在限制饮食结束时测量总体重和脂肪含量。在大鼠中，经常使用的测定全部体脂肪的方法是手术移出腹膜后的脂肪垫(位于腹膜后腔的脂肪体)并称重，所述腹膜后腔为介于后腹壁和后壁腹膜之间的区域。认为所述垫重量与动物体脂肪的百分比直接相关。因为大鼠中体重和体脂肪之间的关系是线性的，因此肥胖动物具有相对较高的体脂肪和腹膜后脂肪垫重量百分比。
在本发明的其它方面，提供用于在受试者中通过降低代谢速率而减少脂肪质量的方法，其中所述方法包括以通过增加受试者的代谢速率而有效减少脂肪质量的量给予抗肥胖剂的组合。脂肪质量可表示为总体重的百分比。在一些方面，在疗程期间脂肪质量减少至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少25%。在一方面，在疗程期间受试者的瘦体重未减少。在另一方面，在疗程期间受试者的瘦体重被维持或增加。在另一方面，受试者处于减少热量膳食或限制性饮食。“减少热量膳食”是指与相同受试者的正常膳食相比，受试者每天摄取较少的热量。在一个例子中，受试者每天消耗的热量至少少50。在其它例子中，受试者每天消耗的热量至少少100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000。
在本发明的某些实施方案中，提供改变受试者中脂肪分布的方法，其中所述方法包括以有效改变受试者中脂肪分布的量给予抗肥胖剂的组合。在一方面，所述改变是由于受试者中内脏脂肪或异位脂肪或两者的代谢增加造成。在一些实施方案中，所述方法涉及内脏脂肪或异位脂肪或两者比皮下脂肪的代谢速率高至少约5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。在一方面，所述方法造成有利的脂肪分布。在某些实施方案中，有利的脂肪分布为皮下脂肪与内脏脂肪、异位脂肪或两者的比率增加。在一方面，所述方法涉及瘦体重增加，例如其由于肌肉细胞质量的增加。
在其它实施方案中，提供用于减少受试者中皮下脂肪的量的方法，其中所述方法包括以有效减少受试者中皮下脂肪量的量给予有需要的受试者抗肥胖剂的组合。在一个例子中，受试者中皮下脂肪的量减少至少约5%。在其它例子中，与给予抗肥胖剂之前的受试者相比，皮下脂肪的量减少至少约10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。
本文所述的方法可用于减少受试者中内脏脂肪的量。在一个例子中，受试者中内脏脂肪减少至少约5%。在其它例子中，与给予抗肥胖剂组合之前的受试者相比，受试者中内脏脂肪减少至少约10%、15%、20%、25%、30%、40%或50%。可通过可用于测定受试者中内脏脂肪量的任何方法测量内脏脂肪。所述方法包括例如，通过CT扫描和MRI方式的腹部体层摄影术。用于测定内脏脂肪的其它方法描述于例如美国专利号6,864,415、6,850,797和6,487,445。
在某些实施方案中，提供用于在受试者中预防异位脂肪积聚或减少异位脂肪量的方法，其中所述方法包括以在受试者中有效预防异位脂肪积聚或减少异位脂肪量的量给予有需要的受试者抗肥胖剂的组合。在一个例子中，与给予抗肥胖剂的组合之前的受试者相比，受试者中异位脂肪的量减少至少约5%。在其它例子中，受试者中异位脂肪减少至少约10%，或至少约15%、20%、25%、30%、40%或50%。或者，与受试者中皮下脂肪相比，异位脂肪的量按比例减少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或100%。可采用可用于测量异位脂肪的任何方法测量受试者中的异位脂肪。
在其它实施方案中，提供用于在受试者中产生更有利的脂肪分布的方法，其中所述方法包括以有效产生有利的脂肪分布的量给予受试者抗肥胖剂的组合。在某些实施方案中，给予抗肥胖剂的组合减少受试者中内脏脂肪或异位脂肪或两者的量。例如，给予抗肥胖剂的组合，其中至少一种抗肥胖剂作用于涉及食物摄取或体重调节或两者的前脑结构，其与给予作用于涉及食物摄取或体重调节或两者的后脑结构的至少一种抗肥胖剂组合。在某些实施方案中，相对于皮下脂肪的减少，所述方法优先减少内脏脂肪量或异位脂肪量或两者的组合。所述方法导致皮下脂肪与内脏脂肪或异位脂肪的比率较高。这样提高的比率可导致心血管病、多囊性卵巢综合征、代谢综合征或其任何组合发生的风险降低。在某些实施方案中，异位脂肪或内脏脂肪以大于皮下脂肪5%的速率代谢。在其它实施方案中，异位脂肪或内脏脂肪以大于皮下脂肪至少10%、15%、20%、25%、30%、50%、60%、70%、80%、90%或100%的速率代谢。
在又一方面，本发明的方法包括使用与糖皮质类固醇组合给予的治疗有效量的抗肥胖剂组合。糖皮质类固醇对增加脂肪质量和降低瘦体重具有反作用。因此，预期在糖皮质类固醇使用是有益的情况下，抗肥胖剂组合可与糖皮质类固醇联合使用。
在又一方面，本发明的方法包括使用治疗有效量的一种抗肥胖剂或抗肥胖剂的组合，其与选自奥利司他、苯丁胺、托吡酯、CONTRAVE和QNEXA的治疗剂组合给予。在一些实施方案中，本发明的方法包括治疗有效量的本发明工程改造多肽与选自奥利司他、苯丁胺、托吡酯、CONTRAVE和QNEXA的治疗剂组合使用。在其它实施方案中，本发明的方法包括治疗有效量的胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽类似物、胰岛淀粉样多肽激动剂或胰岛淀粉样多肽衍生物与选自奥利司他、苯丁胺、托吡酯、CONTRAVE和QNEXA的治疗剂组合使用。在其它实施方案中，本发明的方法包括治疗有效量的本发明工程改造多肽与胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽类似物、胰岛淀粉样多肽激动剂或胰岛淀粉样多肽衍生物以及选自奥利司他、苯丁胺、托吡酯、CONTRAVE和QNEXA的治疗剂组合使用。
还提供在病态肥胖受试者中减少体重的方法，其通过首先减少受试者的体重至低于病态肥胖的体重水平，然后以进一步减少受试者体重的有效量给予受试者抗肥胖剂的组合。用于减少受试者的体重至低于病态肥胖的体重的方法包括减少热量摄取、增加体力活动、药物疗法、肥胖治疗手术(例如胃旁路手术)或上述方法的任何组合。在一方面，给予抗肥胖剂的组合进一步减少受试者的体重。在其它实施方案中，提供用于通过以进一步减少受试者体重的有效量给予抗肥胖剂的组合减少受试者体重指数的方法，所述受试者具有40或更小的体重指数。
减少体重意指在疗程期间受试者减少他/她总体重的一部分，无论疗程是数天、数周、数月或数年。或者，减少体重可定义为降低脂肪质量与瘦体重的比例(换句话说，受试者降低脂肪质量，但维持或获得瘦体重，而非必然在总体重上相应降低)。在这些实施方案中组合给予的抗肥胖剂的有效量是在疗程期间有效减少受试者体重的量，或者在疗程期间有效减少受试者脂肪质量百分比的量。在某些实施方案中，在疗程期间减少受试者的体重至少约1%、至少约5%、至少约10%、至少约15%或至少约20%。或者，在疗程期间受试者的脂肪质量百分比减少至少1%、至少5%、至少10%、至少15%、至少20%或至少25%。
在某些实施方案中，减少体重的方法包括提高对体重维持的遵循。不希望受任何理论的束缚，通过给予本文所述的抗肥胖剂获得的瘦蛋白响应性的恢复克服了肥胖受试者的一个关键挑战。在先前的体重减轻方法中，甚至在减少的体重上，瘦蛋白水平可仍比正常水平高，这对受试者来说维持体重减轻很困难。本文所述的方法不仅包括减少体重的方法，还包括提高对体重维持的遵循的组分。
在某些实施方案中，在受试者中减少营养利用率(例如减少体重)的方法包括以一天一次或多次推注剂量给予受试者有效量的抗肥胖剂。推注剂量是药物的间歇性剂量(与持续输注相反)。每天可给予受试者一次或多次推注剂量。无论何时给予受试者，推注剂量可以是相同的，或者与其它相比，可经调整使得在一天的某些次数上给予受试者较大的推注剂量。在某些制剂(例如，持续释放制剂)中的药剂的给予，可较少频率地给予推注剂量，例如每三天一次、每周一次、每月两次、每月一次。此外，推注剂量间的时间优选足够长以允许以先前推注剂量给予的药物从受试者的血流中清除。
在其它实施方案中，在受试者中减少营养利用率(例如减少体重)的方法包括以持续剂量给予受试者有效量的抗肥胖剂。持续剂量意指通过例如静脉内注射或透皮贴剂持续输注药物。或者，可经口以控制释放胶囊剂或片剂的形式给予持续剂量，其在一段时间内释放药物至受试者系统内。当通过持续剂量给予时，在约1小时的期间内释放药物，在一些情况下，在约2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、18或24小时的期间内释放药物。
“组合给予”是指抗肥胖剂作为单一给药给予、同时作为单独剂量给予、或者按序贯给予。序贯给予是指在一种抗肥胖剂之前或之后给予抗肥胖剂中的一种。在某些实施方案中，第一抗肥胖剂在至少一种其它抗肥胖剂之前或之后约30分钟给予，在其它实施方案中，在至少一种其它抗肥胖剂之前或之后约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时给予。所给予的抗肥胖剂中的任一种可以推注剂量或以持续剂量给予。
此外，在某些实施方案中，组合给予体重减轻剂在本发明的任一方面都产生协同作用。此外，在某些实施方案中，组合给予体重减轻剂对具有相同效果的药剂中的至少一种产生较低的剂量需求。
因此，一个实施方案是在有需要的受试者中治疗肥胖或减少体重的方法，包括外周给予治疗有效量的至少两种不同的抗肥胖剂，其中至少一种抗肥胖剂是胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽类似物、胰岛淀粉样多肽激动剂或胰岛淀粉样多肽衍生物，且至少一种抗肥胖剂是包含白蛋白结合结构域多肽(ABD)和选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素结构域(HD1)的工程改造的多肽，并且受试者减少体重至少10%、12%、15%、20%、30%、40%或甚至50%。
其它实施方案包括以下。
实施方案1. 治疗受试者肥胖的方法，包括外周给予治疗有效量的至少两种不同的抗肥胖剂，其中至少一种抗肥胖剂是胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽类似物、胰岛淀粉样多肽激动剂或胰岛淀粉样多肽衍生物(即，胰岛淀粉样多肽药剂)，且至少一种抗肥胖剂是包含白蛋白结合结构域多肽(ABD)和选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素结构域(HD1)的工程改造的多肽，其中ABD包括选自SEQ ID NO:301-452、455-463和500-593的肽的任一个。
实施方案2. 减少受试者体重的方法，包括外周给予治疗有效量的至少两种不同的抗肥胖剂，其中至少一种抗肥胖剂是胰岛淀粉样多肽、胰岛淀粉样多肽类似物、胰岛淀粉样多肽激动剂或胰岛淀粉样多肽衍生物(即，胰岛淀粉样多肽药剂)，且至少一种抗肥胖剂是包含白蛋白结合结构域多肽(ABD)和选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素结构域(HD1)的工程改造的多肽，其中ABD包括选自SEQ ID NO:301-452、455-463和500-593的肽的任一个。
实施方案3. 实施方案1或2中任一个的方法，其中所述至少一种抗肥胖胰岛淀粉样多肽药剂是胰岛淀粉样多肽激动剂。
实施方案4. 实施方案1-3中任一个的方法，其中所述胰岛淀粉样多肽激动剂包括胰岛淀粉样多肽类似物或衍生物。
实施方案5. 实施方案1-4中任一个的方法，其中所述胰岛淀粉样多肽类似物或衍生物包括普兰林肽。
实施方案6. 实施方案1-5中任一个的方法，其中所述胰岛淀粉样多肽类似物或衍生物包括表4中所公开的化合物。
实施方案7. 实施方案1-6中任一个的方法，其中所述胰岛淀粉样多肽类似物或衍生物包括脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-普兰林肽(SEQ ID NO: 214)。
实施方案8. 实施方案1-7中任一个的方法，其中所述HD1包括选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ IDNO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ IDNO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ IDNO:680。
实施方案9. 实施方案1-8中任一个的方法，其中所述HD1是SEQ ID NO:29。
实施方案10. 实施方案1-9中任一个的方法，其中所述工程改造多肽包括表2中所公开的化合物。
实施方案11. 实施方案1-10中任一个的方法，其中所述工程改造多肽包括选自SEQ ID NO: 594-663和681的氨基酸序列。
实施方案12. 实施方案1-11中任一个的方法，其中所述工程改造多肽包括SEQ IDNO:595的氨基酸序列。
实施方案13. 实施方案1-11中任一个的方法，其中所述工程改造多肽包括SEQ IDNO:657的氨基酸序列。
实施方案14. 实施方案1-13中任一个的方法，其中有效量的胰岛淀粉样多肽药剂和有效量的工程改造多肽包括这样的量，其使得当将胰岛淀粉样多肽药剂与工程改造多肽组合给予所述受试者时，获得比当单独给予任一药剂时获得的体重减轻的量更大量的体重减轻。
实施方案15. 实施方案1-14中任一个的方法，其中将所述两种药剂同时给予。
实施方案16. 实施方案1-15中任一个的方法，其中将所述两种药剂混合在一起。
实施方案17. 实施方案1-16中任一个的方法，其中受试者的BMI大于25。
实施方案18. 实施方案1-17中任一个的方法，其中受试者的BMI为25-35。
实施方案19. 实施方案1-18中任一个的方法，其中受试者的BMI为25-40。
实施方案20. 实施方案1-19中任一个的方法，其中受试者的BMI为25-45。
实施方案21. 实施方案1-20中任一个的方法，其中受试者的BMI为35-45。
实施方案22. 实施方案1-21中任一个的方法，其中受试者的BMI减少至小于30。
实施方案23. 实施方案1-22中任一个的方法，其中受试者的BMI减少至小于25。
实施方案24. 实施方案1-23中任一个的方法，其中受试者的BMI减少至正常。
实施方案25. 实施方案1-24中任一个的方法，其中在治疗4周内实现体重减轻。
实施方案26. 实施方案1-25中任一个的方法，其中在治疗8周内实现体重减轻。
实施方案27. 实施方案1-26中任一个的方法，其中在治疗12周内实现体重减轻。
实施方案28. 实施方案1-27中任一个的方法，其中在治疗20周内实现体重减轻。
实施方案29. 实施方案1-28中任一个的方法，其中在治疗24周内实现体重减轻。
实施方案30. 实施方案1-29中任一个的方法，其中受试者是人。
实施方案31. 实施方案1-30中任一个的方法，其中受试者是肥胖人。
实施方案32. 实施方案1-31中任一个的方法，其中体重减轻减少至少10%。
实施方案33. 实施方案1-32中任一个的方法，其中体重减轻减少至少12%。
实施方案34. 实施方案1-33中任一个的方法，其中体重减轻减少至少15%。
B. 制剂
本发明的药物化合物可按照常规技术例如在E. W. Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中所公开的那些，与药学上可接受的载体或稀释剂以及任何其它已知的辅剂和赋形剂一起配制。亦参见Wang等(1988) J. of Parenteral Sci. 和Tech., Technical Report No. 10, Supp. 42:2 S。
一般而言，工程改造的多肽可配制为用于给予患者的稳定安全的药物组合物。预期用于本发明的方法的药物制剂可包含约0.01-1.0% (w/v)、在某些情况下0.05-1.0%的工程改造的多肽；约0.02-0.5% (w/v)的乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐或谷氨酸盐缓冲液，其使最终组合物的pH在约3.0-约7.0；约1.0-10% (w/v)的碳水化合物或多羟基醇张度剂；和任选约0.005-1.0% (w/v)的选自间-甲酚、苯甲醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯和苯酚的防腐剂。如果所配制的肽包含在多次使用的产品中，则通常包含所述防腐剂。
在具体的实施方案中，本发明工程改造的多肽的药物制剂可包含在这些实施方案中浓度范围为例如约0.01%-约98% w/w、或约1-约98% w/w、或优选80%-90% w/w、或优选约0.01%-约50% w/w、或更优选约10%-约25% w/w的化合物。可使用足够量的注射用水以获得所需浓度的溶液。
如果需要，还可存在另外的张度剂例如氯化钠以及其他已知的赋形剂。在一些情况下，所述赋形剂可用于维持化合物的总体张度。赋形剂可以各种浓度包括在本文所述的制剂中。例如，赋形剂可以约0.02%-约20% w/w、优选约0.02%-0.5% w/w、约0.02%-约10% w/v或约1%-20% w/w的浓度范围包括在内。此外，与本发明制剂本身类似，赋形剂可以固体(包括粉末化的)、液体、半固体或凝胶形式包含在内。
药物制剂可以多种形式构成，例如固体、液体、半固体或液体。本文所用的术语“固体”意指包括该术语的所有常规应用，包括例如粉剂和冻干制剂。本发明所述的制剂可以是冻干的。
术语缓冲液、缓冲溶液和缓冲的溶液，当用于提及氢离子浓度或pH时，是指系统(特别是水溶液)在加入酸或碱或用溶剂稀释时抵抗pH变化的能力。在加入酸或碱时经历pH小量变化的缓冲溶液的特征是存在弱酸和弱酸的盐、或弱碱和弱碱的盐。前述系统的实例为乙酸和乙酸钠。pH的变化是微小的，只要所加入的水合氢离子或氢氧离子的量未超过中和它的缓冲系统的能力。
如本文所述，多种液体溶媒可适用于工程改造的多肽制剂，例如水或水性溶剂/有机溶剂的混合物或混悬液。
如本文所述使用的工程改造的多肽制剂的稳定性通过维持制剂的pH在由本领域已知的方法测定的范围内而增强。在某些实施方案中，维持制剂的pH在约3.5-5.0、或约3.5-6.5的范围内，在一些实施方案中，约3.7-4.3或约3.8-4.2。在一些实施方案中，pH可以是约4.0、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或甚至更高。在一些实施方案中，pH可以在生理学范围、pH 6-8、优选pH 7-7.6内。
在某些实施方案中，工程改造的多肽的缓冲液是乙酸盐缓冲液(优选以约1-5至约60 mM的最终制剂浓度)、磷酸盐缓冲液(优选以约1-5至约30 mM的最终制剂浓度)或谷氨酸盐缓冲液(优选以约1-5至约60 mM的最终制剂浓度)。在一些实施方案中，缓冲液是乙酸盐(优选以约5至约30 mM的最终制剂浓度)。
稳定剂可包括在制剂中，但不是必然需要的。然而，如果包括的话，可用于本发明实践的稳定剂是碳水化合物或多羟基醇。可用于本发明实践的合适稳定剂为约1.0-10%(w/v)的碳水化合物或多羟基醇。多羟基醇和碳水化合物在其骨架上共有相同的特征，即，-CHOH-CHOH-，其是使蛋白稳定的原因。多羟基醇包括例如山梨醇、甘露醇、甘油和聚乙二醇(PEG)等化合物。这些化合物是直链分子。另一方面，碳水化合物，例如甘露糖、核糖、蔗糖、果糖、海藻糖、麦芽糖、肌醇和乳糖，是环状分子，其可包含酮基或醛基。已证实这两类化合物有效稳定蛋白质免于由升高温度或由冷冻-解冻或冷冻-干燥过程引起的变性。合适的碳水化合物包括：半乳糖、阿拉伯糖、乳糖或任何其他碳水化合物，其对糖尿病患者没有不良影响，即，碳水化合物并不在血液中代谢形成不可接受的大浓度的葡萄糖。适用于糖尿病的所述碳水化合物为本领域熟知。在非糖尿病应用(例如，治疗肥胖)中，蔗糖和果糖可适于与化合物一起使用。
在某些实施方案中，如果包含稳定剂的话，化合物用多羟基醇稳定，所述多羟基醇例如山梨醇、甘露醇、肌醇、甘油、木糖醇和聚丙二醇/乙二醇的共聚物以及分子量为200、400、1450、3350、4000、6000、8000和甚至更高的各种聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，甘露醇是优选的多羟基醇。本发明冻干制剂的另一有用特征是使用用来维持本文所述冻干制剂的稳定性的所述制剂组分维持所述制剂的张度。在一些实施方案中，甘露醇是用于该目的的优选多羟基醇。
美国药典(USP)规定，必须将抑制细菌或抑制真菌浓度的抗微生物剂添加到在多剂量容器中所包含的制剂中。它们必须在使用时以足够的浓度存在以阻止微生物的繁殖，在用皮下注射针头和注射器吸取内容物的一部分或使用用于递送的其它入侵式方法(例如笔式注射器)时，所述微生物不注意地引入到制剂中。应评估抗微生物剂以确保其与配方中的所有其他组分相容，并且应评估其在整个配方中的活性以确保在一种制剂中是有效的具体药剂在另一制剂中不是无效的。常见的是发现一种具体的抗微生物剂在一种制剂中有效，而在另一制剂中无效。
在通常的制药学意义上，防腐剂是阻止或抑制微生物生长的物质，并且其可为该目的而添加到药物制剂中以避免随后由微生物引起的制剂腐败。尽管防腐剂的量不是很大，然而其仍可影响肽的总体稳定性。
尽管用于药物组合物的防腐剂范围可为0.005-1.0% (w/v)，但在一些实施方案中，每种防腐剂(单独或与其他组合)的范围为：苯甲醇(0.1-1.0%)、或间-甲酚(0.1-0.6%)、或苯酚(0.1-0.8%)、或对羟基苯甲酸甲酯(0.05-0.25%)和对羟基苯甲酸乙酯或对羟基苯甲酸丙酯或对羟基苯甲酸丁酯(0.005%-0.03%)的组合。对羟基苯甲酸酯类是对羟基苯甲酸的低级烷基酯。每种防腐剂的详述列于Remington's Pharmaceutical Sciences (同上)中。
工程改造的多肽当呈液体形式时，在玻璃容器内可不具有吸附到玻璃上的倾向，因此，可不需要表面活性剂以进一步稳定药物制剂。然而，对于当呈液体形式时有所述倾向的化合物，应在它们的制剂中使用表面活性剂。这些制剂可然后被冻干。表面活性剂经常引起蛋白变性，其通过疏水性破裂和盐桥分离两者。因为表面活性剂部分和蛋白上的反应性位点之间的强相互作用，相对低浓度的表面活性剂可产生强力的变性活性。然而，正确利用该相互作用可使蛋白稳定，免于界面或表面的变性。可进一步稳定工程改造的多肽的表面活性剂可任选在总制剂的约0.001-0.3% (w/v)的范围内存在，并包括聚山梨醇酯80 (即，聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯)、CHAPS® (即，3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵基]1-丙磺酸盐)、Brij® (例如，Brij® 35，其为聚氧乙烯(23)月桂基醚)、泊洛沙姆或其他非离子型表面活性剂。
根据所选的张度剂，加入氯化钠或其他盐以调节药物制剂的张度亦可为合乎需要的。然而，这是任选的，并依赖于所选的特定制剂。胃肠外制剂优选可以是等渗的或基本上等渗的。
用于胃肠外产品的优选溶媒是水。可通过蒸馏或通过反向渗透制备用于胃肠外给予的合适品质的水。注射用水是用于药物制剂的优选水性溶媒。
药物制剂中可存在其它成分是可能的。这样的其它成分包括例如湿润剂、乳化剂、油剂、抗氧化剂、膨胀剂、张度调节剂、螯合剂、金属离子、油性溶媒、蛋白质(例如，人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如，氨基酸例如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。此外，聚合物溶液或聚合物的混合物提供控制释放肽的可能性。当然，这样的其它成分不应不利地影响本发明的药物制剂的总体稳定性。
容器也是注射制剂的一个组成部分，并且可认为是一个组分，因为不存在完全惰性的容器，或者不存在不以某种方式影响其包含的液体的容器，特别是如果液体是水性的。因此，具体注射容器的选择必须基于容器组成以及溶液组成和其将进行的处理的考虑。还可将肽在小瓶玻璃表面的吸附最小化，如有必要，通过使用硼硅玻璃例如Wheaton I型硼硅玻璃#33 (Wheaton I型-33)或其等同物(Wheaton Glass Co.)。生产可接受的类似硼硅玻璃小瓶和药筒的其它供应商包括Kimbel Glass Co.、West Co.、Bunder Glas GMBH和Forma Vitrum。化合物的生物学和化学性质可通过以下来稳定：在Wheaton I型-33硼硅酸盐血清小瓶中配制和冻干至化合物终浓度为0.1 mg/ml和10 mg/ml (在5%甘露醇和0.02%Tween 80存在下)。
对于通过注射递送的制剂，为了允许将皮下注射器的针头引入到多剂量小瓶中，并且在针头抽出后尽可能快地提供再次密封，每个小管的开放末端优选用通过铝带固定在合适位置的橡胶封闭塞密封。
玻璃小瓶的塞子，例如West 4416/50、4416/50 (Teflon表面)和4406/40、Abbott5139或任何等同塞子，可用作注射用药物的封闭。对于包含肽类抗肥胖剂的制剂，这些塞子与肽以及制剂的其它组分相容。本发明人已发现，这些塞子当采用患者使用模式测试时通过塞子完整性测试，例如，塞子可经受至少约100次注射。或者，可将肽冻干至小瓶、注射器或药筒以随后复溶。本发明的液体制剂可装入到一个或两个分室药筒或一个或两个室式注射器。
每一种上述药物制剂组分是本领域已知的，并描述于 Pharmaceutical Dosage Forms: Parenteral Medications, 第1卷, 第二版, Avis等编辑, Mercel Dekker, NewYork, N.Y. 1992，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
上述液体制剂的制备方法通常包括配料、无菌过滤和填充步骤。配料程序包括已特定的顺序溶解成分(防腐剂，然后稳定剂/张度剂、缓冲剂和肽)或同时溶解。
备选制剂，例如非胃肠外制剂，可不需要灭菌。然而，如果灭菌是需要的或必需的，任何合适的灭菌方法可用于开发本发明的肽药物制剂。典型的灭菌方法包括过滤、蒸汽(湿热)、干热、气体(例如，环氧乙烷、甲醛、二氧化氯、环氧丙烷、β-丙内酯、臭氧、氯化苦、过乙酸、甲基溴等)、暴露于放射源和无菌处理。过滤是本发明的液体制剂灭菌的优选方法。无菌过滤包括通过0.45 μm和0.22 μm (1或2)过滤，其可串联连接。过滤后，将溶液填充至合适的小瓶或容器中。
在某些实施方案中，本文所述的工程改造的多肽经外周给予受试者。在一些实施方案中，本发明的液体药物制剂预期胃肠外给予。合适的给药途径包括肌内、静脉内、皮下、皮内、关节内、鞘内等。在一些实施方案中，优选皮下给药途径。在某些实施方案中，还优选粘膜递送。这些途径包括但不限于口服、鼻、舌下、肺和含服途径，其可包括给予呈液体、半固体或固体形式的肽。对于包含工程改造的多肽的制剂，与胃肠外递送相比，通过这些途径的给药由于降低的生物利用度而可能需要显著更多的化合物以获得需要的生物学作用。
此外，胃肠外控制释放递送可通过形成聚合的微胶囊、基质、溶液、植入物和装置并将它们胃肠外给予来实现，或通过手术方式来实现。控制释放制剂的实例描述于美国专利号6,368,630、6,379,704和5,766,627，其通过引用结合到本文中。因为聚合物基质或装置中一些肽的包埋，这些剂型可具有较低的生物利用度。参见例如美国专利号6,379,704、6,379,703和6,296,842，其每一个通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
化合物可以包含一定量的工程改造多肽的剂量单位形式提供，所述一定量的工程改造的多肽将在单剂量或多剂量中有效。
如本领域技术人员所认识，工程改造多肽的有效量将随许多因素而变化，包括受试者的年龄和体重、受试者的身体状态、待治疗的病况和本领域已知的其它因素。工程改造多肽的有效量还将随给予的具体组合而变化。如本文所述，工程改造多肽的组合给予可使所给予的工程改造多肽的降低量为有效量。
工程改造多肽的长作用持续时间可提供所需的延长作用持续时间，例如每天一次或每周一次给予。可选择作用持续时间，例如通过选择ABD和其对白蛋白的亲和力。不希望受任何理论的束缚，认为对白蛋白较高的亲和力将得到较长的循环时间，其提供较长的作用持续时间。药效学(治疗效果)和药代动力学(药物性质)的任一者或两者可在递送后随时间进行测量，例如药物血浆水平、急性或慢性葡萄糖和/或HbA1c下降、胰岛素血浆水平、食物摄取抑制或重量减轻。
C. 有效剂量
本文提供的药物组合物包括其中包含治疗有效量(即，有效实现其预期目的的量)的活性成分的组合物。对具体应用有效的实际量将尤其依赖于所治疗的病况。例如，当在治疗糖尿病的方法中给予时，所述组合物将包含有效实现所需结果(例如，降低受试者的禁食血糖)的量的活性成分。当在治疗肥胖的方法中给予时，所述组合物将包含有效实现所需结果(例如，降低体重)的量的活性成分。
给予的化合物的剂量和频率(单次或多次给药)可根据多种因素而不同，包括给药途径；接受者的尺寸、年龄、性别、健康、体重、体重指数和饮食；所治疗的疾病症状的性质和程度(例如，疾病对本文所述化合物的响应)；其它疾病或其它健康相关问题的存在；同时存在的治疗的类型；和任何疾病或治疗方案的并发症。其它治疗方案或药剂可与本发明的方法和化合物一起使用。
人类使用的治疗有效量可从动物模型确定。例如，可配制人类的剂量以获得已发现在动物中有效的浓度。人类中的剂量可通过监测一个或多个生理学参数(包括但不限于血糖和体重)并上调或下调剂量来进行调整，如上文所述和本领域已知。
剂量可根据患者的需要和所使用的化合物而变化。在本发明的情况下，给予患者的剂量应足以在一定的时间内在患者中产生有益的治疗反应。剂量的大小还将通过任何不良副作用的存在、性质和程度来确定。通常，用较小剂量开始治疗，所述剂量小于化合物的最佳剂量。之后，小增量增加剂量，直到达到在各情况下的最佳效果。在本发明的一个实施方案中，剂量范围为0.001%-10% w/v。在另一实施方案中，剂量范围为0.1%-5% w/v。
然而，典型的剂量可包含约0.1 mg药物化合物/天的下限至约200 mg药物化合物/天的上限。还预期其他剂量范围，例如1 mg-100 mg化合物/剂量和3 mg-70 mg/剂量。通常，给予具有长作用持续时间的工程改造多肽的剂量例如每天和甚至每周一次。每天的剂量可以离散单位剂量递送，只要以24小时周期或24小时的任何部分连续递送。
剂量和间隔可单独调整，以对所治疗的具体临床适应症提供有效的给予化合物的水平。这提供了一种与个体疾病状态的严重性相称的治疗方案。
利用本文提供的教导，可设计有效的预防性或治疗性治疗方案，其不引起显著毒性而且还完全有效地治疗特定患者显示的临床症状。该设计应包括通过考虑例如化合物效能、相对的生物利用度、患者体重、不良副作用的存在和严重性、优选的给药方式和所选药剂的毒性概况等因素而谨慎选择活性化合物。
本文所述的工程改造多肽令人惊讶的剂量节省性质，以及它们令人惊讶的长血浆半寿期和药理学作用持续时间，提供了优良的药剂。包括剂量节省的优良性质允许较低剂量(由此较少或较不严重的副作用和改进的制品成本)和/或更成本有效和更简单的每天一次或每周一次给予的制剂，这通过单独的母体化合物目前是无法实现的。
C. 毒性
特定化合物的毒性与治疗效果的比率是其治疗指数，可表示为LD50 (在50%的群体中致死的化合物的量)与ED50 (在50%的群体中有效的化合物的量)的比率。优选显示高治疗指数的化合物。自细胞培养测定和/或动物研究获得的治疗指数数据可用于配制人类中使用的剂量范围。所述化合物的剂量优选在包括几乎没有或没有毒性的ED50的血浆浓度范围内。在该范围内剂量可根据所用剂型和所用给药途径而变化。参见例如Fingl等,In: ThePharmacological Basis of Therapeutics, Ch.1, p.l, 1975。准确的制剂、给药途径和剂量可由单独的医师根据患者的病况和使用化合物的具体方法来选择。
不希望受任何理论所束缚，认为ABD白蛋白结合结构域与本文所述的激素结构域的缀合可提供减少的免疫原性，其通过相对于没有ABD缀合的激素结构域在免疫反应上的降低来判断。参见例如，WO 2009/016043，其通过引用以其整体结合到本文中并用于所有目的。
VII. 实施例
提供实施例1-5以尤其阐明本文所述的ABD的优良性质，例如与先前的ABD相比减少免疫原性的性质。
实施例1：白蛋白结合多肽的克隆、表达、纯化和表征。
在该实施例中，克隆、纯化和表征了8种不同的白蛋白结合多肽，PEP07913 (SEQID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:456)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968 (即，与PEP07911缀合的DOTA, SEQ ID NO:459)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ IDNO:455)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)，其氨基酸序列列于图1中。
材料与方法
白蛋白结合多肽变体的克隆
通过测序验证构建体后，将载体DNA纯化并转化至表达宿主(通常为BL21(DE3))中。选择单克隆在4 ml LB培养基中生长起子培养物约6小时。
用适当的寡核苷酸，使用定向诱变产生G148-GA3的突变，以获得所需的白蛋白结合多肽变体。通过PCR用引物扩增基因片段，在白蛋白结合多肽变体的前面添加特定的内切酶位点以及N-端MGSS (SEQ ID NO: 36)序列。用NdeI和NotI切割片段，纯化并连接至用相同酶限制的克隆载体，质粒pAY02556(含有来自pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因和用于表达目标基因的T7启动子)。将连接体转化至电感受态大肠杆菌TOP10细胞。将转化细胞铺板于补充有50 μg/ml卡那霉素的TBAB平板(30 g/l胰蛋白胨血琼脂基质)，然后在37℃下孵育过夜。使用PCR筛选菌落，使用生物素化的寡核苷酸和按厂商手册使用的BigDye®Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)将扩增的片段测序。通过使用Magnatrix 8000 (NorDiag AB)结合到链霉抗生物素包被的磁珠上来纯化测序反应物，并在ABI PRISM® 3100 Genetic Analyzer (PE Applied Biosystems)上分析。将所有的白蛋白结合多肽变体作为单体进行亚克隆，通过表达载体编码的构建体为MGSS-[PP###](如SEQ ID NO: 36公开的“MGSS”)，其中PP###对应于构成白蛋白结合多肽序列的46个氨基酸残基。
此外，G148-GA3、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313) 和PP037(SEQ ID NO:337)的基因片段通过PCR用引物扩增，在构成白蛋白结合多肽序列的46个氨基酸残基之前添加特定的内切酶位点以及六组氨酸(SEQ ID NO: 34)序列、TEV蛋白酶位点和甘氨酸残基。多肽PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914(SEQ ID NO:458)和PEP07968 (SEQ ID NO:459)对应于添加有甘氨酸残基的白蛋白结合多肽G148-GA3、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313)和PP037 (SEQ ID NO:337)。将片段用XbaI和NotI切割，纯化并连接至用相同酶限制的克隆载体，质粒pAY02512(含有pBR322的复制起点、卡那霉素抗性基因和用于表达目标基因的T7启动子。克隆位点前面是编码含有六组氨酸标签(SEQ ID NO: 34)的肽序列，该序列之后是TEV蛋白酶的切割位点)。连接、转化和序列鉴定按上述进行。将4个白蛋白结合多肽变体G148-GA3、PP007、PP013和PP037 作为单体进行亚克隆，通过表达载体编码的构建体为MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG-[PP###]，其中
MGSSHHHHHHLQSSGVDLGTENLYFQG为SEQ ID NO:37。
蛋白质表达
在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达白蛋白结合多肽变体，其具有N-端MGSS-延伸(如SEQ ID NO: 36公开的“MGSS”)或具有N-端His6-标签(SEQ ID NO: 34)，其后是TEV蛋白酶识别位点和甘氨酸残基。每个白蛋白结合多肽变体的菌落用于接种添加有卡那霉素至浓度为50 μg/ml的4 ml TSB+YE培养基。在37℃下生长培养物约5小时。3 ml各培养物用于接种平行的生物反应器(Greta system, Belach Bioteknik AB)中添加有卡那霉素至浓度为50μg/ml的800 ml TSB+YE。以800 ml/分钟通气，搅拌概况为保持溶解氧水平大于30%，将培养在37℃下进行至OD600为2，之后添加IPTG至终浓度为0.5 mM。继续培养5小时，之后将培养物冷却至10℃，停止通气并将搅拌降低至300 rpm。通过离心(15600 × g，4℃，20分钟)收获细胞沉淀，并储存于-20℃直至纯化。
具有His6-标签(SEQ ID NO: 34)和TEV蛋白酶位点的白蛋白结合多肽的纯化
将包含带可溶性六组氨酸-标签(SEQ ID NO: 34)的多肽PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:456)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (SEQ ID NO:459)的冷冻细胞沉淀悬浮于添加有1000 U Benzonase® (1.01654.001, Merck)的35 ml结合缓冲液(20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、20 mM咪唑，pH 7.4)中，并通过超声处理破裂。对于各个多肽，通过离心(1 h，37000 × g，4℃)使超声处理的悬浮液澄清，并将上清液装载到His GraviTrapTM柱(11-0033-99, GE Healthcare)上。用10 ml洗涤缓冲液(20 mM磷酸钠、0.5 M NaCl、60 mM咪唑，pH 7.4)洗涤柱，之后用3 ml洗脱缓冲液(20 mM磷酸钠、0.5 MNaCl、0.5 M咪唑，pH 7.4)洗脱多肽。使用PD-10脱盐柱(17-0851-01, GE Healthcare)将缓冲液更换成切割缓冲液(50 mM Tris-HCl、150 mM NaCl，pH 8)。通过测量280 nm处的吸光度来确定多肽产物的量，之后加入DTT至终浓度为5 mM。将带His6-标签(SEQ ID NO: 34)的TEV蛋白酶以相对于多肽产物为1:10的质量比添加至切割缓冲液中。切割于4℃在缓慢混合下进行过夜。添加咪唑至切割混合物中至浓度为20 mM，之后将混合物装载到HisGraviTrapTM柱(11-0033-99, GE Healthcare),以除去切下来的His6-标签(SEQ ID NO:34)、带His6-标签(SEQ ID NO: 34)的TEV蛋白酶和带His6-标签(SEQ ID NO: 34)的未切割产物。
对于每个变体，包含白蛋白结合多肽变体的穿流液(flow-through)进一步通过反相色谱(RPC)纯化，如下。将穿流液流分装载到预先用RPC A缓冲液(含0.1% TFA的水)平衡的1 ml Resource 15 RPC柱(GE Healthcare)上。用10柱体积(CV)的RPC A缓冲液进行柱洗涤后，用0-50% RPC B缓冲液(含0.1% TFA的乙腈)的线性梯度在10 CV期间洗脱结合的多肽。流速为2 ml/min，监测280 nm处的吸光度。含有白蛋白结合多肽变体的流分通过SDS-PAGE分析鉴定并合并。
RPC纯化的白蛋白结合多肽变体通过填塞在XK16柱(GE Healthcare)中的120 mlSuperdex 75 (GE Healthcare)上的凝胶过滤进一步纯化。运行缓冲液是1xPBS，流速是2ml/min。合并含有纯的白蛋白结合多肽变体的流分并浓缩至约1.3 mg/ml。最终，按照厂商建议，通过使用AffinityPak Detoxi-Gel Endotoxin去除凝胶(Pierce, prod#20344)的1ml柱纯化浓缩物以除去痕量的残余内毒素。
将白蛋白结合多肽变体PEP07911与Mal-DOTA 缀合，之后进行RPC纯化步骤，如下。使用一次性的PD-10脱盐柱(GE Healthcare)，将IMAC-FT纯化步骤的穿流液流分的缓冲液更换为0.2 M NaAc，pH 5.5。以5倍摩尔过量添加马来酰亚胺-单-酰胺-DOTA(Macrocyclics, 目录号B-272)，并在30℃持续摇动下孵育60分钟。得到的多肽表示为PEP07968。
不含His6-标签(SEQ ID NO: 34)的白蛋白结合多肽变体的纯化
将包含可溶性白蛋白结合多肽变体PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQID NO:455)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)的冷冻细胞沉淀悬浮于20 mM Tris-HCl，pH 8中，并通过超声处理破裂。对于每个多肽变体，通过离心(30min，32000 × g，4℃)使超声处理的悬浮液澄清，并将上清液装载到HSA-Sepharose柱(GEHealthcare)上。在用TST缓冲液(25 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、200 mM NaCl、0.05% Tween20，pH 8.0)洗涤并接着用5 mM NH4Ac，pH 5.5洗涤后，用0.5 M HAc，pH 3.2洗脱结合的白蛋白结合多肽变体。
通过反相色谱(RPC)进一步纯化白蛋白结合多肽变体，如下。对于每个变体，将HSA-亲和纯化步骤的洗出液装载到预先用RPC A缓冲液(含0.1% TFA的水)平衡的1 mlResource 15 RPC柱(GE Healthcare)上。在用10 CV RPC A缓冲液进行柱洗涤后，用0-50 %RPC B缓冲液(含0.1% TFA的乙腈)的线性梯度在10 CV期间洗脱结合的多肽。流速为2 ml/min，监测280 nm处的吸光度。含有纯的白蛋白结合多肽变体的流分通过SDS-PAGE分析鉴定并合并。最终，使用一次性PD-10脱盐柱(GE Healthcare)将缓冲液更换为1xPBS (2.68 mMKCl、137 mM NaCl、1.47 mM KH2PO4、8.1 mM Na2HPO4，pH 7.4)。
纯化的白蛋白结合多肽变体的表征
使用NanoDrop® ND-1000分光光度计通过测量280 nm处的吸光度估算浓度。用SDS-PAGE和LC-MS进一步分析蛋白质。
对于SDS-PAGE分析，将约10 μg的各个白蛋白结合多肽变体与 NuPAGE LDS样品缓冲液(Invitrogen)混合，在70℃下孵育15分钟，并装载到NuPAGE 4-12 % Bis-Tris凝胶(Invitrogen)。在XCell II SureLock Electrophoresis Cell (Novex)上用NuPAGE MESSDS运行缓冲液(Invitrogen)运行凝胶，使用Sharp Prestained Standard (Invitrogen)作为分子量标记，并使用PhastGel BlueR (GE Healthcare)染色。
为证实白蛋白结合多肽变体的身份，使用装配有API-ESI和单一的四级质量分析仪的Agilent 1100 LC/MSD系统进行LC/MS分析。将约10 μg的各个纯化的白蛋白结合多肽变体以0.5 ml/min的流速装载到Zorbax 300SB-C8 Narrow-Bore柱(2.1 x 150 mm，3.5 µm，Agilent Technologies)上。使用10-70%溶液B的线性梯度以0.5 ml/min洗脱多肽15分钟。分离在30℃下进行。监测离子信号和280 nm及220 nm处的吸光度。通过MS确认纯化的白蛋白结合多肽变体的分子量。
结果
按SDS-PAGE分析估计，白蛋白结合多肽变体的表达水平为10-30 mg产物/g细胞沉淀。
对于所有的变体，按SDS-PAGE分析测定的纯度超过95%，且LC/MS分析证实了正确的分子量。纯化后，对8个白蛋白结合多肽变体中的每一个，获得1-8 mg的纯多肽。
实施例2：白蛋白结合多肽的亲和力测定
在该实施例中，使用Biacore仪器，表征了在实施例1中合成或表达和纯化的PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07844 (SEQ ID NO:461)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (即与PEP07911缀合的DOTA，SEQ ID NO:459)对人血清白蛋白(HSA)的亲和力。PEP07913对应于添加有N-端甘氨酸残基的G148-GA3的氨基酸序列，而PEP07271、PEP07844、PEP07912、PEP07914和PEP07968对应于具有不同N-端氨基酸添加的白蛋白结合多肽PP001(SEQ ID NO:301)、PP043 (SEQ ID NO:343)、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313)和PP037 (SEQ ID NO:337)。
材料与方法
使用HSA (Albucult®, Novozyme)在Biacore2000仪器(GE Healthcare)上进行生物传感器分析，按照厂商建议，通过胺偶联将HSA固定到CM-5芯片(研究级；Biacore)表面的羧化葡聚糖层上。将芯片的表面1活化和失活并在注入期间用作参照池(空白表面)，而表面2包含固定至731共振单位(RU)的HSA，表面4包含固定至955 RU的HSA。将纯化的白蛋白结合多肽变体在运行缓冲液HBS-EP (GE Healthcare)中稀释至2.5 nM、10 nM和40 nM，并以50 μl/min的恒定流速注入5分钟，然后注入HBS-EP 60分钟。用一次注入25 μl HCl，10 mM使表面再生。以两组进行亲和力测量；第一组中注入(芯片表面2)HBS-EP、PEP06923、PEP07271、PEP07912、PEP07913、PEP07914 和PEP07968，第二组中注入(芯片表面4)HBS-EP、PEP06923、PEP07844、PEP07912和PEP07914。在每次运行中注入PEP06923两次作为对照。用BiaEvaluation软件(GE Healthcare)分析结果。从配体表面的曲线扣除空白表面的曲线。
结果
Biacore 2000仪器具有技术上的局限，阻碍了极高亲和力的测量。因此，Biacore研究的目的不是测定白蛋白结合多肽变体对HSA的亲和力的精确动力学参数。然而，结果提供了定量评估这些多肽对白蛋白的相对亲和力。扣除参考表面和缓冲液注入之后，使用具有质量传递修正和具有设置为局部参数的RUmax的BIAevaluation软件，将曲线拟合至1:1(Langmuir)结合模型。曲线显示于图2中。估算了相对KD、ka (kon)和kd (koff)值并显示于下表中。
如表X1和表X2所示，PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07844 (SEQ ID NO:461)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458) 和PEP07968 (与DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)都似乎对HSA具有大致相同的亲和力，大大超过了母体G148-GA3(PEP07913；SEQ ID NO:453)的亲和力。尽管类似的解离速率，但这些多肽的HSA亲和力略微低于PEP06923 (SEQ ID NO:454)。
实施例3：白蛋白结合多肽的变性温度(Tm)的测定
在该实施例中，将按实施例1中所述表达和纯化的白蛋白结合多肽变体PEP07913(SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07554(SEQ ID NO:456)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968(与DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)，以及白蛋白多肽变体PEP07975 (即，DOTA缀合的PEP07834，SEQ ID NO:460，通过Cys14与马来酰亚胺-单-酰胺-DOTA (Macrocyclics, 目录号B-272)通过CD分析法进行分析。PEP07913对应于具有N-端甘氨酸残基的G148-GA3的序列，PEP06923为先前由Jonsson等(上述)描述的工程改造的高亲和力衍生物，而PEP07271、PEP07554、PEP07912、PEP07914、PEP07968、PEP07844和PEP07975为根据本公开内容具有不同的N-端氨基酸添加的46个氨基酸残基白蛋白结合多肽PP001 (SEQ ID NO:301)、PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313)、PP037(SEQ ID NO:337)和PP043 (SEQ ID NO:343)的实例。
材料与方法
将纯化的白蛋白结合多肽变体在1xPBS中稀释至终浓度为0.4-0.5 mg/mg。在Jasco J-810分光偏振计上，在具有光学路径长度为1 mm的池内进行圆二色性(CD)分析。在可变温度测量下，从20℃至90℃测量221 nm处的吸光度，温度梯度为5℃/min。
结果
通过测定CD vs.温度曲线中的转换中点来计算不同白蛋白结合多肽变体的解链温度(Tm)。结果总结于下表X3中。
表X3. 测定所测试的白蛋白结合多肽变体的Tm值
变体 SEQ ID NO:# N-端序列3 Tm (℃)
PEP07913 SEQ ID NO:453 GL 61
PEP06923 SEQ ID NO:454 GSSL 57
PEP07271 SEQ ID NO:455 GSSL 65
PEP07554 SEQ ID NO:456 GSSL 58
PEP07912 SEQ ID NO:457 GL 53
PEP07914 SEQ ID NO:458 GL 59
PEP07968 SEQ ID NO:4591 GL 53
PEP07975 SEQ ID NO:4601, 2 AL 50
PEP07844 SEQ ID NO:461 GSSL 65
1)肽在半胱氨酸处与马来酰亚胺-DOTA缀合
2)肽在C-端被酰胺化
3)亮氨酸(下划线)是如本公开内容的第一方面中定义的白蛋白结合多肽的46个氨基酸序列第1位的残基，表X3中的“GSSL”如 SEQ ID NO: 38所公开。
多肽PEP07968与PEP07912相同，除了前者在第14位上具有半胱氨酸残基，其与马来酰亚胺DOTA缀合，而后者为丝氨酸残基。因此，DOTA修饰不应影响解链温度。PEP07975也使用Cys14用DOTA与马来酰亚胺缀合，并且其与PEP07968相同，除了C-端酰胺(产生于肽合成)和具有N-端丙氨酸而不是甘氨酸。此外，将PEP07912与PEP07554进行比较，揭示了N-端丝氨酸比相同位置上的甘氨酸提供更高的解链温度(Tm有5℃差异)。因此，本公开内容的所有白蛋白结合多肽变体显示超过55℃的Tm，除了PEP07912和DOTA缀合的变体。考虑到N-端部分的重要性，所有测试的白蛋白结合多肽优于Jonsson等的衍生物，例如PEP06923。
实施例4：血清反应分析
通过ELISA分析能够结合本文公开的白蛋白结合多肽组的含IgG人血清的百分比。总体上，筛选了对应于127个个体的149份血清样品。
材料与方法
ELISA板(96孔，半面积板(Costar，目录号3690))用50 μl/孔的在包被缓冲液(Sigma，目录号3041)中稀释至8 μl/ml的Albucult® (Novozyme)包被。将板在4℃下包被过夜三天。在分析当天，用自来水洗涤板两次，并用100 μl含0.05%酪蛋白的磷酸盐缓冲盐水(PBS)(PBSC)封闭2小时。将板倒空，按照预先制造的板布局，加入在PBSC中稀释至2 μg/ml的50 μl/孔的白蛋白结合多肽PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)、PEP07271 (SEQ ID NO:455)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07554 (SEQ ID NO:456)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)、PEP07968 (DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)和PEP07844 (SEQ ID NO:461)。在室温(RT)下孵育2小时后，使用自动ELISA洗涤器在PBSC中洗涤板4次。通过加入24 μl血清至1174 μl PBSC中，将来自129个个体的149份血清样品在PBSC中稀释50倍。按照预先制造的板布局，将50 μl的稀释血清加到每孔中。每份血清样品作为单峰进行测试。在每个板上以及对每种白蛋白结合多肽，包括阳性对照和阴性对照。加入白蛋白结合抗体(内部制备50 µl，0.5 µl/ml免疫球蛋白溶液，其来自PEP06923免疫的灵长类血清)作为阳性对照，50 μl PBSC用作阴性对照。在RT下将板孵育1小时，随后使用自动ELISA洗涤器在PBSC中洗涤4次。用50 μl/孔的在PBSC中稀释10 000倍的抗人IgG(Southern Biotech，目录号2040-05)检测结合的IgG。使用自动ELISA洗涤器在PBSC中洗涤4次后，加入50 μl/孔的底物(Pierce，目录号34021)。通过加入50 μl H2SO4至每孔10-15分钟后终止反应，随后使用多孔读板器(Victor3, Perkin Elmer)测量吸光度。
结果
对结合白蛋白结合多肽的IgG进行筛选的149份血清中，23份对所有8种多肽是阴性(OD值< 0.1)，即，显示没有IgG结合到多肽。用对一种或多种白蛋白结合多肽为阳性的126份血清进行分析。计算平均吸光度(图3A)和OD值< 0.15 (图3B)或> 1.0 (图3C)的血清百分比。对于PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP06923 (SEQ ID NO:454)和PEP07844 (SEQID NO:461)，获得具有IgG结合的血清的最高平均OD值和最高百分比，而对于PEP07968(DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07954 (SEQ IDNO:456)，发现最低反应性。
因此，最具反应性的白蛋白结合多肽是母体G148-GA3 (PEP07913，SEQ ID NO:453)和先前亲和力改进的衍生物(PEP06923，SEQ ID NO:454)，其具有自G148-GA3上保留的螺旋1。第三个较具反应性的多肽(PEP07844，SEQ ID NO:461)含有螺旋1中第14位上的初始赖氨酸。该残基预期用于缀合，因此在如此使用时不会暴露出来。除了在第14位具有丙氨酸之外相同的白蛋白结合多肽变体(PEP07554，SEQ ID NO:456)是最不具活性的一个。
实施例5：白蛋白结合多肽的免疫原性测试
从52个人类高加索个体(获自CRI-Labo Medische Analyse, Gent, Belgium)中，针对诱导外周血单核细胞(PBMC)的T细胞增殖的能力，筛选PEP07913 (SEQ ID NO:453)、PEP07912 (SEQ ID NO:457)、PEP07914 (SEQ ID NO:458)和PEP07968 (即，DOTA缀合的PEP07911，SEQ ID NO:459)。PEP07913对应于具有N-端甘氨酸残基的G148-GA3的序列，而PEP07912、PEP07914和PEP07968是根据本公开内容具有不同N-端氨基酸添加的46个氨基酸残基白蛋白结合多肽PP007 (SEQ ID NO:307)、PP013 (SEQ ID NO:313)和PP037 (SEQ IDNO:337)的实例。
材料与方法
将按标准细胞生物学方法制备的PBMC以300 000 PBMC/孔的量加入到组织培养物(TC)处理的96孔圆底板(Falcon)中。通过加入100 μl/孔在AIMV培养基(Invitrogen)中的白蛋白结合多肽PEP07913、PEP07912、PEP07914和PEP07968刺激细胞，所述AIMV培养基另外含有900 μl/ml (3倍摩尔过量)的重组人白蛋白(Albucult®, Novozyme)。这对应于30 µg/ml白蛋白结合多肽的终浓度。一式八份进行刺激，即将相同的白蛋白结合多肽以相同的量和相同的条件下加入到8个孔中。在阳性对照孔中，用30 µg/ml匙孔血蓝蛋白(KLH,Calbiochem)或30 µg/ml破伤风类毒素(TT, Statens Serum Institut)刺激细胞。在阴性对照孔中，仅加入含或不含900 µg/ml白蛋白的AIMV培养基。
培养7天后，使用Alexa Fluor 488 Click-iT EdU流式细胞计数测定试剂盒(Invitrogen)评价细胞增殖。在第6天加入1 μM/孔EdU掺入标记。在第7天，将细胞洗涤，从板上解离，再次洗涤并用抗-CD3-PerCP试剂(Becton Dickinson)和抗-CD4-Alexa647试剂(Becton Dickinson)染色30分钟。染色后，按厂商的方案(Invitrogen)，将细胞洗涤，固定(BD cellfix, BD biosciences)，透化(使用皂苷)和通过加入Click-iT试剂对EdU染色。完成染色后，再次洗涤细胞，并用流式细胞仪(FACSCantoII, BD Biosciences)进行分析。为评价增殖细胞的数量，分析前向每孔加入固定量的fluosphere (Invitrogen)。所有染色程序和洗涤直接在96孔板中进行。
原始FACSCantoII数据对CD3+ CD4+ T细胞进行分级设门，并记录设门细胞的数量以及它们的EdU-Alexa Flour 488掺入标记荧光强度。将增殖细胞的数量的平均值/一式八份的蛋白处理的孔与阳性对照和阴性对照比较，并计算得到的比率，其描述为刺激指数(SI)。基于SI和重复间的差异，刺激和抑制的SI阈值分别设置为2.0和0.5。
结果
使用体外PBMC增殖测定法，在目标人类群体中，在3倍过量重组人白蛋白的存在下，评价白蛋白结合多肽PEP07913、PEP07912、PEP07914和PEP07968的免疫原性潜力。与白蛋白对照相比，PEP07913诱导52个供体的6个中的CD3+CD4+ T细胞增殖，PEP07912诱导52个供体的5个中的CD3+CD4+ T细胞增殖，PEP07914和PEP07968诱导52个供体的1个中的CD3+CD4+ T细胞增殖(图4A)。
与包含重组人白蛋白的阴性对照相比，对于PEP07914和PEP07968，所有52个供体的平均刺激指数(SI)没有显著差异(分别地，p=0.79和0.48，图4B)。PEP07913的SI显著更高(p=0.002)，而PEP07912的SI较高但不显著(p=0.03，图4B)。
与仅缓冲液相比，反应个体的数量分别为：对PEP07912为10、对PEP07912为7、对PEP07914为2、对PEP07968为1、对重组人白蛋白为2、对两个阳性对照TT和KLH为49和51 (图4C)。按照白蛋白结合多肽的免疫原性，以下列顺序将其分级：PEP07913 > PEP07912 >PEP07914 > PEP07968。PEP07914和PEP07968两者定义为无免疫原性。因此上述结果证实，与阳性对照相比，本公开内容的白蛋白结合多肽的免疫原性潜力低。
实施例6：瘦蛋白的体外功能活性
方法。该测定法测量表达修饰的瘦蛋白受体的细胞经处理后的受体信号转导。假定测试样品为100%纯度，并在刺激缓冲液中溶解成10X测定浓度。将总共90 μl的各10X化合物转移至深孔pp板中，并使用Perkin Elmer Multiprobe® II用刺激缓冲液连续稀释(3倍系列)。使用转移200 μl各稀释化合物并混合细胞的MultiMek测试程序，将连续稀释板混合至96孔刺激板中，其含有2.5 x 10^5个的瘦蛋白戒断18小时的Keptin细胞(如本领域已知)的细胞沉淀。此时，将板用粘性板盖密封，并置于37℃下30分钟以允许pSTAT5刺激。参见例如Crouse等, 1998, J. Biol. Chem., 273:18365-18373。孵育后，将刺激板离心以再沉淀细胞，移除上清液并将剩余的细胞沉淀冷冻于-80℃ (>30分钟)。通过加入100 μl 1x裂解液至解冻的细胞沉淀中，伴随在环境室温旋转20分钟来制备细胞裂解物(Perkin ElmerpSTAT5测定试剂盒)。以2500 rpm 20分钟使裂解物澄清，并用pSTAT5测定试剂盒按厂商说明书以4 μl/孔在384孔ProxiplateTM中进行检查。使用设置成Alpha读取参数的PackardFusion α-FP HT读板器测定pSTAT5信号(RFU)。在384孔ProxiplateTM板上以11 μl总体积完成测定，数值表示n=4测定孔/剂量点的平均值。
结果
如下表X4所示，本文所述的工程改造多肽在Obeca STAT5测定中显示功能活性。
表X4：瘦蛋白的体外功能活性
Cmpd 分子或工程改造的多肽类型 EC50 nM (Obeca STAT5测定)
2 SEQ ID NO: 595 0.725
67 SEQ ID NO: 660 1.38
12 SEQ ID NO: 605 0.947
1 SEQ ID NO: 594 0.908
68 SEQ ID NO: 661 0.710
48 SEQ ID NO: 641 0.553
41 SEQ ID NO: 634 0.506
55 SEQ ID NO: 648 0.639
69 SEQ ID NO: 662 0.832
70 SEQ ID NO: 663 0.941
63 SEQ ID NO: 659 0.785
10 SEQ ID NO: 603 0.743
65 SEQ ID NO: 658 0.840
64 SEQ ID NO: 657 0.634
9 SEQ ID NO: 602 0.433
71 SEQ ID NO: 681 1.258
实施例7：白蛋白存在下的瘦蛋白体外功能活性。
在该测定中，使用实施例6中所述方法，除了将白蛋白加入至刺激缓冲液中以测试在白蛋白存在下化合物2的瘦蛋白功能。所测试的白蛋白包括0.1%或1%牛血清白蛋白(BSA)、1%大鼠血清白蛋白(RSA)或1%人血清白蛋白(HSA)。对照样品是含0.1% BSA的A100瘦蛋白。
结果。如图5所示，在瘦蛋白功能测定中，1%牛/大鼠/人白蛋白对化合物2产生的EC50活性没有影响。该结果是出人意料的，并证明甚至在与白蛋白结合时，治疗化合物也具有活性。
实施例8：单一给予工程改造多肽后体重和食物摄取的改变
方法。研究期间Sprague Dawley瘦大鼠以低脂肪膳食维持。研究开始时平均体重为315-330克。将动物分成六组(n=5/组)。分配各组接受以下的一种：溶媒；13.33 nmol/kg的Cmpd 2；40 nmol/kg的Cmpd 2；120 nmol/kg的Cmpd 2。各测试动物在时间=0时接受单次皮下注射。监测食物摄取和体重改变(%溶媒校正)7天，结果记录如所示(图6A和6B)。给予的化合物：溶媒(圆形)；13.33 nmol/kg的Cmpd 2 (倒三角形)；40 nmol/kg的Cmpd 2 (菱形)；120 nmol/kg (星形)。
结果。如图6A至6B所示，不同剂量的工程改造多肽的给予导致相对于仅接受溶媒的组，食物摄取和体重减少。
实施例9：单一给予工程改造多肽后体重和食物摄取的改变
方法。研究期间Sprague Dawley瘦大鼠以低脂肪膳食维持。研究开始时平均体重为315-330克。各测试动物(n=5/组)在时间=0时接受单次皮下注射。将动物分成五组。分配各组接受以下的一种：溶媒或Cmpd 66。以120 nmol/kg的剂量递送Cmpd 66。监测食物摄取和体重改变(%溶媒校正)7天，结果记录如所示(图7A和7B)。给予的化合物：溶媒(圆形)；120nmol/kg的Cmpd 66 (倒三角形)。
结果。如图7A至7B所示，工程改造多肽的给予导致相对于仅接受溶媒的组，食物摄取和体重减少。
实施例10：单一给予工程改造多肽后体重的改变
方法。研究期间Sprague Dawley瘦大鼠以低脂肪膳食维持。研究开始时平均体重为315-330克。将动物分成六组。各测试动物(n=5/组)在时间=0时接受单次皮下注射。分配各组接受以下的一种：溶媒；Cmpd 2或Cmpd 67。以120 nmol/kg的剂量分别递送Cmpd 2和Cmpd 67。监测各组的体重改变百分比7天，结果记录如所示(图8)。给予的化合物：溶媒(圆形)；Cmpd 2 (倒三角形)；Cmpd 67 (菱形)。
结果。如图8所示，接受单次注射所测试的工程改造多肽之一的各组动物显示相对于仅接受溶媒的组，体重显著和持续减少。
实施例11：单一给予工程改造多肽后体重的改变
方法。研究期间Sprague Dawley瘦大鼠以低脂肪膳食维持。研究开始时平均体重为315-330克。将动物分成六组。各测试动物(n=5/组)在时间=0时接受单次皮下注射。分配各组接受以下的一种：溶媒；Cmpd 2；Cmpd 12；Cmpd 1。以120 nmol/kg的剂量分别递送Cmpd2、Cmpd 12和Cmpd 1。监测各组的体重改变百分比7天，结果记录如所示(图9)。给予的化合物：溶媒(圆形)；Cmpd 2 (倒三角形)；Cmpd 12 (圆形)；Cmpd 1 (倒三角形)。
结果。如图9所示，相对于仅接受溶媒的组，接受单次注射所测试的工程改造多肽之一的各组动物显示体重显著和持续减少。
实施例11：白蛋白结合多肽的亲和力测定
在该实施例中，针对其与不同白蛋白变体的亲和力，表征PEP07986 (SEQ ID NO:463)、PEP07986-中性接头-A500 (化合物2, SEQ ID NO:595)和PEP07986-阴性接头-A500(化合物12, SEQ ID NO:605)。
材料与方法
所有研究使用GLC传感器芯片在25℃下在BioRad ProteOn XPR36系统上进行。对于胺偶联，使用自如下所示的水中原始储液稀释30倍的sulfo-NHS/EDC的1:1混合物活化GLC芯片5分钟。将每种白蛋白样品在10 mM乙酸钠pH 5.0中稀释至25 μg/ml，并注入到各个传感器表面上5分钟。然后用1 M乙醇胺pH 8.5封闭每个表面。每种白蛋白以2000-5000共振单位的密度偶联。
使用5 nM作为最高浓度以3倍稀释系列检测工程改造多肽的结合。运行缓冲液含有10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、3 mM EDTA和0.005% tween-20。使用3倍稀释系列检测所有样品。每个浓度系列重复检测。监测最高浓度的离解相3小时。
结果
对于工程改造多肽所测量的相对KD显示于下表X5中。结果显示，白蛋白结合多肽与血清白蛋白(SA)以高亲和力结合。
表X5：白蛋白结合多肽与白蛋白变体的KD
实施例12：工程改造多肽的溶解度
如下表X6中所示，本文所述的工程改造多肽在中性pH下具有令人惊讶的高溶解度。
用下列测定法测量溶解度：将6-10 mg的纯化蛋白在4℃下用离心过滤单元(Amicon Ultra-15或Ultra-4，具有3KDa MW的截断；Millipore)浓缩至小于0.5 ml的体积。将它们在4℃下以14,000 rpm离心10分钟，以除去沉淀并将上清液转移至新管中。允许蛋白于室温在暗处平衡过夜，然后用0.22微米注射过滤器(Milex GV；Millipore)过滤以除去沉淀。用NanoDrop分光光度计测量在OD280处的吸光度，并使用蛋白质的理论摩尔消光系数计算浓度。
表X6. 工程改造多肽的溶解度
实施例13：工程改造多肽的稳定性
本文所述的工程改造多肽是物理学上稳定的。表X7显示对A100和ABD2-HuSeal进行分子排阻色谱法(SEC)的结果。与A100相比，工程改造多肽几乎不显示或不显示自身结合成二聚体/寡聚体。
表X7. 工程改造多肽的稳定性
化合物 Pk 1 (%) Pk 2 (%) Pk 3 (%)
ABD2-HuSeal 98.78 1.22 n/a
A100 88.21 11.15 0.65
SEC方法：
柱– Tosoh TSK Gel G3000 SWxl 7.8mm x 30cm (#08541)
流动相– 10mM 磷酸钠, pH 7.4 + 238mM NaCl + 2.7mM KCl
运行时间– 22min
流速– 0.8mL/min
柱温度– 25℃
样品温度– 5℃
样品负载– 40ug
检测– 214nm
实施例14：在高BMI受试者中缺乏胰岛淀粉样多肽和瘦蛋白的协同作用
先前的研究已描述在体重为500-550克的大鼠中胰岛淀粉样多肽/瘦蛋白的协同作用。在表明功效和BMI之间的反相关之后，我们评价了组合在极肥胖大鼠(750克)中以及在开始药物治疗前经食物限制至中度肥胖范围的极肥胖大鼠(500-550 g)中的作用。
在该研究中，允许一组极肥胖大鼠(750 g)自由进食，并用胰岛淀粉样多肽、瘦蛋白或胰岛淀粉样多肽+瘦蛋白的组合治疗。尽管胰岛淀粉样多肽是有效的，但在加入瘦蛋白时没有明显的协同作用。将第二组极肥胖大鼠(750 g)热量限制下降至500-550 g范围，先前已证实在该范围内的协同作用。然后这些动物开始胰岛淀粉样多肽/瘦蛋白治疗，并允许自由进食。图10显示研究的结果。在溶媒和瘦蛋白单一疗法治疗的大鼠中快速重量恢复明显。用胰岛淀粉样多肽单一疗法实现一定的重量保持。用组合没有实现进一步的重量保持。这些发现暗示，在“高BMI”啮齿动物中协同作用的缺乏不能简单地通过膳食引入(diet-lead in)来拯救。
实施例15：工程改造多肽与胰岛淀粉样多肽激动剂的协同作用
该研究表明，每周一次给予ABD2-HuSeal (化合物64)当与每周两次给予PEG-大鼠胰岛淀粉样多肽(脱-Lys1-[Lys26(mPEG40K)]-大鼠胰岛淀粉样多肽(SEQ ID NO: 148)，化合物124)共给予时足以引起协同作用。图11显示，工程改造多肽和PEG-大鼠胰岛淀粉样多肽的组合导致比对单独各药剂所观察到的结果更大的体重减轻。ABD2-HuSeal以120 nmol/kg给予以及PEG-胰岛淀粉样多肽以125 nmol/kg给予500 g平均体重的雄性DIO HSD大鼠。
实施例16：在非肥胖、1型糖尿病小鼠中工程改造多肽的抗糖尿病作用
该研究的目的是评价工程改造多肽对1型糖尿病(T1DM)的高剂量STZ小鼠模型中关键糖尿病和代谢终点的体内作用。给予C57 BL/6雄性小鼠单次腹膜内注射200 mg/kgSTZ以诱导1型糖尿病。一周两次皮下给予化合物持续两周。测量的终点包括HbA1c水平、葡萄糖水平、体重和食物摄取。
图12显示，在STZ诱导的糖尿病小鼠中，化合物12引起血糖的剂量相关降低。其还引起血红蛋白A1c水平的剂量相关降低(如图13所示)和体重及累积食物摄取减少(如图14所示)。
为了确保疗法的葡萄糖降低作用不是由于胰岛素的作用所引起，进行另一研究以组合瘦蛋白疗法和低剂量的胰岛素。在T1DM的高剂量STZ小鼠模型中，添加或不添加0.05U/天剂量的胰岛素而给予化合物2。给予C57 BL/6雄性小鼠单次腹膜内注射175 mg/kg的STZ以诱导1型糖尿病。一周两次皮下给予60 nmol/kg的化合物持续两周。测量的终点包括HbA1c水平、葡萄糖水平、体重和食物摄取。
图15显示对于化合物2，低剂量胰岛素以可加方式增强葡萄糖降低作用。其还降低血红蛋白A1c水平(如图16所示)和降低体重及累积食物摄取(如图17所示)。
VIII. 实施方案
本文所述的工程改造的多肽、其使用方法和药物组合物的其它实施方案如下：
实施方案1. 工程改造的多肽，包含：白蛋白结合结构域多肽(ABD)和选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素结构域(HD1)，
其中所述ABD包含选自包括以下的氨基酸序列的氨基酸序列：
(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300)
其中彼此独立地，
X3选自E、S、Q和C；
X6选自E、S和C；
X7选自A和S；
X10选自A、S和R；
X14选自A、S、C和K；
X26选自D和E；
X39选自D和E；
X40选自A和E；
X43选自A和K；
X44选自A、S和E；
第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和
第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和
(ii) 与(i)中定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列；
条件是X7不是L、E或D；
或者备选地，
条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布的申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20AL X23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，
其中彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L、E和D；
Xc选自N、L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；和
X5选自Y和F；
X8选自N、R和S；
X9选自V、I、L、M、F和Y；
X11选自N、S、E和D；
X12选自R、K和N；
X14选自K和R；
X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；
X23选自K、I和T；
X24选自A、S、T、G、H、L和D；和
X25选自H、E和D。
实施方案2. 实施方案1的工程改造的多肽，还包含与所述HD1共价连接的第一接头(L1)。
实施方案3. 实施方案1或2的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含所述ABD作为N-端部分和所述HD1作为C-端部分。
实施方案4. 实施方案1或2的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含所述ABD作为C-端部分和所述HD1作为N-端部分。
实施方案5. 实施方案3的工程改造的多肽，其包含结构：ABD-HD1。
实施方案6. 实施方案3的工程改造的多肽，其包含结构：ABD-L1-HD1。
实施方案7. 实施方案4的工程改造的多肽，其包含结构：HD1-ABD。
实施方案8. 实施方案4的工程改造的多肽，其包含结构：HD1-L1-ABD。
实施方案9. 实施方案1-8中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是所述瘦蛋白、瘦蛋白类似物、瘦蛋白活性片段或瘦蛋白衍生物。
实施方案10. 实施方案1-9中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与选自以下的氨基酸序列具有至少50%的同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ IDNO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680。
实施方案11. 实施方案1-10中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与选自以下的氨基酸序列具有至少90%的同一性：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ IDNO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ IDNO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ IDNO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ IDNO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680。
实施方案12. 实施方案1-11中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与人瘦蛋白具有至少50%的同一性。
实施方案13. 实施方案1-12中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与人瘦蛋白具有至少90%的同一性。
实施方案14. 实施方案1-13中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与SEQ IDNO:20具有至少50%的同一性。
实施方案15. 实施方案1-14中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与SEQ IDNO:20具有至少90%的同一性。
实施方案16. 实施方案1-15中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与鸭嘴兽瘦蛋白具有至少50%的同一性。
实施方案17. 实施方案1-16中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1与海豹瘦蛋白具有至少50%的同一性。
实施方案18. 实施方案1-17中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1具有1-5个氨基酸修饰，所述修饰独立选自插入、缺失、添加和取代中的任一个或组合。
实施方案19. 实施方案1-18中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680。
实施方案20. 实施方案1-19中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680。
实施方案21. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:1。
实施方案22. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:2。
实施方案23. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:3。
实施方案24. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:4。
实施方案25. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:5。
实施方案26. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:6。
实施方案27. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:7。
实施方案28. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:8。
实施方案29. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:9。
实施方案30. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:10。
实施方案31. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:11。
实施方案32. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:12。
实施方案33. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:13。
实施方案34. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:14。
实施方案35. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:15。
实施方案36. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:16。
实施方案37. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:17。
实施方案38. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:18。
实施方案39. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:19。
实施方案40. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:20。
实施方案41. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:21。
实施方案42. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:22。
实施方案43. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:23。
实施方案44. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:24。
实施方案45. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:25。
实施方案46. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:26。
实施方案47. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:27。
实施方案48. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:28。
实施方案49. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:29。
实施方案50. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:30。
实施方案51. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:31。
实施方案52. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:32。
实施方案53. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:33。
实施方案54. 实施方案1-53中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD包含选自包括以下氨基酸序列的氨基酸序列：
(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLI X26 KAKTVEGVEALK X39X40 IL X43 X44 LP (SEQ ID NO: 300)
其中彼此独立地，
X3选自E、S、Q和C；
X6选自E、S和C；
X7选自A和S；
X10选自A、S和R；
X14选自A、S、C和K；
X26选自D和E；
X39选自D和E；
X40选自A和E；
X43选自A和K；
X44选自A、S和E；
第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和
第46位的脯氨酸是存在或不存在的。
实施方案55. 实施方案1-54中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD包含氨基酸序列，包括：(ii) 与(i)定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
实施方案56. 实施方案1-55中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD包含选自以下氨基酸序列的氨基酸序列：
(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDFYKRLIDKAKTVEGVEALKDA ILAALP(SEQ ID NO: 678)，其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X10选自A、S和R；X14选自A、S、C和K；第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和第46位的脯氨酸是存在或不存在的；和
(ii) 与(i)所定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列，条件是X7不是L、E或D；
或者备选地，
条件是所述氨基酸序列不由在PCT公布申请号WO 2009/016043中定义的下列序列所定义：LAEAK Xa Xb A Xc Xd EL Xe KY GVSD X5 YK X8 X9 I X11 X12 A X14 TVEGV X20 ALX23 X24 X25 ILAALP (SEQ ID NO: 679)，
其中彼此独立地，
Xa选自V和E；
Xb选自L、E和D；
Xc选自N、L和I；
Xd选自R和K；
Xe选自D和K；和
X5选自Y和F；
X8选自N、R和S；
X9选自V、I、L、M、F和Y；
X11选自N、S、E和D；
X12选自R、K和N；
X14选自K和R；
X20选自D、N、Q、E、H、S、R和K；
X23选自K、I和T；
X24选自A、S、T、G、H、L和D；和
X25选自H、E和D。
实施方案57. 实施方案1-56中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD包含选自包括以下氨基酸序列的氨基酸序列：
(i) LA X3 AK X6 X7 AN X10 ELD X14 YGVSDF YKRLIDKAKT VEGVEALKDA ILAALP(SEQ ID NO: 678)，其中彼此独立地，X3选自E、S、Q和C；X6选自E、S和C；X7选自A和S；X10选自A、S和R；X14选自A、S、C和K；第45位的亮氨酸是存在或不存在的；和第46位的脯氨酸是存在或不存在的。
实施方案58. 实施方案1-57中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD包含包括以下的氨基酸序列：(ii) 与(i)所定义的序列具有至少95%同一性的氨基酸序列。
实施方案59. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X6为E。
实施方案60. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X3为S。
实施方案61. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X3为E。
实施方案62. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X7为A。
实施方案63. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X14为S。
实施方案64. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X14为C。
实施方案65. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X10为A。
实施方案66. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X10为S。
实施方案67. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中第46位的脯氨酸是不存在的。
实施方案68. 实施方案56-58中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X26为D。
实施方案69. 实施方案56-58中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X39为D。
实施方案70. 实施方案56-58中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X40为A。
实施方案71. 实施方案56-58中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X43为A。
实施方案72. 实施方案56-58中任一个的工程改造的多肽，其中在ABD中X44为A。
实施方案73. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中ABD与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-5 s-1。
实施方案74. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中ABD与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-6 s-1。
实施方案75. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中ABD选自SEQ IDNO:301-452、455-463和500-593中的任一个。
实施方案76. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中ABD选自以下氨基酸序列：其选自SEQ ID NO:313、SEQ ID NO:448、SEQ ID NO:463、SEQ ID NO:500、SEQ IDNO:501和SEQ ID NO:502中的任一个。
实施方案77. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述ABD还包含位于(i)所定义的序列的N-端和/或C-端上的一个或多个另外的氨基酸残基。
实施方案78. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD的N-端上的丝氨酸残基。
实施方案79. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD的N-端上的甘氨酸残基。
实施方案80. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD的N-端上的半胱氨酸残基。
实施方案81. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD的C-端上的甘氨酸残基。
实施方案82. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述一个或多个另外的氨基酸残基包括在ABD的C-端上的半胱氨酸残基。
实施方案83. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中ABD包含选自SEQID NO:445-450和SEQ ID NO:462-463中任一个的氨基酸序列。
实施方案84. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中ABD包含不超过2个半胱氨酸残基。
实施方案85. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中ABD包含不超过1个半胱氨酸残基。
实施方案86. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中HD1通过多肽的X14位上的半胱氨酸残基的巯基与ABD缀合。
实施方案87. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1是1-30个氨基酸或小于30个氨基酸的肽。
实施方案88. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1选自20个天然存在的氨基酸。
实施方案89. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1是通过化学合成掺入、翻译后化学修饰掺入或通过在宿主细胞中重组表达而体内掺入的非天然氨基酸。
实施方案90. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1氨基酸选自丝氨酸、甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、谷氨酸、天冬氨酸和赖氨酸。
实施方案91. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含大部分无空间位阻的氨基酸。
实施方案92. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含以下的一种或多种：酸性接头、碱性接头和结构基序。
实施方案93. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含多聚甘氨酸、多聚丙氨酸、多聚(Gly-Ala)或多聚(Gly-Ser)。
实施方案94. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含(Gly)3、(Gly)4 (SEQ ID NO: 116)或(Gly)5 (SEQ ID NO: 117)的多聚甘氨酸。
实施方案95. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ ID NO: 118)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 119)、(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO: 120)和GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 121)。
实施方案96. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ala的组合。
实施方案97. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含Gly和Ser的组合。
实施方案98. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含Gly和Glu的组合。
实施方案99. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含Gly和Lys的组合。
实施方案100. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含选自以下的序列：[Gly-Ser]n (SEQ ID NO: 122)、[Gly- Gly- Ser]n (SEQ ID NO: 123)、[Gly-Gly-Gly- Ser]n (SEQ ID NO: 124) 和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO:125)；其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
实施方案101. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含选自以下的序列：[Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 126)、[Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 127)、[Gly-Gly-Gly- Glu]n (SEQ ID NO: 128)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO: 129)、[Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 130)、[Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 131)、[Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO: 132)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO: 133)；其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
实施方案102. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含选自以下的序列：[Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 126)、[Gly-Gly-Glu] n (SEQ ID NO: 127)、[Gly-Gly-Gly- Glu]n (SEQ ID NO: 128)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Glu]n (SEQ ID NO: 129)、[Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 130)、[Gly-Gly-Asp] n (SEQ ID NO: 131)、[Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO: 132)、[Gly-Gly-Gly-Gly-Asp]n (SEQ ID NO: 133)；其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
实施方案103. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含选自以下的序列：[Gly-Lys] n (SEQ ID NO: 134)、[Gly-Gly- Lys] n (SEQ ID NO: 135)、[Gly-Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO: 136)、[Gly-Gly-Gly-Gly- Lys]n (SEQ ID NO: 137)、[Gly- Arg] n (SEQ ID NO: 138)、[Gly-Gly- Arg] n (SEQ ID NO: 139)、[Gly-Gly-Gly-Arg]n (SEQ ID NO: 140)、[Gly-Gly-Gly-Gly- Arg]n (SEQ ID NO: 141)；其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
实施方案104. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含选自以下的序列：[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]n (SEQ ID NO: 142)，其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10。
实施方案105. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含选自以下的序列：[Gly-Gly-Glu] 6 (SEQ ID NO: 153)、[Gly-Gly-Lys] 6 (SEQ ID NO:154)、[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]3 (SEQ ID NO: 155)、[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]4 (SEQ IDNO: 156)或[Glu-Ala-Ala-Ala-Lys]5 (SEQ ID NO: 157)。
实施方案106. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含N-端TG二肽。
实施方案107. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含C-端AS二肽。
实施方案108. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含N-端TG二肽和C-端AS二肽。
实施方案109. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述接头L1包含选自以下的氨基酸序列：TG-(GGGS)1 (SEQ ID NO: 215)、TG-(GGGS)2 (SEQ ID NO: 216)、TG-(GGGS)3 (SEQ ID NO: 217)、TG-(GGGS)4 (SEQ ID NO: 218)、TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO:219)、(GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 220)、(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 221)、(GGGS)3-AS (SEQID NO: 222)、(GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 223)、(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 224)、TG-(GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 225)、TG-(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 226)、TG-(GGGS)3-AS (SEQID NO: 227)、TG-(GGGS)4-AS (SEQ ID NO: 228)和TG-(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 229)。
实施方案110. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述TG二肽TG和/或所述二肽AS是不存在的，或被一对选自T、A、S和G的氨基酸置换。
实施方案111. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述多肽还包含一个或多个另外的接头。
实施方案112. 前述实施方案中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含选自SEQ ID NO: 594-663和681的氨基酸序列。
实施方案113. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 594所示的氨基酸序列。
实施方案114. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 595所示的氨基酸序列。
实施方案115. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 596所示的氨基酸序列。
实施方案116. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 597所示的氨基酸序列。
实施方案117. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 598所示的氨基酸序列。
实施方案118. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 599所示的氨基酸序列。
实施方案119. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 600所示的氨基酸序列。
实施方案120. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 601所示的氨基酸序列。
实施方案121. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 602所示的氨基酸序列。
实施方案122. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 603所示的氨基酸序列。
实施方案123. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 604所示的氨基酸序列。
实施方案124. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 605所示的氨基酸序列。
实施方案125. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 606所示的氨基酸序列。
实施方案126. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 607所示的氨基酸序列。
实施方案127. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 608所示的氨基酸序列。
实施方案128. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 609所示的氨基酸序列。
实施方案129. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 610所示的氨基酸序列。
实施方案130. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 611所示的氨基酸序列。
实施方案131. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 612所示的氨基酸序列。
实施方案132. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 613所示的氨基酸序列。
实施方案133. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 614所示的氨基酸序列。
实施方案134. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 615所示的氨基酸序列。
实施方案135. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 616所示的氨基酸序列。
实施方案136. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 617所示的氨基酸序列。
实施方案137. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 618所示的氨基酸序列。
实施方案138. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 619所示的氨基酸序列。
实施方案139. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 620所示的氨基酸序列。
实施方案140. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 621所示的氨基酸序列。
实施方案141. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 622所示的氨基酸序列。
实施方案142. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 623所示的氨基酸序列。
实施方案143. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 624所示的氨基酸序列。
实施方案144. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 625所示的氨基酸序列。
实施方案145. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 626所示的氨基酸序列。
实施方案146. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 627所示的氨基酸序列。
实施方案147. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 628所示的氨基酸序列。
实施方案148. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 629所示的氨基酸序列。
实施方案149. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 630所示的氨基酸序列。
实施方案150. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 631所示的氨基酸序列。
实施方案151. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 632所示的氨基酸序列。
实施方案152. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 633所示的氨基酸序列。
实施方案153. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 634所示的氨基酸序列。
实施方案154. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 635所示的氨基酸序列。
实施方案155. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 636所示的氨基酸序列。
实施方案156. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 637所示的氨基酸序列。
实施方案157. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 638所示的氨基酸序列。
实施方案158. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 639所示的氨基酸序列。
实施方案159. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 640所示的氨基酸序列。
实施方案160. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 641所示的氨基酸序列。
实施方案161. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 642所示的氨基酸序列。
实施方案162. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 643所示的氨基酸序列。
实施方案163. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 644所示的氨基酸序列。
实施方案164. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 645所示的氨基酸序列。
实施方案165. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 646所示的氨基酸序列。
实施方案166. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 647所示的氨基酸序列。
实施方案167. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 648所示的氨基酸序列。
实施方案168. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 649所示的氨基酸序列。
实施方案169. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 650所示的氨基酸序列。
实施方案170. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 651所示的氨基酸序列。
实施方案171. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 652所示的氨基酸序列。
实施方案172. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 653所示的氨基酸序列。
实施方案173. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 654所示的氨基酸序列。
实施方案174. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 655所示的氨基酸序列。
实施方案175. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 656所示的氨基酸序列。
实施方案176. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 657所示的氨基酸序列。
实施方案177. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 658所示的氨基酸序列。
实施方案178. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 659所示的氨基酸序列。
实施方案179. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 660所示的氨基酸序列。
实施方案180. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 661所示的氨基酸序列。
实施方案181. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 662所示的氨基酸序列。
实施方案182. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 663所示的氨基酸序列。
实施方案183. 实施方案1-112中任一个的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含SEQ ID NO: 681所示的氨基酸序列。
实施方案184. 实施方案1-183中任一个的工程改造的多肽，其对血清白蛋白的亲和力具有小于约10-6 mol/L的解离常数。
实施方案185. 实施方案1-184中任一个的工程改造的多肽，其对血清白蛋白的亲和力具有小于约10-9 mol/L的解离常数。
实施方案186. 实施方案1-185中任一个的工程改造的多肽，其对血清白蛋白的亲和力具有小于约10-12 mol/L的解离常数。
实施方案187. 实施方案1-186中任一个的工程改造的多肽，其中所述多肽的作用持续时间为至少1天。
实施方案188. 实施方案1-187中任一个的工程改造的多肽，其中所述多肽的作用持续时间为至少3天。
实施方案189. 实施方案1-188中任一个的工程改造的多肽，其中所述多肽的作用持续时间为至少5天。
实施方案190. 实施方案1-189中任一个的工程改造的多肽，其中所述多肽在人受试者中的作用持续时间为至少5天。
实施方案191. 用于治疗受试者中疾病或病症的方法，包括以有效治疗所述疾病或病症的量给予有需要的受试者实施方案1-190中任一个的工程改造的多肽。
实施方案192. 实施方案191的方法，其中所述疾病或病症是脂质营养不良、血脂障碍、高血脂、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病、糖尿病(包括I型和II型)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X和亨廷顿氏病。
实施方案193. 实施方案191或实施方案192的方法，其中所述疾病或病症是脂质营养不良、血脂障碍、高血脂、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病或糖尿病。
实施方案194. 实施方案191-193中任一个的方法，其中所述疾病或病症是I型糖尿病或II型糖尿病。
实施方案195. 实施方案191-193中任一个的方法，其中所述疾病或病症是肥胖。
实施方案196. 实施方案191-193中任一个的方法，其中所述疾病或病症是脂质营养不良或瘦蛋白不足。
实施方案197. 包含实施方案1-190中任一个的工程改造的多肽和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
实施方案198. 实施方案197的药物组合物，其中所述药物组合物是可注射的药物组合物。
实施方案199. 实施方案197-198中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是持续释放或长效的药物组合物。
实施方案200. 实施方案197-199中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是每天一次的药物组合物。
实施方案201. 实施方案197-199中任一个的药物组合物，其中所述药物组合物是每周一次的药物组合物。
实施方案202. 实施方案197-201中任一个的药物组合物，其用于治疗受试者中的疾病或病症。
实施方案203. 实施方案197-202中任一个的药物组合物，其中所述疾病或病症是脂质营养不良、血脂障碍、高血脂、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病、糖尿病(包括I型和II型)、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X和亨廷顿氏病。
实施方案204. 实施方案202或实施方案203的药物组合物，其中所述疾病或病症是脂质营养不良、血脂障碍、高血脂、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病或糖尿病。
实施方案205. 实施方案202-204中任一个的方法，其中所述疾病或病症是I型糖尿病或II性糖尿病。
实施方案206. 实施方案202-204中任一个的方法，其中所述疾病或病症是肥胖。
实施方案207. 实施方案202-204中任一个的方法，其中所述疾病或病症是脂质营养不良或瘦蛋白不足。
实施方案208. 实施方案1-18中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1选自：
(a)选自以下的瘦蛋白的氨基酸序列1-146：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ IDNO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ IDNO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ IDNO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ IDNO:33、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ IDNO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676和SEQ ID NO:677；其中在以下位置的一个或多个上不同的氨基酸被取代，且保持相同的编号(甚至在缺少第28位的谷氨酰基残基的情况下)：4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142和145；
(b)子部分(a)的氨基酸序列，其中第28位的谷氨酰基残基是不存在的；
(c)子部分(a)或(b)的氨基酸序列，其中在N-端添加甲硫氨酰基残基；
(d)由(a)、(b)或(c)的氨基酸序列的片段组成的瘦蛋白，所述氨基酸序列的片段选自：
(i)氨基酸98-146；
(ii)氨基酸1-32；
(iii)氨基酸40-116；
(iv)氨基酸1-99和112-146；
(v)氨基酸1-99和112-146，其中氨基酸100-111中的一个或多个位于氨基酸99和112之间；
(vi)子部分(i)的氨基酸序列，其中氨基酸100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142和145中的一个或多个被另一氨基酸取代；
(vii)子部分(ii)的氨基酸序列，其中氨基酸4、8和32中的一个或多个被另一氨基酸取代；
(viii)子部分(iii)的氨基酸序列，其中氨基酸50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111和112中的一个或多个被另一氨基酸置换；
(ix)子部分(iv)的氨基酸序列，其中氨基酸4、8、32、33、35、48、50、53、60、64、66、67、68、71、74、77、78、89、97、112、118、136、138、142和145中的一个或多个被另一氨基酸置换；和
(x)子部分(v)的氨基酸序列，其中氨基酸4、32、33、35、50、64、68、71、74、77、78、89、97、100、102、105、106、107、108、111、118、136、138、142和145中的一个或多个被另一氨基酸置换；
(xi)子部分(i)-(x)中任一个的氨基酸序列，其中在N-端添加甲硫氨酸；
(e)子部分(a)至(d)中任一个的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列与化学部分连接；
(f)子部分(e)的氨基酸序列，其中所述化学部分是水溶性聚合物部分；
(g)子部分(f)的氨基酸序列，其中所述水溶性聚合物部分选自：聚乙二醇、乙二醇/丙二醇的共聚物、羧基甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、多聚氨基酸同聚物、多聚氨基酸随机共聚物、白蛋白、Fc蛋白、聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇同聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙基化多元醇、聚乙烯醇、聚乙二醇丙醛、琥珀酸盐、苯乙烯、羟乙基淀粉；和
(h)子部分(g)的氨基酸序列，其中所述水溶性聚合物部分是聚乙二醇；和
(i)子部分(g)的氨基酸序列，其中所述水溶性聚合物是选自白蛋白、抗体、Fc蛋白和多聚赖氨酸部分的多聚氨基酸。
实施方案209. 实施方案1-18和208中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中一个或多个氨基酸被取代。
实施方案210. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中一个氨基酸被取代。
实施方案211. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中两个氨基酸被取代。
实施方案212. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中三个氨基酸被取代。
实施方案213. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中四个氨基酸被取代。
实施方案214. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中五个氨基酸被取代。
实施方案215. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中六个氨基酸被取代。
实施方案216. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中七个氨基酸被取代。
实施方案217. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中八个氨基酸被取代。
实施方案218. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中九个氨基酸被取代。
实施方案219. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中十个氨基酸被取代。
实施方案220. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中11个氨基酸被取代。
实施方案221. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中12个氨基酸被取代。
实施方案222. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中13个氨基酸被取代。
实施方案223. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中14个氨基酸被取代。
实施方案224. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中15个氨基酸被取代。
实施方案225. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中16个氨基酸被取代。
实施方案226. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中17个氨基酸被取代。
实施方案227. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中18个氨基酸被取代。
实施方案228. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中19个氨基酸被取代。
实施方案229. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中20个氨基酸被取代。
实施方案230. 实施方案1-18和209中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ IDNO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ IDNO:29、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ ID NO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680；其中21个氨基酸被取代。
实施方案231. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:143。
实施方案232. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:144。
实施方案233. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:145。
实施方案234. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:146。
实施方案235. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:664。
实施方案236. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:665。
实施方案237. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:666。
实施方案238. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:667。
实施方案239. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:668。
实施方案240. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:669。
实施方案241. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:670。
实施方案242. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:671。
实施方案243. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:672。
实施方案244. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:673。
实施方案245. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:674。
实施方案246. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:675。
实施方案247. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:676。
实施方案248. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:677。
实施方案249. 实施方案1-20中任一个的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ IDNO:680。
尽管前述描述公开了本发明，提供实施例用于例证性目的，但应理解，本发明的实施包括所有的常见变更、改变或修改，其都在所要求保护的发明范围内。因此，描述和实施例不应解释为限制本发明的范围，所述范围由所附权利要求书限定。

Claims (27)

1.工程改造的多肽，包含：白蛋白结合结构域多肽(ABD)和包含瘦蛋白的第一肽激素结构域(HD1)，
其中所述ABD包含SEQ ID NO:300；
其中彼此独立地，
X3选自E、S和Q；
X6为E；
X7为A；
X10选自A和R；
X14选自A、S、C和K；
X26为D；
X39为D；
X40为A；
X43为A；
X44为A；
第45位上的亮氨酸是存在的；并且
第46位上的脯氨酸是存在的，其中任选G或S与氨基酸序列的N-末端连接。
2.权利要求1的工程改造的多肽，还包含第一接头，其使所述ABD与所述HD1共价连接。
3.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述HD1包含选自以下的氨基酸序列：SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ IDNO:25、SEQ ID NO: 26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、SEQID NO:31、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:143、SEQ ID NO:144、SEQ ID NO:145、SEQ ID NO:146、SEQ ID NO:664、SEQ ID NO:665、SEQ ID NO:666、SEQ ID NO:667、SEQ IDNO:668、SEQ ID NO:669、SEQ ID NO:670、SEQ ID NO:671、SEQ ID NO:672、SEQ ID NO:673、SEQ ID NO:674、SEQ ID NO:675、SEQ ID NO:676、SEQ ID NO:677和SEQ ID NO:680。
4.权利要求1的工程改造的多肽，其中ABD与白蛋白结合，使得相互作用的koff值为至多5 x 10-5 s-1。
5.权利要求1的工程改造的多肽，其中ABD选自SEQ ID NO:313、455-459、463、511和514中的任一个。
6.工程改造的多肽，包含：白蛋白结合结构域多肽(ABD)和包含瘦蛋白的第一肽激素结构域(HD1)，其中所述ABD选自517和535。
7.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述第一接头包含多聚甘氨酸、多聚丙氨酸、多聚(Gly-Ala)或多聚(Gly-Ser)。
8.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述第一接头包含(Gly)3、(Gly)4 (SEQ ID NO:116)或(Gly)5 (SEQ ID NO: 117)的多聚甘氨酸。
9.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述第一接头包含(Gly)3Lys(Gly)4 (SEQ IDNO: 118)、(Gly)3AsnGlySer(Gly)2 (SEQ ID NO: 119)、(Gly)3Cys(Gly)4 (SEQ ID NO:120)和GlyProAsnGlyGly (SEQ ID NO: 121)。
10.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述第一接头包含选自以下的序列：[Gly-Ser]n(SEQ ID NO: 122)、[Gly- Gly- Ser]n (SEQ ID NO: 123)、[Gly-Gly-Gly- Ser]n (SEQ IDNO: 124) 和[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]n (SEQ ID NO: 125)；其中n为1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
11.权利要求2的工程改造的多肽，其中所述第一接头包含选自以下的氨基酸序列：TG-(GGGS)1 (SEQ ID NO: 215)、TG-(GGGS)2 (SEQ ID NO: 216)、TG-(GGGS)3 (SEQ ID NO:217)、TG-(GGGS)4 (SEQ ID NO: 218)、TG-(GGGS)5 (SEQ ID NO: 219)、(GGGS)1-AS (SEQID NO: 220)、(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 221)、(GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 222)、(GGGS)4-AS(SEQ ID NO: 223)、(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 224)、TG-(GGGS)1-AS (SEQ ID NO: 225)、TG-(GGGS)2-AS (SEQ ID NO: 226)、TG-(GGGS)3-AS (SEQ ID NO: 227)、TG-(GGGS)4-AS(SEQ ID NO: 228)和TG-(GGGS)5-AS (SEQ ID NO: 229)。
12.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含选自SEQ ID NO:594、595、602、603、605、634、641、657、658、659、660、661和681的氨基酸序列。
13.工程改造的多肽，其中所述工程改造的多肽包含选自SEQ ID NO: 648、662和663的氨基酸序列。
14.权利要求1的工程改造的多肽，其对血清白蛋白的亲和力具有小于约10-6 mol/L的解离常数。
15.权利要求1的工程改造的多肽，其对血清白蛋白的亲和力具有小于约10-9 mol/L的解离常数。
16.权利要求1-15中任一项的工程改造的多肽在制备用于治疗有需要的受试者的疾病或病症的药物中的用途，其中所述疾病或病症是脂质营养不良、血脂障碍、高血脂、超重、肥胖、下丘脑性闭经、阿尔茨海默氏病、瘦蛋白不足、脂肪肝病、糖尿病、非酒精性脂肪肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、代谢综合征X或亨廷顿氏病。
17.包含权利要求1-15中任一项的工程改造的多肽和药学上可接受的赋形剂的药物组合物。
18.权利要求17的药物组合物，其中所述药物组合物是可注射的药物组合物。
19.权利要求17的药物组合物，其中所述药物组合物是持续释放或长效的药物组合物。
20.编码权利要求1-15中任一项的工程改造的多肽的多核苷酸。
21.包含权利要求20的多核苷酸的表达载体。
22.包含权利要求21的表达载体的宿主细胞。
23.制备权利要求1-15中任一项的工程改造的多肽的方法，所述方法包括表达编码所述工程改造的多肽的多核苷酸或通过非生物学肽合成而合成多肽。
24.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述ABD是SEQ ID NO: 463或SEQ ID NO: 313。
25.权利要求1的工程改造的多肽，其中所述HD1是SEQ ID NO: 33。
26.权利要求1的工程改造的多肽，其包含SEQ ID NO: 595的氨基酸序列。
27.权利要求1的工程改造的多肽，其包含SEQ ID NO: 657的氨基酸序列。
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