CN101939443A - 经修饰瘦素多肽和其用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供经修饰人类瘦素多肽和其用途。

Description

经修饰瘦素多肽和其用途

相关申请案的交叉引用

本申请案主张2008年2月8日申请的美国临时专利申请案第61/027,414号和2008年11月7日申请的美国临时专利申请案第61/112,671号的优先权和权利，各案的说明书和揭示内容以全文并入本文中。

技术领域

本发明涉及经至少一个非天然编码氨基酸修饰的瘦素多肽。

背景技术

肥胖(ob)基因产物瘦素是体重调控的一个重要循环信号(Zhang Y等人，(1994)Nature 372：425-432)。非功能性ob基因纯合型小鼠因过度进食和代谢效率增加而变得病态性肥胖和呈糖尿病性。1995年，Tartaglia L A等人(Cell 83：1263-1271)描述鼠类瘦素的一种高亲和力受体(OB-R)。有迹象表明，瘦素减轻体重的作用可通过经由下丘脑中的OB-R进行信号转导来介导(Lee G H等人，(1996)Nature 379：632-635)。

剪接变异体表达的调控可在信号转导分子的活性中具有重要作用且牵涉数种疾病的发病机理(Khachigian L M等人，(1992)Pathology 24：280-290)。举例来说，产生磺酰脲受体基因的新剪接变异体的突变会隔离家族持续性高胰岛素血症性低血糖症(ThomasPM等人，(1995)Science 268：426-429)。

已描述小鼠OB-R的至少9种替代性剪接形式(Lee等人，同上)。一种剪接变异体B219表达于小鼠卵黄囊、早期胎儿肝脏、富集的造血干细胞、多种淋巴造血细胞系中和成体生殖器官中，且可能直接参与造血和生殖(Cioffi JA等人，(1996)Nature Medicine2：585-589)。关于瘦素和瘦素受体在生殖中的作用的额外证据来自Chehab F F等人，其报导瘦素治疗会修正ob/ob雌性小鼠中的不孕缺陷(1996，Nature Genet 12：318-320)。研究人员指出，瘦素通过恢复必需的下丘脑和垂体激素水平而不是通过减少脂肪来改善生育力。

产生替代性剪接的转录物的OB-R突变是形成db/db小鼠的重度肥胖表型的原因(Chen H等人，(1996)Cell 84：491-495)。基于人类与小鼠染色体之间的同线性(synteni)，OB-R的人类形式很可能对应于人类染色体1p31(Lee等人，同上)。

在秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中尝试进行的基因组定序已分别揭示推定的开放阅读框架(ORF)C30B5.2和YJR044c(Wilson R等人，(1994)Nature 368：32-38；Huang M E等人，(1995)Yeast 11：775-781)。YJR044c与C30B5.2的氨基酸序列有27％相同且有71％类似，且共享类似的疏水性模式。YJR044c已表征为推定的膜相关蛋白质(Wilson等人，同上)。C30B5.2氨基酸序列与磷脂酶A2(一个从甘油的第二个碳基团释放脂肪酸的酶的家族)具有共同模式(CCxxHxxC)。

认为诸如瘦素受体等许多信号转导分子是通过表达分子的剪接变异体来调控活性。新颖瘦素受体相关蛋白质可提供诊断和治疗与由代谢病症所致的信号转导事件相关的疾病状态的基础，所述代谢病症为诸如肥胖症和糖尿病以及生殖病症(包括不孕不育症)。

与亲水性聚合物聚(乙二醇)(缩写为PEG)共价连接是对许多生物活性分子(包括蛋白质、肽和尤其疏水性分子)增加水溶性、生物可用性，增加血清半衰期，增加治疗半衰期，调节免疫原性，调节生物活性或延长循环时间的方法。PEG已广泛用于药物、人工植入物，以及生物相容性、无毒性和无免疫原性具有重要性的其它应用中。为最大化PEG的所需性质，连接到生物活性分子上的一种或一种以上PEG聚合物的总分子量和水合状态必须足够高以赋予通常与PEG聚合物连接相关的有利特征(例如增加的水溶性和循环半衰期)，而不会不利地影响母体分子的生物活性。

PEG衍生物通常通过例如赖氨酸、半胱氨酸和组氨酸残基、N末端以及碳水化合物部分等反应性化学官能团与生物活性分子连接。蛋白质和其它分子通常具有有限数目的可用于聚合物连接的反应性位点。通常，最适于通过聚合物连接来修饰的位点在受体结合中起重要作用，并且对于分子的生物活性保持来说是必需的。因此，聚合物链与生物活性分子上的这些反应性位点的杂乱连接通常导致聚合物修饰的分子的生物活性显著降低或甚至完全丧失。R.Clark等人，(1996)，J.Biol.Chem.，271：21969-21977。为形成具有足够聚合物分子量以赋予标靶分子以所需优点的接合物，先前技术方法通常涉及多个聚合物臂与分子的随机连接，从而增大母体分子的生物活性降低或甚至完全丧失的风险。

形成PEG衍生物与蛋白质的连接点的反应性位点由蛋白质的结构指示。蛋白质(包括酶)由多个α氨基酸序列构成，所述序列具有一般结构H₂N--CHR--COOH。一个氨基酸的α氨基部分(H₂N--)与相邻氨基酸的羧基部分(--COOH)连接形成酰胺键联，其可表示为--(NH--CHR--CO)_n--，其中下标“n”可等于数百或数千。由R表示的片段可含有关于蛋白质生物活性和用于连接PEG衍生物的反应性位点。

举例来说，在氨基酸赖氨酸的情况下，在ε位以及α位存在--NH₂部分。ε--NH₂在碱性pH值条件下不反应。用PEG进行蛋白质衍生领域中的许多技术是针对开发用于连接蛋白质中存在的赖氨酸残基的ε--NH₂部分的PEG衍生物。″Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation″，Nektar Molecular Engineering Catalog，2003，第1-17页。然而，这些PEG衍生物都具有常见限制：其不能在蛋白质表面上存在的通常众多赖氨酸残基之间进行选择性安装。在赖氨酸残基对于蛋白质活性较为重要(例如存在于酶活性位点中)的情况下或在赖氨酸残基在介导蛋白质与其它生物分子的相互作用中起作用(如在受体结合位点的情况下)的情况下，这可能是一个重要限制。

蛋白质聚乙二醇化的现有方法的又一个同样重要的复杂情况在于PEG衍生物可能经历与除所需残基以外的残基发生的不需要的副反应。组氨酸含有反应性亚氨基部分(其结构表示为--N(H)--)，但许多与ε--NH₂反应的化学反应性物质也可与--N(H)--反应。类似地，氨基酸半胱氨酸的侧链带有自由巯基，其结构表示为--SH。在一些情况下，针对赖氨酸的ε--NH₂基团的PEG衍生物也与半胱氨酸、组氨酸或其它残基反应。这可以产生PEG衍生的生物活性分子的复杂的异质混合物，并且存在破坏所靶向生物活性分子的活性的风险。将需要开发出允许在蛋白质内的单一位点处引入化学官能团的PEG衍生物，其随后将使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质表面上确定以及可预测的特定位点处的生物活性分子选择性偶合。

除赖氨酸残基之外，所属领域中也已作出相当大的努力来开发靶向其它氨基酸侧链(包括半胱氨酸、组氨酸和N末端)的活化PEG试剂。例如，参看以引用的方式并入本文中的美国专利第6,610,281号，以及″Polyethylene Glycol and Derivatives for Advanced PEGylation″，Nektar Molecular Engineering Catalog，2003，第1-17页。可使用定点诱变和所属领域中已知的其它技术将半胱氨酸残基位点选择性地引入蛋白质结构中，并且所得自由巯基部分可与带有硫醇反应性官能团的PEG衍生物反应。然而，这种方法的复杂之处在于引入自由巯基可能使所得蛋白质的表达、折叠和稳定性变得复杂。因此，将需要获得一种将化学官能团引入生物活性分子中的方法，其使得一种或一种以上PEG聚合物能够与蛋白质选择性偶合，同时可与巯基和蛋白质中通常可见的其它化学官能团相容(即，不会发生不需要的副反应)。

从所属领域中的取样来看，在已开发的用于连接蛋白质侧链(具体来说，赖氨酸氨基酸侧链上的--NH₂部分和半胱氨酸侧链上的--SH部分)的这些衍生物中，已证实许多衍生物的合成和使用存在问题。一些衍生物与蛋白质形成不稳定键联，其经历水解并因此分解、降解或以其它方式在水性环境中(例如在血流中)不稳定。关于PEG-Intron

中键联的稳定性的论述，参看Pedder，S.C.Semin Liver Dis.2003；23增刊1：19-22。一些衍生物形成较稳定的键联，但在形成所述键联之前经历水解，这表示PEG衍生物上的反应性基团可能在可连接蛋白质之前已失活。一些衍生物稍有毒性并且因此不太适于活体内使用。一些衍生物因反应过慢而不能实际使用。一些衍生物因与负责蛋白质活性的位点连接而导致蛋白质活性丧失。一些衍生物在其将连接的位点中不具特异性，这也可能导致所需活性丧失并缺乏结果的再现性。为克服与用聚(乙二醇)部分修饰蛋白质相关的挑战，已开发出更稳定(例如，美国专利6,602,498，其以引用的方式并入本文中)或与分子和表面上的硫醇部分选择性反应(例如，美国专利6,610,281，其以引用的方式并入本文中)的PEG衍生物。所属领域中无疑需要在要求选择性反应形成稳定化学键之前在生理环境中呈化学惰性的PEG衍生物。

近年来，已报导蛋白质科学中的全新技术，其有希望克服众多与蛋白质的位点特异性修饰相关的限制。具体来说，已将新的组分添加到原核生物大肠杆菌(Escherichia coli；E.coli)(例如，L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500)以及真核生物酿酒酵母(Sacchromyces cerevisiae；S.cerevisiae)(例如，J.Chin等人，Science 301：964-7(2003))的蛋白质生物合成机制中，其使得能够在活体内将非遗传编码氨基酸并入蛋白质中。使用此方法，已回应琥珀密码子TAG而将具有新颖化学、物理或生物性质的许多新颖氨基酸(包括光亲和性标记和可光致异构化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基酸)有效且高保真地并入大肠杆菌以及酵母中的蛋白质中。例如，参看J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society 124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，ChemBioChem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99：11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.，1-10。这些研究已证实有可能选择性地并且常规地引入蛋白质中不存在的化学官能团(例如酮基、炔基和叠氮部分)，所述官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的所有官能团都呈化学惰性并且可用于有效并选择性地反应形成稳定共价键联。

在蛋白质中并入非遗传编码氨基酸的能力允许引入可能提供天然存在的官能团(例如赖氨酸的ε--NH₂、半胱氨酸的巯基--SH、组氨酸的亚氨基等)的有价值替代的化学官能团。已知某些化学官能团对20种常见的遗传编码氨基酸中存在的官能团呈惰性，但完全并有效地反应形成稳定键联。举例来说，所属领域中已知叠氮基和乙炔基在催化量的铜存在下在水性条件下经历休斯根(Huisgen)[3+2]环加成反应。例如，参看Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。举例来说，通过在蛋白质结构中引入叠氮部分，能够并入对蛋白质中存在的胺、巯基、羧酸、羟基呈化学惰性，但也与乙炔部分平稳并有效地反应形成环加成产物的官能团。重要的是，在不存在乙炔部分的情况下，叠氮化物在其它蛋白质侧链存在下在生理条件下仍保持化学惰性并且不反应。

所属领域中已知投予外源性瘦素来治疗肥胖症(Heymsfield等人，JAMA.282：1568-1575，1999)和增加内源性瘦素产生(例如参看美国专利公开案第2007/0203225号)的方法，这两篇参考文献出于所有目的均以引用的方式并入本文中。瘦素具有若干超出能量平衡调控的作用，除肥胖症管理以外，一种增加血清或循环瘦素的方法还可适用于调节葡萄糖和脂质代谢、下丘脑-垂体神经内分泌功能、治疗不孕不育症，和促进免疫功能、造血以及增加血管生成和创伤愈合。举例来说，最近已显示，瘦素投药在因脂肪沉积缺陷(脂肪营养不良)而患糖尿病的人类中改良葡萄糖控制和降低血清脂质(三酸甘油酯)(Oral等人，New Engl.J.Med.，2002)。已从活体外培养的脂肪细胞的实验中获得数据，表明葡萄糖利用是胰岛素介导的瘦素基因表达和瘦素分泌的重要决定因素(Mueller等人，Endocrinology，1998)。还指出，葡萄糖厌氧代谢成乳酸盐不会导致瘦素分泌增加(Mueller等人，Obesity Res.，8：530-539，2000)。额外信息指出一种需要增加转运到线粒体中的底物以用于三羧酸(TCA)循环中的氧化的机理，胰岛素介导的葡萄糖代谢正是通过这一代谢途径来调控瘦素产生(Havel等人，Obesity Res.，Abstract，1999)。

本发明尤其涉及与瘦素多肽的活性和制备相关的问题，并且也涉及具有改良的生物或药理学性质的瘦素多肽的制备。

发明内容

本发明提供包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽。

在一些实施例中，瘦素多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。在一些实施例中，瘦素多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。在一些实施例中，瘦素多肽是与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它瘦素多肽连接。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子是双官能聚合物。在一些实施例中，双官能聚合物是与第二多肽连接。在一些实施例中，第二多肽是瘦素多肽。

在一些实施例中，瘦素多肽包含至少两个与包含聚(乙二醇)部分的水溶性聚合物连接的氨基酸。在一些实施例中，至少一个氨基酸是非天然编码氨基酸。

瘦素的核苷酸序列、氨基酸序列和二级结构区在所属领域中为众所周知的且已论述和揭示于若干参考文献中，所述参考文献包括：F.Peelman等人，(2004)，J.Biol.Chem.，279：41038-41046；Zhang等人，(1997)Nature 387，206-209；Kline等人，(1997)，Fed.Eur. Biochem.Soc.，407：239-242；RCSB Protein Data Bank″Obesity Protein″，UniProt referenceQ6NT58；各以引用的方式并入本文中。瘦素的二级结构可说明如下，其中氨基酸位置在中间行指出：

      螺旋A          螺旋B           螺旋C            螺旋D

[1-3]-[4-26]-[27-50]-[51-67]-[68-70]-[71-93]-[94-120]-[121-142]-[143-146]

N末端        A-B环           B-C环           C-D环              C末端

对于SEQ ID NO：4，所述区为相同的且C末端包括氨基酸位置143-147。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区中的任何位置，所述区对应于瘦素中的二级结构，如下：SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的1-3(N末端)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-146(C末端)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区中的任何位置，所述区对应于瘦素中的二级结构，如下：SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸的1-4(N末端区)、5-27(A螺旋)、28-51(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、52-68(B螺旋)、69-71(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、72-94(C螺旋)、95-121(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、122-143(D螺旋)、144-148(C末端区)。在其它实施例中，非天然编码氨基酸在选自由以下组成的群组的位置处进行取代：hGHSEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的残基1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-55、56-60、61-65、66-70、71-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、101-105、106-110、111-115、116-120、121-125、126-130、131-135、136-140、141-146。在另一实施例中，非天然编码氨基酸在选自由以下组成的群组的位置处进行取代：hGH SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸的残基1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-55、56-60、61-65、66-70、71-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、101-105、106-110、111-115、116-120、121-125、126-130、131-135、136-140、141-147。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入瘦素中的一个或一个以上以下位置中：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。在另一实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入瘦素中的一个或一个以上以下位置中：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35和36(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸；或SEQ IDNO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：位置1(即，在N末端)之前、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72和73(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸；或SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109和110(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸；或SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146和147(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。在其它实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：111、112、113、134、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147和148(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：45、65、66、99、104、107、110(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：46、66、67、100、105、108、111(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：105、41、117、100、118、40、108、71、95、5、106、112、97、92、109、23、4、119、103、102、142、69、111、22、93、116、143、67、138、99、3、115、8、141、104、24、120、66、101、70、78、39、43、39、9、94、12、96、107、74、113、15、85、49、46、145、122、81、110(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：106、42、118、101、119、41、109、72、96、6、107、113、98、93、110、24、5、120、104、103、143、70、112、23、94、117、144、68、139、100、4、116、9、342、105、25、121、67、102、71、79、40、44、20、10、95、13、97、108、75、114、16、86、50、47、146、123、82、111(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：45、65、66、99、104、107、110(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：46、66、67、100、105、108、111(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

瘦素拮抗剂包括(但不限于)在以下各处具有取代的拮抗剂：120、121或其组合(SEQID NO：2，或SEQ ID NO：1的相应氨基酸)。瘦素拮抗剂包括(但不限于)在以下各处具有取代的拮抗剂：121、122或其组合(SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：3的相应氨基酸)。

在一些实施例中，瘦素多肽包含调节瘦素多肽对瘦素多肽受体的亲和性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含增加瘦素多肽的稳定性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取代：瘦素SEQ ID NO：2中的Glu105、Phe41、Ser117、Glu100、Gly118、Asp40、Asp108、Arg71、Ser95、Lys5、Thr106、Gly112、Hi97、Phe92、Ser109、Asp23、Gln4、Tyr119、Gly103、Ser102、Lu142、Pro69、Gly111、Asn22、Ser93、Ala116、Ser143、Ser67、Trp138、Pro99、Ile3、Glu115、Asp8、Asp141、Leu104、Ile24、Ser120、Thr66、Ala101、Ser70、Asn78、Leu39、Pro43、Thr19、Asp9、Lys94、Thr12、Cys96、Leu107、Ile74、Val113、Lys15、Asp85、Leu49、His46、Gly145、Glu122、Glu81、Leu110或其任何组合。在其它实施例中，瘦素多肽包含选自由以下组成的群组的氨基酸取代：瘦素SEQ ID NO：4中的Glu106、Phe42、Ser118、Glu101、Gly119、Asp41、Asp109、Arg72、Ser96、Lys6、Thr107、Gly113、Hi98、Phe93、Ser110、Asp24、Gln5、Tyr120、Gly104、Ser103、Lu143、Pro70、Gly112、Asn23、Ser94、Ala117、Ser144、Ser68、Trp139、Pro100、Ile4、Glu116、Asp9、Asp142、Leu105、Ile25、Ser121、Thr67、Ala102、Ser71、Asn79、Leu40、Pro44、Thr20、Asp10、Lys95、Thr13、Cys97、Leu108、Ile75、Val114、Lys16、Asp86、Leu50、His47、Gly146、Glu123、Glu82、Leu111或其任何组合。在一些实施例中，瘦素多肽包含调节瘦素多肽的免疫原性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含调节瘦素多肽的血清半衰期或循环时间的取代、添加或缺失。

在一些实施例中，瘦素多肽包含增加瘦素多肽的水溶性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含增加宿主细胞中产生的瘦素多肽的溶解性的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含增加瘦素多肽在宿主细胞中的表达或增加活体外合成的瘦素多肽的取代、添加或缺失。在一些实施例中，瘦素多肽包含SEQ ID NO：2的120、121或120与121处的氨基酸取代。在一些实施例中，瘦素多肽包含SEQ ID NO：4的121、122或121与122处的氨基酸取代。包含这种取代的瘦素多肽保持激动剂活性并且保持或提高宿主细胞中的表达水平。

在一些实施例中，瘦素多肽中的氨基酸可经天然存在或非天然存在氨基酸取代，条件是存在至少一个非天然编码氨基酸取代。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R₂为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R₃为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R₄为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含氨氧基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含酰肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含肼基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含炔基。在一些实施例中，非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

在一些实施例中，多肽为瘦素多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂。在一些实施例中，瘦素多肽激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，瘦素激动剂、部分激动剂、拮抗剂、部分拮抗剂或反向激动剂包含非天然编码氨基酸以及一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。在一些实施例中，包含与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸的瘦素多肽通过阻止瘦素多肽拮抗剂结合于第二瘦素多肽受体分子而阻止瘦素多肽受体二聚合。

本发明也提供包含在严格条件下与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3杂交的多核苷酸的分离核酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。在一些实施例中，选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子(opal codon)、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。

本发明也提供制备与水溶性聚合物连接的瘦素多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离瘦素多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的水溶性聚合物接触。在一些实施例中，并入瘦素多肽中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，并入瘦素多肽中的非天然编码氨基酸反而可与不与20种常见氨基酸中的任一种反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。

在一些实施例中，通过使包含含羰基的氨基酸的瘦素多肽与包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物连接的瘦素多肽。在一些实施例中，氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基是通过酰胺键联与聚(乙二醇)分子连接。

在一些实施例中，通过使包含羰基的聚(乙二醇)分子与包含包括氨氧基、肼、酰肼或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备与水溶性聚合物连接的瘦素多肽。

在一些实施例中，通过使包含含炔的氨基酸的瘦素多肽与包含叠氮部分的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物连接的瘦素多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是通过酰胺键联与聚(乙二醇)分子连接。

在一些实施例中，通过使包含含叠氮基的氨基酸的瘦素多肽与包含炔部分的聚(乙二醇)分子反应来制备与水溶性聚合物连接的瘦素多肽。在一些实施例中，叠氮基或炔基是通过酰胺键联与聚(乙二醇)分子连接。

在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。在一些实施例中，聚(乙二醇)分子具有介于0.1kDa与50kDa之间的分子量。

在一些实施例中，聚(乙二醇)分子为支化聚合物。在一些实施例中，聚(乙二醇)支化聚合物的各支链具有介于1kDa与100kDa之间或介于1kDa与50kDa之间的分子量。

在一些实施例中，与瘦素多肽连接的水溶性聚合物包含聚烷二醇部分。在一些实施例中，并入瘦素多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。在一些实施例中，并入瘦素多肽中的非天然编码氨基酸残基包含羰基部分，并且水溶性聚合物包含氨氧基、酰肼、肼或氨基脲部分。在一些实施例中，并入瘦素多肽中的非天然编码氨基酸残基包含炔部分，并且水溶性聚合物包含叠氮部分。在一些实施例中，并入瘦素多肽中的非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，并且水溶性聚合物包含炔部分。

本发明也提供组合物，其包含包括非天然编码氨基酸的瘦素多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。

本发明也提供包含编码包含选择密码子的瘦素多肽的多核苷酸的细胞。在一些实施例中，所述细胞包含用于将非天然编码氨基酸取代到瘦素多肽中的正交RNA合成酶和/或正交tRNA。

本发明也提供制备包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的方法。在一些实施例中，所述方法包含在允许瘦素多肽表达的条件下培养包含一种或一种以上编码瘦素多肽的多核苷酸、正交RNA合成酶和/或正交tRNA的细胞；以及从细胞和/或培养基纯化瘦素多肽。

本发明也提供增加瘦素多肽的治疗半衰期、血清半衰期或循环时间的方法。本发明也提供调节瘦素多肽的免疫原性的方法。在一些实施例中，所述方法包含用非天然编码氨基酸取代天然存在瘦素多肽中的任何一个或一个以上氨基酸和/或将瘦素多肽与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。

本发明也提供用有效量的本发明的瘦素分子治疗需要这种治疗的患者的方法。在一些实施例中，所述方法包含向患者投予治疗有效量的医药组合物，所述医药组合物包含包括非天然编码氨基酸的瘦素多肽和医药学上可接受的载剂。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。

本发明也提供包含以SEQ ID NO：2或4表示的序列的瘦素多肽，但其中至少一个氨基酸是由非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸与水溶性聚合物连接。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

本发明也提供医药组合物，其包含医药学上可接受的载剂和包含以SEQ ID NO：2或4表示的序列的瘦素多肽，其中至少一个氨基酸是经非天然编码氨基酸取代。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。在一些实施例中，水溶性聚合物通过糖部分与多肽连接。在一些实施例中，连接子、聚合物或生物活性分子通过糖部分与瘦素多肽连接。

本发明也提供包含在单一氨基酸处通过共价键连接的水溶性聚合物的瘦素多肽。在一些实施例中，水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。在一些实施例中，与水溶性聚合物共价连接的氨基酸为多肽中存在的非天然编码氨基酸。

本发明提供包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子的瘦素多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经由核糖体并入多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与瘦素多肽连接。在一些实施例中，瘦素多肽是经单聚乙二醇化。本发明也提供包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸是在预选位点处经由核糖体并入瘦素多肽中。

附图说明

图1-展示四螺旋束(4HB)蛋白质的一般结构图。

图2-成熟瘦素(SEQ ID NO：2)的146个残基位置中各位置的Cx值的图。

图3-瘦素(SEQ ID NO：2)的Cx值的表，较高的Cx值对应于较高的表面暴露。

图4-展示瘦素蛋白质的一般结构图。

图5-基于瘦素(SEQ ID NO：2)的表面暴露、Cx值依次列出瘦素的顶部聚乙二醇化位点的表。

图6-展示考马斯蓝染色的SDS-PAGE，证实在各以下位置包含非天然编码氨基酸对乙酰基苯丙氨酸的hGH的表达：Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143或K145。

图7的图A和图B-展示包含非天然编码氨基酸的hGH(图B)和野生型hGH(图A)对IM9细胞的生物活性的图。

图8-展示考马斯蓝染色的SDS-PAGE，证实产生包含通过共价键联PEG(5、20和30kDa)与非天然编码氨基酸而聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH。

图9-所展示的图证实包含非天然编码氨基酸的hGH的各种聚乙二醇化形式对IM9细胞的生物活性。

图10的图A-这个图描绘hGH的一级结构，其中指出胰蛋白酶裂解位点且用箭头指明非天然氨基酸取代F92pAF(从Becker等人，Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4)：326-337修改的图)。图10的图B-展示以下肽的叠加胰蛋白酶图：由包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(标记为A)、由包含非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(标记为B)和由WHO rhGH产生的肽(标记为C)。图10的图C-展示图B的峰9的放大图。

图11的图A和图B展示经纯化的PEG-hGH多肽的考马斯蓝染色的SDS-PAGE分析。

图12-展示hGH二聚物分子对IM9细胞的生物活性的图。

图13的图A-展示测量具有G120R取代的hGH拮抗剂对pSTAT5的磷酸化作用的IM-9检验数据的图。图13的图B-展示测量在同一位置(G120)处合并有非天然氨基酸的hGH多肽对pSTAT5的磷酸化作用的IM-9检验数据的图。

图14-所展示的图指出图13的图B中所示的hGH拮抗剂的二聚物在IM-9检验中也缺乏生物活性。

图15-展示比较包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH多肽与未聚乙二醇化的hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。

图16-展示比较包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。

图17-展示比较包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。以2.1mg/kg对大鼠给药一次。

图18的图A-展示投予单次剂量的包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸(位置35、92)的hGH多肽后对大鼠体重增加的影响的图。图18的图B-展示投予单次剂量的包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸(位置35、92)的hGH多肽后对循环血浆IGF-1水平的影响的图。图18的图C-展示投予单次剂量的包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸(位置92、134、145、131、143)的hGH多肽后对大鼠体重增加的影响的图。图18的图D-展示投予单次剂量的包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸(位置92、134、145、131、143)的hGH多肽后对循环血浆IGF-1水平的影响的图。图18的图E-展示比较包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸(位置92、134、145、131、143)的hGH多肽在大鼠中的血清半衰期的图。

图19展示在大肠杆菌中表达的瘦素的SDS-PAGE分析。

图20展示瘦素-H46-pAF的纯化的色谱图和SDS-PAGE分析。

图21展示瘦素-H46-30KPEG的纯化的色谱图和SDS-PAGE分析。

图22展示实例47的相对于第1天的体重变化，且展示聚乙二醇化瘦素使得在处理后3-4天体重减轻。图的最右侧，第8天的线自上而下依次是顶部线PEG-瘦素野生型、rH(天然人类)瘦素、PBS、PEG-瘦素E105、PEG-瘦素W100、PEG-瘦素D108、PEG-瘦素H46和PEG-瘦素G111。

图23展示实例47的平均每日食物消耗，且展示在处理后2天PEG-瘦素组的总消耗减少。图的最右侧，第7天的线自上而下依次表示PEG-瘦素E105、PBS、PEG-瘦素WT、PEG-瘦素W100、PEG-瘦素D108、rH瘦素、PEG-瘦素H46和PEG-瘦素G111。

图24展示由实例47中进行的实验所引起的7天总消耗(以克计)的条形图。

图25展示处理后8天中每日体重变化百分比的图，且如同图22，这一数据集的最大差异由PEG-瘦素G111产生，展示于图的最后一行，意味着用PEG-瘦素G111处理的个体展示距第1天最大的体重减轻百分比。图26展示ob/ob小鼠的平均食物消耗的图，一组是在用缓冲液对照处理之后，且其它组是在用.037mg/kg、0.11mg/kg、0.34mg/kg、1.0mg/kg和3.0mg/kg PEG-瘦素30K G111多肽处理之后。第1天投予ob/ob小鼠各种浓度的瘦素多肽变异体G111，且y轴量度每天的食物消耗(以克计)。

图27(A)展示数个不同的ob/ob小鼠处理组在第0天用瘦素处理后的7天中的每日体重(以克为计量单位)的图。图中所示的组包括用PBS处理的对照组和5个用5种不同剂量的PEG-瘦素30K G111处理的不同组，所述剂量包括0.037mg/kg、0.11mg/kg、0.34mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg。

图27(B)展示处理后7天中每日体重变化百分比的图，且如同图27(A)，总计展示6个组：用PBS处理的对照组和5个用5种不同剂量的PEG-瘦素30K G111处理的不同组，所述剂量包括0.037mg/kg、0.11mg/kg、0.34mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg。

图28展示数个不同组的每日平均食物消耗(以克为计量单位)的图，所述组为对照组和用不同剂量的本发明的PEG-瘦素多肽处理的组。图中所示的组包括用PBS处理的对照组和5个用5种不同剂量的PEG-瘦素40K G111处理的不同组，所述剂量包括0.037mg/kg、0.11mg/kg、0.34mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg。

图29(A)展示数个不同的ob/ob小鼠处理组在第0天用瘦素处理后的7天中的每日体重(以克为计量单位)的图。图中所示的组包括用PBS处理的对照组和5个用5种不同剂量的PEG-瘦素40K G111处理的不同组，所述剂量包括0.037mg/kg、0.11mg/kg、0.34mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg。

图29(B)展示处理后7天中每日体重变化百分比的图，且如同图29(A)，总计展示6个组：用PBS处理的对照组和5个用5种不同剂量的PEG-瘦素40K G111处理的不同组，所述剂量包括0.037mg/kg、0.11mg/kg、0.34mg/kg、1.0mg/kg、3.0mg/kg。

图30(A)展示三个不同处理组在15天中的体重百分比(100％等于与起始重量相同，高于100％是重量增加，低于100％是重量减轻)：PEG-瘦素(30K-H46)，以0.5mg/kg给药一次；每日rh瘦素处理；和用PBS处理的对照组。

图30(B)展示三个不同处理组在15天中的体重百分比(100％等于与起始重量相同，高于100％是重量增加，低于100％是重量减轻)：PEG-瘦素(30K-G111)，以0.5mg/kg给药一次；每日rh瘦素处理；和用PBS处理的对照组。

图31展示投予大鼠0.1mg/kg单次皮下剂量的瘦素多肽后，瘦素血清浓度(以ng/mL为计量单位，y轴)针对经过时间(以小时计，x轴)的图。用以下各物处理不同处理组：rh瘦素(血清半衰期等于不足1小时)；和PEG-瘦素(30K-H46)(血清半衰期等于约10小时)；PEG-瘦素(30K-W100)(血清半衰期等于约10小时)；PEG-瘦素(30K-G111)(血清半衰期等于约8小时)；和PEG-瘦素(30K-D108)(血清半衰期等于约10小时)。

图32(A)展示三个不同处理组在8天中的体重百分比(100％等于与起始重量相同，高于100％是重量增加，低于100％是体重减轻)：PEG-瘦素(30K-H46)，以0.5mg/kg给药一次；每日rh瘦素处理；和用PBS处理的对照组。

图32(B)展示三个不同处理组在8天中的体重百分比(100％等于与起始重量相同，高于100％是重量增加，低于100％是重量减轻)：PEG-瘦素(30K-G111)，以0.5mg/kg给药一次；每日rh瘦素处理；和用PBS处理的对照组。图32(A)和32(B)以及相关实验展示，本发明的瘦素多肽所减轻的重量超过rh瘦素。

具体实施方式

定义

应了解，本发明并不限于本文中所述的特定方法、方案、细胞系、构筑体和试剂，并且同样可改变。也应了解，本文中使用的术语只是为了达成描述特定实施例的目的，而并不打算限制本发明的范围，所述范围应仅由随附权利要求加以限制。

除非上下文另外明确指出，否则如本文和随附权利要求中所使用，单数形式“一”和“所述”包括多个提及物。因此，举例来说，对“瘦素”、“hGH”、“hIFN”、“G-CSF”或“hEPO”的提及是对一个或一个以上所述蛋白质的提及，并且包括所属领域的技术人员已知的其等效物等。

除非另外定义，否则本文中使用的所有科技术语都具有与本发明所属领域的技术人员通常所了解的含义相同的含义。虽然可将与本文中所述类似或等效的任何方法、装置和材料用于本发明的实践或测试中，但现仅对优选方法、装置和材料加以描述。

本文中所提及的所有公开案和专利都是以引用的方式并入本文中，以达到描述和揭示例如所述公开案中所述的可能与当前所述的发明结合使用的构筑体和方法的目的。本文中所讨论的公开案仅提供本申请案的申请日期之前的揭示内容。本文决不应解释为承认发明者无权由于先前发明或任何其它原因而使所述揭示案的日期提前。

术语“实质上经纯化”是指可实质上或基本上不含通常伴随天然存在环境(即天然细胞，或者在重组产生瘦素多肽的情况下为宿主细胞)中存在的蛋白质或与天然存在环境中存在的蛋白质相互作用的组分的瘦素多肽。可实质上不含细胞物质的瘦素多肽包括具有小于约30％、小于约25％、小于约20％、小于约15％、小于约10％、小于约5％、小于约4％、小于约3％、小于约2％或小于约1％(以干重计)的污染蛋白的蛋白制剂。当瘦素多肽或其变异体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重的约30％、约25％、约20％、约15％、约10％、约5％、约4％、约3％、约2％或约1％或1％以下存在。当瘦素多肽或其变异体是由宿主细胞重组产生时，蛋白质可以细胞干重计以约5g/L、约4g/L、约3g/L、约2g/L、约1g/L、约750mg/L、约500mg/L、约250mg/L、约100mg/L、约50mg/L、约10mg/L或约1mg/L或1mg/L以下存在于培养基中。因此，由本发明方法产生的“实质上经纯化”的瘦素多肽可具有如通过适当方法(例如SDS/PAGE分析、RP-HPLC、SEC和毛细管电泳)所测定至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％的纯度水平，特定来说至少约75％、80％、85％的纯度水平，并且更特定来说至少约90％的纯度水平、至少约95％的纯度水平、至少约99％或99％以上的纯度水平。

“重组宿主细胞”或“宿主细胞”是指不管何种方法用于插入(例如，直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知用于产生重组宿主细胞的其它方法)，包括外源多核苷酸的细胞。外源多核苷酸可保持非整合载体(例如，质粒)形式，或者可整合到宿主基因组中。

如本文中所用，术语“培养基”包括可支撑或容纳任何宿主细胞的任何培养基、溶液、固体、半固体或刚性支撑物，所述宿主细胞包括细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、昆虫宿主细胞、植物宿主细胞、真核宿主细胞、哺乳动物宿主细胞、CHO细胞或大肠杆菌和细胞内含物。因此，所述术语可涵盖已生长宿主细胞的培养基，例如已分泌瘦素多肽的培养基，包括在增殖步骤之前或之后的培养基。例如，在瘦素多肽已在细胞内产生并且宿主细胞已溶解或破裂以释放瘦素多肽的情况下，所述术语也可涵盖含有宿主细胞溶解产物的缓冲液或试剂。

如本文中关于蛋白质再折叠所用的“还原剂”是定义为使巯基保持还原状态并还原分子内或分子间二硫键的任何化合物或物质。合适的还原剂包括(但不限于)二硫苏糖醇(DTT)、2-巯基乙醇、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸、半胱胺(2-氨基乙硫醇)以及还原型谷胱甘肽。所属领域的技术人员显而易见，多种还原剂适用于本发明的方法和组合物中。

如本文中关于蛋白质再折叠所用的“氧化剂”是定义为能够从所氧化的化合物去除电子的任何化合物或物质。合适的氧化剂包括(但不限于)氧化型谷胱甘肽、胱氨酸、胱胺、氧化型二硫苏糖醇、氧化型赤藓糖醇和氧。所属领域的技术人员显而易见，多种氧化剂适用于本发明的方法中。

如本文中所用的“变性剂”是定义为会造成蛋白质可逆展开的任何化合物或物质。变性剂的强度将由特定变性剂的性质和浓度决定。合适的变性剂可为离液剂(chaotrope)、清洁剂、有机溶剂、水可混溶溶剂、磷脂或两种或两种以上所述试剂的组合。合适的离液剂包括(但不限于)尿素、胍和硫氰酸钠。适用的清洁剂可包括(但不限于)强清洁剂，例如十二烷基硫酸钠或聚氧乙烯醚(例如Tween或Triton清洁剂)、Sarkosyl；温和非离子型清洁剂(例如，毛地黄皂苷(digitonin))；温和阳离子型清洁剂，例如N-＞2，3-(二油烯基氧基)-丙基-N，N，N-三甲基铵；温和离子型清洁剂(例如胆酸钠或脱氧胆酸钠)；或两性离子型清洁剂，包括(但不限于)硫代甜菜碱(Zwittergent)、3-(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基-1-丙烷硫酸盐(CHAPS)以及3-(3-胆酰胺基丙基)二甲基氨基-2-羟基-1-丙烷磺酸盐(CHAPSO)。可使用例如乙腈、低碳烷醇(尤其C₂-C₄烷醇，例如乙醇或异丙醇)或低碳烷二醇(尤其C₂-C₄烷二醇，例如乙二醇)等有机、水可混溶溶剂作为变性剂。适用于本发明中的磷脂可为天然存在磷脂，例如磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇；或合成磷脂衍生物或变异体，例如二己酰基磷脂酰胆碱或二庚酰基磷脂酰胆碱。

如本文中所用，“再折叠”描述将含有二硫键的多肽从不当折叠或展开状态转化为二硫键的天然或适当折叠的构象的任何过程、反应或方法。

如本文中所用，“共折叠”特定是指使用至少两种彼此相互作用的多肽并使得展开或不当折叠的多肽转化为天然、适当折叠多肽的再折叠过程、反应或方法。

如本文中所用，术语“瘦素”、“瘦素多肽”是指任何已知的、和变得已知的瘦素家族多肽或蛋白质。这些术语包括(但不限于)任何其它瘦素家族成员，包括包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的成员以及变异体、融合体、突变体、片段、激动剂、拮抗剂、二聚物、多聚物、与聚合物共价结合的多肽、与瘦素家族成员共享90％或90％以上氨基酸序列一致性的多肽和具有四螺旋束结构的多肽。除非上下文另外明确指出，否则所述术语包括复数形式提及。

如本文中所用，“生长激素”或“GH”应包括具有人类生长激素以及GH类似物、GH亚型、GH模拟物、GH片段、杂合GH蛋白、其融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体和突变蛋白的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，而不管所述物质的生物活性如何，并且更不管其合成或制造方法(包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸产生)、合成、转基因和基因活化方法)如何。术语“hGH多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的hGH多肽。例示性取代包括例如申请中的美国专利申请公开案第20060189529号中可见的取代；又，关于额外取代，参看例如美国专利第6,143,523号，其以引用的方式并入本文中。

术语“hGH多肽”也包括天然存在hGH的医药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在hGH和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。术语“hGH多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或这两个末端包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)：例如，由重组表达所产生的使蛋氨酸与hGH的N末端连接的蛋氨酰基生长激素；出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。

如本文中所用，“干扰素”或“IFN”应包括具有人类干扰素(包括(但不限于)IFNα、IFNβ、IFNγ、IFNω、IFNε或IFNτ)(例如以下专利中所述的干扰素：美国专利第4,414,150号、第4,456,748号、第4,727,138号、第4,762,791号、第4,929,554号、第5,096,705号、第4,695,623号、第4,614,651号、第4,678,751号、第4,925,793号、第5,460,811号、第5,120,832号、第4,780,530号、第4,908,432号、第4,970,161号、第4,973,479号、第4,975,276号、第5,098,703号、第5,278,286号、第5,661,009号、第6,372,206号、第6,433,144号、第6,472,512号、第6,572,853号、第6,703,225号、第6,200,780号、第6,299,869号、第6,300,475号、第6,323,006号、第6,350,589号、第5,705,363号、第5,738,845号、第5,789,551号、第6,117,423号、第6,174,996号、第5,540,923号、第5,541,293号、第5,541,312号、第5,554,513号、第5,593,667号，其以引用的方式并入本文中)以及其IFN类似物、IFN亚型、IFN模拟物、IFN片段、杂合IFN蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体和突变蛋白的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，而不管所述物质的生物活性如何，并且更不管其合成或制造方法(包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸产生)、合成、转基因和基因活化方法)如何。IFN的具体实例包括(但不限于)IFNγ-1b(Actimmune

)、IFNβ-1a(Avonex

和Rebif

)、IFNβ-1b(Betaseron)、复合干扰素(consensus IFN)、干扰素α-1(IFN alfacon-1，Infergen

)、IFNα-2(IntronA

)、IFNα-2a(Roferon-A)、聚乙二醇化干扰素α-2a(Pegasys

)、聚乙二醇化干扰素α-2b(PEG-Intron)、IFN类似物、IFN突变体、改变的糖基化人类IFN和PEG接合的IFN类似物。经修饰以表达内源人类IFN的细胞的具体实例描述于Devlin等人，J.Leukoc.Biol.41：306(1987)；美国专利第6,716,606号、第6,610,830号、第6,482,613号、第6,489,144号、第6,159,712号、第5,814,485号、第5,710,027号、第5,595,888号、第4,966,843号、第6,379,661号、第6,004,548号、第5,830,705号、第5,582,823号、第4,810,643号和第6,242,218号中，所述文献以引用的方式并入本文中。

术语“人类IFN(hIFN)”或“hIFN多肽”是指如上所述的干扰素或IFN，以及保留天然存在hIFN的至少一种生物活性的多肽。hIFN多肽包括天然存在人类IFN的医药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在人类IFN和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。hIFN多肽的实例包括(但不限于)以下专利中所述的hIFN多肽：美国专利第4,604,284号、第5,582,824号、第6,531,122号、第6,204,022号、第6,120,762号、第6,046,034号、第6,036,956号、第5,939,286号、第5,908,626号、第5,780,027号、第5,770,191号、第5,723,125号、第5,594,107号、第5,378,823号、第4,898,931号、第4,892,743号，其以引用的方式并入本文中。术语“hIFN多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或这两个末端包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)：例如，由缺乏分泌信号肽的hIFN的成熟形式或其部分重组表达所产生的使蛋氨酸与hIFN的N末端连接的蛋氨酰基IFN；出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。已知全长和成熟形式的天然存在hIFN核酸和氨基酸序列，也已知变异体，例如单氨基酸变异体或剪接变异体。

如本文中所用，“粒细胞集落刺激因子”或“G-CSF”应包括具有人类hG-CSF(例如以下专利中所述的G-CSF：美国专利第6,716,606号、第6,689,351号、第6,565,841号、第6,162,426号、第5,811,301号、第5,776,895号、第5,718,893号、第5,580,755号、第5,536,495号、第5,202,117号、第5,043,156号、第4,999,291号、第4,810,643号和第4,968,618号，其以引用的方式并入本文中)以及G-CSF类似物、G-CSF亚型、G-CSF模拟物、G-CSF片段、杂合G-CSF蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体和突变蛋白的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，而不管所述物质的生物活性如何，并且更不管其合成或制造方法(包括(但不限于)重组(由cDNA、基因组DNA、合成DNA或其它形式的核酸产生)、合成、转基因和基因活化方法)如何。G-CSF的具体实例包括(但不限于)培非格司亭(pegfilgrastim)(NEULASTA

)、非格司亭(filgrastim)(NEUPOGEN

)、G-CSF类似物、G-CSF突变体、改变的糖基化人类G-CSF和PEG接合的G-CSF类似物。经修饰以表达内源人类G-CSF的细胞系的具体实例描述于Devlin等人，J.Leukoc.Biol.41：306(1987)；美国专利第6,716,606号、第6,379,661号、第6,004,548号、第5,830,705号、第5,582,823号、第4,810,643号和第6,242,218号中，所述文献以引用的方式并入本文中。

术语“人类G-CSF(hG-CSF)”或“hG-CSF多肽”是指如上所述的粒细胞集落刺激因子或G-CSF，以及保留天然存在hG-CSF的至少一种生物活性的多肽。hG-CSF多肽包括天然存在人类G-CSF的医药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在人类G-CSF和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。hG-CSF多肽和模拟物的实例包括以下专利中所述的hG-CSF多肽和模拟物：美国专利第6,716,606号、第6,689,351号、第6,565,841号、第6,162,426号、第5,824,784号、第5,811,301号、第5,776,895号、第5,718,893号、第5,202,117号、第5,043,156号、第4,968,618号、第6,630,470号、第6,346,531号，其以引用的方式并入本文中。术语“hG-CSF多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或这两个末端包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)：例如，由缺乏分泌信号肽的hG-CSF的成熟形式重组表达所产生的使蛋氨酸与hG-CSF的N末端连接的蛋氨酰基G-CSF(例如SEQ ID NO：29的多肽)；出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。SEQ ID NO：29的位置1处的蛋氨酸置换hG-CSF的天然存在成熟形式中可见的丙氨酸。已知全长和成熟形式的天然存在hG-CSF核酸和氨基酸序列，也已知变异体，诸如单氨基酸变异体和剪接变异体。关于完整的全长天然存在hG-CSF氨基酸序列以及成熟的蛋氨酰基hG-CSF氨基酸序列以及剪接变异体，分别参看本文的SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29和SEQ IDNO：30。关于天然存在hG-CSF单氨基酸序列变异体，参看本文的SEQ ID NO：35和SEQID NO：36。在一些实施例中，本发明的hG-CSF多肽与SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：36实质上一致。还已知编码hG-CSF突变体和突变hG-CSF多肽的核酸分子。hG-CSF突变体的实例包括以下专利中所揭示的hG-CSF突变体：美国专利第6,489,293号、第6,153,407号、第6,048,971号、第5,614,184号、第5,416,195号、第5,399,345号和第5,457,089号，其以引用的方式并入本文中。

粒细胞集落刺激因子或hG-CSF具有多种生物活性，包括(但不限于)结合于其受体、引起其受体二聚、刺激中性粒细胞产生、和刺激细胞增殖和分化。粒细胞集落刺激因子和hG-CSF的一些生物活性的实例描述于上文和以下专利中：美国专利第6,676,947号、第6,579,525号、第6,531,121号、第6,521,245号、第6,489,293号、第6,368,854号、第6,316,254号、第6,268,336号、第6,239,109号、第6,165,283号、第5,986,047号、第5,830,851号、第5,043,156号和第5,773,569号，其以引用的方式并入本文中。

hG-CSF的生物活性片段/变异体包括(但不限于)含有207或204(缺失V66、S67和E68的剪接变异体)个氨基酸的基因产物，其中前30个氨基酸在分泌期间裂解(Nagata等人，Nature 319：415(1986)；Souza等人，Science 232：61(1986))。

如本文中所用，“促红细胞生成素”或“EPO”应包括具有EPO以及人类EPO(hEPO)、促红细胞生成素类似物、促红细胞生成素亚型(例如美国专利第5,856,298号中所述者，所述专利以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素模拟物(例如美国专利第6,310,078号中所述者，所述专利以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素片段、杂合促红细胞生成素蛋白、融合蛋白、寡聚物和多聚物、同源物、糖基化模式变异体和突变蛋白的至少一种生物活性的多肽和蛋白质，而不管所述物质的生物活性如何，并且更不管其合成或制造方法(包括(但不限于)重组(由cDNA或基因组DNA产生)、合成(美国专利第6,552,167号、第6,001,364号、第6,174,530号、第6,217,873号、第6,663,869号、第6,673,347号、WO 00/12587，以引用的方式并入本文中)、转基因和基因活化方法)如何。非人类EPO的具体实例包括(但不限于)牛科动物、犬科动物(美国专利第6,696,411号)、猫科动物、灵长类动物(美国专利第6,555,343号和第6,831,060号)、猪科动物和马科动物EPO。关于对包括马、猪、猫和羊在内的多种哺乳动物的EPO序列的分析，还参看Wen等人，″Erythropoietin structure-function relationships：high degree of sequence homology among mammals，″Blood，(1993)82：1507-1516，和Lin等人，″Monkey erythropoietin gene：cloning，expression and comparison with the human erythropoietin gene，″Gene，(1986)44(2-3)：201-9。所有引用均以引用的方式并入本文中。促红细胞生成素的具体实例包括(但不限于)阿法依伯汀(epoetin alfa)(例如美国专利第4,667,016号、第4,703,008号、第5,441,868号、第5,547,933号、第5,618,698号、第5,621,080号、第5,756,349号和第5,955,422号中所述者，所述专利以引用的方式并入本文中)、达依泊汀α(darbepepoetin alfa)(例如欧洲专利申请案EP640619中所述者)、DYNEPO^TM(依泊汀δ(epoetin delta))、人类促红细胞生成素类似物(例如国际专利申请案WO99/66054和美国专利第6,548,653号和第5,888,772号中所述的人类血清白蛋白融合蛋白，所述文献以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素突变体(例如国际专利申请案WO99/38890和美国专利第6,489,293号、第5,888,772号、第5,614,184号和第5,457,089号中所述者，所述文献以引用的方式并入本文中)、促红细胞生成素ω(其可由美国专利第5,688,679号、第6,099,830号、第6,316,254号和第6,682,910号中所述的人类促红细胞生成素基因的Apa I限制片段产生，所述文献以引用的方式并入本文中)、改变的糖基化人类促红细胞生成素(例如国际专利申请案WO99/11781和EP1064951中所述者)和PEG接合促红细胞生成素类似物(例如WO98/05363和美国专利第5,643,575号、第6,583,272号、第6,340,742号和第6,586,398号中所述者，所述文献以引用的方式并入本文中)。经修饰以表达内源人类促红细胞生成素的细胞系的具体实例描述于国际专利申请案WO99/05268和WO94/12650和美国专利第6,376,218号中，所述文献以引用的方式并入本文中。

术语“人类促红细胞生成素(hEPO)”或“hEPO多肽”是指如上所述的促红细胞生成素或EPO，以及保留天然存在hEPO的至少一种生物活性的多肽。hEPO多肽包括天然存在人类促红细胞生成素的医药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在人类促红细胞生成素和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。hEPO多肽和模拟物的实例包括以下专利中所述的hEPO多肽和模拟物：美国专利第6,310,078号、第5,106,954号、第6,703,480号、第6,642,353号、第5,986,047号和第5,712,370号，其以引用的方式并入本文中。术语“hEPO多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或这两个末端包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)：例如，使蛋氨酸与hEPO的N末端连接的蛋氨酰基促红细胞生成素；出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。已知天然存在hEPO核酸和氨基酸序列。关于完整的天然存在hEPO氨基酸序列以及成熟的天然存在hEPO氨基酸序列、和成熟EPO的变异体，分别参看本文的SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38和SEQ ID NO：39。在一些实施例中，本发明的hEPO多肽与SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：38或SEQ ID NO：39实质上一致。还已知编码hEPO突变体和突变hEPO多肽的核酸分子。hEPO突变体的实例包括以下专利中所揭示的hEPO突变体：美国专利第6,489,293号、第6,153,407号、第6,048,971号、第5,614,184号和第5,457,089号，其以引用的方式并入本文中。

促红细胞生成素或hEPO具有多种生物活性，包括(但不限于)结合于其受体、引起其受体二聚、刺激红细胞产生和刺激细胞增殖。促红细胞生成素和hEPO的一些生物活性的实例描述于美国专利第6,676,947号、第6,579,525号、第6,531,121号、第6,521,245号、第6,489,293号、第6,368,854号、第6,316,254号、第6,268,336号、第6,239,109号、第6,165,283号、第5,986,047号、第5,830,851号和第5,773,569号中，所述专利以引用的方式并入本文中。

多个参考文献揭示通过聚合物接合或糖基化对多肽进行修饰。术语“瘦素多肽”包括与例如PEG等聚合物接合的多肽，并且可包含一种或一种以上由半胱氨酸、赖氨酸或其它残基进行的其它衍生。另外，瘦素多肽可包含连接子或聚合物，其中与连接子或聚合物接合的氨基酸可为本发明的非天然氨基酸，或可利用所属领域中已知的技术(例如与赖氨酸或半胱氨酸偶合)使连接子或聚合物与天然编码氨基酸接合。

已报导瘦素多肽的聚合物接合，且K.G.Hofbauer的书Pharmacotherapy of Obesity， Options and Alternatives，(2004)的16.12章节中报导了许多使用PEG-OB蛋白质或瘦素的研究的综述。4HB多肽的聚合物接合的其它实例很丰富。参看例如美国专利第5,849,535号、第6,136,563号和第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。已报导天然IFNβ或其C17S变异体的聚合物修饰(EP 229108、美国专利第5,382,657号、EP 593868、美国专利第4,917,888号和WO 99/55377，其以引用的方式并入本文中)。美国专利第4,904,584号揭示聚乙二醇化的赖氨酸缺失多肽，其中至少一个赖氨酸残基已缺失或由任何其它氨基酸残基置换。WO 99/67291揭示一种使蛋白质与PEG接合的方法，其中蛋白质上的至少一个氨基酸残基已缺失并且在足以实现与蛋白质接合的条件下使蛋白质与PEG接触。WO 99/03887揭示属于生长激素超家族的多肽的聚乙二醇化变异体，其中半胱氨酸残基已由位于多肽指定区域中的非必需氨基酸残基取代。聚乙二醇化IFN分子的实例包括美国专利第6,524,570号、第6,250,469号、第6,180,096号、第6,177,074号、第6,042,822号、第5,981,709号、第5,951,974号、第5,908,621号、第5,738,846号、第5,711,944号、第5,382,657号中所揭示者，这些专利以引用的方式并入本文中。提及IFNβ为属于生长激素超家族的多肽的一个实例。WO 00/23114揭示糖基化和聚乙二醇化的IFNβ。WO 00/23472揭示IFNβ融合蛋白。WO 00/26354揭示一种制备具有降低的变应原性的糖基化多肽变异体的方法，所述变异体与相应母体多肽相比包含至少一个其它糖基化位点。美国专利第5,218,092号揭示对粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和其它多肽的修饰，以与天然多肽相比引入至少一个其它碳水化合物链。揭示IFNβ为许多可根据美国专利第5,218,092号中所描述的技术加以修饰的多肽的一个实例。

术语“瘦素多肽”也包括多肽的N连接或O连接糖基化形式。这些形式包括(但不限于)SEQ ID NO：2中可见的氨基酸序列上任何位置或SEQ ID NO：1的等效位置或SEQ ID NO：4中可见的氨基酸序列上任何位置或SEQ ID NO：3的等效位置处具有O连接糖基化位点的多肽。术语“瘦素多肽”还包括多肽的糖基化形式，包括(但不限于)SEQ ID NO：2中可见的氨基酸序列上任何位置或SEQ ID NO：1的等效位置或SEQ IDNO：4中可见的氨基酸序列上任何位置或SEQ ID NO：3的等效位置处具有O连接糖基化位点的多肽。含单一核苷酸变化的变异体也被视为瘦素多肽的生物活性变异体。另外，也包括剪接变异体。术语“瘦素多肽”也包括由化学方式连接或以融合蛋白形式表达的任何一种或一种以上瘦素多肽或任何其它多肽、蛋白质、碳水化合物、聚合物、小分子、配体或任何类型的其它活性分子的瘦素多肽异质二聚物、同型二聚物、异质多聚物或同型多聚物，以及含有例如特定缺失或其它修饰但仍保持生物活性的多肽类似物。术语“瘦素多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或这两个末端包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)：例如，由缺乏分泌信号肽的瘦素的成熟形式或其部分重组表达所产生的使蛋氨酸与瘦素的N末端连接的蛋氨酰基瘦素(SEQ ID NO：4)；出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。已知全长和成熟形式的天然存在瘦素核酸和氨基酸序列。含单一核苷酸变化的变异体也被视为瘦素的生物活性变异体。

所属领域的技术人员应了解，在任何其它瘦素分子(例如瘦素融合体、变异体、片段等)中可容易地鉴别对应于SEQ ID NO：2、4或任何其它瘦素序列中的位置的氨基酸位置。举例来说，可使用例如BLAST等序列比对程序来比对并鉴别与SEQ ID NO：2、4或其它瘦素序列中的位置一致的特定蛋白质位置。本文中关于SEQ ID NO：2或4或其它瘦素序列所述的氨基酸取代、缺失或添加也打算指代本文中所述或所属领域中已知的瘦素融合体、变异体、片段等的相应位置中的取代、缺失或添加，并且由本发明明确涵盖。瘦素多肽可包含分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)原核生物分泌信号序列、真核生物分泌信号序列、为进行细菌表达而优化5′的真核生物分泌信号序列、新颖分泌信号序列、果胶裂解酶分泌信号序列、Omp A分泌信号序列和噬菌体分泌信号序列。分泌信号序列的实例包括(但不限于)STII(原核生物)、Fd GIII和M13(噬菌体)、Bgl2(酵母)和源自转座子的信号序列bla。

术语“瘦素多肽”涵盖包含一个或一个以上氨基酸取代、添加或缺失的瘦素多肽。本发明的瘦素多肽可包含一个或一个以上天然氨基酸修饰以及一个或一个以上非天然氨基酸修饰。已描述在天然存在瘦素多肽中的多个氨基酸位置中的例示性取代，其包括(但不限于)调节瘦素多肽的一种或一种以上生物活性(例如(但不限于)增加激动剂活性、增加多肽溶解性、将多肽转化成拮抗剂等)的取代，并且术语“瘦素多肽”涵盖所述取代。术语“瘦素多肽”还包括天然存在瘦素的医药学上可接受的盐和前药，以及盐的前药、多晶型物、水合物、溶剂化物、生物活性片段、生物活性变异体和立体异构体，以及天然存在瘦素和其多肽融合体的激动剂、模拟物和拮抗剂变异体。术语“瘦素多肽”涵盖在氨基末端、羧基末端或这两个末端包含其它氨基酸的融合体。例示性融合体包括(但不限于)：例如，由重组表达所产生的使蛋氨酸与瘦素的N末端连接的蛋氨酰基生长激素；出于纯化目的而形成的融合体(包括(但不限于)与聚组氨酸或亲和性抗原决定基融合)；与血清白蛋白结合肽形成的融合体；和与血清蛋白(例如血清白蛋白)形成的融合体。

SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的1-3(N末端)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-146(C末端)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区中的任何位置，所述区对应于瘦素中的二级结构，如下：SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸的1-4(N末端)、5-27(A螺旋)、28-51(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、52-68(B螺旋)、69-71(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、72-94(C螺旋)、95-121(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、122-143(D螺旋)、144-148(C末端)。

在一些实施例中，瘦素拮抗剂包含至少一个位于SEQ ID NO：2的以下区中的取代：1-3(N末端)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-146(C末端)，或至少一个位于SEQ ID NO：4的以下区中的取代：1-4(N末端)、5-27(A螺旋)、28-51(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、52-68(B螺旋)、69-71(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、72-94(C螺旋)、95-121(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、122-143(D螺旋)、144-148(C末端)，这些取代使瘦素充当拮抗剂。在其它实施例中，瘦素多肽中并入非天然编码氨基酸的例示性位点包括螺旋A的氨基末端区和螺旋C的一部分内的残基。在另一实施例中，SEQ ID NO：2的氨基酸位置120和/或121处的取代或SEQ ID NO：4的氨基酸位置121和/或122处的取代是非天然编码氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代。在其它实施例中，以上所列的取代与使瘦素多肽成为瘦素拮抗剂的其它取代组合。在一些实施例中，瘦素拮抗剂包含与存在于瘦素分子的受体结合区中的水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。

在一些实施例中，瘦素多肽进一步包含调节瘦素多肽的生物活性的添加、取代或缺失。举例来说，添加、取代或缺失可调节对瘦素多肽受体的亲和性，调节(包括(但不限于)增加或降低)受体二聚，稳定受体二聚物，调节循环半衰期，调节治疗半衰期，调节多肽的稳定性，调节剂量，调节释放或生物可用性，促进纯化，或改良或改变特定投药途径。类似地，瘦素多肽可包含蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或改良多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特性的连接分子(包括(但不限于)生物素)。

术语“瘦素多肽”也涵盖所连接的同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物和异质多聚物，包括(但不限于)通过非天然编码氨基酸侧链与相同或不同的非天然编码氨基酸侧链、与天然编码氨基酸侧链直接连接或通过连接子间接连接者。例示性连接子包括(但不限于)水溶性聚合物(例如聚(乙二醇)或葡萄聚糖)或多肽。

“非天然编码氨基酸”是指并非20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸或硒代半胱氨酸中的一种的氨基酸。可与术语“非天然编码氨基酸”同义使用的其它术语为“非天然氨基酸”、“非天然存在氨基酸”。术语“非天然编码氨基酸”也包括(但不限于)通过修饰(例如翻译后修饰)天然编码氨基酸(包括(但不限于)20种常见氨基酸或吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸)而存在，但本身无法通过翻译复合物天然并入正在生长的多肽链中的氨基酸。这些非天然存在氨基酸的实例包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基葡糖胺基-L-苏氨酸以及O-磷酸酪氨酸。

“氨基末端修饰基”是指可与多肽的氨基末端连接的任何分子。类似地，“羧基末端修饰基”是指可与多肽的羧基末端连接的任何分子。末端修饰基包括(但不限于)各种水溶性聚合物、肽或蛋白质(例如血清白蛋白)，或增加肽的血清半衰期的其它部分。

术语“官能团”、“活性部分”、“活化基团”、“离去基”、“反应性位点”、“化学反应性基团”和“化学反应部分”在所属领域和本文中是用于指代分子中独特的可限定部分或单元。这些术语在化学领域中在一定程度上同义，并且在本文中是用于指示执行某种功能或活性并可与其它分子反应的分子部分。

术语“键联”或“连接子”在本文中用于指通常由于化学反应而形成并且通常为共价键联的基团或键。水解稳定键联意思是所述键联在水中实质上稳定并且在适用的pH值下(包括(但不限于)在生理条件下)长时间(或许甚至无限期)不与水反应。水解不稳定或可降解的键联意思是所述键联可在水或水溶液(包括例如血液)中降解。酶促不稳定或可降解的键联意思是所述键联可由一种或一种以上酶降解。所属领域中应了解，PEG和相关聚合物在聚合物主链中或在聚合物主链与聚合物分子的一个或一个以上末端官能团之间的连接基团中可包括可降解键联。举例来说，由PEG羧酸或活化PEG羧酸与生物活性剂上的醇基反应所形成的酯键联通常在生理条件下水解以释放所述生物活性剂。其它水解可降解的键联包括(但不限于)碳酸酯键联；由胺与醛反应所产生的亚胺键联；由醇与磷酸酯基反应所形成的磷酸酯键联；作为酰肼与醛的反应产物的腙键联；作为醛与醇的反应产物的缩醛键联；作为甲酸盐与醇的反应产物的原酸酯键联；由包括(但不限于)例如PEG等聚合物的末端的胺基与肽的羧基形成的肽键联；以及由包括(但不限于)聚合物末端的亚磷酰胺(phosphoramidite)基与寡核苷酸的5′羟基形成的寡核苷酸键联。

术语“生物活性分子”、“生物活性部分”或“生物活性剂”在用于本文中时意思是可影响生物体(包括(但不限于)病毒、细菌、真菌、植物、动物以及人类)的任何物理或生物化学性质的任何物质。具体来说，如本文中所用的生物活性分子包括(但不限于)打算用于诊断、治愈、缓解、治疗或预防人类或其它动物的疾病或用于以其它方式增强人类或动物的身体或精神健康状况的任何物质。生物活性分子的实例包括(但不限于)肽、蛋白质、酶、小分子药物、染料、脂质、核苷、寡核苷酸、细胞、病毒、脂质体、微粒和胶束。适用于本发明的生物活性剂的种类包括(但不限于)抗生素、杀真菌剂、抗病毒剂、消炎药、抗肿瘤药、心血管药、抗焦虑药、激素、生长因子、类固醇药等。

“双官能聚合物”是指包含两个能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键联的不连续官能团的聚合物。具有一个可与特定生物活性组分上的基团反应的官能团和另一个可与第二生物组分上的基团反应的基团的双官能连接子可用于形成包括第一生物活性组分、双官能连接子以及第二生物活性组分的接合物。已知使各种化合物与肽连接的众多程序和连接分子。例如，参看欧洲专利公开案第188,256号、美国专利第4,671,958号、第4,659,839号、第4,414,148号、第4,699,784号、第4,680,338号、第4,569,789号和第4,589,071号，其以引用的方式并入本文中。“多官能聚合物”是指包含两个或两个以上能够与其它部分(包括(但不限于)氨基酸侧基)特异性反应以形成共价或非共价键联的不连续官能团的聚合物。

当由从左向右书写的常规化学式表示取代基时，同样涵盖由从右向左书写的结构得到的化学上相同的取代基，例如，结构-CH₂O-等同于结构-OCH₂-。

术语“取代基”包括(但不限于)“无干扰取代基”。“无干扰取代基”为产生稳定化合物的基团。合适的无干扰取代基或基团包括(但不限于)卤基、C₁-C₁₀烷基、C₂-C₁₀烯基、C₂-C₁₀炔基、C₁-C₁₀烷氧基、C₁-C₁₂芳烷基、C₁-C₁₂烷芳基、C₃-C₁₂环烷基、C₃-C₁₂环烯基、苯基、经取代苯基、甲苯酰基、二甲苯基、联苯基、C₂-C₁₂烷氧基烷基、C₂-C₁₂烷氧基芳基、C₇-C₁₂芳氧基烷基、C₇-C₁₂氧基芳基、C₁-C₆烷基亚磺酰基、C₁-C₁₀烷基磺酰基、--(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀烷基)(其中m为1到8)、芳基、经取代芳基、经取代烷氧基、氟烷基、杂环基、经取代杂环基、硝基烷基、--NO₂、--CN、--NRC(O)--(C₁-C₁₀烷基)、--C(O)--(C₁-C₁₀烷基)、C₂-C₁₀烷基硫烷基、--C(O)O--(C₁-C₁₀烷基)、--OH、--SO₂、＝S、--COOH、--NR₂、羰基、--C(O)--(C₁-C₁₀烷基)-CF3、--C(O)--CF3、--C(O)NR2、--(C₁-C₁₀芳基)-S--(C₆-C₁₀芳基)、--C(O)--(C₁-C₁₀芳基)、--(CH₂)_m--O--(--(CH₂)_m--O--(C₁-C₁₀烷基)(其中各m为1到8)、--C(O)NR₂、--C(S)NR₂、--SO₂NR₂、--NRC(O)NR₂、--NRC(S)NR₂、其盐等。如本文中所用，各R为H、烷基或经取代烷基、芳基或经取代芳基、芳烷基或烷芳基。

术语“卤素”包括氟、氯、碘和溴。

除非另外说明，否则术语“烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是直链或支链或环状烃基或其组合，其可为完全饱和、单不饱和或多不饱和的并且可包括具有指定碳原子数目(即C₁-C₁₀意思是1到10个碳)的二价基团和多价基团。饱和烃基的实例包括(但不限于)以下基团，例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、异丁基、仲丁基、环己基、(环己基)甲基、环丙基甲基；(例如)正戊基、正己基、正庚基、正辛基等的同系物和异构体。不饱和烷基为具有一个或一个以上双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括(但不限于)乙烯基、2-丙烯基、巴豆基、2-异戊烯基、2-(丁二烯基)、2，4-戊二烯基、3-(1，4-戊二烯基)、乙炔基、1-丙炔基和3-丙炔基、3-丁炔基以及高级同系物和异构体。除非另外说明，否则术语“烷基”还打算包括下文更详细定义的烷基的衍生物，例如“杂烷基”。只限于烃基的烷基被称作“同系烷基(homoalkyl)”。

术语“亚烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由烷烃衍生的二价基团，例如(但不限于)结构-CH₂CH₂-和-CH₂CH₂CH₂CH₂-，并且进一步包括下文描述为“亚杂烷基”的基团。通常，烷基(或亚烷基)将具有1到24个碳原子，其中具有10个或10个以下碳原子的基团在本发明中为优选的。“低碳烷基”或“低碳亚烷基”为通常具有8个或8个以下碳原子的较短链烷基或亚烷基。

术语“烷氧基”、“烷基氨基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)是以其常规意义使用，并且是指分别通过氧原子、氨基或硫原子与分子的其余部分连接的烷基。

除非另外说明，否则术语“杂烷基”本身或与另一术语组合时意思是由指定数目的碳原子以及至少一个选自由O、N、Si和S组成的群组的杂原子组成的稳定直链或支链或环状烃基或其组合，并且其中氮和硫原子可任选地经氧化且氮杂原子可任选地经季铵化。杂原子O、N和S以及Si可位于杂烷基的任何内部位置或位于烷基与分子的其余部分连接的位置。实例包括(但不限于)-CH₂-CH₂-O-CH₃、-CH₂-CH₂-NH-CH₃、-CH₂-CH₂-N(CH₃)-CH₃、-CH₂-S-CH₂-CH₃、-CH₂-CH₂，-S(O)-CH₃、-CH₂-CH₂-S(O)₂-CH₃、-CH＝CH-O-CH₃、-Si(CH₃)₃、-CH₂-CH＝N-OCH₃和-CH＝CH-N(CH₃)-CH₃。至多两个杂原子可相邻，例如-CH₂-NH-OCH₃和-CH₂-O-Si(CH₃)₃。类似地，术语“亚杂烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由杂烷基衍生的二价基团，例如(但不限于)-CH₂-CH₂-S-CH₂-CH₂-和-CH₂-S-CH₂-CH₂-NH-CH₂-。对于亚杂烷基来说，相同或不同的杂原子也可占据链的一端或两端(包括(但不限于)亚烷基氧基、亚烷基二氧基、亚烷基氨基、亚烷基二氨基、氨氧基亚烷基等)。此外，对于亚烷基和亚杂烷基连接基团来说，连接基团的化学式所书写的方向并不表示连接基团的定向。举例来说，式-C(O)₂R′-表示-C(O)₂R′-与-R′C(O)₂-。

除非另外说明，否则术语“环烷基”和“杂环烷基”本身或与其它术语组合时分别表示“烷基”和“杂烷基”的环状形式。因此，环烷基或杂环烷基包括饱和与不饱和的环键联。另外，对于杂环烷基来说，杂原子可占据杂环与分子的其余部分连接的位置。环烷基的实例包括(但不限于)环戊基、环己基、1-环己烯基、3-环己烯基、环庚基等。杂环烷基的实例包括(但不限于)1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)、1-哌啶基、2-哌啶基、3-哌啶基、4-吗啉基、3-吗啉基、四氢呋喃-2-基、四氢呋喃-3-基、四氢噻吩-2-基、四氢噻吩-3-基、1-哌嗪基、2-哌嗪基等。另外，所述术语涵盖双环和三环结构。类似地，术语“亚杂环烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由杂环烷基衍生的二价基团，并且术语“亚环烷基”本身或作为另一取代基的一部分时意思是由环烷基衍生的二价基团。

如本文中所用，术语“水溶性聚合物”是指可溶于水性溶剂中的任何聚合物。水溶性聚合物与瘦素多肽的连接可产生以下改变，包括(但不限于)相对于未经修饰形式有所增加或经调节的血清半衰期或者有所增加或经调节的治疗半衰期、经调节的免疫原性、经调节的物理缔合特性(例如聚集和多聚物形成)、改变的受体结合和改变的受体二聚或多聚。水溶性聚合物可能具有或可能不具有其本身的生物活性。合适的聚合物包括(但不限于)聚乙二醇、聚乙二醇丙醛、其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(描述于美国专利第5,252,714号中，所述专利以引用的方式并入本文中)、单甲氧基-聚乙二醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙烯醇、聚氨基酸、二乙烯醚马来酸酐、N-(2-羟基丙基)-甲基丙烯酰胺、葡聚糖、葡聚糖衍生物(包括硫酸葡聚糖)、聚丙二醇、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯化多元醇、肝素、肝素片段、多糖、寡糖、聚糖(glycan)、纤维素和纤维素衍生物(包括(但不限于)甲基纤维素和羧甲基纤维素)、淀粉和淀粉衍生物、多肽、聚烷二醇和其衍生物、聚烷二醇和其衍生物的共聚物、聚乙烯基乙醚以及α-β-聚[(2-羟基乙基)-DL-天冬酰胺等，或其混合物。所述水溶性聚合物的实例包括(但不限于)聚乙二醇和血清白蛋白。

如本文中所用，术语“聚烷二醇”或“聚(烷二醇)”是指聚乙二醇(聚(乙二醇))、聚丙二醇、聚丁二醇和其衍生物。术语“聚烷二醇”涵盖线性和支化聚合物且平均分子量介于0.1kDa与100kDa之间。其它例示性实施例列于例如商业供应商目录中，例如Shearwater Corporation的目录“Polyethylene Glycol and Derivatives for Biomedical Applications”(2001)。

除非另外说明，否则术语“芳基”意思是可为单环或稠合在一起或共价连接的多个环(优选1到3个环)的多不饱和芳香族烃取代基。术语“杂芳基”是指含有1到4个选自N、O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮和硫原子任选地经氧化，并且氮原子任选地经季铵化。杂芳基可通过杂原子与分子的其余部分连接。芳基和杂芳基的非限制性实例包括苯基、1-萘基、2-萘基、4-联苯基、1-吡咯基、2-吡咯基、3-吡咯基、3-吡唑基、2-咪唑基、4-咪唑基、吡嗪基、2-噁唑基、4-噁唑基、2-苯基-4-噁唑基、5-噁唑基、3-异噁唑基、4-异噁唑基、5-异噁唑基、2-噻唑基、4-噻唑基、5-噻唑基、2-呋喃基、3-呋喃基、2-噻吩基、3-噻吩基、2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-苯并噻唑基、嘌呤基、2-苯并咪唑基、5-吲哚基、1-异喹啉基、5-异喹啉基、2-喹喔啉基、5-喹喔啉基、3-喹啉基和6-喹啉基。上述芳基和杂芳基环系统中的每一者的取代基都选自下文所述的可接受取代基的群组。

为了简便起见，当与其它术语组合使用时(包括(但不限于)芳氧基、芳基硫氧基、芳基烷基)，术语“芳基”包括如上文所定义的芳基与杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”打算包括芳基与烷基连接的基团(包括(但不限于)苄基、苯乙基、吡啶基甲基等)，所述烷基包括碳原子(包括(但不限于)亚甲基)已经例如氧原子置换的烷基(包括(但不限于)苯氧基甲基、2-吡啶基氧基甲基、3-(1-萘基氧基)丙基等)。

以上术语(包括(但不限于)“烷基”、“杂烷基”、“芳基”以及“杂芳基”)各自打算包括指定基团的经取代与未经取代形式。各类型基团的例示性取代基提供如下。

烷基和杂烷基(包括通常称作亚烷基、烯基、亚杂烷基、杂烯基、炔基、环烷基、杂环烷基、环烯基以及杂环烯基的基团)的取代基可为选自(但不限于)以下的多种基团中的一者或一者以上：-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO₂R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-NRSO₂R′、-CN以及-NO₂，其数目在0到(2m′+1)的范围内，其中m′为此类基团中碳原子的总数。R′、R″、R″′和R″″各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R′和R″与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

与对于烷基所述的取代基类似，芳基和杂芳基的取代基存在改变且选自(但不限于)：卤素、-OR′、＝O、＝NR′、＝N-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-SiR′R″R″′、-OC(O)R′、-C(O)R′、-CO₂R′、-CONR′R″、-OC(O)NR′R″、-NR″C(O)R′、-NR′-C(O)NR″R″′、-NR″C(O)₂R′、-NR-C(NR′R″R″′)＝NR″″、-NR-C(NR′R″)＝NR″′、-S(O)R′、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-NRSO₂R′、-CN和-NO₂、-R′、-N₃、-CH(Ph)₂、氟(C₁-C₄)烷氧基和氟(C₁-C₄)烷基，其数目在0到芳环系统上开放价态的总数的范围内；并且其中R′、R″、R″′和R″″独立地选自氢、烷基、杂烷基、芳基和杂芳基。举例来说，当本发明化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。

如本文中所用，术语“经调节的血清半衰期”意思是经修饰生物活性分子的循环半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。通过在投予生物活性分子后的各个时间点取血样并测定每一样品中所述分子的浓度来测量血清半衰期。血清浓度与时间的相关性允许计算血清半衰期。血清半衰期的增加理想地为至少约两倍，但例如当较小增加能够促成令人满意的给药方案或避免毒性作用时，较小增加也可适用。在一些实施例中，所述增加为至少约3倍、至少约5倍或至少约10倍。

如本文中所用，术语“经调节的治疗半衰期”意思是治疗有效量的经修饰生物活性分子的半衰期相对于其未经修饰形式的正变化或负变化。通过在投予后的各个时间点测量分子的药物动力学和/或药效学性质来测量治疗半衰期。增加的治疗半衰期理想地能够促成特定有益的给药方案、特定有益的总剂量或避免不需要的作用。在一些实施例中，增加的治疗半衰期是由效力增加、经修饰分子与其标靶的结合增加或降低或者未经修饰分子的另一参数或作用机制增加或降低引起。

当应用于核酸或蛋白质时，术语“分离”表示所述核酸或蛋白质实质上不含其在天然状态下缔合的其它细胞组分。其可为均质状态。分离物质可为干燥或半干燥状态，或为溶液(包括(但不限于)水溶液)形式。通常使用例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱等分析化学技术来测定纯度和均质性。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质实质上已经纯化。具体来说，经分离基因是从侧接所述基因并编码除所关注基因之外的蛋白质的开放阅读框分离。术语“经纯化”表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中产生实质上一个条带。具体来说，其意思是核酸或蛋白质为至少85％纯、至少90％纯、至少95％纯、至少99％纯或更纯。

术语“核酸”是指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸以及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述核酸具有与参考核酸相似的结合性质并且是以类似于天然存在核苷酸的方式代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也是指寡核苷酸类似物，包括PNA(肽核酸)、反义技术中使用的DNA类似物(硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等)。除非另外说明，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指示的序列。具体来说，可通过产生一个或一个以上所选(或所有)密码子的第三位置是经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol et al.(1992)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用来指代氨基酸残基的聚合物。也就是说，针对多肽的描述同样适用于对肽的描述以及对蛋白质的描述，并且反之亦然。所述术语适用于天然存在氨基酸聚合物以及一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，包括全长蛋白质(即，抗原)，其中氨基酸残基是通过共价肽键连接。

术语“氨基酸”是指天然存在和非天然存在氨基酸，以及以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然编码氨基酸为20种常见氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)以及吡咯赖氨酸和硒代半胱氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构(即，与氢、羧基、氨基和R基团结合的α碳)的化合物，例如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍。所述类似物具有经修饰R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰肽主链，但仍保持与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。

在本文中，氨基酸可由其通常已知的三字母符号或由IUPAC-IUB生物化学命名委员会(IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission)推荐的单字母符号来指代。同样，核苷酸可由其公认的单字母代码来指代。

“保守性修饰变异体”适用于氨基酸与核酸序列。对于特定核酸序列来说，“保守性修饰变异体”是指编码一致或基本上一致的氨基酸序列的核酸，或当核酸不编码氨基酸序列时是指基本上一致的序列。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任何既定蛋白质。举例来说，密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一位置处，密码子可改变为所述相应密码子中的任一者而不会改变所编码的多肽。所述核酸变异为“沉默变异(silent variation)”，其为保守性修饰变异中的一种。本文中编码多肽的每一核酸序列也描述核酸的每一种可能的沉默变异。技术人员应认识到，核酸中的各密码子(除AUG和TGG之外，AUG通常为蛋氨酸的唯一密码子，而TGG通常为色氨酸的唯一密码子)都可经修饰以产生功能相同的分子。因此，编码多肽的核酸的各沉默变异都隐含在各所述序列中。

关于氨基酸序列，技术人员应认识到，改变、添加或缺失所编码序列中的单一氨基酸或少量氨基酸的对核酸、肽、多肽或蛋白质序列的个别取代、缺失或添加为“保守性修饰变异体”，其中所述改变将导致氨基酸经化学上类似的氨基酸取代。所属领域中熟知提供功能类似氨基酸的保守性取代表。所述保守性修饰变异体除为多态变异体之外(并且不排除这些变异体)，还为种间同源物和本发明的等位基因。

以下八组各自含有彼此为保守性取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)、甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)；

3)天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)、赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、蛋氨酸(M)、缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)、苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)、蛋氨酸(M)

(例如参看Creighton，Proteins：Structures and Molecular Properties(W H Freeman &Co.；第2版(1993年12月))。

在两个或两个以上核酸或多肽序列的情形中，术语“一致”或“一致性”百分比是指相同的两个或两个以上序列或子序列。当通过比较窗比较和比对最大对应性时，或如使用下列序列比较算法中的一种或通过手工比对和目测检查来测量指定区域时，如果序列具有相同(即，在指定区域上具有约60％一致性，任选地约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％或约95％一致性)的氨基酸残基或核苷酸百分比，那么所述序列为“实质上一致”的。此定义也是指测试序列的互补序列。一致性可存在于长度为至少约50个氨基酸或核苷酸的区域上，或长度为75-100个氨基酸或核苷酸的区域上，或在未指定时可存在于整个序列或多核苷酸或多肽上。

对于序列比较来说，通常一个序列充当与测试序列相比较的参考序列。在使用序列比较算法时，将测试序列与参考序列输入计算机中，必要时指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，或可指定替代参数。随后，序列比较算法根据程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

如本文中所用，“比较窗”包括参考具有选自由20到600、通常约50到约200、更通常约100到约150组成的群组的连续位置数中的任一者的区段，其中可在将序列与具有相同数目的连续位置的参考序列最佳比对后对两个序列进行比较。所属领域中熟知用于比较的序列比对方法。可通过以下方法进行用于比较的最佳序列比对，所述方法包括(但不限于)Smith和Waterman(1970)Adv.Appl.Math.2：482c的局部同源算法；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443的同源比对算法；搜索Pearson和Lipman(1988)Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 85：2444的相似方法；这些算法的计算机化实施(Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，WI中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA)；或手工比对和目测检查(例如参看Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995年增刊))。

适用于测定序列一致性百分比和序列相似性百分比的算法的一个实例为BLAST和BLAST 2.0算法，其分别描述于Altschul等人，(1977)Nuc.Acids Res.25：3389-3402和Altschul等人，(1990)J.Mol.Biol.215：403-410中。用于进行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)公开获得。BLAST算法参数W、T和X将决定比对的灵敏性和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列来说)使用字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两个股的比较作为默认值。对于氨基酸序列来说，BLASTP程序使用字长3和期望值(E)10以及BLOSUM62得分矩阵(参看Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)比对数(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4以及两个股的比较作为默认值。通常在“低复杂性”过滤器关闭的情况下进行BLAST算法。

BLAST算法也进行两个序列之间相似性的统计学分析(例如参看Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5787)。由BLAST算法提供的相似性的一个量度为最小和概率(smallest sum probability，P(N))，其提供关于两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然会发生匹配的概率的指标。举例来说，如果在测试核酸与参考核酸的比较中最小和概率小于约0.2、更优选小于约0.01，且最优选小于约0.001，那么认为所述核酸与参考序列相似。

短语“与…选择性(或特异性)杂交”是指当复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中存在特定核苷酸序列时，在严格杂交条件下分子仅与所述序列结合、双联或杂交。

短语“严格杂交条件”是指所属领域中已知的低离子强度和高温条件。通常，在严格条件下，探针会与其在核酸的复杂混合物(包括(但不限于)总细胞或文库DNA或RNA)中的标靶子序列杂交，但不与复杂混合物中的其它序列杂交。严格条件具有序列依赖性并且在不同环境下会不同。较长序列在较高温度下特异性杂交。对核酸杂交的广泛指导可见于Tijssen，Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays″(1993)中。通常，选择严格条件为在规定离子强度、pH值下比特异性序列的热力学熔点(T_m)低约5℃-10℃。T_m为与标靶互补的探针的50％与标靶序列杂交处于平衡(因为标靶序列过量存在，在T_m下，在平衡时占据50％的探针)时的温度(在规定离子强度、pH值以及核酸浓度下)。严格条件可为在pH值为7.0到8.3下盐浓度小于约1.0M钠离子、通常约0.01M到1.0M钠离子浓度(或其它盐)且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)来说为至少约30℃且对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)来说为至少约60℃的条件。也可通过添加例如甲酰胺等去稳定剂来实现严格条件。对于选择性或特异性杂交来说，阳性信号可为至少两倍背景、任选地10倍背景杂交。例示性严格杂交条件可如下：50％甲酰胺、5×SSC和1％SDS，在42℃下培育；或5×SSC、1％SDS，在65℃下培育，其中在65℃下在0.2×SSC和0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

如本文中所用，术语“真核生物”是指属于系统发育域(phylogenetic domain)真核域(Eucarya)的生物体，例如动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、爬行动物、鸟类等)、纤毛虫、植物(包括(但不限于)单子叶植物、双子叶植物、藻类等)、真菌、酵母、鞭毛虫、微孢子虫、原生生物等。

如本文中所用，术语“非真核生物”是指非真核生物体。举例来说，非真核生物体可属于真细菌(Eubacteria)(包括(但不限于)大肠杆菌、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)等)系统发育域，或古生菌(Archaea)(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、嗜热自养甲烷杆菌(Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜盐菌(Halobacterium)(例如沃氏嗜盐富饶菌(Haloferax volcanii)和嗜盐菌种NRC-1)、超嗜热古菌(Archaeoglobus fulgidus)、强烈炽热球菌(Pyrococcus furiosus)、极端嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)、嗜热泉生古细菌(Aeuropyrum pernix)等)系统发育域。

如本文中所用，术语“个体”是指动物，优选为哺乳动物，最优选为人类，其为治疗、观察或实验的对象。

如本文中所用，术语“有效量”是指所投予的(经修饰)非天然氨基酸多肽的量，所述量会在一定程度上减轻所治疗的疾病、病状或病症的一种或一种以上症状。可投予含有本文中所述的(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物来进行预防性、增强性和/或治疗性处理。

术语“增强”意思是增加或延长所需作用的效力或持续时间。因此，对于增强治疗剂的作用来说，术语“增强”是指增加或延长其它治疗剂对系统的作用的效力或持续时间的能力。如本文中所用，“增强有效量”是指足以增强另一治疗剂在所需系统中的作用的量。当用于患者中时，关于此用途有效的量将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。

如本文中所用，术语“经修饰”是指多肽上存在翻译后修饰。形式“(经修饰)”术语意思是所讨论的多肽任选地经修饰，也就是说，所讨论的多肽可经修饰或未经修饰。

术语“翻译后修饰”和“经修饰”是指在天然或非天然氨基酸已并入多肽链中之后相对所述氨基酸发生的任何修饰。仅举例来说，所述术语涵盖共翻译活体内修饰、翻译后活体内修饰以及翻译后活体外修饰。

在预防应用中，将含有(经修饰)非天然氨基酸多肽的组合物投予易患特定疾病、病症或病状或者处于患特定疾病、病症或病状的风险中的患者。所述量是定义为“预防有效量”。在这一用途中，精确量也视患者的健康状况、体重等而定。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述预防有效量完全在所属领域的技能范围内。

术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在特定反应条件下发生反应的“保护基”或部分。保护基将视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团为胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苄基或例如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本文中所述的方法和组合物中或与所述方法和组合物一起使用。

仅举例来说，封端/保护基团可选自：

其它保护基描述于Greene和Wuts，Protective Groups in Organic Synthesis，第3版，John Wiley & Sons，New York，NY，1999中，所述文献是以全文引用的方式并入本文中。

在治疗应用中，将足以治愈或至少部分抑制疾病、病症或病状的症状的量的含有经修饰非天然氨基酸多肽的组合物投予已罹患所述疾病、病状或病症的患者。所述量是定义为“治疗有效量”，且将视以下因素而定：疾病、病症或病状的严重性和病程、先前疗法、患者的健康状况和对药物的反应以及主治医师的判断。认为通过常规实验(例如，剂量递增临床试验)确定所述治疗有效量完全在所属领域的技能范围内。

体重指数(Body mass index，“BMI”)也称为克托莱数值(Quetelet number)或克托莱指数(Quetelet index)，是目前最广泛接受的关于人类过量体脂肪的计算。由Adolphe Quetelet开发，BMI通过将个体的体重除以他/她的身高的平方来进行计算(BMI＝W/h²)。在国际单位制(SI)单位中，BMI通常以kg/m²表示；在英制单位中，BMI通常以lb/in²表示。举例来说，重75千克并且身高1.8米的人的BMI将为75/(1.82)＝23.148，且因此将不需要减轻体重。然而，重100千克并且身高1.8米的人的BMI将为100/(1.8)²＝30.864，且因此将在“肥胖”范围内，且因此需要减轻体重。

本发明方法可用于治疗BMI高于推荐体重指数(即，至少在“过重”范围内或至少在“肥胖”范围内)的人类。在一个实施例中，当人类个体的BMI为25或25以上时，认为他或她需要减轻体重。在其它实施例中，出于治疗体重指数为至少约25、25以上、至少约30或30以上的人类的目的，可使用本发明方法。

如本文中所用，术语“肥胖”是指哺乳动物高于其理想体重至少20％。在另一实施例中，当人类个体的体重指数(BMI)为约30或30以上时，他或她是肥胖的。在任何所揭示方法的另一实施例中，肥胖个体的BMI在约30与约35之间。或者，肥胖个体的BMI为约35或35以上。认为腰围(waist measurement)超过40英寸的男性存在风险。腰围为35英寸或35英寸以上的女性存在风险。

如本文中所用，术语“肥胖症”打算涵盖上文所有关于肥胖的定义。

肥胖诱发或肥胖相关共病包括(但不限于)糖尿病、第II(2)型非胰岛素依赖性糖尿病、葡萄糖耐受性异常(impaired glucose tolerance)、空腹血糖异常(impaired fasting glucose)、胰岛素抵抗综合征、血脂异常、高血压、血尿酸过多、痛风、冠状动脉疾病(coronary artery disease)、心肌梗塞、心绞痛、睡眠呼吸暂停综合征(sleep apnea syndrome)、匹克威克综合征(Pickwickian syndrome)、代谢综合征、脂肪肝；脑梗塞、脑血栓形成、短暂性缺血性发作、矫形外科病症、变形性关节炎、腰痛(lumbodynia)、月经病和不孕不育症。共病尤其包括：高血压、高脂血症、血脂异常、葡萄糖不耐受症、心血管疾病、睡眠呼吸暂停、糖尿病和其它肥胖相关病状。

本发明的瘦素多肽可用于预防体重反弹(weight regain)，预防体重增加和用于维持体重。预防体重反弹、预防体重增加和用于维持体重是指投予本发明化合物或组合以减轻或维持处于肥胖风险中的个体的体重。预防的一个结果可为预防先前由饮食、运动或药物疗法减轻的体重出现体重反弹。如果治疗是在处于肥胖风险中的个体的肥胖发作之前投予，那么预防的另一结果可为预防肥胖发生。如果治疗是在处于肥胖风险中的个体的肥胖发作之前投予，那么预防的另一结果可为降低肥胖相关病症的发生和/或严重程度。此外，如果治疗是在已肥胖的个体中进行，那么所述治疗可预防肥胖相关病症的发生、发展或严重程度。

肥胖和肥胖相关病症的“治疗”是指投予本发明的瘦素多肽或本发明的组合以减少肥胖个体的食物摄取、减轻其体重或维持其体重。治疗的一个结果可为相对于即将投予本发明化合物或组合之前肥胖个体的体重减轻所述个体的体重。治疗的另一结果可为预防先前由饮食、运动或药物疗法减轻的体重出现体重反弹。治疗的另一结果可为降低肥胖相关疾病的发生和/或严重程度。治疗的另一结果可为维持体重减轻。治疗宜减少个体的食物或热量摄取，包括减少总食物摄取，或减少饮食具体组分(例如碳水化合物或脂肪)的摄取；和/或抑制营养吸收；和/或抑制代谢率降低；和减轻有需要患者的体重。治疗还可改变代谢率，例如增加代谢率，而非抑制代谢率降低或另外还抑制代谢率降低；和/或将通常由体重减轻引起的代谢抗性降至最低。

肥胖和肥胖相关病症的“预防”是指投予本发明的瘦素多肽或组合以减少处于肥胖风险中的个体的食物摄取、减轻其体重或维持其体重。预防的一个结果可为相对于即将投予本发明化合物或组合之前处于肥胖风险中的个体的体重减轻所述个体的体重。预防的另一结果可为预防先前由饮食、运动或药物疗法减轻的体重出现体重反弹。如果治疗是在处于肥胖风险中的个体的肥胖发作之前投予，那么预防的另一结果可为预防肥胖发生。如果治疗是在处于肥胖风险中的个体的肥胖发作之前投予，那么预防的另一结果可为降低肥胖相关病症的发生和/或严重程度。另一预防结果可为延长体重增加的抵抗性。另一预防结果可为预防体重反弹。此外，如果治疗是在已肥胖的个体中进行，那么所述治疗可预防肥胖相关病症的发生、发展或严重程度，所述肥胖相关病症例如(但不限于)动脉硬化、第II型糖尿病、多囊卵巢病(polycystic ovarian disease)、心血管疾病、骨关节炎、皮肤病症、高血压、胰岛素抵抗、代谢综合征、高胆固醇血症、高甘油三酯血症和胆石症。

本文的肥胖相关病症与肥胖相关，由肥胖引起或由肥胖所致。肥胖相关病症的实例包括过度进食和贪食症、高血压、糖尿病、高血浆胰岛素浓度和胰岛素抵抗、血脂异常、高脂血症、子宫内膜癌、乳癌、前列腺癌和结肠癌、骨关节炎、阻塞性睡眠呼吸暂停、胆石症、胆囊结石(gallstone)、心脏病、异常心脏节律和心律失常、心肌梗塞、充血性心力衰竭、冠心病、猝死、中风、多囊卵巢病、颅咽管瘤(craniopharyngioma)、普拉德-威利综合征(Prader-Willi Syndrome)、弗罗利奇综合征(Frohlich′s syndrome)、GH缺乏个体、正常变异矮身材、特纳氏综合征(Turner′s syndrome)和其它显示代谢活性降低或以总的不含脂肪物质的百分比计静息能量消耗减少的病理学病状，例如患急性淋巴母细胞白血病(acute lymphoblastic leukemia)的儿童。肥胖相关病症的其它实例是代谢综合征(也称为X综合征)、胰岛素抵抗综合征、生殖激素异常、性和生殖功能异常(例如生育障碍(impaired fertility)、不孕不育症、男性性腺功能减退和女性多毛症)、母体肥胖所致胎儿缺陷、胃肠动力障碍(例如肥胖相关胃食管反流)、呼吸障碍(例如肥胖换气不足综合征(匹克威克综合征)、气喘)、心血管病症、炎症(例如血管全身性炎症)、动脉硬化、高胆固醇血症、高尿酸血症、下背疼痛、胆囊疾病、痛风、肾癌和麻醉风险增加。本发明的组合还适用于降低肥胖继发性结果的风险，例如降低左心室肥厚的风险。本发明的组合还适用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer′s disease)。

术语“治疗”是用于指预防性和/或治疗性处理。

除非另外说明，否则使用所属领域的技能范围内的质谱、NMR、HPLC、蛋白质化学、生物化学、重组DNA技术以及药理学的常规方法。

具体实施方式

I.引言

本发明提供包含至少一个非天然氨基酸的瘦素分子。在本发明的某些实施例中，具有至少一个非天然氨基酸的瘦素多肽包括至少一个翻译后修饰。在一个实施例中，所述至少一个翻译后修饰包含利用所属领域的技术人员已知适用于特定反应性基团的化学方法，使包含第二反应性基团的分子与至少一个包含第一反应性基团的非天然氨基酸连接，所述包含第二反应性基团的分子包括(但不限于)：标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分、可光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中，其中炔丙基有时也被称作乙炔部分)，并且第二反应性基团为叠氮部分，并利用[3+2]环加成化学方法。在另一个实例中，第一反应性基团为叠氮部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)，并且第二反应性基团为炔基部分。在本发明的经修饰4HB多肽的某些实施例中，使用至少一种包含至少一个翻译后修饰的非天然氨基酸(包括(但不限于)含有酮基官能团的非天然氨基酸)，其中所述至少一个翻译后修饰包含糖部分。在某些实施例中，翻译后修饰是在真核细胞或非真核细胞中活体内进行。

在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由一种宿主细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常无法通过另一种宿主细胞类型进行。在某些实施例中，蛋白质包括至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰通常无法通过非真核细胞进行。翻译后修饰的实例包括(但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成(palmitate addition)、磷酸化、糖脂键修饰等。在一个实施例中，翻译后修饰包含通过GlcNAc-天冬酰胺键使寡糖与天冬酰胺连接(包括(但不限于)其中寡糖包含(GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc等)。在另一个实施例中，翻译后修饰包含通过GalNAc-丝氨酸、GalNAc-苏氨酸、GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。在某些实施例中，本发明的蛋白质或多肽可包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。

所关注的蛋白质或多肽可含有至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或十个或十个以上非天然氨基酸。所述非天然氨基酸可为相同或不同的，例如，在蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上不同的非天然氨基酸。在某些实施例中，蛋白质的天然存在形式中所存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸是经非天然氨基酸取代。

本发明提供基于包含至少一个非天然编码氨基酸的瘦素多肽的方法和组合物。将至少一个非天然编码氨基酸引入瘦素多肽中可允许应用涉及特定化学反应(包括(但不限于)与一个或一个以上非天然编码氨基酸反应而不与通常存在的20种氨基酸反应)的接合化学。在一些实施例中，包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽是通过非天然编码氨基酸的侧链与水溶性聚合物(例如聚乙二醇(PEG))连接。本发明提供一种用PEG衍生物选择性修饰蛋白质的高效方法，其涉及回应选择密码子将非遗传编码氨基酸(包括(但不限于)含有在20种天然并入氨基酸中未发现的官能团或取代基(包括(但不限于)酮、叠氮或乙炔部分)的氨基酸)选择性并入蛋白质中，并且随后用合适的反应性PEG衍生物修饰所述氨基酸。一旦并入氨基酸侧链，就可通过利用所属领域的技术人员已知适用于天然编码氨基酸中存在的特定官能团或取代基的化学方法来修饰氨基酸侧链。多种已知的化学方法适用于在本发明中将水溶性聚合物并入蛋白质中。所述方法包括(但不限于)分别与(包括(但不限于))乙炔或叠氮化物衍生物进行休斯根[3+2]环加成反应(例如参看Padwa，A.Comprehensive Organic Synthesis，第4卷，(1991)Trost，B.M.编，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；以及Huisgen，R.1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，(1984)Padwa，A.编，Wiley，New York，第1-176页)。

因为休斯根[3+2]环加成方法涉及环加成而非亲核取代反应，所以蛋白质可在极高选择性下经修饰。通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐，可在室温下在水性条件下以优良区域选择性(1，4＞1,5)进行此反应。例如，参看Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；和Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599；以及WO03/101972。可通过[3+2]环加成而加成到本发明蛋白质上的分子包括具有合适的官能团或取代基(包括(但不限于)叠氮基或乙炔衍生物)的几乎任何分子。这些分子可分别加成到具有乙炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)上。

由休斯根[3+2]环加成得到的5元环在还原性环境中通常为不可逆的，并且在水性环境中长时间对水解稳定。因此，可在苛刻水性条件下用本发明的活性PEG衍生物修饰多种物质的物理和化学特征。甚至更重要的是，因为叠氮部分和乙炔部分彼此具有特异性(并且例如不与20种常见的遗传编码氨基酸中的任一者反应)，所以可在一个或一个以上特异性位点中以极高的选择性修饰蛋白质。

本发明也提供PEG衍生物的水溶性和水解稳定衍生物以及具有一个或一个以上乙炔或叠氮部分的相关亲水性聚合物。含有乙炔部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的叠氮部分偶合。类似地，含有叠氮部分的PEG聚合物衍生物以极高选择性与已回应选择密码子而选择性地引入蛋白质中的乙炔部分偶合。

更具体来说，叠氮部分包含(但不限于)烷基叠氮化物、芳基叠氮化物和这些叠氮化物的衍生物。烷基和芳基叠氮化物的衍生物可包括其它取代基，只要保持乙炔特异性反应性即可。乙炔部分包含烷基和芳基乙炔和各自的衍生物。烷基和芳基乙炔的衍生物可包括其它取代基，只要保持叠氮化物特异性反应性即可。

本发明提供具有多种官能团、取代基或部分的物质与其它物质的接合物，所述其它物质包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。本发明也包括具有叠氮或乙炔部分的物质与具有相应乙炔或叠氮部分的PEG聚合物衍生物的接合物。举例来说，含有叠氮部分的PEG聚合物可在蛋白质中含有带有乙炔官能团的非遗传编码氨基酸的位置处与生物活性分子偶合。使PEG与生物活性分子偶合的键联包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成产物。

所属领域中已明确确定，PEG可用于修饰生物材料的表面(例如参看美国专利6,610,281；Mehvar，R.，J.Pharmaceut Sci.，3(1)：125-136(2000)，其是以引用的方式并入本文中)。本发明也包括包含具有一个或一个以上反应性叠氮基或乙炔位点的表面的生物材料，和通过休斯根[3+2]环加成键联与所述表面偶合的一种或一种以上本发明的含叠氮基或乙炔的聚合物。生物材料和其它物质也可通过除叠氮基或乙炔键联以外的其它键联(例如通过包含羧酸、胺、醇或硫醇部分的键联)与由叠氮化物或乙炔活化的聚合物衍生物偶合以留下叠氮或乙炔部分用于后续反应。

本发明包括一种合成本发明的含叠氮基聚合物和含乙炔聚合物的方法。在含叠氮基的PEG衍生物的情况下，可使叠氮化物与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过将一端具有叠氮部分的连接剂与常规活化聚合物连接来制备含叠氮基的PEG衍生物，使得所得聚合物在其末端具有叠氮部分。在含乙炔的PEG衍生物的情况下，可使乙炔与聚合物的碳原子直接键结。或者，可通过将一端具有乙炔部分的连接剂与常规活化聚合物连接来制备含乙炔的PEG衍生物，使得所得聚合物在其末端具有乙炔部分。

更具体来说，在含叠氮基的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应而产生具有反应性更强的部分(例如甲磺酸根、三氟乙磺酸根、甲苯磺酸根或卤素离去基)的经取代聚合物。熟练技术人员熟知含有磺酰卤、卤素原子以及其它离去基的PEG衍生物的制备和使用。所得经取代的聚合物随后经历反应以在聚合物的末端用叠氮部分取代反应性更强的部分。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与一端具有叠氮基的连接剂发生反应，使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且叠氮部分位于聚合物的末端。熟练技术人员熟知亲核和亲电子部分，包括胺、硫醇、酰肼、肼、醇、羧酸酯、醛、酮、硫酯等。

更具体来说，在含乙炔的PEG衍生物的情况下，具有至少一个活性羟基部分的水溶性聚合物经历反应以从含有乙炔部分的前体置换卤素或其它经活化的离去基。或者，具有至少一个活性亲核或亲电子部分的水溶性聚合物与一端具有乙炔的连接剂发生反应，使得在PEG聚合物与连接剂之间形成共价键，并且乙炔部分位于聚合物的末端。所属领域的技术人员充分确定卤素部分、经活化的离去基、亲核和亲电子部分在有机合成情形中的使用以及PEG衍生物的制备和使用。

本发明也提供一种选择性修饰瘦素蛋白质以将其它物质添加到经修饰蛋白质上的方法，所述其它物质包括(但不限于)水溶性聚合物，例如PEG和含有叠氮或乙炔部分的PEG衍生物。含叠氮基和含乙炔的PEG衍生物可用于改变表面和分子的性质(其中生物相容性、稳定性、溶解性和缺乏免疫原性较为重要)，同时提供一种选择性比所属领域中先前已知更强的使PEG衍生物与蛋白质连接的方法。

II.生长激素超基因家族

瘦素是生长激素超基因家族的成员。以下蛋白质包括由生长激素(GH)超基因家族的基因编码的蛋白质(Bazan，F.，Immunology Today 11：350-354(1991)；Bazan，J.F.Science 257：410-411(1992)；Mott，H.R.和Campbell，I.D.，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Silvennoinen，O.和Ihle，J.N.，SIGNALLING BY THE HEMATOPOIETIC CYTOKINE RECEPTORS(1996))：生长激素、促乳素、胎盘催乳素、促红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)、白细胞介素-2(IL-2)、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12(p35亚单元)、IL-13、IL-15、制瘤素M、睫状神经营养因子(CNTF)、白血病抑制因子(LIF)、α干扰素、β干扰素、ε干扰素、γ干扰素、ω干扰素、τ干扰素、粒细胞-集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)和心肌营养素-1(CT-1)(“GH超基因家族”)。预期这一基因家族的其它成员将在未来通过基因克隆和定序得到鉴别。尽管GH超基因家族的成员一般具有有限的氨基酸或DNA序列一致性，但其具有类似的二级结构和三级结构。共有的结构特征使基因家族的新成员容易地得到鉴别，且本文所述的非天然氨基酸方法和组合物同样适用。鉴于GH超基因家族成员的结构同源性程度，可使用本发明将非天然编码氨基酸并入GH超基因家族的任何成员中。这一蛋白质家族的各成员包含四螺旋束(four helical bundle)，其一般结构显示于图1中。家族成员hGH、EPO、IFNα-2和G-CSF的一般结构分别显示于图2、3、4和5中。

包括G-CSF(Zink等人，FEBS Lett.314：435(1992)；Zink等人，Biochemistry 33：8453(1994)；Hill等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5167(1993))、GM-CSF(Diederichs，K.等人，Science 154：1779-1782(1991)；Walter等人，J.Mol.Biol.224：1075-1085(1992))、IL-2(Bazan，J.F.Science 257：410-411(1992)；McKay，D.B.Science 257：412(1992))、IL-4(Redfield等人，Biochemistry 30：11029-11035(1991)；Powers等人，Science256：1673-1677(1992))和IL-5(Milburn等人，Nature 363：172-176(1993))在内，许多细胞因子的结构已通过X射线衍射和NMR研究进行测定，且显示即使缺乏显著的一级序列同源性，也与GH结构惊人地一致。基于建模和其它研究，IFN被视为这一家族的成员(Lee等人，J.Growth hormone Cytokine Res.15：341(1995)；Murgolo等人，Proteins 17：62(1993)；Radhakrishnan等人，Structure 4：1453(1996)；Klaus等人，J.Mol.Biol.274：661(1997))。基于建模和诱变研究，EPO被视为这一家族的成员(Boissel等人，J.Biol.Chem.268：15983-15993(1993)；Wen等人，J.Biol.Chem.269：22839-22846(1994))。所有上述细胞因子和生长因子现在被视为构成一个大的基因家族。

这一家族的成员除共有类似的二级和三级结构以外，还共有必须寡聚细胞表面受体以活化细胞内信号传导路径的性质。一些GH家族成员(包括(但不限于)GH和EPO)结合单一类型的受体且使之形成同型二聚物。其它家族成员(包括(但不限于)IL-2、IL-4和IL-6)结合一种以上类型的受体且使所述受体形成异质二聚物或更高级的聚集体(Davis等人，(1993)，Science 260：1805-1808；Paonessa等人，(1995)，EMBO J.14：1942-1951；Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995))。诱变研究显示，如同GH，这些其它细胞因子和生长因子含有多个受体结合位点(通常两个)且相继结合其同源受体(Mott和Campbell，Current Opinion in Structural Biology 5：114-121(1995)；Matthews等人，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：9471-9476)。如同GH，这些其它家族成员的初级受体结合位点主要存在于四α螺旋和A-B环中。家族成员间，螺旋束中参与受体结合的特定氨基酸有所不同。大多数与GH超基因家族成员相互作用的细胞表面受体在结构上相关且构成第二个大的多基因家族。例如，参看美国专利第6,608,183号，其以引用的方式并入本文中。

由GH超基因家族各个成员的突变研究所达成的一般结论是，连接α螺旋的环一般倾向于不涉及受体结合。具体来说，在大多数(若非全部)家族成员中，短B-C环似乎对受体结合来说是非必要的。出于这一原因，在GH超基因家族成员中，B-C环可经如本文所述的非天然编码氨基酸取代。A-B环、C-D环(和GH超家族的干扰素/IL-10样成员的D-E环)也可经非天然存在氨基酸取代。邻近螺旋A且远离最后螺旋的氨基酸也倾向于不涉及受体结合，且也可为引入非天然存在氨基酸的位点。在一些实施例中，非天然编码氨基酸在环结构内的任何位置(包括(但不限于)A-B、B-C、C-D或D-E环的头1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸)处进行取代。在一些实施例中，A-B、B-C、C-D或D-E环的最后1、2、3、4、5、6、7或7个以上氨基酸经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代。

GH家族的某些成员(包括(但不限于)EPO、IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、G-CSF、GM-CSF、TPO、IL-10、IL-12p35、IL-13、IL-15和β干扰素)含有N连接和/或O连接糖。蛋白质中的糖基化位点几乎全部存在于环区中，而不存在于α螺旋束中。因为环区一般不涉及受体结合且因为其为共价连接糖基的位点，所以其可为适用于在蛋白质中引入非天然存在氨基酸取代的位点。蛋白质中包含N连接和O连接糖基化位点的氨基酸可为非天然存在氨基酸取代的位点，因为这些氨基酸是表面暴露的。因此，天然蛋白质可容忍在这些位点处连接于蛋白质的大体积糖基，且糖基化位点倾向于位于远离受体结合位点处。

未来可能发现GH超基因家族的其它成员。可通过对预测的蛋白质序列进行计算机辅助的二级和三级结构分析来鉴别GH超基因家族的新成员。GH超基因家族的成员通常具有四或五个由非螺旋氨基酸(环区)连接的两亲螺旋。蛋白质可在其N末端含有疏水性信号序列以促进自细胞分泌。所述后来发现的GH超基因家族成员也包括在本发明内。

因此，生长激素超基因家族的描述仅是出于说明性目的并且以举例的方式提供，且并不限制本文中所述的方法、组合物、策略和技术的范围。此外，本申请案中提及GH、IFN、G-CSF和EPO多肽是打算将所述通称用作GH超基因家族的任何成员的实例。因此，应了解，本文中关于hGH、hIFN、hG-CSF或hEPO多肽或蛋白质所述的修饰和化学可同样适用于GH超基因家族的任何成员，包括本文中特定列出的成员。

III.本发明中使用的一般重组核酸方法

在本发明的众多实施例中，将使用重组方法分离、克隆并通常改变编码所关注的瘦素多肽的核酸。所述实施例是用于(包括但不限于)蛋白质表达或用于源自瘦素多肽的变异体、衍生物、表达盒或其它序列的产生期间。在一些实施例中，编码本发明多肽的序列是可操作地连接到异源启动子上。在其它实施例中，本发明包括瘦素的分离和瘦素在宿主细胞中的产生。

可以母体多肽的氨基酸序列(包括(但不限于)具有SEQ ID NO：2或4中所示的氨基酸序列)为基础合成编码包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的核苷酸序列，并且随后改变所述核苷酸序列以实现相关氨基酸残基的引入(即，并入或取代)或去除(即，缺失或取代)。可根据常规方法通过定点诱变来方便地修饰核苷酸序列。或者，可由化学合成来制备核苷酸序列，包括(但不限于)通过使用寡核苷酸合成器并且优先选择将产生重组多肽的宿主细胞中所偏好的密码子来制备核苷酸序列，其中寡核苷酸是根据所需多肽的氨基酸序列进行设计。举例来说，可通过PCR、连接或连接链式反应来合成并组装编码所需多肽的部分的若干小寡核苷酸。例如，参看Barany等人，Proc.Natl.Acad.Sci.88：189-193(1991)；美国专利6,521,427，其是以引用的方式并入本文中。

本发明利用重组遗传学领域中的常规技术。揭示本发明中使用的一般方法的基础文章包括Sambrook等人，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(第3版，2001)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)；以及Current Protocols inMolecular Biology(Ausubel等人编，1994)。

描述分子生物技术的一般文章包括Berger和Kimmel，Guide to Molecular Cloning  Techniques，Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA (Berger)；Sambrook等人，Molecular Cloning-A Laboratory Manual (第2版)，第1-3卷，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，1989(″Sambrook″)以及Current Protocols in Molecular Biology，F.M.Ausubel等人编，Current Protocols，Greene Publishing Associates，Inc.与John Wiley & Sons，Inc.的合资企业，(1999年全年增补)(″Ausubel″)。这些文章描述诱变、载体和启动子的使用以及许多其它相关主题，所述相关主题涉及(包括但不限于)包括用于制备包括非天然氨基酸、正交tRNA、正交合成酶以及其对的蛋白质的选择密码子的基因的产生。

本发明出于多种目的使用各种类型的诱变，所述目的包括(但不限于)产生tRNA文库、产生合成酶文库、产生选择密码子、在所关注的蛋白质或多肽中插入编码非天然氨基酸的选择密码子。所述诱变包括(但不限于)定点诱变、随机点诱变、同源重组、DNA改组或其它递归诱变方法、嵌合构建、使用含有尿嘧啶的模板的诱变、寡核苷酸定向诱变、硫代磷酸酯修饰的DNA诱变、使用带缺口的双螺旋DNA的诱变等，或其任何组合。其它合适的方法包括点错配修复、使用修复缺陷型宿主菌株的诱变、限制选择和限制纯化、缺失诱变、通过总基因合成进行的诱变、双链断裂修复等。(包括但不限于)涉及嵌合构建体的诱变也包括在本发明中。在一个实施例中，可由天然存在分子或已改变或突变的天然存在分子的已知信息(包括(但不限于)序列、序列比较、物理性质、晶体结构等)来指导诱变。

本文中可见的文章和实例描述这些程序。其它信息可见于以下公开案和其中引用的

参考文献中：Ling等人，Approaches to DNA mutagenesis：an overview，Anal Biochem.254(2)：157-178(1997)；Dale等人，Oligonucleotide-directed random mutagenesis using the phosphorothioate method，Methods Mol.Biol.57：369-374(1996)；Smith，In vitro mutagenesis，Ann.Rev.Genet.19：423-462(1985)；Botstein和Shortle，Strategies and applications of in vitro mutagenesis，Science 229：1193-1201(1985)；Carter，Site-directed mutagenesis，Biochem.J.237：1-7(1986)；Kunkel，The efficiency of oligonucleotide directed mutagenesis，Nucleic Acids & Molecular Biology(Eckstein，F.和Lilley，D.M.J编，Springer Verlag，Berlin)(1987)；Kunkel，Rapid and efficient site-specific mutagenesis-without phenotypic selection，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(1985)；Kunkel等人，Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection，Methods in Enzymol.154，367-382(1987)；Bass等人，Mutant Trp repressors with new DNA-binding specificities，Science 242：240-245(1988)；Methods in Enzymol.100：468-500(1983)；Methods in  Enzymol 154：329-350(1987)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis using M13-derived vectors：an efficient and general procedure for the production of point mutations in any DNA fragment，Nucleic Acids Res.10：6487-6500(1982)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors，Methods  in Enzymol.100：468-500(1983)；Zoller和Smith，Oligonucleotide-directed mutagenesis：a simple method using two oligonucleotide primers and a single-stranded DNA template，Methods in Enzymol.154：329-350(1987)；Taylor等人，The use ofphosphorothioate-modified DNA in restriction enzyme reactions to prepare nicked DNA，Nucl. Acids  Res.13：8749-8764(1985)；Taylor等人，The rapid generation of oligonucleotide-directed mutations at high frequency using phosphorothioate-modified DNA，Nucl.Acids Res.13：8765-8787(1985)；Nakamaye和Eckstein，Inhibition of restriction endonuclease Nci I cleavage by phosphorothioate groups and its application to oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl.Acids Res.14：9679-9698(1986)；Sayers等人，Y-T Exonucleases in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis，Nucl. Acids Res.16：791-802(1988)；Sayers等人，Strand specific cleavage of phosphor othioate-containing DNA by reaction with restriction endonucleases in the presence ofethidium bromide，(1988)Nucl.Acids Res.16：803-814；Kramer等人，The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction，Nucl.Acids Res.12：9441-9456(1984)；Kramer和Fritz Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA，Methods in Enzymol.154：350-367(1987)；Kramer等人，Improved enzymatic in vitro reactions in the gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed construction of mutations，Nucl.Acids Res.16：7207(1988)；Fritz等人，Oligonucleotide-directed construction of mutations：a gapped duplex DNA procedure without enzymatic reactions in vitro，Nucl.Acids Res.16：6987-6999(1988)；Kramer等人，Point Mismatch Repair，Cell 38：879-887(1984)；Carter等人，Improved oligonucleotide site-directed mutagenesis using Ml3 vectors，Nucl.Acids Res.13：4431-4443(1985)；Carter，Improved oligonucleotide-directed mutagenesis using Ml3 vectors，Methods in Enzymol.154：382-403(1987)；Eghtedarzadeh和Henikoff，Use of oligonucleotides to generate large deletions，Nucl.Acids Res.14：5115(1986)；Wells等人，Importance of hydrogen-bond formation in stabilizing the transition state of subtilisin，Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317：415-423(1986)；Nambiar等人，Total synthesis and cloning of a gene coding for the ribonuclease S protein，Science 223：1299-1301(1984)；Sakamar和Khorana，Total synthesis and expression of a gene for the α-subunit of bovine rod outer segment guanine nucleotide-binding protein(transducin)，Nucl.Acids Res.14：6361-6372(1988)；Wells等人，Cassette mutagenesis：an efficient method for generation of multiple mutations at defined sites，Gene 34：315-323(1985)；Grundstrom等人，Oligonucleotide-directed mutagenesis by microscale ′shot-gun′gene synthesis，Nucl.Acids Res.13：3305-3316(1985)；Mandecki，Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli：amethod for site-specific mutagenesis，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：7177-7181(1986)；Arnold，Protein engineering for unusual environments，Current Opinion in Biotechnology 4：450-455(1993)；Sieber等人，Nature Biotechnology，19：456-460(2001)；W.P.C.Stemmer，Nature 370，389-91(1994)；以及I.A.Lorimer，I.Pastan，Nucleic Acids Res.23，3067-8(1995)。关于众多上述方法的其它细节可见于Methods in Enzymology第154卷中，所述文献也描述对于各种诱变方法带来的故障检修问题的有效控制。

本发明也涉及通过正交tRNA/RS对在活体内并入非天然氨基酸的真核宿主细胞、非真核宿主细胞和生物体。用本发明的多核苷酸或包括本发明多核苷酸的构建体(包括(但不限于)本发明的载体，其可为例如克隆载体或表达载体)以遗传学方式工程改造(包括(但不限于)转化、转导或转染)宿主细胞。载体可为例如质粒、细菌、病毒、裸多核苷酸或接合多核苷酸的形式。通过标准方法将载体引入细胞和/或微生物中，所述方法包括电穿孔(From等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，5824(1985))、通过病毒载体感染、在小珠粒或粒子基质内或在表面上由具有核酸的小粒子高速弹道渗透(Klein等人，Nature 327，70-73(1987))。

可在经改良适于例如筛选步骤、活化启动子或选择转化株等活动的常规营养培养基中培养工程改造过的宿主细胞。这些细胞可任选地经培养并进入转基因生物体中。(包括但不限于)关于细胞分离和培养(例如，关于后续核酸分离)的其它有用参考文献包括Freshney(1994)Culture of Animal Cells，a Manual of Basic Technique，第3版，Wiley-Liss，New York以及其中引用的参考文献；Payne等人，(1992)Plant Cell and Tissue Culture  in Liquid Systems John Wiley & Sons，Inc.New York，NY；Gamborg和Phillips(编)(1995)PlantCell，Tissue and Organ Culture；Fundamental Methods Springer Lab Manual，Springer-Verlag(Berlin Heidelberg New York)以及Atlas和Parks(编)The Handbook of  Microbiological Media(1993)CRC Press，Boca Raton，FL。

可使用将标靶核酸引入细胞中的数种熟知的方法，其中任一种方法都可用于本发明中。这些方法包括：受体细胞与含有DNA的细菌原生质体融合、电穿孔、基因枪法(projectile bombardment)以及经病毒载体(在下文中进一步论述)感染等。细菌细胞可用于扩增含有本发明的DNA构建体的质粒的数目。使细菌生长到对数生长期并且可通过所属领域中已知的多种方法分离细菌中的质粒(例如参看Sambrook)。另外，可购得许多试剂盒以从细菌中纯化质粒(例如参看来自Pharmacia Biotech的EasyPrep^TM、FlexiPrep^TM；来自Stratagene的StrataClean^TM；以及来自Qiagen的QIAprep^TM)。随后，进一步操纵分离并纯化过的质粒以产生其它质粒，使用所述质粒来转染细胞或将其并入相关载体中以感染生物体。典型载体含有转录和翻译终止子、转录和翻译起始序列以及可用于调节特定标靶核酸的表达的启动子。载体任选地包含通用表达盒，其含有至少一个独立的终止子序列、允许所述表达盒在真核细胞或原核细胞或两者中复制的序列(包括(但不限于)穿梭载体)以及用于原核系统与真核系统的选择标记物。载体适于在原核细胞、真核细胞或优选两者中复制和整合。参看Giliman和Smith，Gene 8：81(1979)；Roberts等人，Nature.328：731(1987)；Schneider，B.等人，Protein Expr.Purif.6435：10(1995)；Ausubel，Sambrook，Berger(都同上文)。适用于克隆的细菌和噬菌体的目录由例如ATCC提供，例如，由ATCC出版的The ATCC Catalogue of Bacteria and Bacteriophage (1992)，Gherna等人(编)。用于测序、克隆和分子生物学的其它方面的其它基本程序以及基础理论考虑因素也可见于Watson等人(1992)Recombinant DNA第2版Scientific American Books，NY中。另外，基本上任何核酸(以及实际上任何经标记核酸，无论标准或非标准)都可从多种商业来源中的任一者定制或标准定购，这些商业来源例如Midland Certified Reagent Company(Midland，TX，可通过万维网在mcrc.com上获得)、The Great American Gene Company(Ramona，CA，可通过万维网在genco.com上获得)、ExpressGen Inc.(Chicago，IL，可通过万维网在expressgen.com上获得)、Operon Technologies Inc.(Alameda，CA)以及许多其它来源。

选择密码子

本发明的选择密码子扩展蛋白质生物合成机制的遗传密码子框架。举例来说，选择密码子包括(但不限于)独特三碱基密码子、无义密码子(例如终止密码子，包括(但不限于)琥珀密码子(UAG)或蛋白石密码子(UGA))、非天然密码子、四个或四个以上碱基的密码子、稀有密码子等。所属领域的技术人员显而易见，可引入所需基因中的选择密码子的数目范围很广，其包括(但不限于)在编码瘦素多肽的至少一部分的单一多核苷酸中存在一个或一个以上、两个或两个以上、三个以上、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或10个以上选择密码子。

在一个实施例中，所述方法涉及使用作为终止密码子的选择密码子以在真核细胞中活体内并入非天然氨基酸。举例来说，产生识别终止密码子(包括(但不限于)UAG)的O-tRNA，并且通过O-RS利用所需非天然氨基酸使O-tRNA氨酰基化。此O-tRNA无法由天然存在宿主的氨酰基-tRNA合成酶识别。可使用常规定点诱变在所关注多肽中的所关注位点处引入终止密码子(包括(但不限于)TAG)。例如，参看Sayers，J.R.等人，(1988)，5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res，791-802。当O-RS、O-tRNA和编码所关注多肽的核酸在活体内组合时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸以得到在指定位置处含有非天然氨基酸的多肽。

活体内并入非天然氨基酸可在不显著干扰真核宿主细胞的情况下进行。举例来说，因为对于UAG密码子的抑制效率取决于O-tRNA(包括(但不限于)琥珀抑制因子tRNA)与真核释放因子(包含但不限于eRF)(其与终止密码子结合并起始核糖体释放正在生长的肽)之间的竞争，所以可通过(包括但不限于)增加O-tRNA和/或抑制因子tRNA的表达水平来调节抑制效率。

选择密码子也包含延长密码子，包括(但不限于)四个或四个以上碱基的密码子，例如四个、五个、六个或六个以上碱基的密码子。四碱基密码子的实例包括(包括(但不限于))AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五碱基密码子的实例包括(但不限于)AGGAC、CCCCU、CCCUC、CUAGA、CUACU、UAGGC等。本发明的特征包括使用基于移码抑制(frameshift suppression)的延长密码子。四个或四个以上碱基的密码子可将(包括但不限于)一个或多个非天然氨基酸插入同一蛋白质中。举例来说，在存在具有反密码子环(例如，具有至少8-10nt的反密码子环)的突变O-tRNA(包括(但不限于)特定移码抑制因子tRNA)的情况下，将四个或四个以上碱基的密码子读作单一氨基酸。在其它实施例中，反密码子环可解码(包括但不限于)至少一个四碱基密码子、至少一个五碱基密码子或至少一个六碱基密码子或更多碱基的密码子。因为存在256种可能的四碱基密码子，所以可使用四个或四个以上碱基的密码子在同一细胞中编码多个非天然氨基酸。参看Anderson等人，(2002)Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size，Chemistry and Biology，9：237-244；Magliery，(2001)Expanding the Genetic Code：Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of ″Shifty″Four-base Codons with a Library Approach in Escherichia coli，J.Mol.Biol.307：755-769。

举例来说，使用活体外生物合成方法，已经用四碱基密码子将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如，参看Ma等人，(1993)Biochemistry，32：7939；以及Hohsaka等人，(1999)J. Am.Chem.Soc.121：34。使用CGGG和AGGU，从而在活体外利用两个化学酰化的移码抑制因子tRNA将2-萘基丙氨酸和赖氨酸的NBD衍生物同时并入抗生蛋白链菌素中。例如，参看Hohsaka等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：12194。在活体内研究中，Moore等人研究具有NCUA反密码子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密码子(N可为U、A、G或C)的能力，并且发现四联体UAGA可由具有UCUA反密码子的tRNALeu以13％到26％的效率解码，其中在0或-1框架中极少解码。参看Moore等人，(2000)J.Mol.Biol.，298：195。在一个实施例中，可在本发明中使用基于稀有密码子或无义密码子的延长密码子，其可减少在其它不合需要的位点处的错义通读和移码抑制。

对于既定系统来说，选择密码子也可包括一个天然三碱基密码子，其中内源系统不使用(或很少使用)天然碱基密码子。举例来说，这包括缺乏识别天然三碱基密码子的tRNA的系统和/或三碱基密码子为稀有密码子的系统。

选择密码子任选地包括非天然碱基对。这些非天然碱基对进一步扩展现有遗传代码。一个额外的碱基对使三联体密码子的数目从64增加到125。第三碱基对的性质包括稳定且具有选择性的碱基配对、通过聚合酶以高保真性有效地酶促并入DNA中以及在合成新的非天然碱基对之后有效的持续引物延伸。可适于方法和组合物的非天然碱基对的描述包括例如Hirao等人，(2002)An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein，Nature Biotechnology，20：177-182。其它相关公开案列于下文中。

对于活体内使用来说，非天然核苷是膜可渗透的并且经磷酸化以形成相应的三磷酸盐。另外，增加的遗传信息稳定并且不受细胞酶破坏。Benner等人先前的工作利用与规范Watson-Crick配对不同的氢键合模式，其中最值得注意的实例为iso-C:iso-G配对。例如，参看Switzer等人，(1989)J.Am.Chem.Soc 111：8322；以及Piccirilli等人，(1990)Nature，343：33；Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602。这些碱基通常在一定程度上与天然碱基错配且不能酶促复制。Kool和同事证实碱基之间的疏水性堆积相互作用可代替氢键合来驱动碱基对的形成。参看Kool，(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.，4：602；以及Guckian和Kool，(1998)Angew.Chem.Int.Ed.Engl.，36，2825。在致力于开发满足所有上述要求的非天然碱基对的过程中，Schultz、Romesberg和同事已系统地合成并研究了一系列非天然疏水性碱基。发现PICS：PICS自身配对比天然碱基对稳定，并可通过大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment，KF)有效地并入DNA中。例如，参看McMinn等人，(1999)J.Am.Chem.Soc，121：11586；以及Ogawa等人，(2000)J.Am. Chem.Soc，122：3274。可通过KF以足以用于生物功能的效率和选择性合成3MN:3MN自身配对。例如，参看Ogawa等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：8803。然而，这两种碱基都充当用于进一步复制的链终止子。突变DNA聚合酶近来已得到发展，其可用于复制PICS自身配对。另外，也可复制7AI自身配对。例如，参看Tae等人，(2001)J.Am.Chem. Soc，123：7439。也已开发新颖金属碱基对Dipic:Py，其在结合Cu(II)后形成稳定配对。参看Meggers等人，(2000)J.Am.Chem.Soc，122：10714。因为延长密码子和非天然密码子固有地与天然密码子正交，所以本发明的方法可利用这一性质来产生正交tRNA以供其使用。

也可使用翻译旁路系统(translational bypassing system)将非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻译旁路系统中，将大序列并入基因中，但并未将其翻译成蛋白质。所述序列含有充当诱导核糖体跳过所述序列并在插入下游重新开始翻译的提示的结构。

在某些实施例中，在本发明的方法和/或组合物中的所关注的蛋白质或多肽(或其部分)是由核酸编码。通常，核酸包含至少一个选择密码子、至少两个选择密码子、至少三个选择密码子、至少四个选择密码子、至少五个选择密码子、至少六个选择密码子、至少七个选择密码子、至少八个选择密码子、至少九个选择密码子、十个或十个以上选择密码子。

可使用所属领域的技术人员熟知并且在本文中描述的方法来诱变所关注的蛋白质或多肽的编码基因，从而使其包括例如一个或一个以上选择密码子以并入非天然氨基酸。举例来说，诱变所关注蛋白质的核酸以使其包括一个或一个以上选择密码子，从而提供一个或一个以上非天然氨基酸的并入。本发明包括例如包括至少一个非天然氨基酸的任何蛋白的任何这种变异体(包括但不限于突变体)形式。类似地，本发明也包括相应核酸，即，具有一个或一个以上编码一个或一个以上非天然氨基酸的选择密码子的任何核酸。

可容易地使编码所关注蛋白质(例如瘦素多肽)的核酸分子突变以在多肽的任何所需位置处引入半胱氨酸。半胱氨酸广泛用于将反应性分子、水溶性聚合物、蛋白质或多种其它分子引入所关注蛋白质上。所属领域中已知适于将半胱氨酸并入瘦素多肽的所需位置中的方法，例如美国专利第6,420,339号(其是以引用的方式并入本文中)中所述的方法，以及标准诱变技术。

IV.非天然编码氨基酸

多种非天然编码氨基酸适用于本发明中。可将任何数目的非天然编码氨基酸引入瘦素多肽中。一般来说，引入的非天然编码氨基酸实质上对20种常见的遗传编码氨基酸(即，丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)呈化学惰性。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包括与20种常见氨基酸中不存在的官能团(包括(但不限于)叠氮基、酮基、醛基以及氨氧基)有效并选择性地反应形成稳定接合物的侧链官能团。举例来说，包括含有叠氮基官能团的非天然编码氨基酸的瘦素多肽可与聚合物(包括(但不限于)聚(乙二醇))或者含有炔部分的第二多肽反应，以形成由于叠氮基与炔官能团选择性反应形成休斯根[3+2]环加成产物而引起的稳定接合物。

α-氨基酸的一般结构说明如下(式I)：

非天然编码氨基酸通常为具有以上所列结构式(其中R基团为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)的任何结构，并且可适用于本发明中。因为本发明的非天然编码氨基酸通常仅关于侧链结构与天然氨基酸存在不同，所以非天然编码氨基酸以与天然存在多肽中形成酰胺键相同的方式与其它氨基酸(包括(但不限于)天然或非天然编码氨基酸)形成酰胺键。然而，非天然编码氨基酸具有使其区别于天然氨基酸的侧链基团。举例来说，R任选地包含烷基-、芳基-、酰基-、酮基-、叠氮基-、羟基-、肼、氰基-、卤基-、酰肼、烯基、炔基、醚、硫醇、硒基-、磺酰基-、硼酸酯基(borate)、硼酸酯基(boronate)、磷酸基、膦酰基、膦、杂环基、烯酮、亚胺、醛、酯、硫代酸、羟胺、氨基等或其任何组合。所关注的可适用于本发明中的其它非天然存在氨基酸包括(但不限于)包含可光活化交联剂的氨基酸、自旋标记的氨基酸、荧光氨基酸、结合金属的氨基酸、含金属的氨基酸、放射性氨基酸、具有新颖官能团的氨基酸、与其它分子共价或非共价相互作用的氨基酸、光笼化和/或可光致异构化的氨基酸、包含生物素或生物素类似物的氨基酸、糖基化氨基酸(例如糖取代丝氨酸)、其它碳水化合物修饰的氨基酸、含酮基的氨基酸、包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸、经重原子取代的氨基酸、可化学裂解和/或可光裂解的氨基酸、与天然氨基酸相比具有延长侧链(包括(但不限于)聚醚或长链烃，包括(但不限于)约5个以上或约10个以上碳)的氨基酸、含碳连接的糖的氨基酸、氧化还原活性氨基酸、含氨基硫代酸的氨基酸以及包含一个或一个以上毒性部分的氨基酸。

可适用于本发明中并且适用于与水溶性聚合物反应的例示性非天然编码氨基酸包括(但不限于)具有羰基、氨氧基、肼、酰肼、氨基脲、叠氮化物以及炔反应性基团的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，非天然编码氨基酸包含糖部分。所述氨基酸的实例包括N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-半乳糖胺基-L-丝氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-苏氨酸、N-乙酰基-L-葡糖胺基-L-天冬酰胺和O-甘露糖胺基-L-丝氨酸。这些氨基酸的实例也包括氨基酸与糖之间的天然存在N-或O-键联是由自然界中通常不存在的共价键(包括(但不限于)烯烃、肟、硫醚、酰胺等)置换的实例。这些氨基酸的实例也包括天然存在蛋白质中通常不存在的糖，例如2-脱氧-葡萄糖、2-脱氧半乳糖等。

本文中提供的多种非天然编码氨基酸可购自例如Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)、Novabiochem(EMD Biosciences的分公司，Darmstadt，Germany)或Peptech(Burlington，MA，USA)。不可购得的非天然编码氨基酸是任选地如本文中所提供而合成，或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon，Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March，Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；以及Carey和Sundberg，Advanced Organic Chemistry(第3版，A和B部分，1990，Plenum Press，New York)。也参看美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885，其是以引用的方式并入本文中。除含有新颖侧链的非天然氨基酸之外，可适用于本发明中的非天然氨基酸也任选地包含经修饰的主链结构，包括(但不限于)如式II和III的结构所说明的结构：

其中Z通常包含OH、NH₂、SH、NH-R′或S-R′；X和Y可相同或不同，通常包含S或O；并且R和R′任选地相同或不同，通常选自上文对于具有式I的非天然氨基酸所述的R基团的组成部分的相同清单以及氢。举例来说，本发明的非天然氨基酸任选地包含如式II和III所说明的氨基或羧基中的取代。这种类型的非天然氨基酸包括(但不限于)α-羟基酸、α-硫代酸、α-氨基硫代羧酸盐，包括(但不限于)具有对应于20种常见天然氨基酸的侧链或非天然侧链的非天然氨基酸。另外，在α-碳上的取代任选地包括(但不限于)L、D或α-α-二取代氨基酸，例如D-谷氨酸、D-丙氨酸、D-甲基-O-酪氨酸、氨基丁酸等。其它结构替代物包括环状氨基酸，例如脯氨酸类似物以及3、4、6、7、8和9元环脯氨酸类似物；β和γ氨基酸，例如经取代β-丙氨酸和γ-氨基丁酸。

多种非天然氨基酸是基于例如酪氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸等天然氨基酸并且适用于本发明中。酪氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的酪氨酸、邻位取代的酪氨酸以及间位取代的酪氨酸，其中经取代酪氨酸包含(包括但不限于)酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、氨基、肼、羟胺、硫醇基、羧基、异丙基、甲基、C₆-C₂₀直链或支链烃、饱和或不饱和烃、O-甲基、聚醚基团、硝基、炔基等。另外，也涵盖多取代芳环。可适用于本发明中的谷氨酰胺类似物包括(但不限于)α-羟基衍生物、γ-取代衍生物、环状衍生物以及酰胺取代的谷氨酰胺衍生物。可适用于本发明中的例示性苯丙氨酸类似物包括(但不限于)对位取代的苯丙氨酸、邻位取代的苯丙氨酸和间位取代的苯丙氨酸，其中取代基包含(包括但不限于)羟基、甲氧基、甲基、烯丙基、醛、叠氮基、碘基、溴基、酮基(包括但不限于乙酰基)、苯甲酰基、炔基等。可适用于本发明中的非天然氨基酸的具体实例包括(但不限于)对乙酰基-L-苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAc β-丝氨酸、L-多巴(L-Dopa)、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、L-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸以及对炔丙基氧基-苯丙氨酸等。可适用于本发明中的多种非天然氨基酸的结构的实例是提供于例如标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO2002/085923中。关于其它蛋氨酸类似物，也参看Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS99：19-24。。

在一个实施例中，提供包括非天然氨基酸(例如对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸)的瘦素多肽的组合物。也提供包含对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸和(包括但不限于)蛋白质和/或细胞的各种组合物。一方面，包括对(炔丙基氧基)-苯丙氨酸非天然氨基酸的组合物进一步包括正交tRNA。非天然氨基酸可与正交tRNA键结(包括(但不限于)共价键结)，其包括(但不限于)通过氨酰基键与正交tRNA共价键结、与正交tRNA的末端核糖的3′OH或2′OH共价键结等。

可借助于非天然氨基酸并入蛋白质中的化学部分提供蛋白质的多种优点和操纵性。举例来说，酮基官能团的独特反应性允许利用多种含肼或含羟胺试剂中的任一者在活体外以及活体内选择性修饰蛋白质。例如，重原子非天然氨基酸可适用于定相X射线结构数据。使用非天然氨基酸进行重原子的位点特异性引入还为选择重原子的位置提供选择性和灵活性。举例来说，光反应性非天然氨基酸(包括但不限于具有二苯甲酮和芳基叠氮化物(包括但不限于叠氮基苯)侧链的氨基酸)允许蛋白质的活体内和活体外有效光交联。光反应性非天然氨基酸的实例包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸以及对苯甲酰基-苯丙氨酸。随后，可通过激发光反应性基团(提供时间控制)使具有光反应性非天然氨基酸的蛋白质随意交联。在一个实例中，(包括但不限于)在使用核磁共振以及振动光谱的情况下，可由作为局部结构和动力学的探针的经同位素标记的(包括但不限于)甲基取代非天然氨基酸的甲基。举例来说，炔基或叠氮基官能团允许利用分子通过[3+2]环加成反应选择性修饰蛋白质。

并入瘦素多肽的氨基末端的非天然氨基酸可由R基团(其为除用于20种天然氨基酸中的取代基之外的任何取代基)和不同于α-氨基酸(参看式I)中通常存在的NH₂基团的第二反应性基团构成。类似的非天然氨基酸可在羧基末端并入不同于α-氨基酸(参看式I)中通常存在的COOH基团的第二反应性基团。

非天然氨基酸的化学合成

适用于本发明中的多种非天然氨基酸可购自例如Sigma(USA)或Aldrich(Milwaukee，WI，USA)。无法购得的非天然氨基酸是任选地如本文中所提供或如各种公开案中所提供而合成，或使用所属领域的技术人员已知的标准方法合成。关于有机合成技术，例如参看Fessendon和Fessendon，Organic Chemistry，(1982，第2版，Willard Grant Press，Boston Mass.)；March，Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)；以及Carey和Sundberg，Advanced Organic Chemistry(第3版，A和B部分，1990，Plenum Press，New York)。描述非天然氨基酸合成的其它公开案包括(例如)标题为“In vivo incorporation of Unnatural Amino Acids”的WO 2002/085923；Matsoukas等人，(1995)J. Med.Chem.，38，4660-4669；King，F.E.和Kidd，D.A.A.(1949)A New Synthesis of Glutamine and of γ-Dipeptides of Glutamic Acid from Phthylated Intermediates，J.Chem. Soc，3315-3319；Friedman，O.M.和Chatterrji，R.(1959)Synthesis of Derivatives of Glutamine as Model Substrates for Anti-Tumor Agents.J.Am.Chem.Soc.81，3750-3752；Craig，J.C.等人，(1988)Absolute Configuration of the Enantiomers of 7-Chloro-4[[4-(diethylamino)-1-methylbutyl]amino]quinoline (Chloroquine).J.Org.Chem.53，1167-1170；Azoulay，M.，Vilmont，M.和Frappier，F.(1991)Glutamine analogues as Potential Antimalarials，.Eur.J.Med.Chem.26，201-5；Koskinen，A.M.P.和Rapoport，H.(1989)Synthesis of 4-Substituted Prolines as Conformationally Constrained Amino Acid Analogues.J.Org.Chem.54，1859-1866；Christie，B.D.和Rapoport，H.(1985)Synthesis of Optically Pure Pipecolates from L-Asparagine.Application to the Total Synthesis of (+)-Apovincamine through Amino Acid Decarbonylation and Iminium Ion Cyclization.J.Org. Chem.1989：1859-1866；Barton等人，(1987)Synthesis of Novel α-Amino-Acids and Derivatives Using Radical Chemistry：Synthesis of L-and D-α-Amino-Adipic Acids，L-α-aminopimelic Acid and Appropriate Unsaturated Derivatives.Tetrahedron Lett.43：4297-4308；以及Subasinghe等人，(1992)Quisqualic acid analogues：synthesis of beta-heterocyclic 2-aminopropanoic acid derivatives and their activity at a novel quisqualate-sensitized site.J.Med.Chem.35：4602-7。也参看2003年12月22日申请的标题为“Protein Arrays”的专利申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号。

A.羰基反应性基团

具有羰基反应性基团的氨基酸允许多种通过亲核加成或醇醛缩合反应连接分子(包括(但不限于)PEG或其它水溶性分子)的反应。

例示性含羰基的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R₂为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R₃为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R₄为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基并且R₂为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基并且R₂为简单烷基(即，甲基、乙基或丙基)，并且酮部分位于相对于烷基侧链的间位。

对乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸和间乙酰基-(+/-)-苯丙氨酸的合成描述于Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中，其是以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员可类似地制备其它含羰基的氨基酸。

在一些实施例中，以化学方式修饰包含非天然编码氨基酸的多肽以产生反应性羰基官能团。举例来说，可由具有相邻氨基和羟基的官能团产生可用于接合反应的醛官能团。当生物活性分子为多肽时，例如可使用N末端丝氨酸或苏氨酸(其可正常存在，或可通过化学或酶促消化而暴露)在温和的氧化裂解条件下使用高碘酸盐产生醛官能团。例如，参看Gaertner等人，Bioconjug.Chem.3：262-268(1992)；Geoghegan，K.和Stroh，J.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Gaertner等人，J.Biol.Chem.269：7224-7230(1994)。然而，所属领域中已知的方法局限于肽或蛋白质的N末端氨基酸。

在本发明中，带有相邻羟基和氨基的非天然编码氨基酸可作为“经掩蔽”的醛官能团并入多肽中。举例来说，5-羟基赖氨酸带有与ε胺相邻的羟基。用于产生醛的反应条件通常涉及在温和条件下添加摩尔过量的偏高碘酸钠，以避免在多肽内的其它位点处发生氧化。氧化反应的pH值通常为约7.0。典型反应涉及向多肽的缓冲溶液中添加约1.5摩尔过量的偏高碘酸钠，接着在黑暗环境中培育约10分钟。例如参看美国专利第6,423,685号，其是以引用的方式并入本文中。

羰基官能团可在温和条件下在水溶液中与含肼、酰肼、羟胺或氨基脲的试剂选择性反应，以分别形成在生理条件下稳定的相应腙、肟或缩氨基脲(semicarbazone)键联。例如，参看Jencks，W.P.，J.Am.Chem.Soc.81，475-481(1959)；Shao，J.和Tam，J.P.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。此外，羰基的独特反应性允许在存在其它氨基酸侧链的情况下进行选择性修饰。例如，参看Cornish，V.W.等人，J.Am.Chem.Soc.118：8150-8151(1996)；Geoghegan，K.F.和Stroh，J.G.，Bioconjug.Chem.3：138-146(1992)；Mahal，L.K.等人，Science 276：1125-1128(1997)。

B.肼、酰肼或氨基脲反应性基团

含有亲核基团(例如肼、酰肼或氨基脲)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。

例示性含肼、酰肼或氨基脲的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N或S或不存在；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。

在一些实施例中，n为4，R₁不存在并且X为N。在一些实施例中，n为2，R₁不存在并且X不存在。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，并且氧原子位于芳环上脂肪族基团的对位。

含酰肼、肼和氨基脲的氨基酸可获自商业来源。举例来说，L-谷氨酸-γ-酰肼可获自Sigma Chemical(St.Louis，MO)。无法购得的其它氨基酸可由所属领域的技术人员制备。例如参看美国专利第6,281,211号，其是以引用的方式并入本文中。

含有带有酰肼、肼或氨基脲官能团的非天然编码氨基酸的多肽可与多种含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的分子有效并选择性地反应。例如，参看Shao，J.和Tam，J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)。与20种常见氨基酸上存在的亲核基团(包括(但不限于)丝氨酸或苏氨酸的羟基或赖氨酸的氨基以及N末端)相比，酰肼、肼和氨基脲官能团的独特反应性使其对醛、酮和其它亲电子基团的反应性显著更强。

C.含氨氧基的氨基酸

含有氨氧基(也被称作羟胺)的非天然编码氨基酸允许与多种亲电子基团反应形成接合物(包括(但不限于)与PEG或其它水溶性聚合物反应)。如同肼、酰肼以及氨基脲一样，氨氧基的增强的亲核性使其与多种含有醛或具有类似化学反应性的其它官能团的分子有效并选择性地反应。例如，参看Shao，J.和Tam，J.，J.Am.Chem.Soc.117：3893-3899(1995)；H.Hang和C.Bertozzi，Acc.Chem.Res.34：727-736(2001)。尽管与肼基团反应的结果为相应腙，但氨氧基与含羰基的基团(例如酮)的反应通常产生肟。

例示性含氨氧基的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；Y＝C(O)或不存在；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为1，并且Y存在。在一些实施例中，n为2，R₁和X不存在，m为0，并且Y不存在。

含氨氧基的氨基酸可由可易于获得的氨基酸前体(高丝氨酸、丝氨酸以及苏氨酸)制备。例如，参看M.Carrasco和R.Brown，J.Org.Chem.68：8853-8858(2003)。某些含氨氧基的氨基酸(例如L-2-氨基-4-(氨氧基)丁酸)已从天然来源分离(Rosenthal，G.等人，Life Sci.60：1635-1641(1997))。其它含氨氧基的氨基酸可由所属领域的技术人员来制备。

D.叠氮化物和炔反应性基团

叠氮化物和炔官能团的独特反应性使其极适用于多肽和其它生物分子的选择性修饰。有机叠氮化物(尤其是脂肪族叠氮化物)以及炔通常对常见的反应性化学条件稳定。具体来说，叠氮化物与炔官能团都对天然存在多肽中可见的20种常见氨基酸的侧链(即，R基团)呈惰性。然而，当叠氮化物和炔基团靠近时，其“弹簧加压(spring-loaded)”性质显露，并且其通过休斯根[3+2]环加成反应选择性并有效地反应产生相应三唑。例如，参看Chin J.等人，Science 301：964-7(2003)；Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)。

因为休斯根环加成反应涉及选择性环加成反应(例如参看Padwa，A.，COMPREHENSIVE ORGANIC SYNTHESIS，第4卷，(Trost，B.M.编，1991)，第1069-1109页；Huisgen，R.，1，3-DIPOLAR CYCLOADDITION CHEMISTRY，(Padwa，A.编，1984)，第1-176页)而非亲核取代，所以并入带有含叠氮基和含炔的侧链的非天然编码氨基酸使得所得多肽在非天然编码氨基酸的位置处经选择性修饰。涉及含叠氮基或含炔的瘦素多肽的环加成反应可在室温下在水性条件下通过在催化量的用于将Cu(II)原位还原为Cu(I)的还原剂存在下添加Cu(II)(包括(但不限于)呈催化量的CuSO₄的形式)来进行。例如，参看Wang，Q.等人，J.Am.Chem.Soc.125，3192-3193(2003)；Tornoe，C.W.等人，J.Org.Chem.67：3057-3064(2002)；Rostovtsev等人，Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599(2002)。例示性还原剂包括(包括但不限于)抗坏血酸盐、金属铜、奎宁(quinine)、氢醌、维生素K、谷胱甘肽、半胱氨酸、Fe²⁺、Co²⁺以及外加电位。

在一些需要叠氮化物与炔之间的休斯根[3+2]环加成反应的情况下，瘦素多肽包含包括炔部分的非天然编码氨基酸并且欲与氨基酸连接的水溶性聚合物包含叠氮部分。或者，也可进行逆向反应(即，在氨基酸上具有叠氮部分并且在水溶性聚合物上存在炔部分)。

叠氮官能团也可与含有芳基酯并且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键联。芳基膦基团原位还原叠氮基，并且所得胺随后与最接近的酯键有效反应以产生相应酰胺。例如参看E.Saxon和C.Bertozzi，Science 287，2007-2010(2000)。含叠氮基的氨基酸可为烷基叠氮化物(包括(但不限于)2-氨基-6-叠氮基-1-己酸)或芳基叠氮化物(对叠氮基-苯丙氨酸)。

含有芳基酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：

其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物并且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-CN以及-NO₂。R′、R″、R″′和R″″各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。举例来说，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，各R基团是独立地经选择，而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R′和R″与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

叠氮官能团也可与含有硫酯并且经芳基膦部分适当官能化的水溶性聚合物选择性地反应以产生酰胺键联。芳基膦基团原位还原叠氮基，并且所得胺随后与硫酯键有效反应以产生相应酰胺。含有硫酯和膦部分的例示性水溶性聚合物可如下表示：

其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，且W为水溶性聚合物。

例示性含炔的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10，R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X不存在，m为0并且乙炔部分位于相对于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为1并且炔丙基氧基位于相对于烷基侧链的对位(即，O-炔丙基-酪氨酸)。在一些实施例中，n为1，R₁和X不存在且m为0(即，炔丙基甘氨酸)。

含炔的氨基酸在市面上有售。举例来说，炔丙基甘氨酸可购自Peptech(Burlington，MA)。或者，可根据标准方法来制备含炔的氨基酸。举例来说，例如可如Deiters，A.等人，J.Am.Chem.Soc.125：11782-11783(2003)中所述来合成对炔丙基氧基苯丙氨酸，并且可如Kayser，B.等人，Tetrahedron 53(7)：2475-2484(1997)中所述来合成4-炔基-L-苯丙氨酸。所属领域的技术人员可制备其它含炔的氨基酸。

例示性含叠氮基的氨基酸可如下表示：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R₂为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基团，并且R₃为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基团。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X不存在，m为0并且叠氮部分位于烷基侧链的对位。在一些实施例中，n为0-4并且R₁和X不存在，并且m＝0。在一些实施例中，n为1，R₁为苯基，X为O，m为2并且β叠氮基乙氧基部分位于相对于烷基侧链的对位。

含叠氮基的氨基酸可获自商业来源。举例来说，4-叠氮基苯丙氨酸可获自Chem-Impex International，Inc.(Wood Dale，IL)。对于无法购得的含叠氮基的氨基酸，可相对容易地使用所属领域的技术人员已知的标准方法来制备叠氮基，所述方法包括(但不限于)通过置换合适的离去基(包括(但不限于)卤离子、甲磺酸根、甲苯磺酸根)或通过打开经适当保护的内酯。例如参看March，Advanced Organic Chemistry(第3版，1985，Wiley and Sons，New York)。

E.氨基硫醇反应性基团

β取代的氨基硫醇官能团的独特反应性使其极其适用于通过形成噻唑烷来选择性修饰含有醛基的多肽和其它生物分子。例如参看J.Shao和J.Tam，J.Am.Chem.Soc.1995，117(14)3893-3899。在一些实施例中，β取代的氨基硫醇氨基酸可并入瘦素多肽中并且随后与包含醛官能团的水溶性聚合物反应。在一些实施例中，水溶性聚合物、药物接合物或其它有效负载可通过形成噻唑烷而与包含β取代的氨基硫醇氨基酸的瘦素多肽偶合。

非天然氨基酸的细胞摄取

真核细胞对非天然氨基酸的摄取为设计并选择(包括但不限于)用于并入蛋白质中的非天然氨基酸时通常考虑的一个问题。举例来说，α-氨基酸的高电荷密度表明这些化合物不可能为细胞可渗透的。通过以蛋白质为基础的转运系统的集合将天然氨基酸吸收到真核细胞中。可进行快速筛选以分析哪些非天然氨基酸(如果存在)是由细胞吸收。例如，参看例如2003年12月22日申请的标题为“Protein Arrays”的申请案第10/744,899号和2002年12月22日申请的第60/435,821号以及Liu，D.R.和Schultz，P.G.(1999)Progress toward the evolution of an organism with an expanded genetic code.PNAS United  States 96：4780-4785中的毒性检验。尽管通过各种检验可容易地分析摄取，但设计适用于细胞摄取途径的非天然氨基酸的替代方案为提供在活体内产生氨基酸的生物合成途径。

非天然氨基酸的生物合成

许多生物合成途径已存在于细胞中以用于产生氨基酸和其它化合物。虽然自然界(包括(但不限于)真核细胞)中可能不存在特定非天然氨基酸的生物合成方法，但本发明提供所述方法。举例来说，任选地通过添加新酶或改变现有宿主细胞途径而在宿主细胞中产生非天然氨基酸的生物合成途径。其它新酶任选地为天然存在的酶或人工开发的酶。举例来说，对氨基苯丙氨酸的生物合成(如在标题为“In vivo incorporation of unnatural amino acids”的WO 2002/085923中的实例中所呈现)依赖来自其它生物体的已知酶的组合的加入。可通过利用包含这些酶的基因的质粒转化细胞而将所述基因引入真核细胞中。当在细胞中表达时，所述基因提供合成所需化合物的酶促途径。任选地添加的酶类型的实例提供于下文实例中。其它酶序列可见于(例如)Genbank中。人工开发的酶也任选地以相同方式添加到细胞中。以此方式操纵细胞的细胞机构和资源以产生非天然氨基酸。

多种方法可用于产生用于生物合成途径中或用于发展现有途径的新颖酶。举例来说，任选地使用包括(但不限于)如Maxygen，Inc.(可通过万维网在maxygen.com上获得)所开发的递归重组来开发新颖酶和途径。例如，参看Stemmer(1994)，Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling，Nature370(4)：389-391；以及Stemmer，(1994)，DNAshuffling by random fragmentation and reassembly：In vitro recombination for molecular evolution，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，91：10747-10751。类似地，任选地将Genencor(可通过万维网在genencor.com上获得)所开发的DesignPath^TM用于代谢途径工程改造，包括(但不限于)工程改造在细胞中产生O-甲基-L-酪氨酸的途径。这项技术使用新基因(包括但不限于)经由功能基因组学以及分子进化和设计所鉴别的基因)的组合在宿主生物体中重建现有途径。Diversa公司(可通过万维网在diversa.com上获得)也提供快速筛选基因文库和基因途径的技术，从而包括(但不限于)建立新途径。

通常，由本发明的工程改造过的生物合成途径产生的非天然氨基酸是以足以进行有效蛋白质生物合成(包括(但不限于)天然细胞量)，但未达到影响其它氨基酸的浓度或耗尽细胞资源的程度的浓度产生。以此方式在活体内产生的典型浓度为约10mM到约0.05mM。在利用包含用于产生特定途径所需的酶的基因的质粒转化细胞并产生非天然氨基酸后，任选地使用活体内选择以针对核糖体蛋白质合成和细胞生长进一步优化非天然氨基酸的产生。

具有非天然氨基酸的多肽

可出于多种目的进行非天然氨基酸的并入，所述目的包括(但不限于)调整蛋白质结构和/或功能的改变；改变尺寸、酸度、亲核性、氢键合、疏水性、蛋白酶标靶位点的可接近性；靶向部分(包括(但不限于)，对于蛋白质阵列)等。包括非天然氨基酸的蛋白质可具有增强或甚至全新的催化或生物物合理质。举例来说，任选地通过在蛋白质中包括非天然氨基酸来改良以下性质：毒性、生物分布、结构性质、光谱性质、化学和/或光化学性质、催化能力、半衰期(包括(但不限于)血清半衰期)、与其它分子反应的能力(包括(但不限于)共价或非共价)等。包括包含至少一个非天然氨基酸的蛋白质的组合物适用于(包括但不限于)新颖治疗剂、诊断剂、催化酶、工业酶、结合蛋白(包括但不限于抗体)以及(包括但不限于)蛋白质结构和功能的研究。例如参看Dougherty，(2000)Unnatural Amino Acids as Probes of Protein Structure and Function，Current Opinion in Chemical Biology，4：645-652。

在本发明的一方面，组合物包括至少一种具有至少一个(包括(但不限于)至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少十个或十个以上)非天然氨基酸的瘦素蛋白质。非天然氨基酸可为相同或不同的，包括(但不限于)在瘦素蛋白质中可存在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同位点，其包含1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或10个以上不同的非天然氨基酸。另一方面，组合物包括蛋白质中存在的至少一个(但少于全部)特定氨基酸经非天然氨基酸取代的瘦素蛋白质。对于具有一个以上非天然氨基酸的既定蛋白质来说，非天然氨基酸可相同或不同(包括(但不限于)所述蛋白质可包括两个或两个以上不同类型的非天然氨基酸，或可包括两个相同的非天然氨基酸)。对于具有两个以上非天然氨基酸的既定瘦素蛋白质来说，非天然氨基酸可相同、不同或为相同种类的多个非天然氨基酸与至少一个不同的非天然氨基酸的组合。

所关注的具有至少一个非天然氨基酸的瘦素蛋白质或多肽为本发明的特征。本发明也包括使用本发明的组合物和方法产生的具有至少一个非天然氨基酸的瘦素多肽或蛋白质。赋形剂(包括(但不限于)医药学上可接受的赋形剂)也可与瘦素多肽一起存在。

通过在真核细胞中利用至少一个非天然氨基酸产生所关注的瘦素多肽，蛋白质或多肽通常应包括真核生物翻译后修饰。在某些实施例中，瘦素多肽包括至少一个非天然氨基酸和至少一个由真核细胞在活体内进行的翻译后修饰，其中所述翻译后修饰并非由原核细胞进行。举例来说，翻译后修饰包括(包括但不限于)乙酰化、酰化、脂质修饰、棕榈酰化、棕榈酸盐加成、磷酸化、糖脂键联修饰、糖基化等。一方面，翻译后修饰包括通过GlcNAc-天冬酰胺键联使寡糖(包括(但不限于)(GlcNAc-Man)₂-Man-GlcNAc-GlcNAc)与天冬酰胺连接。参看表1，其列出真核生物蛋白的N-连接寡糖的一些实例(也可存在其它未绘示的残基)。另一方面，翻译后修饰包括通过GalNAc-丝氨酸或GalNAc-苏氨酸键联或GlcNAc-丝氨酸或GlcNAc-苏氨酸键联使寡糖(包括(但不限于)Gal-GalNAc、Gal-GlcNAc等)与丝氨酸或苏氨酸连接。

表1：通过GlcNAc键联连接的寡糖的实例

另一方面，翻译后修饰包括前体(包括(但不限于)降血钙素前体、降血钙素基因相关肽前体、前甲状旁腺激素原(preproparathyroid hormone)、前胰岛素原、胰岛素原、前阿黑皮素原(prepro-opiomelanocortin)、阿黑皮素原等)的蛋白水解加工，组装成多亚单位蛋白或大分子组装物，翻译到细胞中的另一位点中(包括(但不限于)翻译到例如内质网、高尔基体(Golgi apparatus)、核、溶酶体、过氧化物酶体、线粒体、叶绿体、液泡等细胞器中，或通过分泌途径)。在某些实施例中，瘦素多肽包含分泌或定位序列、抗原决定基标签、FLAG标签、聚组氨酸标签、GST融合体等。美国专利第4,963,495号和第6,436,674号(其以引用的方式并入本文中)详细描述设计用于改良hGH多肽的分泌的构建体。

非天然氨基酸的一个优点在于，其提供可用于添加其它分子的其它化学部分。这些修饰可在真核细胞或非真核细胞中活体内进行或在活体外进行。因此，在某些实施例中，翻译后修饰是通过非天然氨基酸进行。举例来说，翻译后修饰可通过亲核-亲电子反应进行。目前用于蛋白质的选择性修饰的大多数反应涉及亲核与亲电子反应搭配物之间的共价键形成，包括(但不限于)α-卤代酮与组氨酸或半胱氨酸侧链的反应。在这些情况下，选择性是由蛋白质中亲核残基的数目和可接近性决定。在本发明的瘦素多肽中，可在活体外以及活体内使用其它选择性更大的反应，例如非天然酮基氨基酸与酰肼或氨氧基化合物的反应。例如，参看Cornish等人，(1996)Am.Chem.Soc，118：8150-8151；Mahal等人，(1997)Science，276：1125-1128；Wang等人，(2001)Science 292：498-500；Chin等人，(2002)Am.Chem.Soc.124：9026-9027；Chin等人，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci..99：11020-11024；Wang等人，(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.，100：56-61；Zhang等人，(2003)Biochemistry，42：6735-6746；以及Chin等人，(2003)Science，出版中。这允许用包括荧光团、交联剂、糖类衍生物以及细胞毒性分子在内的大量试剂选择性标记几乎任何蛋白质。也参看2003年1月16日申请的标题为“Glycoprotein synthesis”的美国专利申请案第10/686,944号，其是以引用的方式并入本文中。包括(但不限于)通过叠氮基氨基酸进行的翻译后修饰也可通过施陶丁格连接反应(Staudinger ligation)(包括(但不限于)用三芳基膦试剂)进行。例如参看Kiick等人，(2002)Incorporation of azides into recombinant proteins for chemoselective modification by the Staudinger ligation，PNAS99：19-24。

本发明提供选择性修饰蛋白质的另一种极为有效的方法，其涉及回应选择密码子而将非天然氨基酸(包括(但不限于)含有叠氮基或炔基部分)遗传并入蛋白质中。然后，可通过包括(但不限于)休斯根[3+2]环加成反应(例如参看Padwa，A.，Comprehensive  Organic Synthesis，第4卷，(1991)Trost，B.M.编，Pergamon，Oxford，第1069-1109页；和Huisgen，R.，1，3-Dipolar Cycloaddition Chemistry，(1984)Padwa，A.编，Wiley，New York，第1-176页)分别用包括(但不限于)炔基或叠氮衍生物来修饰这些氨基酸侧链。因为此方法涉及环加成而非亲核取代，所以可以极高选择性修饰蛋白质。可在室温下在水性条件下通过向反应混合物中添加催化量的Cu(I)盐而以极佳区域选择性(1,4＞1,5)进行此反应。例如参看Tornoe等人，(2002)Org.Chem.67：3057-3064；以及Rostovtsev等人，(2002)Angew.Chem.Int.Ed.41：2596-2599。可使用的另一方法为在双砷化合物上用四半胱氨酸基元进行配体交换，例如参看Griffin等人，(1998)Science 281：269-272。

可通过[3+2]环加成而加成到本发明的瘦素多肽中的分子包括具有叠氮基或炔基衍生物的几乎任何分子。这些分子包括(但不限于)染料、荧光团、交联剂、糖类衍生物、聚合物(包括(但不限于)聚乙二醇的衍生物)、光交联剂、化学毒性化合物、亲和性标记、生物素衍生物、树脂、珠粒、第二蛋白质或多肽(或更多)、多核苷酸(包括(但不限于)DNA、RNA等)、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物等。这些分子可分别加成到具有炔基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对炔丙基氧基苯丙氨酸)或具有叠氮基的非天然氨基酸(包括(但不限于)对叠氮基-苯丙氨酸)中。

V.包含非遗传编码氨基酸的瘦素多肽的活体内产生

可使用经修饰的tRNA和tRNA合成酶在活体内产生本发明的瘦素多肽，以将其加成到天然存在的系统中无法编码的氨基酸中或取代所述氨基酸。

例如，使用天然存在的系统中无法编码的氨基酸来产生tRNA和tRNA合成酶的方法是描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，所述专利是以引用的方式并入本文中。这些方法涉及产生独立于翻译系统的内源性合成酶和tRNA起作用(且因此有时被称作“正交”)的翻译机构。通常，翻译系统包含正交tRNA(O-tRNA)以及正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)。通常，O-RS在翻译系统中优先利用至少一种非天然存在氨基酸使O-tRNA氨酰化且O-tRNA识别至少一个不被系统中的其它tRNA识别的选择密码子。因此，翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入系统中所产生的蛋白质中，从而“取代”氨基酸使其进入编码多肽的某一位置中。

所属领域中已描述用于将特定合成氨基酸插入多肽中的多种正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶，并且其通常适用于本发明中。举例来说，酮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶是描述于Wang，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100：56-61(2003)以及Zhang，Z.等人，Biochem.42(22)：6735-6746(2003)中。例示性O-RS或其部分是由多核苷酸序列编码并且包括美国专利申请公开案2003/0082575和2003/0108885中所揭示的氨基酸序列，所述专利各以引用的方式并入本文中。与O-RS一起使用的相应O-tRNA分子也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，所述专利是以引用的方式并入本文中。

叠氮基特异性O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶系统的实例描述于Chin，J.W.等人，J，Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)中。对叠氮基-L-Phe的例示性O-RS序列包括(但不限于)如以引用的方式并入本文中的美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO：14-16和29-32以及氨基酸序列SEQ ID NO：46-48和61-64。适用于本发明中的例示性O-tRNA序列包括(但不限于)如以引用的方式并入本文中的美国专利申请公开案2003/0108885(第10/126,931号)中所揭示的核苷酸序列SEQ ID NO：1-3。对特定非天然编码氨基酸具特异性的O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶对的其它实例描述于以引用的方式并入本文中的美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中。在酿酒酵母中并入含酮基与含叠氮基的氨基酸的O-RS和O-tRNA描述于Chin，J.W.等人，Science 301：964-967(2003)中。

O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的使用涉及选择编码非天然编码氨基酸的特定密码子。尽管可使用任何密码子，但通常希望选择在表达O-tRNA/氨酰基-tRNA合成酶的细胞中很少或从未使用的密码子。举例来说，例示性密码子包括无义密码子(例如终止密码子(琥珀、赭石和蛋白石))、四个或四个以上碱基的密码子以及很少使用或未使用过的其它天然三碱基密码子。

可使用所属领域中已知的诱变方法(包括(但不限于)位点特异性诱变、盒式诱变、限制选择诱变等)将特定的选择密码子引入4HB多核苷酸编码序列的适当位置中。

用于产生可用于并入非天然编码氨基酸的蛋白质生物合成机构的组分(例如O-RS、O-tRNA以及正交O-tRNA/O-RS对)的方法描述于Wang，L.等人，Science 292：498-500(2001)；Chin，J.W.等人，J.Am.Chem.Soc.124：9026-9027(2002)；Zhang，Z.等人，Biochemistry 42：6735-6746(2003)中。用于活体内并入非天然编码氨基酸的方法和组合物描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)中，所述专利是以引用的方式并入本文中。用于选择用于生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法也描述于美国专利申请公开案2003/0082575(第10/126,927号)和2003/0108885(第10/126,931号)中，所述专利是以引用的方式并入本文中。

用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法包含：(a)自第一生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选地突变)RS的文库，所述第一生物体包括(但不限于)原核生物体，例如詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌(T.thermophilus)等；或真核生物体；(b)在RS(任选地突变RS)的文库中选择(和/或筛选)在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的成员，从而提供活性(任选地突变)RS的池；和/或(c)在所述池中选择(任选地通过阴性选择)在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(包括(但不限于)突变RS)，从而提供至少一种重组O-RS；其中所述至少一种重组O-RS利用非天然编码氨基酸优先使O-tRNA氨酰化。

在一个实施例中，RS为非活性RS。非活性RS可通过使活性RS突变而产生。举例来说，可通过使至少约1个、至少约2个、至少约3个、至少约4个、至少约5个、至少约6个或至少约10个或10个以上氨基酸突变为不同氨基酸(包括(但不限于)丙氨酸)来产生非活性RS。

可使用所属领域中已知的各种技术来产生突变RS的文库，所述技术包括(但不限于)以蛋白质三维RS结构为基础的合理设计或在随机或合理设计技术中RS核苷酸的诱变。举例来说，可通过位点特异性突变、随机突变、产生多样性的重组突变、嵌合构建体、合理设计以及本文中所述或所属领域中已知的其它方法产生突变RS。

在一个实施例中，在RS(任选地突变RS)的文库中选择(和/或筛选)(包括(但不限于))在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下使正交tRNA(O-tRNA)氨酰基化的活性成员包括：将阳性选择或筛选标记物(包括(但不限于)抗生素抗性基因等)和(任选地突变)RS的文库引入多个细胞中，其中阳性选择和/或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)琥珀、赭石或蛋白石密码子)；使所述多个细胞在存在选择剂的情况下生长；通过抑制阳性选择或筛选标记物中的至少一个选择密码子来鉴别在存在选择剂和/或筛选剂的情况下存活(或显示特异性反应)的细胞，从而提供含有活性(任选地突变)RS的池的经阳性选择细胞的子集。任选地可改变选择剂和/或筛选剂浓度。

一方面，阳性选择标记物为氯霉素(chloramphenicol)乙酰基转移酶(CAT)基因并且在CAT基因中，选择密码子为琥珀终止密码子。任选地，阳性选择标记物为β-内酰胺酶基因且在β-内酰胺酶基因中，选择密码子为琥珀终止密码子。另一方面，阳性筛选标记物包含荧光或发光筛选标记物或基于亲和性的筛选标记物(包括(但不限于)细胞表面标记物)。

在一个实施例中，在池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使O-tRNA氨酰基化的活性RS(任选地突变体)包括：将阴性选择或筛选标记物与来自阳性选择或筛选的活性(任选地突变)RS的池引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)抗生素抗性基因，其包括(但不限于)氯霉素乙酰基转移酶(CAT)基因)；以及鉴别在补充有非天然编码氨基酸和筛选剂或选择剂的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应、但在未补充非天然编码氨基酸和选择剂或筛选剂的第二培养基中不能存活或显示特异性反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞。举例来说，CAT鉴别方案在适当O-RS重组体的确定中任选地充当阳性选择和/或阴性筛选。举例来说，任选地在存在或不存在一个或一个以上非天然编码氨基酸的情况下在含有CAT(其包含至少一个选择密码子)的生长板上复制克隆池。因此，认为仅在含有非天然编码氨基酸的平板上生长的集落含有重组O-RS。一方面，改变选择(和/或筛选)剂的浓度。在一些方面中，第一生物体与第二生物体不同。因此，第一生物体和/或第二生物体任选地包含：原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌(archaebacterium)、真细菌(eubacterium)、植物、昆虫、原生生物等。在其它实施例中，筛选标记物包含荧光或发光筛选标记物或基于亲和性的筛选标记物。

在另一实施例中，在池中筛选或选择(包括(但不限于)阴性选择)活性(任选地突变)RS包括：从阳性选择步骤(b)分离活性突变RS的池；将阴性选择或筛选标记物和活性(任选地突变)RS的池引入第二生物体的多个细胞中，其中阴性选择或筛选标记物包含至少一个选择密码子(包括(但不限于)包含至少一个选择密码子的毒性标记基因，其包括(但不限于)核糖核酸酶barnase基因)；以及鉴别在未补充非天然编码氨基酸的第一培养基中存活或显示特异性筛选反应、但在补充有非天然编码氨基酸的第二培养基中不能存活或显示特异性筛选反应的细胞，从而提供具有至少一种重组O-RS的存活细胞或筛选细胞，其中所述至少一种重组O-RS对非天然编码氨基酸具特异性。一方面，所述至少一个选择密码子包含约两个或两个以上选择密码子。这些实施例任选地可包括所述至少一个选择密码子包含两个或两个以上选择密码子的情形，以及第一生物体与第二生物体不同(包括(但不限于)各生物体任选地为(包括但不限于)原核生物、真核生物、哺乳动物、大肠杆菌、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等)的情形。另外，一些方面包括阴性选择标记物包含核糖核酸酶barnase基因(其包含至少一个选择密码子)的情形。其它方面包括筛选标记物任选地包含荧光或发光筛选标记物或基于亲和性的筛选标记物的情形。在本文中的实施例中，筛选和/或选择任选地包括筛选和/或选择严格度的变化。

在一个实施例中，用于产生至少一种重组正交氨酰基-tRNA合成酶(O-RS)的方法可进一步包含：(d)分离所述至少一种重组O-RS；(e)产生来源于所述至少一种重组O-RS的第二组O-RS(任选地突变体)；以及(f)重复步骤(b)和(c)，直到获得包含优先使O-tRNA氨酰基化的能力的突变O-RS。任选地，将步骤(d)-(f)重复(包括(但不限于))至少约两次。一方面，可通过诱变(包括(但不限于)随机诱变、位点特异性诱变、重组或其组合)产生来源于至少一种重组O-RS的第二组突变O-RS。

在上述方法中，选择/筛选步骤(包括(但不限于)阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c))的严格度任选地包括改变选择/筛选严格度。在另一实施例中，阳性选择/筛选步骤(b)、阴性选择/筛选步骤(c)或阳性与阴性选择/筛选步骤(b)与(c)包含使用报告基因，其中报告基因是通过荧光激活细胞分类(FACS)检测或其中报告基因是通过发光检测。报告基因任选地呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等且根据涉及非天然编码氨基酸或类似物的亲和性或催化活性进行选择。在一个实施例中，突变合成酶是呈现于细胞表面、噬菌体呈现上等。

用于产生重组正交tRNA(O-tRNA)的方法包括：(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA(包括(但不限于)抑制银子tRNA)的突变tRNA文库；(b)在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下由来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选地突变)tRNA，从而提供tRNA(任选地突变体)的池；以及(c)在所述tRNA(任选地突变体)池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA；其中所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰基化。在一些实施例中，所述至少一种tRNA为抑制因子tRNA和/或包含具有天然和/或非天然碱基的独特三碱基密码子，或为无义密码子、稀有密码子、非天然密码子、包含至少4个碱基的密码子、琥珀密码子、赭石密码子或蛋白石终止密码子。在一个实施例中，重组O-tRNA具有正交性的改良。应了解在一些实施例中，O-tRNA无需修饰而任选地从第二生物体引入第一生物体中。在各种实施例中，第一生物体与第二生物体相同或不同并且任选地选自(包括(但不限于))原核生物(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、大肠杆菌、嗜盐菌等)、真核生物、哺乳动物、真菌、酵母、古细菌、真细菌、植物、昆虫、原生生物等。另外，重组tRNA是由非天然编码氨基酸任选地氨酰基化，其中非天然编码氨基酸是在活体内天然生物合成或通过基因操纵生物合成。任选地将非天然编码氨基酸添加到至少第一生物体或第二生物体的生长培养基中。

一方面，在所述文库中选择(包括(但不限于)阴性选择)或筛选通过氨酰基-tRNA合成酶氨酰基化的(任选地突变)tRNA(步骤(b))包括：将毒性标记基因和(任选地突变)tRNA文库引入来自第二生物体的多个细胞中，其中毒性标记基因包含至少一个选择密码子(或导致产生毒性剂或抑制剂(static agent)的基因或生物体必需的基因，其中所述标记基因包含至少一个选择密码子)；以及选择存活细胞，其中存活细胞含有包含至少一个正交tRNA或非功能性tRNA的(任选地突变)tRNA的池。举例来说，可使用比较比率细胞密度检验来选择存活细胞。

另一方面，毒性标记基因可包括两个或两个以上选择密码子。在所述方法的另一个实施例中，毒性标记基因为核糖核酸酶barnase基因，其中核糖核酸酶barnase基因包含至少一个琥珀密码子。核糖核酸酶barnase基因任选地可包括两个或两个以上琥珀密码子。

在一个实施例中，在(任选地突变)tRNA的池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员可包括：将阳性选择或筛选标记基因以及O-RS和(任选地突变)tRNA的池引入来自第二生物体的多个细胞中，其中阳性标记基因包含药物抗性基因(其包括(但不限于)β-内酰胺酶基因，其包含至少一个选择密码子，例如至少一个琥珀终止密码子)或生物体必需的基因或使得毒性剂解毒的基因；以及鉴别在存在选择剂或筛选剂(包括(但不限于)抗生素)的情况下生长的存活或筛选细胞，从而提供具有至少一种重组tRNA的细胞池，其中所述至少一种重组tRNA是通过O-RS氨酰基化且回应所述至少一个选择密码子而将氨基酸插入由阳性标记基因编码的翻译产物中。在另一个实施例中，改变选择剂和/或筛选剂的浓度。

提供用于产生特异性O-tRNA/O-RS对的方法。所述方法包括：(a)由第一生物体产生来源于至少一种tRNA的突变tRNA的文库；(b)在所述文库中阴性选择或筛选在不存在来自第一生物体的RS的情况下通过来自第二生物体的氨酰基-tRNA合成酶(RS)氨酰基化的(任选地突变)tRNA，从而提供(任选地突变)tRNA池；(c)在(任选地突变)tRNA池中选择或筛选通过引入的正交RS(O-RS)氨酰基化的成员，从而提供至少一种重组O-tRNA。所述至少一种重组O-tRNA识别选择密码子并且无法由来自第二生物体的RS有效识别且通过O-RS优先氨酰基化。所述方法还包括(d)由第三生物体产生来源于至少一种氨酰基-tRNA合成酶(RS)的(任选地突变)RS的文库；(e)在所述突变RS文库中选择或筛选在存在非天然编码氨基酸和天然氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的成员，从而提供活性(任选地突变)RS池；和(f)在所述池中阴性选择或筛选在不存在非天然编码氨基酸的情况下优先使所述至少一种重组O-tRNA氨酰基化的活性(任选地突变)RS，从而提供至少一个特异性O-tRNA/O-RS对，其中所述至少一个特异性O-tRNA/O-RS对包含至少一种对非天然编码氨基酸具特异性的重组O-RS和所述至少一种重组O-tRNA。包括由所述方法产生的特异性O-tRNA/O-RS对。举例来说，特异性O-tRNA/O-RS对可包括(包括(但不限于))mutRNATyr-mutTyrRS对(例如mutRNATyr-SS12TyrRS对)、mutRNALeu-mutLeuRS对、mutRNAThr-mutThrRS对、mutRNAGlu-mutGluRS对等。另外，所述方法包括第一与第三生物体相同(包括(但不限于)詹氏甲烷球菌)的情形。

本发明中也包括选择用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对的方法。所述方法包括：将标记基因、tRNA和从第一生物体分离或获得的氨酰基-tRNA合成酶(RS)引入来自第二生物体的第一组细胞中；将标记基因和tRNA引入来自第二生物体的复制细胞组中；以及选择在复制细胞组中不能存活的第一组中的存活细胞或筛选显示特异性筛选反应但在复制细胞组中不能提供这种反应的细胞，其中第一组与复制细胞组是在存在选择剂或筛选剂的情况下生长，其中存活或筛选细胞包含用于第二生物体的活体内翻译系统中的正交tRNA-tRNA合成酶对。在一个实施例中，比较和选择或筛选包括活体内互补检验。可改变选择剂或筛选剂的浓度。

本发明的生物体包含多种生物体和多种组合。举例来说，本发明方法的第一生物体与第二生物体可能相同或不同。在一个实施例中，生物体任选地为原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。在一个实施例中，第一生物体是大肠杆菌。在另一实施例中，第二生物体是大肠杆菌，或第一和第二生物体都是大肠杆菌。或者，生物体任选地包含真核生物体，包括(但不限于)植物(包括(但不限于)复杂植物，例如单子叶植物或双子叶植物)、藻类、原生生物、真菌(包括(但不限于)酵母等)、动物(包括(但不限于)哺乳动物、昆虫、节肢动物等)等。在另一个实施例中，第二生物体为原核生物体，包括(但不限于)詹氏甲烷球菌、嗜热自养甲烷杆菌、嗜盐菌、大肠杆菌、超嗜热古菌、嗜盐菌、强烈炽热球菌、极端嗜热古菌、嗜热泉生古细菌、极端嗜热菌等。或者，第二生物体可为真核生物体，包括(但不限于)酵母、动物细胞、植物细胞、真菌、哺乳动物细胞等。在各个实施例中，第一生物体与第二生物体为不同的。

VI.非天然存在氨基酸在瘦素多肽中的位置

本发明涵盖将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入瘦素多肽中。可将一个或一个以上非天然存在氨基酸并入特定位置处而不破坏瘦素多肽的活性。这可通过进行“保守”取代来实现，所述取代包括(但不限于)用疏水性氨基酸取代疏水性氨基酸、用庞大氨基酸取代庞大氨基酸、用亲水性氨基酸取代亲水性氨基酸和/或在活性不需要的位置中插入非天然存在氨基酸。

瘦素的区可说明如下，其中氨基酸位置在中间行指出(SEQ ID NO：2)：

      螺旋A          螺旋B           螺旋C            螺旋D

[1-3]-[4-26]-[27-50]-[51-67]-[68-70]-[71-93]-[94-120]-[121-142]-[143-146]

N末端        A-B环           B-C环           C-D环              C末端

对于SEQ ID NO：4，所述区可说明如下，其中氨基酸位置在中间行指出：

     螺旋A          螺旋B           螺旋C            螺旋D

[14]-[5-27]-[28-51]-[52-68]-[69-71]-[72-94]-[95-121]-[122-143]-[144-147]

N末端       A-B环           B-C环           C-D环              C末端

可使用多种生物化学和结构方法来选择瘦素多肽内供非天然编码氨基酸取代的所需位点。所属领域的技术人员显而易见，多肽链的任何位置都适于选择以并入非天然编码氨基酸，并且选择可基于合理设计或通过随机选择来进行以实现任何目的或无特定需要的目的。所需位点的选择可用于产生具有任何所需性质或活性的四螺旋束分子(包括(但不限于)激动剂、超激动剂、反向激动剂、拮抗剂、受体结合调节剂、受体活性调节剂)、二聚物或多聚物形成、与天然分子相比不改变活性或性质，或操纵多肽的任何物理或化学性质(例如溶解性、聚集或稳定性)。举例来说，可使用所属领域中已知的丙氨酸扫描或同源物扫描方法来鉴别肽中为四螺旋束多肽的生物活性所需的位置。例如，参看Cunningham，B.和Wells，J.，Science，244：1081-1085(1989)(鉴别14个对hGH生物活性来说至关重要的残基)和Cunningham，B.等人，Science 243：1330-1336(1989)(使用同源物扫描诱变鉴别抗体和受体抗原决定基)。关于IFN，例如参看Di Marco等人，Biochem Biophys Res Com 202：1445(1994)；Walter等人，Cancer Biotherapy & Radiopharm.13：143(1998)；Runkel等人，J.B.C.273：8003(1998)。G-CSF丙氨酸扫描诱变研究描述于Reidhaar-Olson JF等人，Biochemistry(1996)7月16日；35(28)：9034-41；Young DC等人，Protein Sci.(1997)6月；6(6)：1228-36；和Layton等人，(1997)JBC 272(47)：29735-29741。例如，参看Bittorf，T.等人，FEBS，336：133-136(1993)(鉴别对hEPO活性来说至关重要的残基)；Wen，D.等人，JBC，269：22839-22846(1994)(使用丙氨酸扫描诱变鉴别hEPO在功能上重要的域)；和Elliot，S.等人，Blood，89：493-502(1997)(鉴别hEPO与人类EPO受体之间的关键静电相互作用)。除通过丙氨酸或同源物扫描诱变被鉴别为对生物活性至关重要的残基之外的残基可视多肽所追求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。或者，经鉴别为对生物活性至关重要的位点也可视多肽所追求的所需活性而为供非天然编码氨基酸取代的良好候选者。另一替代方法将为在瘦素多肽链上的各个位置中利用非天然编码氨基酸简单地进行连续取代并且观察对多肽活性的影响。所属领域的技术人员显而易见，在任何多肽中选择供非天然氨基酸取代的位置的任何方式、技术或方法都适用于本发明中。

也可检查含有缺失的瘦素多肽的天然存在突变体的结构和活性以确定可能允许用非天然编码氨基酸进行取代的蛋白质区。关于hGH，例如参看Kostyo等人，Biochem.Biophys.Acta，925：314(1987)；Lewis，U.等人，J.Biol.Chem.，253：2679-2687(1978)。关于hEPO，例如参看Bittorf等人，FEBS，336：133(1993)；Wen等人，JBC，269：22839(1994)。可以类似方式使用蛋白酶消化和单克隆抗体来鉴别负责结合4HB多肽受体的4HB多肽区。例如，参看Cunningham，B.等人，Science 243：1330-1336(1989)；Mills，J.等人，Endocrinology，107：391-399(1980)；Li，C.，Mol Cell Biochem.，46：31-41(1982)(指出残基134-149之间的氨基酸可缺失而不损失hGH活性)。Layton等人，(2001)JBC 276(39)36779-36787描述使用hG-CSF和其受体的抗体研究。在排除可能不允许经非天然编码氨基酸取代的残基后，可由4HB和其结合蛋白质的三维晶体结构研究所提出的取代在各剩余位置处的影响。关于hGH，参看de Vos，A.等人，Science，255：306-312(1992)；hGH的所有晶体结构都可在蛋白质数据库(包括3HHR、1AXI和1HWG)(Protein Data Bank；PDB，通过rcsb.org在万维网上获得)中获得，这一蛋白质数据库是含有蛋白质和核酸大分子的三维结构数据的集中数据库。hIFN的X射线结晶学和NMR结构也可在蛋白质数据库(1RH2和1ITF)以及美国专利第5,602,232号、第5,460,956号、第5,441,734号、第4,672,108号(其以引用的方式并入本文中)中获得。hG-CSF的X射线结晶学和NMR结构可以PDB ID：1CD9、1PGR、1RHG、1GNC在蛋白质数据库中以及美国专利第5,581,476号和第5,790,421号(其以引用的方式并入本文中)中获得。关于hEPO，参看Syed等人，Nature，395：511(1998)和Cheetham等人，Nature Structural Biology，5：861(1998)；hEPO的X射线结晶学和NMR结构可以PDB ID：1CN4、1EER和1BUY在蛋白质数据库中获得。因此，所属领域的技术人员可容易地鉴别可经非天然编码氨基酸取代的氨基酸位置。

在一些实施例中，本发明的瘦素多肽包含一个或一个以上位于蛋白质的某一区中而不破坏多肽的二级结构的非天然存在氨基酸。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区中的任何位置，所述区对应于瘦素中的二级结构，如下：结合位点I(由螺旋D的C末端形成)、结合位点II(包括螺旋A和C中的残基)、结合位点III(螺旋D的N末端中、连接螺旋C与D的环中和连接螺旋A与B的环中的残基)。

合并非天然碥码氨基酸的例示性残基可为如由四螺旋束多肽与其受体的三维晶体结构所预测，排除在潜在受体结合区(包括(但不限于)结合位点I、结合位点II和结合位点III)以外的残基、可完全或部分暴露于溶剂的残基、与附近残基具有极低或无氢键合相互作用的残基、可最小程度地暴露于附近反应性残基的残基以及可位于高度可挠区(包括(但不限于)C-D环)或结构刚性区(包括(但不限于)B螺旋)中的残基。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区中的任何位置，所述区对应于瘦素中的二级结构，如下：SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的1-3(N末端)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-146(C末端)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入一个或一个以上以下区中的任何位置，所述区对应于瘦素中的二级结构，如下：SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸的1-3(N末端)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-147(C末端)。

在其它实施例中，本发明的瘦素多肽包含至少一个取代位于hGH的至少一个选自由以下组成的群组的区中的至少一个氨基酸的非天然存在氨基酸：SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的1-3(N末端区)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-146(C末端)。在其它实施例中，本发明的瘦素多肽包含至少一个取代位于hGH的至少一个选自由以下组成的群组的区中的至少一个氨基酸的非天然存在氨基酸：SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸的1-3(N末端区)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-147(C末端)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入瘦素中的一个或一个以上以下位置中：hGH SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-55、56-60、61-65、66-70、71-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、101-105、106-110、111-115、116-120、121-125、126-130、131-135、136-140、141-146。在另一个实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入瘦素中的一个或一个以上以下位置中：hGH SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸的1-5、6-10、11-15、16-20、21-25、26-30、31-35、36-40、41-45、46-50、51-55、56-60、61-65、66-70、71-75、76-80、81-85、86-90、91-95、96-100、101-105、106-110、111-115、116-120、121-125、126-130、131-135、136-140、141-147。

一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性并入位点包括105、41、117、100、118、40、108、71、95、5、106、112、97、92、109、23、4、119、103、102、142、69、111、22、93、116、143、67、138、99、3、115、8、141、104、24、120、66、101、70、78、39、43、19、9、94、12、96、107、74、113、15、85、49、46、145、122、81、110或其任何组合(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。一个或一个以上非天然编码氨基酸的其它例示性并入位点包括106、42、118、101、119、41、109、72、96、6、107、113、98、93、110、24、5、120、104、103、143、70、112、23、94、117、144、68、139、100、4、116、9、142、105、25、121、67、102、71、79、40、44、20、10、95、13、97、108、75、114、16、86、50、47、146、123、82、111或其任何组合(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)或其任何组合(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1或3编码的相应氨基酸)。

合并一个或一个以上非天然碥码氨基酸的例示性位点的子集包括105、41、117、100、118、40、108、71、95、5、106、112、97、92、109、23、4、119、103、102、142、69、111、22、93、116和143或其任何组合(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。关于瘦素的晶体结构和其与瘦素受体的相互作用的研究指出，这些氨基酸残基的侧链可完全或部分地接近溶剂，且非天然编码氨基酸的侧链可远离蛋白质表面并进入溶剂中。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性并入位点包括45、65、66、99、104、107、110(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性并入位点包括46、66、67、100、105、108、111(SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸)。

可用多种非天然编码氨基酸取代瘦素多肽中的既定位置，或可将多种非天然编码氨基酸并入瘦素多肽中的既定位置中。一般来说，根据对瘦素多肽与其受体的三维晶体结构的研究来选择供并入的特定非天然编码氨基酸，其中优选保守取代(即，用基于芳基的非天然编码氨基酸(例如对乙酰基苯丙氨酸或O-炔丙基酪氨酸)取代Phe、Tyr或Trp)以及希望引入瘦素多肽中的特异性接合化学(例如，如果需要利用具有炔部分的水溶性聚合物来实现休根斯[3+2]环加成，或需要利用具有芳基酯(其又并入膦部分)的水溶性聚合物来形成酰胺键，那么引入4-叠氮基苯丙氨酸)。

在一个实施例中，所述方法进一步包括将非天然氨基酸并入蛋白质中，其中所述非天然氨基酸包含第一反应性基团；以及使蛋白质与包含第二反应性基团的分子(包括(但不限于)标记、染料、聚合物、水溶性聚合物、聚乙二醇的衍生物、光交联剂、细胞毒性化合物、药物、亲和性标记、光亲和性标记、反应性化合物、树脂、第二蛋白质或多肽或多肽类似物、抗体或抗体片段、金属螯合剂、辅因子、脂肪酸、碳水化合物、多核苷酸、DNA、RNA、反义多核苷酸、抑制性核糖核酸、生物材料、纳米粒子、自旋标记、荧光团、含金属的部分、放射性部分、新颖官能团、与其它分子共价或非共价相互作用的基团、光笼化部分、可光致异构化部分、生物素、生物素衍生物、生物素衍生物、生物素类似物、结合有重原子的部分、可化学裂解的基团、可光裂解的基团、延长的侧链、碳连接的糖、氧化还原活性剂、氨基硫代酸、毒性部分、经同位素标记的部分、生物物理探针、磷光基团、化学发光基团、电子致密基团、磁性基团、插入基团、发色团、能量转移剂、生物活性剂、可检测标记、小分子或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质)接触。第一反应性基团与第二反应性基团反应以使分子通过[3+2]环加成与非天然氨基酸连接。在一个实施例中，第一反应性基团为炔基或叠氮部分，并且第二反应性基团为叠氮基或炔基部分。举例来说，第一反应性基团为炔基部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对炔丙基氧基苯丙氨酸中)并且第二反应性基团为叠氮部分。在另一实例中，第一反应性基团为叠氮部分(包括(但不限于)在非天然氨基酸对叠氮基-L-苯丙氨酸中)并且第二反应性基团为炔基部分。

在一些情况下，将非天然编码氨基酸取代与瘦素多肽内的其它添加、取代或缺失组合以影响瘦素多肽的其它生物特性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加瘦素多肽的稳定性(包括(但不限于)对蛋白水解降解的抵抗性)或增加瘦素多肽对其受体的亲和性。在一些情况下，其它添加、取代或缺失可增加瘦素多肽的溶解性(包括(但不限于)在大肠杆菌或其它宿主细胞中表达时)。在一些实施例中，添加、取代或缺失可增加在大肠杆菌重组宿主细胞中表达后的多肽溶解性。在一些实施例中，选择供天然编码或非天然氨基酸取代的位点，以及选择另一供并入非天然氨基酸的位点，这使得在大肠杆菌重组宿主细胞中表达后多肽溶解性增加。hEPO中用于氨基酸取代以增加溶解性的所述位点的实例为N36、Q86、G113和/或Q115，其可经Lys、Arg、Glu或任何其它带电的天然编码或非天然编码氨基酸取代(SEQ ID NO：38)。在一些实施例中，瘦素多肽包含另一添加、取代或缺失，所述添加、取代或缺失调节瘦素多肽受体的亲和性、调节(包括(但不限于)增加或减小)受体二聚、稳定受体二聚物、调节循环半衰期、调节释放和生物可用性、促进纯化或改良或改变特定投药途径。举例来说，除引入本文所述的一个或一个以上非天然编码氨基酸以外，还可引入一个或一个以上以下取代：F10A、F10H或F10I；M14W、M14Q或M14G；H18D；H21N；R167N；D171S；E174S；F176Y和I179T，以增加hGH变异体对其受体的亲和性。举例来说，除引入本文所述的一个或一个以上非天然编码氨基酸以外，还可引入一个或一个以上以下取代：S9A、F48S、Y49S、A50S、Q59A、A73G、G101A、T106A、L108A、T132A、R139A、K140A、R143A、S146A、N147A、R150A和K154A，以增加hEPO变异体对其受体的亲和性(Wen等人，(1994)JBC 269：22839-22846)。类似地，瘦素多肽可包含改良多肽的检测(包括(但不限于)GFP)、纯化或其它特性的蛋白酶裂解序列、反应性基团、抗体结合域(包括(但不限于)FLAG或poly-His)或其它基于亲和性的序列(包括(但不限于)FLAG、poly-His、GST等)或连接分子(包括(但不限于)生物素)。

在一些实施例中，非天然编码氨基酸的取代会产生瘦素拮抗剂。在一些实施例中，瘦素拮抗剂包含至少一个位于以下区中的取代：SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的1-3(N末端区)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-146(C末端)，使得瘦素充当拮抗剂。在其它实施例中，瘦素拮抗剂包含至少一个位于以下区中的取代：SEQ ID NO：4或由SEQ ID NO：3编码的相应氨基酸的1-4(N末端区)、5-27(A螺旋)、28-51(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、52-68(B螺旋)、69-71(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、72-94(C螺旋)、95-121(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、122-143(D螺旋)、144-148(C末端区)，使得瘦素充当拮抗剂。在其它实施例中，合并非天然碥码氨基酸的例示性位点包括螺旋A的氨基末端区和螺旋C的一部分内的残基。在另一个实施例中，氨基酸120、121、122或其任何组合经非天然编码氨基酸(诸如对叠氮基-L-苯丙氨酸或O-炔丙基-L-酪氨酸)取代。在其它实施例中，以上所列的取代与使瘦素多肽成为瘦素拮抗剂的其它取代组合。在一些实施例中，瘦素拮抗剂包含与存在于瘦素分子的受体结合区中的水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。

在一些情况下，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上氨基酸经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代。在一些情况下，瘦素多肽进一步包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上天然存在氨基酸经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代。举例来说，在一些实施例中，瘦素的以下区中的至少两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1编码的相应氨基酸的1-3(N末端区)、4-26(A螺旋)、27-50(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、51-67(B螺旋)、68-70(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、71-93(C螺旋)、94-120(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、121-142(D螺旋)、143-146(C末端)。在一些实施例中，瘦素的以下区中的至少两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：SEQ ID NO：4或由SEQID NO：3编码的相应氨基酸的1-4(N末端区)、5-27(A螺旋)、28-51(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、52-68(B螺旋)、69-71(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、72-94(C螺旋)、95-121(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、122-143(D螺旋)、144-148(C末端区)。在一些情况下，两个或两个以上非天然编码残基与一个或一个以上具有较低分子量的线性或支化PEG(质量为约5-20kDa或更低)连接，从而相对于与单一较高分子量PEG连接的物质增强结合亲和性并且具有可相当的血清半衰期。

在一些实施例中，hGH的以下位置处的残基中至多有两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：105、41、117、100、118、40、108、71、95、5、106、112、97、92、109、23、4、119、103、102、142、69、111、22、93、116、143、67、138、99、3、115、8、141、104、24、120、66、101、70、78、39、43、19、9、94、12、96、107、74、113、15、85、49、46、145、122、81、110或其任何组合(SEQ ID NO：2)。在一些实施例中，hGH的以下位置处的残基中至多有两个残基经一个或一个以上非天然编码氨基酸取代：106、42、118、101、119、41、109、72、96、6、107、113、98、93、110、24、5、120、104、103、143、70、112、23、94、117、144、68、139、100、4、116、9、142、105、25、121、67、102、71、79、40、44、20、10、95、13、97、108、75、114、16、86、50、47、146、123、82、111或其任何组合(SEQ ID NO：4)。

VII.非真核细胞和真核细胞中的表达

为获得克隆的瘦素多核苷酸的高水平表达，通常将编码本发明的瘦素多肽的多核苷酸亚克隆到含有指导转录的强启动子、转录/翻译终止子以及(如果就编码蛋白质的核酸来说)供翻译起始的核糖体结合位点的表达载体中。合适的细菌启动子在所属领域中为熟知的，并且例如描述于Sambrook等人以及Ausubel等人中。

用于表达本发明的瘦素多肽的细菌表达系统可在(包括但不限于)大肠杆菌中获得。用于这些表达系统的试剂盒在市面上有售。所属领域中熟知哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统，并且其也在市面上有售。在使用正交tRNA和氨酰基tRNA合成酶(上述)来表达本发明的瘦素多肽的情况下，用于表达的宿主细胞是根据其使用正交组分的能力进行选择。例示性宿主细胞包括革兰氏阳性细菌(Gram-positive bacteria)(包括(但不限于)短小芽孢杆菌(B.brevis)、枯草杆菌(B.subtilis)或链霉菌(Streptomyces))和革兰氏阴性细菌(Gram-negative bacteria)(大肠杆菌、荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌、恶臭假单胞菌)，以及酵母和其它真核细胞。如本文中所述，可使用包含O-tRNA/O-RS对的细胞。

本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。一方面，组合物任选地包括(包括但不限于)至少10微克、至少50微克、至少75微克、至少100微克、至少200微克、至少250微克、至少500微克、至少1毫克、至少10毫克、至少100毫克、至少1克或1克以上包含非天然氨基酸的蛋白质，或可通过活体内蛋白质制备方法所实现的量的所述蛋白质(关于重组蛋白制备和纯化的细节提供于本文中)。另一方面，所述蛋白质任选地以在(包括但不限于)细胞溶菌液、缓冲液、医药缓冲液或其它液体悬浮液(包括但不限于体积(包括但不限于)约为约1nl到约100L)中(包括但不限于)每升至少10微克蛋白质、每升至少50微克蛋白质、每升至少75微克蛋白质、每升至少100微克蛋白质、每升至少200微克蛋白质、每升至少250微克蛋白质、每升至少500微克蛋白质、每升至少1毫克蛋白质或每升至少10毫克或10毫克以上蛋白质的浓度存在于组合物中。在真核细胞中产生大量(包括但不限于大于用其它方法(包括但不限于活体外翻译)通常可能获得的量)包括至少一个非天然氨基酸的蛋白质是本发明的特征。

本发明的真核宿主细胞或非真核宿主细胞提供生物合成较大有用量的包含非天然氨基酸的蛋白质的能力。举例来说，可在细胞提取物、细胞溶菌液、培养基、缓冲液等中产生蛋白质浓度为(包括但不限于)至少10微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至少250微克/升或至少500微克/升、至少1毫克/升、至少2毫克/升、至少3毫克/升、至少4毫克/升、至少5毫克/升、至少6毫克/升、至少7毫克/升、至少8毫克/升、至少9毫克/升、至少10毫克/升、至少20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900毫克/升、1克/升、5克/升、10克/升或10克/升以上的包含非天然氨基酸的蛋白质。

I.表达系统、培养和分离

瘦素多肽可在任何数目的合适表达系统(例如包括酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞和细菌)中表达。例示性表达系统的描述提供于下文中。

酵母：如本文中所用，术语“酵母”包括能够表达编码瘦素多肽的基因的各种酵母中的任一者。所述酵母包括(但不限于)产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、担孢子酵母(basidiosporogenous)和属于半知菌(芽孢纲(Blastomycetes))类的酵母。产子囊酵母分为两个科：蚀精霉科(Spermophthoraceae)和酵母菌科(Saccharomycetaceae)。后者包含四个亚科，即裂殖酵母亚科(Schizosaccharomycoideae)(例如，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)属)、拿逊酵母亚科(Nadsonioideae)、脂酵母亚科(Lipomycoideae)以及酵母亚科(Saccharomycoideae)(例如，毕赤酵母(Pichia)属、克鲁维酵母(Kluyveromyces)属和酵母菌(Saccharomyces)属)。担孢子酵母包括白冬孢酵母(Leucosporidium)属、红冬孢酵母(Rhodosporidium)属、锁掷酵母(Sporidiobolus)属、线黑粉酵母(Filobasidium)属和香灰拟锁担菌(Filobasidiella)属。属于半知菌(芽孢纲)类的酵母分为两个科：掷孢酵母科(Sporobolomycelaceae)(例如，掷孢酵母(Sporoholomyces)属和布勒掷孢酵母(Bullera)属)和隐球酵母科(Cryptococcaceae)(例如，假丝酵母(Candida)属)。

尤其受关注的供本发明使用的物种为毕赤酵母属、克鲁维酵母属、酵母菌属、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、球拟酵母属(Torulopsis)和假丝酵母属内的物种，其包括(但不限于)巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、谷勒氏酵母(P.guillerimondii)、酿酒酵母、卡尔斯伯酵母(S.carlsbergensis)、糖化酵母(S.diastaticus)、道格拉斯酵母(S.douglasii)、克鲁维酵母(S.kluyveri)、诺本酵母(S.norbensis)、卵形酵母(S.oviformis)、乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)、白假丝酵母菌(C.albicans)、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)和汉森酵母(H.polymorpha)。

适用于表达瘦素多肽的酵母的选择是在所属领域的技术人员的技能范围内。在选择用于表达的酵母宿主时，合适的宿主可包括显示具有(例如)良好分泌能力、低蛋白水解活性、良好分泌能力、良好可溶性蛋白质产生以及总体坚固性的酵母宿主。酵母通常可获自多种来源，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系酵母基因保藏中心(Yeast Genetic Stock Center，Department of Biophysics and Medical Physics，University of California，Berkeley，CA)和美国典型菌种保藏中心(American Type Culture Collection，“ATCC”)(Manassas，VA)。

术语“酵母宿主”或“酵母宿主细胞”包括可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的酵母。所述术语包括已接受重组载体或其它转移DNA的原始酵母宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全一致。与将要以相关性质(例如存在编码瘦素多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。

已开发包括染色体外复制子或整合载体的表达和转化载体以将其转化到多种酵母宿主中。举例来说，已开发用于以下各酵母的表达载体：酿酒酵母(Sikorski等人，GENETICS(1998)112：19；Ito等人，J.BACTERIOL.(1983)153：163；Hinnen等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1978)75：1929)；白假丝酵母菌(Kurtz等人，MOL.CELL.BIOL.(1986)6：142)；麦芽糖假丝酵母(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25：141)；汉森酵母(Gleeson等人，J.GEN.MICROBIOL.(1986)132：3459；Roggenkamp等人，MOL.GEN.GENET.(1986)202：302)；脆壁克鲁维酵母(Das等人，J.BACTERIOL.(1984)158：1165)；乳酸克鲁维酵母(De Louvencourt等人，J.BACTERIOL.(1983)154：737；Van den Berg等人，BIO/TECHNOLOGY(NY)(1990)8：135)；谷勒氏酵母(Kunze等人，J.BASIC MICROBIOL.(1985)25：141)；巴斯德毕赤酵母(美国专利第5,324,639号；第4,929,555号；和第4,837,148号；Cregg等人，MOL.CELL.BIOL.(1985)5：3376)；粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)(Beach和Nurse，NATURE(1981)300：706)；以及解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)(Davidow等人，CURR.GENET.(1985)10：380(1985)；Gaillardin等人，CURR.GENET.(1985)10：49)；构巢曲霉(A.nidulans)(Ballance等人，BIOCHEM.BIOPHYS.RES.COMMUN.(1983)112：284-89；Tilburn等人，GENE(1983)26：205-221；和Yelton等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1984)81：1470-74)；黑曲霉(A.niger)(Kelly和Hynes，EMBO J.(1985)4：475479)；里氏木霉(T.reesia)(EP 0244234)；和丝状真菌，例如脉孢菌(Neurospora)、青霉菌(Penicillium)、弯颈霉(Tolypocladium)(WO 91/00357)，其中各文献是以引用的方式并入本文中。

所属领域的技术人员熟知用于酵母载体的控制序列，并且所述序列包括(但不限于)来自以下基因的启动子区域：例如，醇脱氢酶(ADH)(EP 0 284 044)；烯醇酶；葡萄糖激酶；葡萄糖-6-磷酸异构酶；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(GAP或GAPDH)；己糖激酶；磷酸果糖激酶；3-磷酸甘油酸变位酶；和丙酮酸激酶(PyK)(EP 0 329 203)。编码酸性磷酸酶的酵母PHO5基因也可提供适用的启动子序列(Miyanohara等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1983)80：1)。用于酵母宿主的其它合适的启动子序列可包括3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman等人，J.BIOL.CHEM.(1980)255：2073)和其它糖解酶(例如丙酮酸脱羧酶、磷酸丙糖异构酶和磷酸葡萄糖异构酶(Holland等人，BIOCHEMISTRY(1978)17：4900；Hess等人，J.ADV.ENZYME REG.(1968)7：149))的启动子。具有由生长条件控制的转录的其它优点的可诱导酵母启动子可包括醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、与氮代谢相关的降解酶以及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区域。适用于酵母表达的载体和启动子进一步描述于EP 0 073 657中。

酵母增强子也可与酵母启动子一起使用。另外，合成启动子也可充当酵母启动子。举例来说，酵母启动子的上游活化序列(UAS)可与另一酵母启动子的转录活化区域连接，从而产生合成杂合启动子。所述杂合启动子的实例包括与GAP转录活化区域连接的ADH调节序列。参看美国专利第4,880,734号和第4,876,197号，其是以引用的方式并入本文中。杂合启动子的其它实例包括由ADH2、GAL4、GAL10或PHO5基因的调节序列连接糖解酶基因(例如GAP或PyK)的转录活化区域所组成的启动子。参看EP 0164 556。此外，酵母启动子可包括具有与酵母RNA聚合酶结合并起始转录的能力的非酵母来源的天然存在启动子。

可构成酵母表达载体的一部分的其它控制元件包括例如来自GAPDH或烯醇酶基因的终止子(Holland等人，J.BIOL.CHEM.(1981)256：1385)。另外，来自2μ质粒来源的复制起点适用于酵母。适用于酵母的选择基因为酵母质粒中存在的trp1基因。参看Tschemper等人，GENE(1980)10：157；Kingsman等人，GENE(1979)7：141。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长的能力的酵母的突变菌株提供选择标记物。类似地，由带有Leu2基因的已知质粒补充Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。

所属领域的技术人员熟知将外源DNA引入酵母宿主中的方法，并且所述方法通常包括(但不限于)转化原生质球状体或经碱性阳离子处理的完整酵母宿主细胞。举例来说，可根据Hsiao等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.USA(1979)76：3829和Van Solingen等人，J.BACT.(1977)130：946中所述的方法来进行酵母的转化。然而，也可如Sambrook等人，MOLECULAR CLONING：A LAB.MANUAL(2001)中通常所述来使用将DNA引入细胞中的其它方法(例如通过核注射、电穿孔或原生质体融合)。随后，可使用所属领域的技术人员已知的标准技术来培养酵母宿主细胞。

所属领域的技术人员熟知在酵母宿主细胞中表达异源蛋白的其它方法。通常参看美国专利公开案第20020055169号；美国专利第6,361,969号；第6,312,923号；第6,183,985号；第6,083,723号；第6,017,731号；第5,674,706号；第5,629,203号；第5,602,034号；和第5,089,398号；美国复审专利第RE37,343号和第RE35,749号；PCT公开专利申请案WO 99/078621；WO 98/37208；和WO 98/26080；欧洲专利申请案EP 0 946 736；EP 0 732 403；EP 0 480 480；EP 0 460 071；EP 0 340 986；EP 0 329 203；EP 0 324 274；和EP 0164556。也参看Gellissen等人，ANTONIE VAN LEEUWENHOEK(1992)62(1-2)：79-93；Romanos等人，YEAST(1992)8(6)：423-488；Goeddel，METHODS IN ENZYMOLOGY(1990)185：3-7，其各自以引用的方式并入本文中。

在使用所属领域的技术人员熟知的标准进料分批发酵方法进行的扩增阶段期间，可使酵母宿主菌株在发酵罐中生长。所述发酵方法可适用于解释特定酵母宿主的碳利用途径或表达控制模式的差异。举例来说，酵母菌酵母宿主的发酵可能需要单一葡萄糖进料、复杂氮源(例如，酪蛋白水解产物)和多种维生素补充。相反，甲基营养型酵母巴斯德毕赤酵母可能需要甘油、甲醇和痕量矿物进料，但仅需要简单铵(氮)盐以进行最佳生长和表达。例如，参看美国专利第5,324,639号；Elliott等人，J.PROTEIN CHEM.(1990)9：95；和Fieschko等人，BIOTECH.BIOENG.(1987)29：1113，其是以引用的方式并入本文中。

然而，所述发酵方法可具有与所用的酵母宿主菌株无关的某些常见特征。举例来说，在扩增阶段期间，可将限制生长的营养素(通常为碳)添加到发酵罐中以允许最大生长。另外，发酵方法通常使用经设计成含有适量碳、氮、基本盐、磷和其它微量营养素(维生素、痕量矿物和盐等)的发酵培养基。适用于毕赤酵母的发酵培养基的实例描述于美国专利第5,324,639号和第5,231,178号中，其是以引用的方式并入本文中。

感染杆状病毒的昆虫细胞：术语“昆虫宿主”或“昆虫宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的昆虫。所述术语包括已经转染的原始昆虫宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。与将要以相关性质(例如存在编码瘦素多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。

所属领域的技术人员熟知适用于表达瘦素多肽的昆虫细胞的选择。多种昆虫物种在所属领域中得到充分描述并且在市面上有售，其包括埃及伊蚊(Aedes aegypti)、桑蚕(Bombyx mori)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)和粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)。在选择用于表达的昆虫宿主时，合适的宿主可包括显示具有良好分泌能力、低蛋白水解活性和总体稳固性的宿主。昆虫通常可获自多种来源，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系昆虫基因保藏中心(Berkeley，CA)；和美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA)。

通常，感染杆状病毒的昆虫表达系统的组分包括：转移载体(通常为细菌质粒)，其含有杆状病毒基因组的片段和用于插入欲表达的异源基因的便利限制位点；野生型杆状病毒，其具有与转移载体中的杆状病毒特异性片段同源的序列(这允许将异源基因同源重组到杆状病毒基因组中)；以及适当的昆虫宿主细胞和生长培养基。所属领域中已知用于构建载体、转染细胞、挑选斑块、使细胞在培养物中生长等的材料、方法和技术并且可使用描述这些技术的手册。

在将异源基因插入转移载体中之后，将载体和野生型病毒基因组转染到昆虫宿主细胞中，其中载体与病毒基因组重组。表达经包装的重组病毒，并且鉴别和纯化重组体斑块。用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的材料和方法可以试剂盒形式购自例如Invitrogen Corp.(Carlsbad，CA)。所属领域的技术人员通常已知这些技术，并且所述技术全面描述于SUMMERS AND SMITH，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN，第1555期，(1987)中，其是以引用的方式并入本文中。也参看RICHARDSON，39 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY：BACULOVIRUS EXPRESSION PROTOCOLS(1995)；Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY 16.9-16.11(1994)；King和Possee，THE BACULOVIRUS SYSTEM：A LABORATORY GUIDE(1992)；以及O′Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。

实际上，所属领域中熟知使用杆状病毒/昆虫细胞表达系统来制备各种异源蛋白质。例如，参看美国专利第6,368,825号；第6,342,216号；第6,338,846号；第6,261,805号；第6,245,528号；第6,225,060号；第6,183,987号；第6,168,932号；第6,126,944号；第6,096,304号；第6,013,433号；第5,965,393号；第5,939,285号；第5,891,676号；第5,871,986号；第5,861,279号；第5,858,368号；第5,843,733号；第5,762,939号；第5,753,220号；第5,605,827号；第5,583,023号；第5,571,709号；第5,516,657号；第5,290,686号；WO 02/06305；WO 01/90390；WO 01/27301；WO 01/05956；WO 00/55345；WO 00/20032；WO 99/51721；WO 99/45130；WO 99/31257；WO 99/10515；WO 99/09193；WO 97/26332；WO 96/29400；WO 96/25496；WO 96/06161；WO 95/20672；WO 93/03173；WO 92/16619；WO 92/03628；WO 92/01801；WO 90/14428；WO 90/10078；WO 90/02566；WO 90/02186；WO 90/01556；WO 89/01038；WO 89/01037；WO 88/07082，其是以引用的方式并入本文中。

所属领域中已知适用于杆状病毒/昆虫细胞表达系统的载体，并且所述载体例如包括从杆状病毒苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)获得的昆虫表达和转移载体，其为不依赖于辅助细胞的病毒表达载体。从此系统得到的病毒表达载体通常使用强病毒多角体蛋白基因启动子来驱动异源基因的表达。通常参看Reilly等人，BACULOVIRUS EXPRESSION VECTORS：A LABORATORY MANUAL(1992)。

在将外来基因插入杆状病毒基因组中之前，通常将包含启动子、前导序列(必要时)、所关注的编码序列和转录终止序列的上述组分组装到中间错位构建体(intermediate transplacement construct)(转移载体)中。中间错位构建体通常保持在能够稳定保持在宿主(例如细菌)中的复制子(例如染色体外元件(例如，质粒))中。复制子将具有复制系统，因此使其保持在适用于克隆和扩增的宿主中。更具体来说，质粒可含有多角体蛋白聚腺苷酸化信号(Miller等人，ANN.REV.MICROBIOL.(1988)42：177)和用于在大肠杆菌中选择和繁殖的原核氨苄西林(ampicillin)抗性(amp)基因和复制起点。

一种将外来基因引入AcNPV中的常用转移载体为pAc373。也已经对所属领域的技术人员已知的多种其它载体进行设计，所述载体包括(例如)pVL985，其将多角体蛋白起始密码子从ATG改变为ATT，并且其在ATT下游32个碱基对处引入BamHI克隆位点。参看Luckow和Summers，17VIROLOGY 31(1989)。其它市售载体例如包括PBlueBac4.5/V5-His；pBlueBacHis2；pMelBac；pBlueBac4.5(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)。

在插入异源基因之后，将转移载体和野生型杆状病毒基因组共转染到昆虫细胞宿主中。所属领域中已知将异源DNA引入杆状病毒的所需位点中的方法。参看Summers和Smith，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN，第1555期，(1987)；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156；Luckow和Summers，VIROLOGY(1989)17：31。举例来说，可通过同源双交叉重组插入例如多角体蛋白基因等基因中；也可插入所需杆状病毒基因中工程改造过的限制酶位点中。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)4：91。

可通过电穿孔来实现转染。参看TROTTER和WOOD，39METHODS IN MOLECULARBIOLOGY(1995)；MANN和KING，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。或者，可使用脂质体以重组表达载体和杆状病毒转染昆虫细胞。例如，参看Liebman等人，BIOTECHMQUES(1999)26(1)：36；Graves等人，BIOCHEMISTRY(1998)37：6050；Nomura等人，J.BIOL.CHEM.(1998)273(22)：13570；Schmidt等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1998)12：323；Siffert等人，NATURE GENETICS(1998)18：45；Tilkins等人，CELL BIOLOGY：A LABORATORY HANDBOOK 145-154(1998)；Cai等人，PROTEIN EXPRESSION AND PURIFICATION(1997)10：263；Dolphin等人，NATURE GENETICS(1997)17：491；Kost等人，GENE(1997)190：139；Jakobsson等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271：22203；Rowles等人，J.BIOL.CHEM.(L996)271(37)：223/6；Reverey等人，J.BIOL.CHEM.(1996)271(39)：23607-10；Stanley等人，J.BIOL.CHEM.(1995)270：4121；Sisk等人，J.VIROL.(1994)68(2)：766；以及Peng等人，BIOTECHNIQUES(1993)14(2)：274。市售脂质体例如包括Cellfectin和Lipofectin(Invitrogen，Corp.，Carlsbad，CA)。另外，也可使用磷酸钙转染。参看Trotter和Wood，39METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY(1995)；KITTS，NAR(1990)18(19)：5667；以及Mann和King，J.GEN.VIROL.(1989)70：3501。

杆状病毒表达载体通常含有杆状病毒启动子。杆状病毒启动子是能够与杆状病毒RNA聚合酶结合并起始编码序列(例如，结构基因)下游(3′)转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5′端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。杆状病毒启动子也可具有被称作增强子的第二域，当存在所述域时，其通常在结构基因的末梢。此外，表达可经调节或为组成性的。

在感染周期的末期大量转录的结构基因提供尤其适用的启动子序列。实例包括源自编码病毒多面体蛋白的基因(Friesen等人，The Regulation of Baculovirus Gene Expression，THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES(1986)；EP 0 127 839和0 155 476)和编码p10蛋白的基因(Vlak等人，J.GEN.VIROL.(1988)69：765)的序列。

将新近形成的杆状病毒表达载体包装到感染性重组杆状病毒中并且随后可通过所属领域的技术人员已知的技术来纯化所生长斑块。参看Miller等人，BIOESSAYS(1989)4：91；SUMMERS和Smith，TEXAS AGRICULTURAL EXPERIMENT STATION BULLETIN，第1555期，(1987)。

已开发用于感染到多种昆虫细胞中的重组杆状病毒表达载体。举例来说，已开发用于埃及伊蚊(ATCC第CCL-125号)、桑蚕(ATCC第CRL-8910号)、黑腹果蝇(ATCC第1963号)、草地贪夜蛾和粉纹夜蛾的重组杆状病毒。参看WO 89/046,699；Wright，NATURE(1986)321：718；Carbonell等人，J.VIROL(1985)56：153；Smith等人，MOL.CELL.BIOL.(1983)3：2156。通常参看Fraser等人，In Vitro CELL.DEV.BIOL.(1989)25：225。更具体来说，用于杆状病毒表达载体系统的细胞系通常包括(但不限于)Sf9(草地贪夜蛾)(ATCC第CRL-1711号)、Sf21(草地贪夜蛾)(Invitrogen Corp.，目录号11497-013(Carlsbad，CA))、Tri-368(粉纹夜蛾)和High-Five^TM BTI-TN-5B1-4(粉纹夜蛾)。

用于异源多肽在杆状病毒/表达载体中的直接表达和融合表达的细胞和培养基在市面上有售，并且所属领域的技术人员通常已知细胞培养技术。

大肠杆菌和其它原核生物：所属领域中熟知细菌表达技术。多种载体可用于细菌宿主中。载体可为单拷贝或低或高的多拷贝载体。载体可用于克隆和/或表达。鉴于关于载体的丰富文献、多种载体的商业可得性以及甚至描述载体和其限制酶图谱以及特征的手册，在本文中无需广泛讨论。众所周知，载体通常涉及允许选择的标记物，这些标记物可提供细胞毒性剂抗性、原营养或免疫性。通常存在多个标记物，其提供不同特征。

细菌启动子为能够结合细菌RNA聚合酶并起始编码序列(例如结构基因)下游(3′)转录进入mRNA中的任何DNA序列。启动子将具有通常与编码序列的5′端最接近放置的转录起始区。此转录起始区通常包括RNA聚合酶结合位点和转录起始位点。细菌启动子也可具有被称作操纵基因的第二域，其可与开始RNA合成的相邻RNA聚合酶结合位点重叠。操纵基因允许阴性调节(可诱导)转录，这是因为基因抑制蛋白可结合操纵基因并从而抑制特定基因的转录。在不存在阴性调节元件(例如操纵基因)的情况下可发生组成性表达。另外，可通过基因活化蛋白结合序列实现阳性调节，当存在所述结合序列时，所述序列通常最接近RNA聚合酶结合序列的(5′)。基因活化蛋白的实例为代谢产物活化蛋白(CAP)，其有助于起始大肠杆菌中lac操纵子的转录[Raibaud等人，ANNU.REV.GENET.(1984)18：173]。因此，经调节的表达可为阳性或阴性，从而增强或减弱转录。

编码代谢途径酶的序列提供尤其适用的启动子序列。实例包括来源于糖代谢酶(例如半乳糖、乳糖(lac)[Chang等人，NATURE(1977)198：1056]以及麦芽糖)的启动子序列。其它实例包括来源于生物合成酶(例如色氨酸(trp))的启动子序列[Goeddel等人，Nuc.Acids Res.(1980)8：4057；Yelverton等人，NUCL.ACIDS RES.(1981)9：731；美国专利第4,738,921号；欧洲公开案第036776号以及第121775号，其是以引用的方式并入本文中]。β-半乳糖苷酶(bla)启动子系统[Weissmann(1981)″The cloning of interferon and other mistakes.″Interferon 3(I.Gresser编)]、噬菌体λPL[Shimatake等人，NATURE(1981)292：128]以及T5[美国专利第4,689,406号，其是以引用的方式并入本文中]启动子系统也提供适用的启动子序列。本发明的优选方法利用强启动子(例如T7启动子)来诱导高含量的瘦素多肽。所属领域中熟知这些载体的实例，并且其包括来自Novagen的pET29系列以及WO99/05297(其是以引用的方式并入本文中)中所述的pPOP载体。这些表达系统在宿主中产生高含量的瘦素多肽，而不损害宿主细胞生存能力或生长参数。

另外，自然界中不存在的合成启动子也充当细菌启动子。举例来说，可将一个细菌或噬菌体启动子的转录活化序列与另一细菌或噬菌体启动子的操纵子序列连接，从而产生合成杂合启动子[美国专利第4,551,433号，其是以引用的方式并入本文中]。举例来说，tac启动子是包含trp启动子与lac操纵子序列的杂合trp-lac启动子，其由lac阻遏物调节[Amann等人，GENE(1983)25：167；de Boer等人，PROC.NATL.ACAD.SCI.(1983)80：21]。此外，细菌启动子可包括非细菌来源的天然存在启动子，其具有与细菌RNA聚合酶结合并起始转录的能力。也可将非细菌来源的天然存在启动子与可相容的RNA聚合酶偶合以产生一些基因在原核生物中的高水平表达。噬菌体T7RNA聚合酶/启动子系统是偶合启动子系统的实例[Studier等人，J.MOL.BIOL.(1986)189：113；Tabor等人，PROC NATL.ACAD.SCI.(1985)82：1074]。另外，杂合启动子也可包含噬菌体启动子和大肠杆菌操纵基因区域(欧洲公开案第267851号)。

除功能启动子序列之外，有效核糖体结合位点也适用于在原核生物中表达外来基因。在大肠杆菌中，核糖体结合位点被称作Shine-Dalgarno(SD)序列并包括起始密码子(ATG)和位于起始密码子上游3-11个核苷酸处的长度为3-9个核苷酸的序列[Shine等人，Nature(1975)254：34]。认为SD序列通过SD序列与大肠杆菌16S rRNA的3′端之间的碱基配对来促进mRNA与核糖体的结合[Steitz等人，″Genetic signals and nucleotide sequences in messenger RNA″，Biological Regulation and Development：Gene Expression (Ed.R.F.Goldberger，1979)]。为表达具有弱核糖体结合位点的真核基因和原核基因[Sambrook等人，″Expression of cloned genes in Escherichia coli″，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，1989]。

术语“细菌宿主”或“细菌宿主细胞”是指可用作或已用作重组载体或其它转移DNA的接受者的细菌。所述术语包括已经转染的原始细菌宿主细胞的后代。应了解，由于偶发突变或故意突变，单一母体细胞的后代在形态上或在与原始母体互补的基因组DNA或总DNA方面可能未必完全相同。与将要以相关性质(例如存在编码4HB多肽的核苷酸序列)表征的母体充分类似的母体细胞的后代包括在由此定义所指代的后代中。

所属领域的技术人员熟知适用于表达瘦素多肽的宿主细菌的选择。在选择用于表达的细菌宿主时，合适的宿主可包括显示具有良好包涵体形成能力、低蛋白水解活性以及总体稳固性的宿主。细菌宿主通常可获自多种来源，包括(但不限于)加利福尼亚大学生物物理和医学物理系细菌基因保藏中心(Berkeley，CA)；以及美国典型菌种保藏中心(“ATCC”)(Manassas，VA)。工业/医药发酵通常使用来源于K菌株的细菌(例如W3110)或来源于B菌株的细菌(例如BL21)。这些菌株因其生长参数为人熟知且稳定而特别适用。另外，这些菌株为非病原性的，出于安全性和环境原因，其在商业上较为重要。在本发明方法的一个实施例中，大肠杆菌宿主为BL21的菌株。在本发明方法的另一实施例中，大肠杆菌宿主为蛋白酶缺乏菌株，其包括(但不限于)OMP-和LON-。在本发明方法的另一实施例中，宿主细胞株为假单胞菌种，包括(但不限于)荧光假单胞菌、铜绿假单胞菌以及恶臭假单胞菌。荧光假单胞菌生物型1(命名为菌株MB 101)可由Dow Chemical Company(Midland，MI，可通过万维网在dow.com上获得)以宿主菌株形式用于治疗性蛋白质的制备过程。美国专利第4,755,465号和第4,859,600号(其以引用的方式并入本文中)描述假单胞菌菌株作为hGH产生的宿主细胞的用途。

在形成重组宿主细胞株(即，已将表达构建体引入宿主细胞中并且分离出具有合适表达构建体的宿主细胞)后，在适于产生瘦素多肽的条件下培养重组宿主细胞株。所属领域的技术人员显而易见，重组宿主细胞株的培养方法将依赖于所利用的表达构建体的性质以及宿主细胞的特点。通常使用所属领域中熟知的方法来培养重组宿主菌株。重组宿主细胞通常是在含有可吸收的碳、氮以及无机盐来源并且任选地含有维生素、氨基酸、生长因子和所属领域中熟知的其它蛋白质培养补充物的液体培养基中培养。用于培养宿主细胞的液体培养基可任选地含有抗生素或抗真菌剂以防止不合需要的微生物和/或化合物(包括(但不限于)用于选择含有表达载体的宿主细胞的抗生素)的生长。

重组宿主细胞可以分批或连续模式培养，其中细胞收集(在瘦素多肽在细胞内积聚的情况下)或培养物上清液的收集为分批或连续模式。对于原核宿主细胞中的制备来说，优选分批培养和细胞收集。

本发明的瘦素多肽通常是在重组系统中表达之后纯化。瘦素多肽可通过所属领域中已知的多种方法从宿主细胞中纯化。通常，细菌宿主细胞中所产生的瘦素多肽具有弱溶解性或不可溶(呈包涵体形式)。在本发明的一个实施例中，使用本文中揭示的方法以及所属领域中已知的方法，可容易地在瘦素多肽中进行为增加重组产生的蛋白质的溶解性而选择的氨基酸取代。在不溶性蛋白质的情况下，可通过离心从宿主细胞溶菌液收集蛋白质，并且其后可接着进行细胞的均质化。在具有弱溶解性的蛋白质的情况下，可添加包括(但不限于)聚乙烯亚胺(PEI)的化合物以诱导部分可溶性蛋白质的沉淀。随后可通过离心便利地收集沉淀的蛋白。使用所属领域的技术人员熟知的多种方法，可使重组宿主细胞破裂或均质化以从细胞内部释放包涵体。可使用熟知的技术来进行宿主细胞的破裂或均质化，这些技术包括(但不限于)酶促细胞破裂、超声波降解法、杜恩斯均质化(dounce homogenization)或高压释放破裂。在本发明方法的一个实施例中，使用高压释放技术使大肠杆菌宿主细胞破裂以释放瘦素多肽的包涵体。已发现，可通过经由均质器利用仅一代大肠杆菌宿主细胞来增加呈包涵体形式的不溶性瘦素多肽的产率。在处理瘦素多肽的包涵体时，最好使重复过程的均质化时间最小化以使包涵体产率最大化且不会由于例如溶解、机械剪切或蛋白质水解等因素造成损失。

随后，可使用所属领域中已知的多种合适的增溶剂中的任一者来溶解不溶性或沉淀的瘦素多肽。优选用尿素或盐酸胍溶解瘦素多肽。应使溶解的瘦素多肽-BP的体积最小化，从而可使用可方便操作的批量大小来制备大批量。在重组宿主可以体积为数千升的批量生长的大规模商业装置中，这个因素可为重要的。另外，当在大规模商业装置中制造瘦素多肽时，特别是对于人类医药用途来说，如果可能的话，应避免可损害机器和容器的苛刻化学品或其蛋白质产物。本发明的方法中已展示，可使用较温和的变性剂尿素代替较苛刻的变性剂盐酸胍来溶解瘦素多肽包涵体。尿素的使用显著降低损害在瘦素多肽的制造和纯化过程中使用的不锈钢设备的风险，同时有效溶解瘦素多肽包涵体。

当制备呈融合蛋白形式的瘦素多肽时，优选去除融合序列。可通过酶促或化学裂解、优选通过酶促裂解来实现融合序列的去除。可使用所属领域的技术人员所熟知的方法来实现融合序列的酶促去除。所属领域的技术人员将显而易见，用于去除融合序列的酶的选择将由融合体的特点决定，并且反应条件将根据酶的选择进行指定。优选通过熟知的方法从裂解的融合序列中纯化裂解的瘦素多肽。所属领域的技术人员将显而易见，所述方法将由融合序列和瘦素多肽的特点和性质决定。纯化方法可包括(但不限于)尺寸排阻色谱、疏水性相互作用色谱、离子交换色谱或透析或其任何组合。

优选也纯化瘦素多肽以从蛋白质溶液中去除DNA。虽然可通过所属领域中已知的任何合适的方法(例如沉淀或离子交换色谱)去除DNA，但优选通过用核酸沉淀剂(例如(但不限于)硫酸鱼精蛋白)沉淀来去除DNA。可使用包括(但不限于)离心或过滤的熟知的标准方法使瘦素多肽与沉淀的DNA分离。在将使用瘦素多肽来治疗人类的设定中，宿主核酸分子的去除为重要因素，并且本发明的方法将宿主细胞DNA降到医药学上可接受的水平。

用于小规模或大规模发酵的方法也可用于蛋白质表达中，所述方法包括(但不限于)发酵罐、振荡烧瓶、流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养系统以及搅拌槽生物反应器系统。这些方法中的每一者都可以分批、分批馈料或连续模式方法进行。

通常，可使用所属领域中的标准方法来回收本发明的人类瘦素多肽。举例来说，可离心或过滤培养基或细胞溶菌液以去除细胞碎片。可将上清液浓缩或稀释到所需体积或透滤到合适的缓冲液中以调节供进一步纯化的制剂。本发明的瘦素多肽的进一步纯化包括从完整形式中分离脱酰氨化和剪短形式的瘦素多肽变异体。

以下例示性程序中的任一者都可用于纯化本发明的瘦素多肽：亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAE SEPHAROSE)；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；SDS-PAGE；或萃取。

根据所属领域的技术人员已知并使用的标准程序，可将本发明的蛋白质(包括(但不限于)包含非天然氨基酸的蛋白质、包含非天然氨基酸的蛋白质的抗体、包含非天然氨基酸的蛋白质的结合搭配物等)部分或实质上纯化成均质。因此，可通过所属领域中熟知的多种方法中的任一者来回收和纯化本发明的多肽，这些方法包括(但不限于)硫酸铵或乙醇沉淀、酸或碱萃取、柱色谱、亲和柱色谱、阴离子或阳离子交换色谱、磷酸纤维素色谱、疏水性相互作用色谱、羟基磷灰石色谱、外源凝集素色谱、凝胶电泳等。在制备正确折叠的成熟蛋白质时，必要时可使用蛋白质再折叠步骤。当需要高纯度时，在最后纯化步骤中可使用高效液相色谱(HPLC)、亲和色谱或其它合适的方法。在一个实施例中，使用针对非天然氨基酸(或包含非天然氨基酸的蛋白质)形成的抗体作为纯化试剂，从而(包括但不限于)用于包含一个或一个以上非天然氨基酸的蛋白质的以亲和性为基础的纯化。必要时，在部分纯化或纯化成均质后，任选地将所述多肽用于多种应用，包括(但不限于)用作检验组分、治疗剂、预防剂、诊断剂、研究试剂和/或用作抗体产生的免疫原。

除了本文中指出的其它参考文献外，所属领域中还熟知多种纯化/蛋白质折叠方法，包括(但不限于)以下文献中列出的方法：R.Scopes，Protein Purification.Springer-Verlag，N.Y.(1982)；Deutscher，Methods in Enzymology第182卷：Guide to Protein Purification，Academic Press，Inc.N.Y.(1990)；Sandana，(1997)Bioseparation of Proteins.Academic Press，Inc.；Bollag等人，(1996)Protein Methods，第2版，Wiley-Liss，NY；Walker，(1996)The Protein Protocols Handbook Humana Press，NJ；Harris和Angal，(1990)Protein Purification Applications：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Harris和Angal，Protein Purification Methods：A Practical Approach IRL Press at Oxford，Oxford，England；Scopes，(1993)Protein Purification：Principles and Practice第3版Springer Verlag，NY；Janson和Ryden，(1998)Protein Purification：Principles，High  Resolution Methods and Applications，第2版，Wiley-VCH，NY；以及Walker(1998)，Protein  Protocols on CD-ROM Humana Press，NJ；以及其中引用的参考文献。

在真核宿主细胞或非真核宿主细胞中产生所关注的具有非天然氨基酸的蛋白质或多肽的一个优点在于，所述蛋白质或多肽通常将折叠为其天然构象。然而，在本发明的某些实施例中，所属领域的技术人员应认识到，在合成、表达和/或纯化之后，蛋白质可具有与相关多肽所需的构象不同的构象。在本发明的一方面，任选地使所表达的蛋白质变性并且随后使其复性。这是利用所属领域中已知的方法来实现，所述方法包括(但不限于)向所关注的蛋白质或多肽中添加伴侣蛋白(chaperonin)、将蛋白质溶解于例如盐酸胍等离液剂中、利用蛋白质二硫化物异构酶等。

一般来说，有时需要使所表达的多肽变性和还原并且随后使多肽再折叠成优选构象。举例来说，可将胍、尿素、DTT、DTE和/或伴侣蛋白添加到所关注的翻译产物中。所属领域的技术人员熟知使蛋白质还原、变性和复性的方法(参看上述参考文献以及Debinski等人，(1993)J.Biol.Chem.，268：14065-14070；Kreitman和Pastan(1993)Bioconjug.Chem.，4：581-585；以及Buchner等人，(1992)Anal.Biochem.，205：263-270)。例如，Debinski等人描述胍-DTE中包涵体蛋白质的变性和还原。可在含有(包括(但不限于))氧化型谷胱甘肽和L-精氨酸的氧化还原缓冲剂中使蛋白质再折叠。可使再折叠试剂流动或以其它方式移动以与一种或一种以上多肽或其它表达产物接触，或者可使一种或一种以上多肽或其它表达产物流动或以其它方式移动以与再折叠试剂接触。

在原核制备瘦素多肽的情况下，如此产生的瘦素多肽可能错误折叠并且因而缺乏生物活性或者生物活性降低。可通过“再折叠”来恢复蛋白质的生物活性。一般来说，通过使用(例如)一种或一种以上离液剂(例如尿素和/或胍)和能够还原二硫键的还原剂(例如二硫苏糖醇、DTT或2-巯基乙醇(2-ME))溶解(其中瘦素多肽也不可溶)、展开并还原多肽链而使错误折叠的瘦素多肽再折叠。在中等浓度的离液剂下，随后添加氧化剂(例如，氧、胱氨酸或胱胺)，这允许再形成二硫键。可使用所属领域中已知的标准方法使瘦素多肽再折叠，所述方法例如美国专利第4,511,502号、第4,511,503号和第4,512,922号中所述的方法，所述文献是以引用的方式并入本文中。瘦素多肽也可与其它蛋白质共折叠以形成异质二聚体或异质多聚体。在再折叠或共折叠之后，优选进一步纯化瘦素多肽。

一般纯化方法：可以任何适当顺序对包含瘦素多肽的细胞溶菌液或由任何分离步骤得到的任何瘦素多肽混合物进行多种分离步骤中的任一者，所述任何分离步骤包括(但不限于)亲和色谱、离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、高效液相色谱(“HPLC”)、反相HPLC(“RP-HPLC”)、膨胀床吸附或其任何组合和/或重复。

用于实施本文中所述的技术的设备和其它必要材料在市面上有售。泵、馏分收集器、监控器、记录器以及整个系统都可获自(例如)Applied Biosystems(Foster City，CA)、Bio-Rad Laboratories，Inc.(Hercules，CA)以及Amersham Biosciences，Inc.(Piscataway，NJ)。包括(但不限于)交换基质材料、培养基以及缓冲液的色谱材料也可获自这些公司。

使用专用设备(例如泵)可更迅速地实现平衡以及在本文中所述的柱色谱过程中的其它步骤(例如洗涤和洗脱)。市售泵包括(但不限于)HILOAD

泵P-50、蠕动泵P-1、泵P-901和泵P-903(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。

馏分收集器的实例包括RediFrac馏分收集器、FRAC-100和FRAC-200馏分收集器以及SUPERFRAC

馏分收集器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。也可使用混合器来形成pH值和线性浓度梯度。市售混合器包括梯度混合器GM-1和管道混合器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。

可使用任何市售监控器来监控色谱过程。这些监控器可用于收集如UV、pH值和传导率的信息。检测器的实例包括监控器UV-1、UVICORD

S II、监控器UV-M II、监控器UV-900、监控器UPC-900、监控器pH/C-900以及传导率监控器(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。实际上，整个系统都在市面上有售，包括来自Amersham Biosciences(Piscataway，NJ)的各种AKTA

系统。

在本发明的一个实施例中，例如，可通过首先在尿素中使所得的经纯化的瘦素多肽变性，接着在合适的pH值下在含有还原剂(例如DTT)的TRIS缓冲液中稀释来还原瘦素多肽并使其变性。在另一个实施例中，使瘦素多肽以约2M到约9M的浓度范围在尿素中变性，接着在约5.0到约8.0的范围内的pH值下在TRIS缓冲液中稀释。随后可培育这个实施例的再折叠混合物。在一个实施例中，再折叠混合物在室温下培育4小时到24小时。随后，可进一步分离或纯化经还原并变性的瘦素多肽混合物。

如本文中所述，在进行任何后续分离步骤之前，可调节第一瘦素多肽混合物的pH值。另外，可使用所属领域中已知的技术来浓缩第一瘦素多肽混合物或其任何后续混合物。此外，可使用所属领域的技术人员熟知的技术将包含第一瘦素多肽混合物或其任何后续混合物的洗脱缓冲液交换为适用于下一分离步骤的缓冲液。

离子交换色谱：在一个实施例中，并且作为可选的额外步骤，可对第一瘦素多肽混合物进行离子交换色谱。通常参看ION EXCHANGE CHROMATOGRAPHY：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1114-21，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))。市售离子交换柱包括HITRAP、HIPREP

和HILOAD

柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。这些柱利用强阴离子交换剂，例如Q SEPHAROSE

Fast Flow、Q SEPHAROSE

HighPerformance和Q SEPHAROSE

XL；强阳离子交换剂，例如SP SEPHAROSE

HighPerformance、SP SEPHAROSE

Fast Flow和SP SEPHAROSE

XL；弱阴离子交换剂，例如DEAE SEPHAROSE

Fast Flow；以及弱阳离子交换剂，例如CM SEPHAROSE

FastFlow(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。可在纯化过程的任何阶段对瘦素多肽进行阳离子交换柱色谱以分离实质上经纯化的瘦素多肽。可使用任何合适的阳离子交换基质来进行阳离子交换色谱步骤。适用的阳离子交换基质包括(但不限于)纤维状、多孔、无孔、微粒、珠粒或交联阳离子交换基质材料。这些阳离子交换基质材料包括(但不限于)纤维素、琼脂糖、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚乙烯、聚苯乙烯、二氧化硅、聚醚或任何上述物质的复合物。在使瘦素多肽吸附到阳离子交换剂基质上之后，可通过使基质与具有足够高的pH值或离子强度的缓冲液接触而置换基质中的瘦素多肽，从而洗脱实质上经纯化的瘦素多肽。适用于实质上经纯化的瘦素多肽的高pH值洗脱的缓冲液包括(但不限于)浓度在至少约5mM到至少约100mM范围内的柠檬酸盐、磷酸盐、甲酸盐、乙酸盐、HEPES以及MES缓冲液。

反相色谱：可根据所属领域的技术人员已知的合适方案进行RP-PIPLC以纯化蛋白质。例如参看Pearson等人，ANAL BIOCHEM.(1982)124：217-230(1982)；Rivier等人，J.CHROM.(1983)268：112-119；Kunitani等人，J.CHROM.(1986)359：391-402。可对4HB多肽进行RP-HPLC以分离实质上经纯化的4HB多肽。关于这一点，可使用含有具有多种长度(包括(但不限于)至少约C₃到至少约C₃₀、至少约C₃到至少约C₂₀或至少约C₃到至少约C₁₈树脂)的烷基官能团的二氧化硅衍生的树脂。或者，可使用聚合树脂。举例来说，可使用TosoHaas Amberchrome CG1000sd树脂，其为苯乙烯聚合物树脂。也可使用具有多种烷基链长度的氰基或聚合树脂。此外，可用例如乙醇等溶剂洗涤RP-HPLC柱。可使用含有离子配对剂和有机改质剂(例如甲醇、异丙醇、四氢呋喃、乙腈或乙醇)的合适洗脱缓冲液从RP-HPLC柱洗脱瘦素多肽。最常用的离子配对剂包括(但不限于)乙酸、甲酸、高氯酸、磷酸、三氟乙酸、七氟丁酸、三乙胺、四甲基铵、四丁基铵、乙酸三乙基铵。可使用一种或一种以上梯度或等度条件来进行洗脱，其中优选减少分离时间并降低峰宽度的梯度条件。另一种方法涉及使用两种具有不同溶剂浓度范围的梯度。适用于本文中的洗脱缓冲液的实例可包括(但不限于)乙酸铵和乙腈溶液。

疏水性相互作用色谱纯化技术：可对4HB多肽进行疏水性相互作用色谱(HIC)。通常参看HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY HANDBOOK：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1020-90，Amersham Biosciences(Piscataway，NJ))，其是以引用的方式并入本文中。合适的HIC基质可包括(但不限于)经烷基或芳基取代的基质，例如经丁基、己基、辛基或苯基取代的基质，所述基质包括琼脂糖、交联琼脂糖、琼脂糖凝胶(sepharose)、纤维素、二氧化硅、葡聚糖、聚苯乙烯、聚(甲基丙烯酸酯)基质以及混合模式树脂(包括(但不限于)聚乙二胺树脂或经丁基或苯基取代的聚(甲基丙烯酸酯)基质)。疏水性相互作用柱色谱的市售来源包括(但不限于)HITRAP

、HIPREP

和HILOAD

柱(Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)。简单地说，在装载之前，可使用所属领域的技术人员已知的标准缓冲液(例如乙酸/氯化钠溶液或含有硫酸铵的HEPES)来平衡HIC柱。在装载瘦素多肽后，随后可使用标准缓冲液和条件来洗涤柱以去除不需要的物质，但将瘦素多肽留在HIC柱上。可用约3到约10个柱体积的标准缓冲液(例如含有EDTA和浓度低于平衡缓冲液的硫酸铵的HEPES缓冲液，或乙酸/氯化钠缓冲液)来洗脱瘦素多肽。也可使用例如使用磷酸钾梯度的降低的线性盐梯度来洗脱瘦素分子。随后，可例如通过过滤(例如透滤或超滤)来浓缩洗出液。可使用透滤来去除用于洗脱瘦素多肽的盐。

其它纯化技术：可对第一瘦素多肽混合物或其任何后续混合物进行使用例如凝胶过滤(GEL FILTRATION：PRINCIPLES AND METHODS(目录号18-1022-18，Amersham Biosciences，Piscataway，NJ)，其是以引用的方式并入本文中)、HPLC、膨胀床吸附、超滤、透滤、冻干等的另一分离步骤，以去除任何过量盐并且用合适的缓冲液来代替所述缓冲液以用于下个分离步骤或甚至最终药物产品的调配。可使用所属领域的技术人员已知的技术来监控本文中所述的各步骤中瘦素多肽(包括实质上经纯化的瘦素多肽)的产率。所述技术也可用于在最后分离步骤后分析实质上经纯化的瘦素多肽的产率。举例来说，可使用多个具有多种烷基链长度的反相高压液相色谱柱(例如氰基RP-HPLC、C₁₈RP-HPLC以及阳离子交换HPLC和凝胶过滤HPLC)中的任一者来监控瘦素多肽的产率。

可使用例如SDS-PAGE等标准技术或通过使用Western印迹法和ELISA检验测量瘦素多肽来测定纯度。举例来说，可针对从阴性对照酵母发酵和阳离子交换回收分离的蛋白质产生多克隆抗体。所述抗体也可用于探测污染性宿主细胞蛋白质的存在。

其它纯化程序包括美国专利第4,612,367号所述的程序且包括(但不限于)(1)在约7到约9的pH值下向反相大孔丙烯酸酯共聚物树脂支撑物上施加包含瘦素多肽的混合物；和(2)用pH值为约7到约9且含有约20体积％到约80体积％选自由丙酮、乙腈和丙酮与乙腈的组合组成的群组的有机稀释剂的水性洗脱剂从所述支撑物上洗脱hEPO多肽。

典型的EPO蛋白质纯化方法揭示于WO 96/35718(Burg，1996年11月14日公开)中且因为瘦素纯化中可使用类似技术，所以下文描述所述方法。蓝色琼脂糖(Pharmacia)由琼脂糖珠粒组成，其中汽巴龙蓝色染料(Cibacron blue dye)共价结合于所述珠粒的表面。因为EPO比大多数非蛋白污染物、一些蛋白杂质和PVA更强力地结合于蓝色琼脂糖，所以这一步骤中可富集EPO。通过增加盐浓度以及pH值进行蓝色琼脂糖柱的洗脱。用80-1001蓝色琼脂糖填充柱，用NaOH再生且用平衡缓冲液(氯化钠/氯化钙和乙酸钠)使之平衡。装载酸化并过滤的发酵罐上清液。装载完成后，首先用类似于平衡缓冲液的含有更高氯化钠浓度的缓冲液洗涤柱，接着用TRIS-碱缓冲液洗涤。用TRIS-碱缓冲液洗脱产物且根据主要洗脱概况将其收集成单一洗脱部分。

丁基型Toyopearl 650C(Toso Haas)是脂肪族丁基残基共价偶合的基于聚苯乙烯的基质。因为EPO比大多数杂质和PVA更强力地结合于这一凝胶，所以必须用含异丙醇的缓冲液进行洗脱。用30-40l丁基型Toyopearl 650C填充柱，用NaOH再生，用TRIS-碱缓冲液洗涤并用含有异丙醇的TRIS-碱缓冲液使之平衡。根据柱平衡缓冲液中异丙醇的浓度调节蓝色琼脂糖洗出液并装载于柱上。然后用异丙醇浓度增加的平衡缓冲液洗涤柱。用洗脱缓冲液(高异丙醇含量的TRIS-碱缓冲液)洗脱产物且根据主要洗脱概况将其收集成单一洗脱部分。

羟基磷灰石Ultrogel(Biosepra)由羟基磷灰石组成，合并于琼脂糖基质中以改良机械性质。EPO对羟基磷灰石具有低亲和性，且因此可在低于蛋白质杂质的磷酸盐浓度下洗脱。用30-401羟基磷灰石Ultrogel填充柱，且用磷酸钾/氯化钙缓冲液和NaOH再生，接着用TRIS-碱缓冲液再生。然后用含少量异丙醇和氯化钠的TRIS-碱缓冲液使之平衡。将含EPO的丁基型Toyopearl色谱洗出液装载于柱上。接着用平衡缓冲液和无异丙醇和氯化钠的TRIS-碱缓冲液洗涤柱。用含低浓度磷酸钾的TRIS-碱缓冲液洗脱产物，且根据主要洗脱概况将其收集成单一洗脱部分。

RP-HPLC材料Vydac C4(Vydac)由硅胶粒子组成，其表面带有C4烷基链。瘦素多肽与蛋白质杂质的分离是基于疏水性相互作用强度的差异。用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗脱。使用不锈钢柱(填充2.8到3.2升Vydac C4硅胶)进行制备型HPLC。通过添加三氟乙酸来酸化羟基磷灰石Ultrogel洗出液并且将其装载于Vydac C4柱上。使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度进行洗涤和洗脱。收集洗脱部分并且立即用磷酸盐缓冲液中和。汇集在IPC限度内的4HB多肽洗脱部分。

DEAE Sepharose(Pharmacia)材料由与琼脂糖凝胶珠粒的表面共价结合的二乙基氨基乙基(DEAE)基团组成。通过离子性相互作用来介导瘦素多肽与DEAE基团的结合。乙腈和三氟乙酸无滞留地通过柱。在这些物质被洗掉之后，通过用低pH值的乙酸盐缓冲液洗涤柱来去除痕量杂质。随后用中性磷酸盐缓冲液洗涤柱并且用具有增加的离子强度的缓冲液洗脱瘦素多肽。用DEAE Sepharose fast flow填充柱。调节柱体积以确保瘦素多肽装载量在每毫升凝胶3-10mg瘦素多肽的范围内。用水和平衡缓冲液(磷酸钠/钾)洗涤柱。装载HPLC洗出液的汇集洗脱部分并且用平衡缓冲液洗涤柱。随后用洗涤缓冲液(乙酸钠缓冲液)洗涤柱，接着用平衡缓冲液洗涤。随后，用洗脱缓冲液(氯化钠、磷酸钠/钾)从柱中洗脱瘦素多肽并根据主要洗脱概况将其收集成单一洗脱部分。将DEAE Sepharose柱的洗出液调节到指定传导率。将所得药物无菌过滤到铁氟隆(Teflon)瓶中并储存在-70℃下。

可使用多种方法和程序来分析包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素蛋白质的产率和纯度，所述方法包括(但不限于)Bradford检验、SDS-PAGE、银染色SDS-PAGE、考马斯(coomassie)染色SDS-PAGE、质谱(包括(但不限于)MALDI-TOF)以及所属领域的技术人员已知的用于表征蛋白质的其它方法。

VIII.替代系统中的表达

已使用多种策略将非天然氨基酸引入非重组宿主细胞、诱变宿主细胞或不含细胞的系统中的蛋白质中。这些系统也适用于制备本发明的瘦素多肽。例如Lys、Cys和Tyr等具有反应性侧链的氨基酸的衍生使得赖氨酸转化为N²-乙酰基-赖氨酸。化学合成也提供并入非天然氨基酸的直接方法。通过肽片段的酶促连接和天然化学连接的新近发展，有可能制造较大蛋白质。例如参看P.E.Dawson和S.B.H.Kent，Annu.Rev.Biochem，69：923(2000)。已使用将利用所需非天然氨基酸以化学方式酰化的抑制因子tRNA添加到能够支持蛋白质生物合成的活体外提取物中的通用活体外生物合成方法将超过100个非天然氨基酸位点特异性地并入几乎任何尺寸的多种蛋白质中。例如参看V.W.Cornish，D.Mendel和P.G.Schultz，Angew.Chem.Iht.Ed.Engl.1995，34：621(1995)；C.J.Noren，S.J.Anthony-Cahill，M.C.Griffith，P.G.Schultz，A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science 244：182-188(1989)；以及J.D.Bain，C.G.Glabe，T.A.Dix，A.R.Chamberlin，E.S.Diala，Biosynthetic site-specific incorporation of a unnatural amino acid into a polypeptide，J.Am.Chem.Soc.111：8013-8014(1989)。已经将多种官能团引入蛋白质中以供研究蛋白质稳定性、蛋白质折叠、酶机理和信号转导。

已开发被称作选择性压力并入的活体内方法以使用野生型合成酶的杂乱性。例如参看N.Budisa，C.Minks，S.Alefelder，W.Wenger，F.M.Dong，L.Moroder和R.Huber，FASEB J.，13：41(1999)。使向细胞供应特定天然氨基酸的相关代谢路径关闭的营养缺陷型菌株在含有有限浓度的天然氨基酸的基本培养基中生长，而靶基因的转录受到抑制。在静止生长期开始时，天然氨基酸被耗尽并且由非天然氨基酸类似物置换。对重组蛋白表达的诱导使得含有非天然类似物的蛋白质积聚。举例来说，已使用这种策略将邻氟苯丙氨酸、间氟苯丙氨酸和对氟苯丙氨酸并入蛋白质中，并且其在UV光谱中显示两个可容易地鉴别的特征肩峰，例如参看C.Minks，R.Huber，L.Moroder和N.Budisa，Anal. Biochem.，284：29(2000)；已使用三氟蛋氨酸来代替噬菌体T4溶菌酶中的蛋氨酸，从而通过¹⁹F NMR研究其与壳寡糖配体的相互作用，例如参看H.Duewel，E.Daub，V.Robinson和J.F.Honek，Biochemistry，36：3404(1997)；并且已并入三氟亮氨酸来代替亮氨酸，从而使亮氨酸拉链蛋白的热稳定性和化学稳定性增加。例如参看Y.Tang，G.Ghirlanda，W.A.Petka，T.Nakajima，W.F.DeGrado和D.A.Tirrell，Angew.Chem.Int.Ed. Engl.，40：1494(2001)。此外，将硒代蛋氨酸和碲代蛋氨酸并入各种重组蛋白中以促进X射线结晶学中的相溶解。例如参看W.A.Hendrickson，J.R.Horton和D.M.Lemaster，EMBO J.，9：1665(1990)；J.O.Boles，K.Lewinski，M.Kunkle，J.D.Odom，B.Dunlap，L.Lebioda和M.Hatada，Nat.Struct.Biol.，1：283(1994)；N.Budisa，B.Steipe，P.Demange，C.Eckerskorn，J.Kellermann和R.Huber，Eur.J.Biochem.，230：788(1995)；以及N.Budisa，W.Karnbrock，S.Steinbacher，A.Humm，L.Prade，T.Neuefeind，L.Moroder和R.Huber，J.Mol. Biol.，270：616(1997)。也已有效并入具有烯或炔官能团的蛋氨酸类似物，从而允许通过化学方式对蛋白质进行其它修饰。例如参看J.C.M.vanHest和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，428：68(1998)；J.C.M.van Hest，K.L.Kiick和D.A.Tirrell，J.Am.Chem.Soc.122：1282(2000)；以及K.L.Kiick和D.A.Tirrell，Tetrahedron，56：9487(2000)；美国专利第6,586,207号；美国专利公开案2002/0042097，其是以引用的方式并入本文中。

这种方法的成功取决于氨酰基tRNA合成酶对非天然氨基酸类似物的识别，所述合成酶通常需要高选择性以确保蛋白质翻译的保真度。一种扩展这种方法的范围的方式在于放宽氨酰基tRNA合成酶的底物特异性，这已在有限数目的情况下达成。举例来说，在大肠杆菌苯丙氨酰基tRNA合成酶(PheRS)中由Gly置换Ala²⁹⁴可增加底物结合袋的尺寸，并且导致对氯苯丙氨酸(p-Cl-Phe)使tRNAPhe酰化。参看，M.Ibba，P.Kast和H.Hennecke，Biochemistry，33：7107(1994)。带有这种突变PheRS的大肠杆菌菌株允许并入对氯苯丙氨酸或对溴苯丙氨酸来代替苯丙氨酸。例如参看M.Ibba和H.Hennecke，FEBS Lett.，364：272(1995)；以及N.Sharma，R.Furter，P.Kast和D.A.Tirrell，FEBS Lett.，467：37(2000)。类似地，显示接近大肠杆菌酪氨酰基tRNA合成酶的氨基酸结合位点的点突变Phe130Ser允许氮杂酪氨酸比酪氨酸更有效地并入。参看F.Hamano-Takaku，T.Iwama，S.Saito-Yano，K.Takaku，Y.Monden，M.Kitabatake，D.Soil和S.Nishimura，J.Biol. Chem.，275：40324(2000)。

在活体内将非天然氨基酸并入蛋白质中的另一种策略是修饰具有校对机制的合成酶。这些合成酶无法区分在结构上与同源天然氨基酸类似的氨基酸并且因此使其活化。此错误在单独位点上得到修正，这使来自tRNA的错配氨基酸去酰化以保持蛋白质翻译的保真度。如果合成酶失去校对活性，那么错误活化的结构类似物可避开编辑功能并且被并入。目前已用缬氨酰基tRNA合成酶(ValRS)证实这种方法。参看V.Doring，H.D.Mootz，L.A.Nangle，T.L.Hendrickson，V.de Crecy-Lagard，P.Schimmel和P.Marliere，Science，292：501(2001)。ValRS可利用Cys、Thr或氨基丁酶(Abu)使tRNAVal错误氨酰基化；随后，通过编辑域水解这些非同源氨基酸。在使大肠杆菌染色体随机诱变之后，选择在ValRS的编辑位点中具有突变的突变大肠杆菌菌株。这种编辑缺陷型ValRS错误地使tRNAVal装有Cys。因为Abu与Cys在空间上类似(Cys的-SH基团是由Abu中的-CH₃置换)，所以当这种突变大肠杆菌菌株在存在Abu的情况下生长时，突变ValRS也将Abu并入蛋白质中。质谱分析显示在天然蛋白质中的各缬氨酸位置处约24％的缬氨酸由Abu置换。

固相合成和半合成方法也已允许合成含有新颖氨基酸的多种蛋白质。举例来说，参看以下公开案和其中引用的如下参考文献：Crick，F.J.C.，Barrett，L.Brenner，S.Watts-Tobin，R.General nature of the genetic code for proteins.Nature，192：1227-1232(1961)；Hofmann，K.，Bohn，H.Studies onpolypeptides.XXXVI，The effect ofpyrazole-imidazole replacements on the S-protein activating potency of an S-peptide fragment，J.Am Chem，88(24)：5914-5919(1966)；Kaiser，E.T.Synthetic approaches to biologically active peptides and proteins including enyzmes，Ace Chem Res，47-54(1989)；Nakatsuka，T.，Sasaki，T.，Kaiser，E.T.Peptide segment coupling catalyzed by the semisynthetic enzyme thiosubtilisin，J Am Chem Soc，3808-3810(1987)；Schnolzer，M.，Kent，S B H.Constructing proteins by dovetailing unprotected synthetic peptides：backbone-engineered HIV protease，Science，256(5054)：221-225(1992)；Chaiken，I.M.Semisynthetic peptides and proteins，CRC Crit Rev Biochem，11(3)：255-301(1981)；Offord，R.E.Protein engineeringby chemical means？Protein Eng.，1(3)：151-157(1987)；以及Jackson，D.Y.，Burnier，J.，Quan，C，Stanley，M.，Tom，J.，Wells，J.A.A Designed Peptide Ligasefor Total Synthesis of Ribonuclease A with Unnatural Catalytic Residues，Science，266(5183)：243(1994)。

已使用化学修饰在活体外将包括辅因子、自旋标记和寡核苷酸的多种非天然侧链引入蛋白质中。例如参看Corey，D.R.，Schultz，P.G.Generation of a hybrid sequence-specific single-stranded deoxyribonuclease，Science，238(4832)：1401-1403(1987)；Kaiser，E.T.，Lawrence D.S.，Rokita，S.E.The chemical modification of enzymatic specificity，Annu Rev  Biochem，54：565-595(1985)；Kaiser，E.T.，Lawrence，D.S.Chemical mutation of enyzme active sites，Science，226(4674)：505-511(1984)；Neet，K.E.，Nanci A，Koshland，D.E.Properties of thiol-subtilisin，J Biol.Chem，243(24)：6392-6401(1968)；Polgar，L.B.，M.L.Anew enzyme containing a synthetically formed active site.Thiol-subtilisin.J.Am Chem Soc，3153-3154(1966)；以及Pollack，S.J.，Nakayama，G.Schultz，P.G.Introduction of nucleophiles and spectroscopic probes into antibody combining sites，Science，242(4881)：1038-1040(1988)。

或者，使用以化学方式修饰的氨酰基tRNA的生物合成方法已用于将多种生物物理探针并入在活体外合成的蛋白质中。参看以下公开案和其中所引用的参考文献：Brunner，J.New Photolabeling and crosslinking methods，Annu.Rev Biochem，62：483-514(1993)；以及Krieg，U.C.，Walter，P.，Hohnson，A.E.Photocrosslinking of the signal sequence of nascent preprolactin of the 54-kilodalton polypeptide of the signal recognition particle，Proc.Natl. Acad.Sci，83(22)：8604-8608(1986)。

先前已显示，可通过向利用含有所需琥珀无义突变的基因编程的蛋白质合成反应中添加以化学方式氨酰基化的抑制因子tRNA而在活体外将非天然氨基酸位点特异性地并入蛋白质中。使用这些方法，可使用特定氨基酸的营养缺陷型菌株，用密切结构同源物取代20种常见氨基酸中的多种氨基酸，例如，用氟苯丙氨酸取代苯丙氨酸。例如参看Noren，C.J.，Anthony-Cahill，Griffith，M.C.，Schultz，P.G.A general method for site-specific incorporation of unnatural amino acids into proteins，Science，244：182-188(1989)；M.W.Nowak等人，Science 268：439-42(1995)；Bain，J.D.，Glabe，C.G.，Dix，T.A.，Chamberlin，A.R.，Diala，E.S.Biosynthetic site-specific Incorporation of a non-natural amino acid into a polypeptide，J.Am Chem Soc，111：8013-8014(1989)；N.Budisa等人，FASEB J.13：41-51(1999)；Ellman，J.A.，Mendel，D.，Anthony-Cahill，S.，Noren，C.J.，Schultz，P.G.Biosynthetic method for introducing unnatural amino acids site-specifically into proteins，Methods in Enz.，301-336(1992)；以及Mendel，D.，Cornish，V.W.和Schultz，P.G.Site-Directed Mutagenesis with an Expanded Genetic Code，Annu Rev Biophys.Biomol Struct.24，435-62(1995)。

举例来说，制备识别终止密码子UAG的抑制因子tRNA并且用非天然氨基酸以化学方式使其氨酰基化。使用常规定点诱变在蛋白质基因中的所关注位点处引入终止密码子TAG。例如参看Sayers，J.R.，Schmidt，W.Eckstein，F.5′，3′Exonuclease in phosphorothioate-based olignoucleotide-directed mutagensis，Nucleic Acids Res，16(3)：791-802(1988)。当将酰基化抑制因子tRNA和突变基因组合到活体外转录/翻译系统中时，回应UAG密码子而并入非天然氨基酸，这得到在指定位置处含有所述氨基酸的蛋白质。使用[³H]-Phe的实验以及使用α-羟基酸的实验证实，在由UAG密码子指定的位置处仅并入所需氨基酸且此氨基酸未在蛋白质中的任何其它位点处并入。例如参看Noren等人，同上文；Kobayashi等人，(2003)Nature Structural Biology 10(6)：425-432；以及Ellman，J.A.，Mendel，D.，Schultz，P.G.Site-specific incorporation of novel backbone structures into proteins，Science，255(5041)：197-200(1992)。

也已使用微注射技术将非天然氨基酸并入蛋白质中。例如参看M.W.Nowak，P.C.Kearney，J.R.Sampson，M.E.Saks，C.G.Labarca，S.K.Silverman，W.G.Zhong，J.Thorson，J.N.Abelson，N.Davidson，P.G.Schultz，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Science，268：439(1995)；以及D.A.Dougherty，Curr.Opin.Chem.Biol.，4：645(2000)。将爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)与活体外产生的以下两种RNA物质共同注射：在所关注的氨基酸位置处具有UAG终止密码子的编码标靶蛋白的mRNA，和经所需非天然氨基酸氨酰基化的琥珀抑制因子tRNA。随后，卵母细胞的翻译机构将非天然氨基酸插入由UAG指定的位置处。这种方法已允许通常不适用于活体外表达系统的整体膜蛋白的活体内结构-功能研究。实例包括将荧光氨基酸并入速激肽神经激肽-2受体中以通过荧光共振能量转移来测量距离，例如参看G.Turcatti，K.Nemeth，M.D.Edgerton，U.Meseth，F.Talabot，M.Peitsch，J.Knowles，H.Vogel和A.Chollet，J.Biol.Chem.，271：19991(1996)；并入生物素化氨基酸以鉴别离子通道中表面暴露的残基，例如参看J.P.Gallivan，H.A.Lester和D.A.Dougherty，Chem.Biol.，4：739(1997)；使用笼化的酪胺酸类似物以实时监控离子通道中的构象变化，例如参看J.C.Miller，S.K.Silverman，P.M.England，D.A.Dougherty 和H.A.Lester，Neuron，20：619(1998)；以及使用α羟基氨基酸以改变用于探究其门控机制的离子通道主链。例如，参看P.M.England，Y.Zhang，D.A.Dougherty和H.A.Lester，Cell，96：89(1999)；以及T.Lu，A.Y.Ting，J.Mainland，L.Y.Jan，P.G.Schultz和J.Yang，Nat.Neurosci.4：239(2001)。

在活体内直接将非天然氨基酸并入蛋白质中的能力提供如下优点：突变蛋白的高产率、技术简易性、在细胞中或可能在活生物体中研究突变蛋白的可能性以及这些突变蛋白在治疗性治疗中的使用。将具有各种尺寸、酸度、亲核性、疏水性以及其它性质的非天然氨基酸包括在蛋白质中的能力可极大地扩展理性并系统性地操纵蛋白质结构的能力，从而探究蛋白质功能并且产生具有新颖性质的新蛋白质或生物体。然而，因为实现蛋白质翻译的高保真度所需的tRNA-合成酶相互作用的性质复杂，故所述方法难以进行。

在位点特异性地并入para-F-Phe的一次尝试中，将酵母琥珀抑制因子tRNAPheCUA/苯丙氨酰基tRNA合成酶对用于p-F-Phe抗性、Phe营养缺陷型大肠杆菌菌株中。例如参看R.Furter，Protein Sci.，7：419(1998)。

也可能使用无细胞的(活体外)翻译系统获得本发明的瘦素多核苷酸的表达。在可包括mRNA作为模板(活体外翻译)或包括DNA作为模板(组合型活体外转录和翻译)的这些系统中，由核糖体指导活体外合成。已进行相当多的尝试来开发无细胞的蛋白质表达系统。例如参看Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，74：309-316(2001)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Letters，22，1537-1542，(2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology Progress，16，385-390，(2000)；Kim，D.-M.和J.R.Swartz，Biotechnology and Bioengineering，66，180-188，(1999)；以及Patnaik，R.和J.R.Swartz，Biotechniques 24，862-868，(1998)；美国专利第6,337,191号；美国专利公开案第2002/0081660号；WO 00/55353；WO 90/05785，其是以引用的方式并入本文中。另一种可用于表达包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的方法包括mRNA-肽融合技术。例如参看R.Roberts和J.Szostak，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)94：12297-12302(1997)；A.Frankel等人，Chemistry & Biology 10：1043-1050(2003)。在这种方法中，在核糖体上将与嘌呤霉素(puromycin)连接的mRNA模板翻译为肽。如果已对一种或一种以上tRNA分子进行修饰，那么也可将非天然氨基酸并入肽中。在已读取最后一个mRNA密码子之后，嘌呤霉素捕获肽的C末端。如果发现所得mRNA-肽接合物在活体外检验中具有引人关注的性质，那么易于由mRNA序列揭示其特性。用这种方式，可筛选包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽的文库，以鉴别具有所需性质的多肽。最近，已报导利用经纯化组分的活体外核糖体翻译，其允许合成经非天然编码氨基酸取代的肽。例如参看A.Forster等人，Proc.Natl Acad.Sci.(USA)100：6353(2003)。

IX.与瘦素多肽偶合的大分子聚合物

可使用本文中所述的组合物、方法、技术和策略来实现对本文中所述的非天然氨基酸多肽的各种修饰。这些修饰包括将其它官能团并入到多肽的非天然氨基酸组分上，所述官能团包括(但不限于)标记；染料；聚合物；水溶性聚合物；聚乙二醇的衍生物；光交联剂；细胞毒性化合物；药物；亲和性标记；光亲和性标记；反应性化合物；树脂；第二蛋白质或多肽或多肽类似物；抗体或抗体片段；金属螯合剂；辅因子；脂肪酸；碳水化合物；多核苷酸；DNA；RNA；反义多核苷酸；抑制性核糖核酸；生物材料；纳米粒子；自旋标记；荧光团；含金属的部分；放射性部分；新颖官能团；与其它分子共价或非共价相互作用的基团；光笼化部分；可光致异构化部分；生物素；生物素衍生物；生物素类似物；结合有重原子的部分；可化学裂解的基团；可光裂解的基团；延长的侧链；碳连接的糖；氧化还原活性剂；氨基硫代酸；毒性部分；经同位素标记的部分；生物物理探针；磷光基团；化学发光基团；电子致密基团；磁性基团；插入基团；发色团；能量转移剂；生物活性剂；可检测标记；小分子；或上述物质的任何组合，或任何其它所需化合物或物质。作为本文中所述的组合物、方法、技术和策略的说明性、非限制性实例，以下描述将集中在将大分子聚合物添加到非天然氨基酸多肽上，同时应了解，相关的组合物、方法、技术和策略也适用于(必要时适当修饰，并且所属领域的技术人员可用本文中的揭示内容进行)添加其它官能团(包括(但不限于)上文列出的官能团)。

多种大分子聚合物和其它分子可与本发明的瘦素多肽连接以调节瘦素多肽的生物性质和/或对瘦素分子提供新颖的生物性质。这些大分子聚合物可通过天然编码氨基酸、通过非天然编码氨基酸或天然或非天然氨基酸的任何官能取代基或添加到天然或非天然氨基酸中的任何取代基或官能团与瘦素多肽连接。

本发明提供实质上均质的聚合物：蛋白质接合物的制剂。如本文中所用，“实质上均质”意思是观察到聚合物：蛋白质接合物分子大于总蛋白质的一半。所述聚合物：蛋白质接合物具有生物活性并且本文中提供的本发明的“实质上均质”的聚乙二醇化瘦素多肽制剂为足够均质以致显示均质制剂的优点(例如，易于在临床应用中预测各批次之间的药物动力学)的制剂。

也可选择制备聚合物：蛋白质接合物分子的混合物，并且本文中提供的优点在于可选择包括在所述混合物中的单一聚合物：蛋白质接合物的比例。因此，必要时，可制备各种蛋白质与各种数目的所连接的聚合物部分(即，二、三、四等)的混合物，并且将所述接合物与使用本发明的方法制备的单一聚合物：蛋白质接合物组合，并获得具有预定的单聚合物：蛋白质接合物比例的混合物。

所选聚合物可为水溶性的，以致其所连接的蛋白质在水性环境(例如生理环境)中不沉淀。聚合物可为支化或未支化的。对于最终产品制剂的治疗性使用来说，聚合物优选应为医药学上可接受的。

聚乙二醇分子与蛋白质分子的比例将改变，其在反应混合物中的浓度也将改变。一般来说，可通过所选聚乙二醇的分子量和可提供的可用反应性基团的数目来确定最佳比率(就存在最小过量的未反应蛋白质或聚合物的反应的效率来说)。当涉及分子量时，通常聚合物的分子量越高，可与蛋白质连接的聚合物分子的数目就越少。类似地，当优化这些参数时，应将聚合物的支化考虑在内。通常，分子量越高(或支链越多)，聚合物：蛋白质比率就越高。

如本文中所用，并且当涵盖PEG：瘦素多肽接合物时，术语“治疗有效量”是指使循环瘦素增加，从而使患者得到益处的量。所述量将随个体而变化并且将取决于多种因素，包括患者的整体身体状况和肥胖的根本原因。举例来说，用于患者的瘦素多肽的治疗有效量取决于瘦素多肽的投予方式(包括(但不限于)口服调配物、静脉内、皮下、经皮等)和患者所罹患的病状和投予瘦素多肽可治疗的病状(包括(但不限于)以下病状，例如调控能量平衡、肥胖症管理、调节葡萄糖、调节脂质代谢、调节下丘脑-垂体神经内分泌功能、治疗不孕不育症、促进免疫功能、促进造血、增加血管生成、增加创伤愈合、降低血清脂质)。用于疗法的瘦素多肽的量提供可接受的循环瘦素的增加。瘦素的量还可用于将瘦素的血清水平维持在有益水平。所属领域的技术人员使用可公开获得的材料和程序可容易地确定本发明组合物的治疗有效量。

在一个实施例中，投予肥胖患者治疗有效剂量的本发明的瘦素多肽。当前可用的治疗肥胖症的方法取决于食物摄取的减少(例如曲美(sibutramine))或脂肪吸收的抑制(例如奥利司他(orlistat))。在本发明的一个实施例中，在食物摄取不显著减少的情况下，脂肪组织显著减少。在一个实施例中，本发明的瘦素多肽调节体重。在一个实施例中，投予有需要的患者本发明的瘦素多肽使患者体重减轻。体重减轻期间食物摄取水平的实例包括(a)食物摄取得到维持、有所增加或低于根据本发明治疗之前个体的正常范围(即其投药前水平)约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％；(b)食物摄取得到维持、有所增加或低于其投药前水平约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％；(c)食物摄取得到维持、有所增加或低于其投药前水平约0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％；和(d)食物摄取水平得到维持、有所增加或低于其投药前水平约0、1、2、3、4或5％。

在一些实施例中，用本发明多肽治疗的患者体重减轻已是过去的情况，脂肪组织减少可伴随有瘦肌肉质量的伴随减少。这在显示包括脂肪组织和瘦肌肉质量在内所有身体组织组分都消瘦的癌症患者中尤为明显。然而，在本发明中，可能希望身体脂肪在瘦身体质量不显著减少的情况下显著减少。脂肪组织减少起因于用CB1拮抗剂治疗，而与瘦身体质量的显著变化无关。脂肪组织减少期间瘦身体质量水平的实例包括(a)瘦身体质量得到维持、有所增加或低于根据本发明治疗之前个体的正常范围(即其投药前水平)至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30％；(b)瘦身体质量得到维持、有所增加或低于投药前水平至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％；(c)瘦身体质量得到维持、有所增加或低于投药前水平至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％；和(d)瘦身体质量得到维持、有所增加或低于投药前水平至多约1、2、3、4或5％。

在一些情况下，脂肪组织减少可伴随有水质量的伴随减少。这在促进脱水的饮食方案中尤为明显。在本发明中，可能希望身体脂肪在水质量不显著减少的情况下显著减少。换句话说，脂肪组织减少起因于用CB1拮抗剂治疗，而与水质量的显著变化无关。脂肪组织减少期间水质量水平的实例包括(a)水质量得到维持、有所增加或低于根据本发明治疗之前个体的正常范围(即其投药前水平)至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30％；(b)水质量得到维持、有所增加或低于投药前水平至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15％；(c)水质量得到维持、有所增加或低于投药前水平至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％；和(d)水质量得到维持、有所增加或低于投药前水平至多约1、2、3、4或5％。

目前在市面上销售的曲美和奥利司他是用于治疗肥胖症。这两种化合物通过完全不同的机理实现体重减轻。曲美，一种CNS食欲抑制剂，抑制血清素和去甲肾上腺素的神经元再吸收。奥利司他抑制负责分解摄入的脂肪的肠脂肪酶。

大麻素受体拮抗剂/反向激动剂可通过抑制周边大麻素受体以及与食欲抑制剂、肠脂肪酶抑制剂和其它用于类似适应症的药剂(例如血清素激动剂、瘦素、脂肪酸合成酶抑制剂、单胺氧化酶(MAO)抑制剂)完全不同的机理来促进体重减轻。预期共投予大麻素受体拮抗剂/反向激动剂以及一种或一种以上其它适用于治疗上述适应症(例如肥胖症、糖尿病、心血管代谢病症和其组合)的药剂会因产生例如叠加或协同作用而为有益的。其它药剂的实例包括食欲抑制剂、脂肪酶抑制剂和MAO抑制剂(例如MAO-B和MAO-A/B的组合)。因此，本发明提供一种治疗肥胖症、糖尿病和/或心血管代谢病症的方法，所述方法包含投予治疗有效量的本发明化合物和有效治疗所要适应症的第二组分。

第二组分的实例包括抗肥胖剂，包括(但不限于)：1)生长激素促分泌素；2)生长激素促分泌素受体激动剂/拮抗剂；3)黑色素皮质素激动剂；4)Mc4r(黑色素皮质素4受体)激动剂；5)β3激动剂；7)5HT2C(血清素受体2C)激动剂；8)食欲素拮抗剂；9)黑色素集中激素拮抗；10)黑色素集中激素1受体(MCH 1R)拮抗剂；11)黑色素集中激素2受体(MCH2R)激动剂/拮抗剂；12)甘丙素(galanin)拮抗剂；13)CCK激动剂；14)CCK-A(胆囊收缩素-A)激动剂；16)促肾上腺皮质素释放激素激动剂；17)NPY 5拮抗剂；18)NPY 1拮抗剂；19)组胺受体-3(H3)调节剂；20)组胺受体-3(H3)拮抗剂/反向激动剂；21)β-羟基类固醇脱氢酶-1抑制剂(β-HSD-1)；22)PDE(磷酸二酯酶)抑制剂；23)磷酸二酯酶-3B(PDE3B)抑制剂；24)NE(去甲肾上腺素)转运抑制剂；25)非选择性血清素/去甲肾上腺素转运抑制剂，例如曲美、苯丁胺或芬氟拉明(fenfluramine)；26)饥饿激素拮抗剂；28)瘦素衍生物；29)BRS3(铃蟾肽受体亚型3)激动剂；30)CNTF(睫状神经营养因子)；31)CNTF衍生物，例如阿索开(axokine)(Regeneron)；32)单胺再吸收抑制剂；33)UCP-1(解偶合蛋白质-1)、UCP-2或UCP-3活化剂；34)甲状腺激素β激动剂；35)FAS(脂肪酸合成酶)抑制剂；37)DGAT2(二酰基甘油酰基转移酶2)抑制剂；38)ACC2(乙酰辅酶A羧化酶-2)抑制剂；39)糖皮质激素拮抗剂；40)酰基雌激素；41)脂肪酶抑制剂，例如奥利司他(Xenical.RTM.)；42)脂肪酸转运蛋白抑制剂；43)二羧酸酯转运蛋白抑制剂；44)葡萄糖转运蛋白抑制剂；45)磷酸酯转运蛋白抑制剂；46)血清素再吸收抑制剂；47)二甲双胍(Glucophage.RTM.)；48)托吡酯(Topimax.RTM.)；和/或49)MAO抑制剂。

MAO抑制剂的实例包括吗氯贝胺(Moclobemide)；溴法罗明(Brofaromine)；BWA616U；Ro 41-1049；RS-2232；SR 95191；骆驼蓬碱(Harmaline)；哈尔满(Harman)；阿米夫胺(Amiflamine)；BW 1370U87；FLA 688；FLA 788；二苯美伦(Bifemelane)；氯吉兰(Clorgyline)；LY 51641；MDL 72,394；5-(4-苯甲氧基苯基)-3-(2-氰乙基)-(3H)-1，3，4-噁二唑-2-酮；5-(4-芳基甲氧基苯基)-2-(2-氰乙基)四唑；拉扎贝胺(Lazabemide)；Rol6-6491；阿莫噁酮(Almoxaatone)；XB308；RS-1636；RS-1653；NW-1015；SL 340026；L-司来吉兰(L-selegiline)；雷沙吉林(Rasagiline)；帕吉林(Pargyline)；AGN 1135；MDL 72,974；MDL 72,145；MDL 72,638；LY 54761；MD 780236；MD 240931；二苯美伦；托洛沙酮(Toloxatone)；西莫沙酮(Cimoxatone)；异丙烟肼(Iproniazid)；苯乙肼；尼亚拉胺(Nialamide)；苯肼；1-苯基环丙胺；异卡波肼(Isocarboxazid)；和反苯环丙胺(Tranylcypromine)。MAO抑制剂的其它实例可见于USAN 60/696,067、USAN60/686,585、USAN 60/698,867和USAN 60/704,679中，所述文献的内容以引用的方式并入本文中。

适用于治疗糖尿病的第二组分的实例包括(a)胰岛素致敏剂，包括(i)PPAR-γ激动剂，例如格列酮类(例如曲格列酮(troglitazone)、吡格列酮(pioglitazone)、恩格列酮(englitazone)、MCC-555、罗格列酮(rosiglitazone))和WO 97/27857、97/28115、97/28137和97/27847中揭示的化合物；和(ii)双胍类，例如二甲双胍和苯乙双胍；(b)胰岛素或胰岛素模拟物；(c)磺酰脲类，例如甲苯磺丁脲和格列吡嗪或相关物质；(d)α-葡糖苷酶抑制剂(例如阿卡波糖(acarbose))；(e)胆固醇降低剂，例如(i)HMG-CoA还原酶抑制剂(洛伐他汀、辛伐他汀、普伐他汀、氟伐他汀、阿托伐他汀、瑞伐他汀和其它士他汀)，(ii)螯合剂(例如消胆胺、考来替泊、和交联葡聚糖的二烷基氨基烷基衍生物)，(iii)烟醇、烟酸或其盐，(iv)PPAR-α激动剂(例如非诺贝酸衍生物，包括吉非贝齐、氯贝特、非诺贝特和苯扎贝特)，(v)胆固醇吸收抑制剂(例如β-谷固醇)和酰基CoA：胆固醇酰基转移酶抑制剂(例如甲亚油酰胺(melinamide))和(vi)丙丁酚；(f)PPAR-α/γ激动剂；(g)抗肥胖化合物(前述)；(h)回肠胆酸转运蛋白抑制剂；和(i)胰岛素受体活化剂。

水溶性聚合物可为任何结构形式，包括(但不限于)线性、分叉或支化形式。水溶性聚合物通常为聚(烷二醇)(例如聚(乙二醇)(PEG))，但也可使用其它水溶性聚合物。举例来说，使用PEG来描述本发明的某些实施例。

PEG为众所周知的水溶性聚合物，其在市面上有售或可根据所属领域中熟知的方法(Sandler和Karo，Polymer Synthesis，Academic Press，New York，第3卷，第138-161页)通过乙二醇的开环聚合来制备。术语“PEG”广泛用于涵盖任何聚乙二醇分子而不用考虑PEG的尺寸或其末端的修饰，并且可由下式表示为与4HB多肽连接：

XO-(CH₂CH₂O)_n-CH₂CH₂-Y，

其中n为2到10,000，并且X为H或末端修饰，包括(但不限于)C_1-4烷基。

在一些情况下，本发明中所用的PEG在一端以羟基或甲氧基封端，即，X为H或CH₃(“甲氧基PEG”)。或者，PEG可以反应性基团封端，从而形成双官能聚合物。典型反应性基团可包括通常用于与20种常见氨基酸中所见的官能团反应的反应性基团(包括(但不限于)马来酰亚胺基、活化碳酸酯(包括(但不限于)对硝基苯酯)、活化酯(包括(但不限于)N-羟基琥珀酰亚胺、对硝基苯酯)和醛)以及对20种常见氨基酸呈惰性、但与非天然编码氨基酸中存在的互补官能团特异性反应的官能团(包括(但不限于)叠氮基、炔基)。应注意，PEG的另一端(在上式中由Y表示)将与瘦素多肽直接连接或通过天然存在或非天然编码氨基酸间接与瘦素多肽连接。举例来说，Y可为与多肽的胺基(包括(但不限于)赖氨酸的ε胺或N末端)连接的酰胺键联、氨基甲酸酯键联或尿素键联。或者，Y可为与硫醇基团(包括(但不限于)半胱氨酸的硫醇基团)连接的马来酰亚胺键联。或者，Y可为与通过20种常见氨基酸通常不可接近的残基连接的键联。举例来说，PEG上的叠氮基可与瘦素多肽上的炔基反应形成休斯根[3+2]环加成产物。或者，PEG上的炔基可与非天然编码氨基酸中存在的叠氮基反应形成类似产物。在一些实施例中，强亲核试剂(包括(但不限于)肼、酰肼、羟胺、氨基脲)可与非天然编码氨基酸中存在的醛或酮基反应形成腙、肟或缩氨基脲，在一些情况下，适当时可通过由适当还原剂处理而进一步还原腙、肟或缩氨基脲。或者，强亲核试剂可通过非天然编码氨基酸并入瘦素多肽中并且可用于优先与水溶性聚合物中存在的酮或醛基反应。

可按照实际需要使用任何分子质量的PEG，所述分子质量视需要包括(但不限于)约100道尔顿(Dalton/Da)到100,000Da或100,000Da以上(包括(但不限于)有时为0.1-50kDa或10-40kDa)。也可使用支链PEG，包括(但不限于)各链具有在1-100kDa(包括(但不限于)1-50kDa或5-20kDa)范围内的MW的PEG分子。多种PEG分子描述于(包括但不限于)Shearwater Polymers，Inc.目录、Nektar Therapeutics目录中，所述目录以引用的方式并入本文中。

通常，PEG分子的至少一个末端可用于与非天然编码氨基酸反应。举例来说，可使用具有与氨基酸侧链反应的炔基和叠氮部分的PEG衍生物来使PEG与如本文中所述的非天然编码氨基酸连接。如果非天然编码氨基酸包含叠氮基，那么PEG通常将含有炔部分以形成[3+2]环加成产物，或含有具有膦基的活化PEG物质(即，酯、碳酸酯)以形成酰胺键。或者，如果非天然编码氨基酸包含炔，那么PEG通常将含有叠氮部分以形成[3+2]休斯根环加成产物。如果非天然编码氨基酸包含羰基，那么PEG通常将分别包含有效亲核试剂(包括(但不限于)酰肼、肼、羟胺或氨基脲官能团)以形成相应腙、肟和缩氨基脲键联。在其它替代方案中，可使用上述反应性基团的相反定向，即，可使非天然编码氨基酸中的叠氮部分与含有炔的PEG衍生物反应。

在一些实施例中，具有PEG衍生物的瘦素多肽变异体含有可与非天然编码氨基酸侧链上存在的化学官能团反应的化学官能团。

在一些实施例中，本发明提供含叠氮基和含乙炔的聚合物衍生物，其包含具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链。水溶性聚合物的聚合物主链可为聚(乙二醇)。然而，应了解包括(但不限于)聚乙二醇和其它相关聚合物(包括聚(葡聚糖)和聚(丙二醇))的多种水溶性聚合物也适用于实施本发明，并且术语PEG或聚(乙二醇)的使用打算涵盖并且包括所有这些分子。术语PEG包括(但不限于)呈任何形式的聚(乙二醇)，包括双官能PEG、多臂PEG、衍生PEG、分叉PEG、支链PEG、侧接PEG(即具有一个或一个以上侧接到聚合物主链上的官能团的PEG或相关聚合物)或具有可降解键联的PEG。

PEG通常为透明、无色、无味的，可溶于水中，对热稳定，对许多化学试剂呈惰性，不水解或变质，并且通常无毒。认为聚(乙二醇)为生物相容性的，也就是说PEG能够与活组织或生物体共存而不引起危害。更具体来说，PEG实质上为非免疫原性的，也就是说PEG不倾向于在体内产生免疫反应。当与体内具有一些所要功能的分子(例如生物活性剂)连接时，PEG倾向于掩蔽所述试剂并且可减少或消除任何免疫反应，从而使生物体可耐受所述试剂的存在。PEG接合物倾向于不产生实质免疫反应或引起凝血或其它不需的作用。具有式--CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂--(其中n为约3到约4000，通常约20到约2000)的PEG适用于本发明中。在本发明的一些实施例中，具有约800Da到约100,000Da的分子量的PEG尤其适用作聚合物主链。

聚合物主链可为线性或支化的。所属领域中通常已知支化聚合物主链。通常，支化聚合物具有一个中心支化核心部分和多个与中心支化核心连接的线性聚合物链。PEG通常以支化形式使用，所述形式可通过将氧化乙烯添加到各种多元醇(例如甘油、甘油寡聚物、季戊四醇以及山梨糖醇)上来制备。中心支化部分也可源自多种氨基酸(例如赖氨酸)。支化聚(乙二醇)可以一般形式R(-PEG-OH)_m表示，其中R是源自例如甘油、甘油寡聚物或季戊四醇等核心部分，并且m表示臂的数目。多臂PEG分子(例如在美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；第5,229,490号；第4,289,872号；美国专利申请案2003/0143596；WO 96/21469；以及WO 93/21259中所述的多臂PEG分子，所述文献各自以全文引用的方式并入本文中)也可用作聚合物主链。

支化PEG也可为由PEG(--YCHZ₂)_n表示的分叉PEG形式，其中Y为连接基团并且Z为通过规定长度的原子链与CH连接的活化末端基团。

另一种支化形式侧接PEG沿PEG主链而不是在PEG链的末端处具有例如羧基等反应性基团。

除这些PEG形式之外，也可制备主链中具有弱键联或可降解键联的聚合物。举例来说，可制备聚合物主链中具有经受水解作用的酯键联的PEG。如下文所示，这一水解作用使聚合物裂解为较低分子量的片段：

-PEG-CO₂-PEG-+H₂O→PEG-CO₂H+HO-PEG-。

所属领域的技术人员应了解，术语聚(乙二醇)或PEG表示或包括所属领域中已知的所有形式，其包括(但不限于)在本文中所揭示的形式。

许多其它聚合物也适用于本发明中。在一些实施例中，具有2到约300个末端的水溶性聚合物主链尤其适用于本发明中。合适的聚合物的实例包括(但不限于)其它聚(烷二醇)，例如聚(丙二醇)(“PPG”)、其共聚物(包括(但不限于)乙二醇与丙二醇的共聚物)、其三聚物、其混合物等。尽管聚合物主链的各链的分子量可改变，但其通常在约800Da到约100,000Da、通常约6,000Da到约80,000Da的范围内。

所属领域的技术人员应认识到，实质上水溶性主链的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性，并且预期具有上述性质的所有聚合物材料都适用于本发明中。

在本发明的一些实施例中，聚合物衍生物为“多官能的”，意思是聚合物主链具有至少两个经官能团官能化或活化的末端并且可能具有多达约300个末端。多官能聚合物衍生物包括(但不限于)具有两个末端的线性聚合物，其中各末端与可相同或不同的官能团键结。

在一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：

X-A-POLY-B-N＝N＝N

其中：

N＝N＝N为叠氮部分；

B为连接部分，其可存在或不存在；

POLY为水溶性非抗原聚合物；

A为连接部分，其可存在或不存在并且其可与B相同或不同；并且

X为第二官能团。

A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个并且更优选为1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括例如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处支化。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个并且更优选为5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上碳原子可经氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号；第5,643,575号；以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团，所述文献各自以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到，连接部分的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性，并且预期具有上述性质的所有连接部分都适用于本发明中。

适用作X的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯、三氟乙磺酸酯、烯烃、酮和叠氮化物。所属领域的技术人员应了解，所选X部分应与叠氮基相容以使得不与叠氮基发生反应。含叠氮基的聚合物衍生物可为同双官能的，意思是第二官能团(即，X)也是叠氮部分；或为异双官能的，意思是第二官能团为不同的官能团。

术语“经保护”是指存在防止化学反应性官能团在某些反应条件下发生反应的保护基或保护部分。保护基应视所保护的化学反应性基团的类型而改变。举例来说，如果化学反应性基团是胺或酰肼，那么保护基可选自叔丁氧羰基(t-Boc)和9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)的群组。如果化学反应性基团为硫醇，那么保护基可为邻吡啶基二硫化物。如果化学反应性基团为羧酸(例如丁酸或丙酸)或羟基，那么保护基可为苄基或例如甲基、乙基或叔丁基等烷基。所属领域中已知的其它保护基也可用于本发明中。

文献中末端官能团的具体实例包括(但不限于)碳酸N-琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第5,281,698号、第5,468,478号)、胺(例如参看Buckmann等人，Makromol.Chem.182：1379(1981)；Zalipsky等人，Eur.Polym.J.19：1177(1983))、酰肼(例如参看Andresz等人，Makromol.Chem.179：301(1978))、丙酸琥珀酰亚胺酯和丁酸琥珀酰亚胺酯(例如参看Olson等人，Poly(ethylene glycol)Chemistry & Biological Applications，第170-181页，Harris和Zalipsky编，ACS，Washington，D.C.，1997；也参看美国专利第5,672,662号)、琥珀酸琥珀酰亚胺酯(例如参看Abuchowski等人，Cancer Biochem.Biophys.7：175(1984)以及Joppich等人，Makromol.Chem.180：1381(1979))、琥珀酰亚胺酯(例如参看美国专利第4,670,417号)、碳酸苯并三唑酯(例如参看美国专利第5,650,234号)、缩水甘油醚(例如参看Pitha等人，Eur.J Biochem.94：11(1979)；Elling等人，Biotech.Appl.Biochem.13：354(1991))、氧羰基咪唑(例如参看Beauchamp等人，Anal.Biochem.131：25(1983)；Tondelli等人，J.Controlled Release 1：251(1985))、碳酸对硝基苯酯(例如参看Veronese等人，Appl.Biochem.Biotech.，11：141(1985)；以及Sartore等人，Appl.Biochem.Biotech.，27：45(1991))、醛(例如参看Harris等人，J.Polym.Sci.Chem.Ed.22：341(1984)；美国专利第5,824,784号、美国专利第5,252,714号)、马来酰亚胺(例如参看Goodson等人，Bio/Technology(NY)8：343(1990)；Romani等人，Chemistry of Peptides and Proteins 2：29(1984))；以及Kogan，Synthetic Comm.22：2417(1992))、邻吡啶基二硫化物(例如参看Woghiren等人，Bioconj.Chem.4：314(1993))、丙烯醇(例如参看Sawhney等人，Macromolecules，26：581(1993))、乙烯基砜(例如参看美国专利第5,900,461号)。所有上述参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

在本发明的某些实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-N＝N＝N

其中：

X为如上所述的官能团；并且

n为约20到约4000。

在另一个实施例中，本发明的聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-W-N＝N＝N，

其中：

W为包含1-10个碳原子的脂肪族或芳香族连接部分；

n为约20到约4000；并且

X为如上所述的官能团，m介于1与10之间。

可通过所属领域中已知和/或本文中所揭示的多种方法来制备本发明的含叠氮基的PEG衍生物。在下文展示的一种方法中，具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适的离去基键结的第二末端)与叠氮基阴离子(其可与多种合适的抗衡离子(包括钠、钾、叔丁基铵等)中的任一种配对)反应。离去基经历亲核置换并且由叠氮部分置换，从而得到所需的含叠氮基的PEG聚合物。

X-PEG-L+N₃ ^-→X-PEG-N₃

如所示，适用于本发明的聚合物主链具有式X-PEG-L，其中PEG为聚(乙二醇)并且X为不与叠氮基反应的官能团，并且L为合适的离去基。合适的官能团的实例包括(但不限于)羟基、经保护羟基、缩醛、烯基、胺、氨氧基、经保护胺、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、马来酰亚胺、二硫代吡啶和乙烯基吡啶以及酮。合适的离去基的实例包括(但不限于)氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根以及甲苯磺酸根。

在另一种制备本发明的含叠氮基的聚合物衍生物的方法中，使具有叠氮基官能团的连接剂与具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链接触，其中连接剂具有将与PEG聚合物上的化学官能团选择性反应的化学官能团，以形成含叠氮基的聚合物衍生物产物，其中叠氮基是通过连接基团与聚合物主链分隔开。

例示性反应方案展示如下：

X-PEG-M+N-连接子-N＝N＝N→PG-X-PEG-连接子-N＝N＝N

其中：

PEG为聚(乙二醇)并且X为例如烷氧基等封端基团或如上所述的官能团；并且

M为不可与叠氮基官能团反应、但可与N官能团有效且选择性反应的官能团。

合适的官能团的实例包括(但不限于)：如果N为胺，那么M为羧酸、碳酸酯或活性酯；如果N为酰肼或氨氧基部分，那么M为酮；如果N为亲核基团，那么M为离去基。

可由已知方法(包括(但不限于)沉淀产物，必要时接着进行色谱)实现粗产物的纯化。

下文展示在PEG二胺的情况下的更具体实例，其中一个胺经例如叔丁基-Boc等保护基部分保护并且所得单保护的PEG二胺与具有叠氮基官能团的连接部分反应：

BocHN-PEG-NH₂+HO₂C-(CH₂)₃-N＝N＝N

在这种情况下，可使用多种活化剂(例如亚硫酰氯或碳化二亚胺试剂以及N-羟基琥珀酰亚胺或N-羟基苯并三唑)使胺基与羧酸基团偶合以在单胺PEG衍生物与具有叠氮基的连接部分之间产生酰胺键。在成功形成酰胺键之后，所得经N-叔丁基-Boc-保护的含叠氮基的衍生物可直接用于修饰生物活性分子，或其可进一步经精细修饰以安装其它适用的官能团。举例来说，可通过用强酸处理使N-t-Boc基团水解以产生ω-氨基-PEG-叠氮化物。可使用所得胺作为合成把手(synthetic handle)来安装其它适用的官能团(例如马来酰亚胺基团、活化二硫化物、活化酯等)以产生有价值的异双官能试剂。

当需要将不同分子与聚合物的各末端连接时，异双官能衍生物尤其有用。举例来说，ω-N-氨基-N-叠氮基PEG将允许具有活性亲电子基团(例如醛、酮、活性酯、活性碳酸酯等)的分子与PEG的一个末端连接，并且将允许具有乙炔基团的分子与PEG的另一个末端连接。

在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物具有以下结构：

X-A-POLY-B-C≡C-R，

其中：

R可为H或烷基、烯烃、烷氧基或芳基或经取代芳基；

B为连接部分，其可存在或不存在；

POLY为水溶性非抗原性聚合物；

A为连接部分，其可存在或不存在且其可与B相同或不同；并且

X为第二官能团。

A和B的连接部分的实例包括(但不限于)含有多达18个且更优选为1-10个碳原子的多官能烷基。烷基链中可包括例如氮、氧或硫等杂原子。烷基链也可在杂原子处支化。A和B的连接部分的其它实例包括(但不限于)含有多达10个并且更优选为5-6个碳原子的多官能芳基。芳基的一个或一个以上个碳原子原子可经氮、氧或硫原子取代。合适的连接基团的其它实例包括美国专利第5,932,462号和第5,643,575号以及美国专利申请公开案2003/0143596中所述的连接基团，所述文献各自以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到，连接部分的上述清单无论如何并不详尽并且仅具有说明性，并且预期具有上述性质的多种连接部分适用于本发明中。

适用作X的官能团的实例包括羟基、经保护羟基、烷氧基、活性酯(例如N-羟基琥珀酰亚胺酯和1-苯并三唑酯)、活性碳酸酯(例如碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯和碳酸1-苯并三唑酯)、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃、酮以及乙炔。应了解，所选X部分应与乙炔基相容以使得不与乙炔基发生反应。含乙炔的聚合物衍生物可为同双官能的，意思是第二官能团(即，X)也是乙炔部分，或异双官能的，意思是第二官能团是不同的官能团。

在本发明的另一个实施例中，聚合物衍生物包含具有以下结构的聚合物主链：

X-CH₂CH₂O--(CH₂CH₂O)_n--CH₂CH₂-O-(CH₂)_m-C≡CH，

其中：

X为如上所述的官能团；

n为约20到约4000；并且

m介于1与10之间。

各异双官能PEG聚合物的具体实例展示如下。

可使用所属领域的技术人员已知和/或本文中所揭示的方法来制备本发明的含乙炔的PEG衍生物。在一种方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量的水溶性聚合物主链(所述聚合物主链具有与第一官能团键结的第一末端和与合适的亲核基团键结的第二末端)与具有乙炔官能团和适于与PEG上的亲核基团反应的离去基的化合物反应。当具有亲核部分的PEG聚合物与具有离去基的分子组合时，离去基经历亲核置换并且由亲核部分置换，从而得到所需含乙炔的聚合物。

X-PEG-Nu+L-A-C→X-PEG-Nu-A-C≡CR′。

如所示，用于反应中的优选聚合物主链具有式X-PEG-Nu，其中PEG为聚(乙二醇)，Nu为亲核部分并且X为不与Nu、L或乙炔官能团反应的官能团。

Nu的实例包括(但不限于)主要通过SN2型机制反应的胺、烷氧基、芳氧基、巯基、亚氨基、羧酸酯基、酰肼基、氨氧基。Nu基团的其它实例包括主要通过亲核加成反应来反应的官能团。L基团的实例包括氯离子、溴离子、碘离子、甲磺酸根、三氟乙磺酸根和甲苯磺酸根和预期经历亲核置换的其它基团，以及酮、醛、硫酯、烯烃、α-β不饱和羰基、碳酸酯基和预期经历亲核试剂加成的其它亲电子基团。

在本发明的另一个实施例中，A为具有1-10个碳原子的脂肪族连接子或具有6-14个碳原子的经取代芳环。X为不与叠氮基反应的官能团，并且L为合适的离去基。

在另一种用于制备本发明的含乙炔的聚合物衍生物的方法中，使具有约800Da到约100,000Da的平均分子量、在一个末端上具有经保护官能团或封端剂并且在另一个末端上具有合适的离去基的PEG聚合物与乙炔阴离子接触。

例示性反应方案展示如下：

X-PEG-L+-C≡CR′→X-PEG-C≡CR′，

其中：

PEG为聚(乙二醇)并且X为例如烷氧基等封端基团或如上所述的官能团；并且

R′为H、烷基、烷氧基、芳基或芳氧基或经取代烷基、烷氧基、芳基或芳氧基。

在上文实例中，当与足够浓度的乙炔阴离子接触时，离去基L应充分反应以经历SN2型置换反应。所属领域中熟知由乙炔阴离子实现离去基的SN2置换所需的反应条件。

通常可由所属领域中已知的方法(包括(但不限于)沉淀产物，必要时接着进行色谱)来实现粗产物的纯化。

水溶性聚合物可与本发明的瘦素多肽连接。水溶性聚合物可通过并入瘦素多肽中的非天然编码氨基酸或非天然编码或天然编码氨基酸的任何官能团或取代基或添加到非天然编码或天然编码氨基酸中的任何官能团或取代基连接。或者，水溶性聚合物是通过天然存在氨基酸(包括(但不限于)半胱氨酸、赖氨酸或N末端残基的胺基)与并有非天然编码氨基酸的瘦素多肽连接。在一些情况下，本发明的瘦素多肽包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个非天然氨基酸，其中一个或一个以上非天然编码氨基酸与水溶性聚合物(包括(但不限于)PEG和/或寡糖)连接。在一些情况下，本发明的瘦素多肽进一步包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或10个以上与水溶性聚合物连接的天然编码氨基酸。在一些情况下，本发明的瘦素多肽包含一个或一个以上与水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸以及一个或一个以上与水溶性聚合物连接的天然存在氨基酸。在一些实施例中，相对于未接合形式，本发明中所用的水溶性聚合物增强瘦素多肽的血清半衰期。

可调节与本发明的瘦素多肽连接的水溶性聚合物的数目(即，聚乙二醇化或糖基化程度)以提供改变(包括(但不限于)增加或降低)的药理学、药物动力学或药效特征，例如活体内半衰期。在一些实施例中，4HB的半衰期比未经修饰的多肽增加至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、2倍、5倍、10倍、50倍或至少约100倍。

含有强亲核基团(即，酰肼、肼、羟胺或氨基脲)的PEG衍生物

在本发明的一个实施例中，用含有直接与PEG主链连接的末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的瘦素多肽。

在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。

在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000并且X任选地为可存在或不存在的羰基(C＝O)。

在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000。

在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端羟胺、酰肼、肼或氨基脲部分的PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的瘦素多肽。

在一些实施例中，羟胺末端PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-O-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。

在一些实施例中，含肼或含酰肼的PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，n为100-1,000并且X任选地为可存在或不存在的羰基(C＝O)。

在一些实施例中，含氨基脲的PEG衍生物具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000。

在本发明的另一个实施例中，用含有末端肼、羟胺、酰肼或氨基脲部分的支化PEG衍生物修饰包含含羰基的氨基酸的瘦素多肽，其中支化PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且更优选为5-20kDa的MW。

在本发明的另一个实施例中，用具有支化结构的PEG衍生物修饰包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽。举例来说，在一些实施例中，肼或酰肼末端PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-NH-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000，并且X任选地为可存在或不存在的羰基(C＝O)。

在一些实施例中，含有氨基脲基团的PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-NH-C(O)-NH-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选地为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10并且n为100-1,000。

在一些实施例中，含有羟胺基团的PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-C(O)-NH-CH₂-CH₂]₂CH-X-(CH₂)_m-O-NH₂

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，X任选地为NH、O、S、C(O)或不存在，m为2-10并且n为100-1,000。

水溶性聚合物与瘦素多肽连接的程度和位点可调节瘦素多肽与瘦素多肽受体在位点1处的结合。在一些实施例中，安置各键联，使得瘦素多肽以通过平衡结合检验(例如在Spencer等人，J.Biol.Chem.，263：7862-7867(1988)中关于hGH所述)所测量约400nM或400nM以下的K_d、以150nM或150nM以下的K_d并且在一些情况下以100nM或100nM以下的K_d与瘦素多肽受体在位点1处结合。

用于聚合物活化以及肽接合的方法和化学描述于文献中并且在所属技术领域中为已知的。聚合物活化的常用方法包括(但不限于)用溴化氰、高碘酸盐、戊二醛、双环氧化物(biepoxide)、表氯醇(epichlorohydrin)、二乙烯基砜、碳化二亚胺、磺酰卤、三氯三嗪等活化官能团。(参看R.F.Taylor，(1991)，PROTEIN IMMOBILISATION.FUNDAMENTAL AND APPLICATIONS，Marcel Dekker，N.Y.；S.S.Wong，(1992)，CHEMISTRY OF PROTEIN CONJUGATION AND CROSSLINKING，CRC Press，Boca Raton；G.T.Hermanson等人，(1993)，IMMOBILIZED AFFINITY LIGAND TECHNIQUES，Academic Press，N.Y.；Dunn，R.L.等人编，POLYMERIC DRUGS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series，第469卷，American Chemical Society，Washington，D.C.1991)。

可获得关于PEG的官能化和接合的若干概述和专论。例如，参看Harris，Macromol.Chem.Phys.C25：325-373(1985)；Scouten，Methods in Enzymology 135：30-65(1987)；Wong等人，Enzyme Microb.Technol 14：866-874(1992)；Delgado等人，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249-304(1992)；Zalipsky，Bioconjugate Chem.6：150-165(1995)。

活化聚合物的方法也可见于WO 94/17039、美国专利第5,324,844号、WO 94/18247、WO 94/04193、美国专利第5,219,564号、美国专利第5,122,614号、WO 90/13540、美国专利第5,281,698号和WO 93/15189中，且使活化聚合物与酶接合的方法可见于以下对应不同酶的参考文献中，所述酶包括(但不限于)凝血因子VIII(WO 94/15625)、血红蛋白(WO 94/09027)、载氧分子(美国专利第4,412,989号)、核糖核酸酶和超氧化物歧化酶(Veronese等人，App.Biochem.Biotech.11：141-45(1985))。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

通过任何便利方法来进行含有非天然编码氨基酸(例如对叠氮基-L-苯丙氨酸)的瘦素多肽的聚乙二醇化(即，添加任何水溶性聚合物)。举例来说，用经炔封端的mPEG衍生物使瘦素多肽聚乙二醇化。简单地说，在室温下在搅拌下向含对叠氮基-L-Phe的瘦素多肽的水溶液中添加过量固体mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH。通常，用具有接近进行反应的pH值(通常pH值约为4-10)的pK_a的缓冲液缓冲水溶液。例如，适于在pH 7.5下聚乙二醇化的缓冲液的实例包括(但不限于)HEPES、磷酸盐、硼酸盐、TRIS-HCl、EPPS和TES。必要时，连续监控并调节pH值。通常使反应持续进行约1-48小时。

随后，使反应产物经受疏水性相互作用色谱，以使聚乙二醇化瘦素多肽变异体与游离mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH以及当在分子的两端使未阻断PEG活化从而使瘦素多肽变异体分子交联时可形成的聚乙二醇化瘦素多肽的任何高分子量复合物分离开来。疏水性相互作用色谱期间的条件应使得游离mPEG(5000)-O-CH₂-C≡CH流过柱，而任何交联的聚乙二醇化瘦素多肽变异体复合物则在实现所需形式后洗脱出来，所需形式含有一个与一个或一个以上PEG基团接合的瘦素多肽变异体分子。合适的条件视交联复合物相对于所需接合物的相对大小而改变，并且易于由所属领域的技术人员确定。通过超滤来浓缩含有所需接合物的洗出液且通过透滤使其脱盐。

必要时，可由所属领域的技术人员已知的一种或一种以上程序进一步纯化获自疏水性色谱的聚乙二醇化瘦素多肽，所述程序包括(但不限于)亲和色谱；阴离子或阳离子交换色谱(使用(包括但不限于)DEAE琼脂糖凝胶)；硅胶色谱；反相HPLC；凝胶过滤(使用(包括但不限于)SEPHADEX G-75)；疏水性相互作用色谱；尺寸排阻色谱；金属螯合物色谱；超滤/透滤；乙醇沉淀；硫酸铵沉淀；色谱聚焦；置换色谱；电泳程序(包括(但不限于)制备型等电聚焦)；差异溶解度(包括(但不限于)硫酸铵沉淀)；或萃取。可通过与球状蛋白质标准物(PROTEIN PURIFICATION METHODS，A PRACTICAL APPROACH(Harris和Angal编)IRL Press 1989，293-306)进行比较由GPC来估算表观分子量。可通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)，接着质谱分析来分析4HB-PEG接合物的纯度。Pepinsky B.等人，J，Pharmcol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。

与本发明的瘦素多肽的氨基酸连接的水溶性聚合物可进一步不受限制地衍生或经取代。

含叠氮基的PEG衍生物

在本发明的另一个实施例中，用含有叠氮部分的PEG衍生物修饰瘦素多肽，所述叠氮部分将与非天然编码氨基酸侧链上存在的炔部分反应。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa范围内并且在一些实施例中在10-40kDa范围内的平均分子量。

在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-N₃

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。

在另一个实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-N₃

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。

在本发明的另一个实施例中，用含有末端叠氮部分的支化PEG衍生物修饰包含含炔的氨基酸的瘦素多肽，其中支化PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且更优选为5-20kDa的MW。举例来说，在一些实施例中，叠氮基末端PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pN₃

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，并且n为100-1,000，并且X任选地为O、N、S或羰基(C＝O)，在各情况下，X都可存在或不存在。

含炔的PEG衍生物

在本发明的另一个实施例中，用含有炔部分的PEG衍生物修饰瘦素多肽，所述炔部分将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应。

在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-C≡CH

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10并且n为100-1,000(即，平均分子量介于5-40kDa之间)。

在本发明的另一个实施例中，用含有借助于酰胺键与PEG主链连接的末端叠氮部分或末端炔部分的PEG衍生物修饰包含含炔的非天然编码氨基酸的瘦素多肽。

在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：

RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-NH-C(O)-(CH₂)_p-C≡CH

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10并且n为100-1,000。

在本发明的另一个实施例中，用含有末端炔部分的支化PEG衍生物修饰包含含叠氮基的氨基酸的瘦素多肽，其中支化PEG的各链具有在10-40kDa范围内并且更优选为5-20kDa的MW。举例来说，在一些实施例中，炔末端PEG衍生物将具有以下结构：

[RO-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)₂-NH-C(O)]₂CH(CH₂)_m-X-(CH₂)_pC≡CH

其中R为简单烷基(甲基、乙基、丙基等)，m为2-10，p为2-10，并且n为100-1,000，并且X任选地为O、N、S或羰基(C＝O)或不存在。

含膦的PEG衍生物

在本发明的另一个实施例中，用含有活化官能团(包括(但不限于)酯、碳酸酯)的PEG衍生物修饰瘦素多肽，所述官能团进一步包含将与非天然编码氨基酸侧链上存在的叠氮部分反应的芳基膦基团。一般来说，PEG衍生物将具有在1-100kDa范围内并且在一些实施例中在10-40kDa范围内的平均分子量。

在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：

其中n为1-10；X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，并且W为水溶性聚合物。

在一些实施例中，PEG衍生物将具有以下结构：

其中X可为O、N、S或不存在，Ph为苯基，W为水溶性聚合物并且R可为H、烷基、芳基、经取代烷基和经取代芳基。例示性R基团包括(但不限于)-CH₂、-C(CH₃)₃、-OR′、-NR′R″、-SR′、-卤素、-C(O)R′、-CONR′R″、-S(O)₂R′、-S(O)₂NR′R″、-CN和-NO₂。R′、R″、R″′和R″″各自独立地指代氢、经取代或未经取代杂烷基、经取代或未经取代芳基(包括(但不限于)经1-3个卤素取代的芳基)、经取代或未经取代烷基、烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，R基团是各自独立地经选择，而当存在R′、R″、R″′和R″″基团中的一者以上时，这些基团同样是各自独立地经选择。当R′和R″与同一氮原子连接时，其可与氮原子组合形成5元、6元或7元环。举例来说，-NR′R″打算包括(但不限于)1-吡咯烷基和4-吗啉基。根据对取代基的上述论述，所属领域的技术人员应了解术语“烷基”打算包括包含与除氢基之外的基团结合的碳原子的基团，例如卤烷基(包括(但不限于)-CF₃和-CH₂CF₃)和酰基(包括(但不限于)-C(O)CH₃、-C(O)CF₃、-C(O)CH₂OCH₃等)。

其它PEG衍生物和一般聚乙二醇化技术

可与瘦素多肽连接的其它例示性PEG分子以及聚乙二醇化方法包括以下文献中所述的分子和方法：例如，美国专利公开案第2004/0001838号；第2002/0052009号；第2003/0162949号；第2004/0013637号；第2003/0228274号；第2003/0220447号；第2003/0158333号；第2003/0143596号；第2003/0114647号；第2003/0105275号；第2003/0105224号；第2003/0023023号；第2002/0156047号；第2002/0099133号；第2002/0086939号；第2002/0082345号；第2002/0072573号；第2002/0052430号；第2002/0040076号；第2002/0037949号；第2002/0002250号；第2001/0056171号；第2001/0044526号；第2001/0027217号；第2001/0021763号；美国专利第6,646,110号；第5,824,778号；第5,476,653号；第5,219,564号；第5,629,384号；第5,736,625号；第4,902,502号；第5,281,698号；第5,122,614号；第5,473,034号；第5,516,673号；第5,382,657号；第6,552,167号；第6,610,281号；第6,515,100号；第6,461,603号；第6,436,386号；第6,214,966号；第5,990,237号；第5,900,461号；第5,739,208号；第5,672,662号；第5,446,090号；第5,808,096号；第5,612,460号；第5,324,844号；第5,252,714号；第6,420,339号；第6,201,072号；第6,451,346号；第6,306,821号；第5,559,213号；第5,612,460号；第5,747,646号；第5,834,594号；第5,849,860号；第5,980,948号；第6,004,573号；第6,129,912；WO 97/32607、EP 229,108、EP 402,378、WO 92/16555、WO 94/04193、WO 94/14758、WO 94/17039、WO 94/18247、WO 94/28024、WO 95/00162、WO 95/11924、WO 95/13090、WO 95/33490、WO 96/00080、WO 97/18832、WO 98/41562、WO 98/48837、WO 99/32134、WO 99/32139、WO 99/32140、WO 96/40791、WO 98/32466、WO 95/06058、EP 439508、WO 97/03106、WO 96/21469、WO 95/13312、EP 921131、WO 98/05363、EP 809996、WO 96/41813、WO 96/07670、EP 605 963、EP510 356、EP 400 472、EP 183 503和EP 154 316，其是以引用的方式并入本文中。本文中所述的任一种PEG分子都可以包括(但不限于)单链、支链、多臂链、单官能、双官能、多官能形式或其任何组合的任何形式使用。

增强对血清白蛋白的亲和性

也可使各种分子与本发明的瘦素多肽融合以调节瘦素多肽在血清中的半衰期。在一些实施例中，使分子与本发明的瘦素多肽连接或融合以增强对动物中的内源血清白蛋白的亲和性。

举例来说，在一些情况下，制备瘦素多肽与白蛋白结合序列的重组融合体。例示性白蛋白结合序列包括(但不限于)来自链球菌(streptococcal)蛋白G的白蛋白结合域(例如参看Makrides等人，J.Pharmacol.Exp.Ther.277：534-542(1996)；和Sjolander等人，J，Immunol.Methods 201：115-123(1997))，或白蛋白结合肽，例如在例如Dennis等人，J.Biol.Chem.277：35035-35043(2002)中所述的白蛋白结合肽。

在其它实施例中，用脂肪酸使本发明的瘦素多肽酰化。在一些情况下，脂肪酸促进与血清白蛋白的结合。例如参看Kurtzhals等人，Biochem.J.312：725-731(1995)。

在其它实施例中，本发明的瘦素多肽是直接与血清白蛋白(包括(但不限于)人类血清白蛋白)融合。关于EPO类似物的血清白蛋白融合体，参看例如美国专利第6,548,653号，其以引用的方式并入本文中。所属领域的技术人员应认识到，也可使多种其它分子与本发明的瘦素连接以调节与血清白蛋白或其它血清组分的结合。

X.瘦素多肽的糖基化

本发明包括并有一种或一种以上带有糖残基的非天然编码氨基酸的瘦素多肽。糖残基可为天然残基(包括(但不限于)N-乙酰基葡糖胺)或非天然残基(包括(但不限于)3-氟半乳糖)。糖可通过N或O-连接的糖苷键(包括(但不限于)N-乙酰基半乳糖-L-丝氨酸)或非天然键(包括(但不限于)肟或相应的C或S-连接的糖苷)与非天然编码氨基酸连接。

可在活体内或活体外将糖(包括(但不限于)糖基)部分添加到瘦素多肽中。在本发明的一些实施例中，用由氨氧基衍生的糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的瘦素多肽，以产生通过肟键连接的相应糖基化多肽。在糖与非天然编码氨基酸连接后，可通过用糖基转移酶和其它酶处理来进一步精细修饰糖以产生与瘦素多肽结合的寡糖。例如参看H.Liu等人，J.Am.Chem.Soc.125：1702-1703(2003)。

在本发明的一些实施例中，直接用以氨氧基衍生物形式制备的具有规定结构的聚糖修饰包含含羰基的非天然编码氨基酸的瘦素多肽。所属领域的技术人员应认识到，可使用其它官能团(包括叠氮化物、炔、酰肼、肼和氨基脲)使糖与非天然编码氨基酸连接。

在本发明的一些实施例中，随后可通过(包括但不限于)休斯根[3+2]环加成反应分别用(包括但不限于)炔基或叠氮基衍生物修饰包含含叠氮基或炔基的非天然编码氨基酸的瘦素多肽。这种方法允许以极高选择性修饰蛋白质。

XI.瘦素二聚物和多聚物

本发明也提供瘦素同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物(即，三聚物、四聚物等)，其中含有一个或一个以上非天然编码氨基酸的4HB家族成员多肽直接与多肽主链结合，或通过连接子与瘦素家族成员或其变异体、或GH超基因家族成员或非GH超基因家族成员或其变异体的任何其它多肽结合。由于与单体相比分子量增加，所以瘦素二聚物或多聚物接合物可展现新颖或所需性质，包括(但不限于)相对于单体瘦素家族成员展现不同的药理学、药物动力学、药效学性质、经调节的治疗半衰期或经调节的血浆半衰期。在一些实施例中，本发明的瘦素二聚物将调节瘦素受体的二聚。在其它实施例中，本发明的瘦素二聚物或多聚物将充当瘦素受体的拮抗剂、激动剂或调节剂。

在一些实施例中，存在于含有瘦素的二聚物或多聚物中的一个或一个以上瘦素分子包含与存在于位点II结合区内的水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。因而，二聚物或多聚物的各瘦素分子可用于经由位点I界面结合于瘦素多肽受体，但不可用于经由位点II界面结合于第二瘦素多肽受体。因此，瘦素多肽二聚物或多聚物可啮合两个不同瘦素多肽受体各自的位点I结合位点，但因为瘦素分子具有存在于位点II区中的连接于非遗传编码氨基酸的水溶性聚合物，所以瘦素多肽受体不能啮合瘦素多肽配体的位点II区且二聚物或多聚物充当瘦素多肽拮抗剂。在一些实施例中，存在于含有瘦素多肽的二聚物或多聚物中的一个或一个以上瘦素分子包含与存在于位点I结合区内且允许结合于位点II区的水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。或者，在一些实施例中，存在于含有瘦素多肽的二聚物或多聚物中的一个或一个以上瘦素分子包含与存在于不在位点I或位点II结合区内的位点处以致这两个位点均可用于结合的水溶性聚合物连接的非天然编码氨基酸。在一些实施例中，使用位点I、位点II或这两个位点均可用于结合的瘦素分子组合。至少一个瘦素分子具有可用于结合的位点I且至少一个瘦素分子具有可用于结合的位点II的瘦素分子组合可提供具有所需活性或性质的分子。另外，位点I与位点II均可用于结合的瘦素分子组合可产生超激动剂瘦素分子。

在一些实施例中，瘦素多肽是(包括但不限于)通过Asn-Lys酰胺键或Cys-Cys二硫键直接连接。在一些实施例中，连接的瘦素多肽和/或连接的4HB家族成员将包含不同的非天然编码氨基酸以促进二聚化，包括(但不限于)第一瘦素多肽的一个非天然编码氨基酸中的炔与第二瘦素多肽的第二非天然编码氨基酸中的叠氮化物将通过休斯根[3+2]环加成接合。或者，包含含酮的非天然编码氨基酸的第一瘦素多肽和/或连接的4HB家族成员多肽可与包含含羟胺的非天然编码氨基酸的第二瘦素多肽接合，并且所述多肽是通过形成相应肟进行反应。

或者，两种瘦素多肽和/或连接的瘦素多肽是通过连接子连接。可使用任何异型双官能连接子或同型双官能连接子来连接两种瘦素多肽和/或连接的4HB家族成员多肽，其可具有相同或不同的一级序列。在一些情况下，用于将瘦素多肽和/或连接的4HB家族成员多肽连接在一起的连接子可为双官能PEG试剂。

在一些实施例中，本发明提供具有哑铃结构的水溶性双官能连接子，所述结构包括：a)在聚合物主链的至少一个第一末端上的叠氮基、炔、肼、酰肼、羟胺或含羰基的部分；以及b)至少一个在聚合物主链的第二末端上的第二官能团。第二官能团可与第一官能团相同或不同。在一些实施例中，第二官能团不与第一官能团反应。在一些实施例中，本发明提供包含支化分子结构的至少一个臂的水溶性化合物。举例来说，分枝分子结构可为树枝状。

在一些实施例中，本发明提供通过与水溶性活化聚合物反应而形成的包含一个或一个以上瘦素多肽的多聚物，所述水溶性活化聚合物具有以下结构：

R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

其中n为约5到3,000，m为2-10，X可为叠氮基、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或含羰基的部分，并且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基。R可为例如选自由以下组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳酸1-苯并三唑酯、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃以及酮。

在一些实施例中，本发明提供通过与水溶性活化聚合物反应而形成的包含一个或一个以上与胰岛素、FGF-21、FGF-23或其任何变异体偶合的瘦素多肽的多聚物，所述水溶性活化聚合物具有以下结构：

R-(CH₂CH₂O)_n-O-(CH₂)_m-X

其中n为约5到3,000，m为2-10，X可为叠氮基、炔、肼、酰肼、氨氧基、羟胺、乙酰基或含羰基的部分，并且R为可与X相同或不同的封端基团、官能团或离去基。R可为例如选自由以下组成的群组的官能团：羟基、经保护羟基、烷氧基、N-羟基琥珀酰亚胺酯、1-苯并三唑酯、碳酸N-羟基琥珀酰亚胺酯、碳酸1-苯并三唑酯、乙缩醛、醛、水合醛、烯基、丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、活性砜、胺、氨氧基、经保护胺、酰肼、经保护酰肼、经保护硫醇、羧酸、经保护羧酸、异氰酸酯、异硫氰酸酯、马来酰亚胺、乙烯基砜、二硫代吡啶、乙烯基吡啶、碘乙酰胺、环氧化物、乙二醛、二酮、甲磺酸酯、甲苯磺酸酯和三氟乙磺酸酯、烯烃以及酮。

XII.瘦素多肽活性和瘦素多肽对瘦素多肽受体的亲和性的测量

可使用标准活体外或活体内检验测定瘦素多肽活性。举例来说，可使用在存在瘦素的情况下增殖的细胞系(例如包括(但不限于)表达瘦素受体的细胞系)来监测瘦素受体结合。例如，参看Clark，R.等人，J.Biol Chem.271(36)：21969(1996)；Wada等人，Mol Endocrinol.12：146-156(1998)；Gout，P.W.等人，Cancer Res.40，2433-2436(1980)；WO 99/03887。对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化瘦素多肽，可使用BIAcore^TM生理传感器(Pharmacia)测量所述激素对其受体的亲和性。例如，参看美国专利第5,849,535号；Spencer，S.A.等人，J.Biol.Chem.，263：7862-7867(1988)。测试瘦素活性的活体内动物模型包括例如Clark等人，J.Biol.Chem.271(36)：21969-21977(1996)中所述的模型。关于包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽的二聚能力的检验可如以下文献中所述来进行：Cunningham，B.等人，Science，254：821-825(1991)，和Fuh，G.等人，Science，256：1677-1680(1992)。所引用的所有参考文献和专利均以引用的方式并入本文中。饮食诱发肥胖(DIO)小鼠或大鼠模型也常用于例如肥胖症和第2型糖尿病等代谢病症的研究中。通常，给小鼠或大鼠喂食高脂肪饮食8-12周，且小鼠或大鼠变肥胖并患中度糖尿病。肥胖程度可通过饮食中所包括的脂肪量来控制。

对于包含非天然氨基酸的非聚乙二醇化或聚乙二醇化瘦素多肽，可使用所属领域中已知的技术(例如BIAcore^TM生理传感器(Pharmacia))测量所述激素对其受体的亲和性。测试瘦素活性的活体内动物模型以及人类临床试验包括以下文献中所述者：例如Kontsek等人，Acta Virol，43：63(1999)；Youngster等人，Current Pharma Design 8：2139(2002)；Kozlowski等人，BioDrugs 15：419(2001)；美国专利第6,180,096号、第6,177,074号、第6,042,822号、第5,981,709号、第5,951,974号、第5,908,621号、第5,711,944号、第5,738,846号，其以引用的方式并入本文中。

无论用于产生本发明瘦素类似物的方法如何，都要使类似物进行生物活性检验。可进行氚化胸腺嘧啶检验来确定细胞分裂的程度。然而，也可使用其它生物检验来确定期望活性。例如检验细胞或动物模型中的葡萄糖激发反应的生物检验也提供瘦素活性的指示。虽然可利用OB小鼠模型，但也可利用其它基于细胞的动物检验进行4HB蛋白质评估，包括以下文献中可见的检验：Bailon等人，Bioconj.Chem.12：195(2001)；Forti等人，Meth.Enzymol.119：533(1986)；Walter等人，Cancer Biother.& Radiopharm.13：143(1998)；DiMarco等人，BioChcm.Biophys.Res.Com.202：1445(1994)；和美国专利第4,675,282号、第4,241,174号、第4,514,507号、第4,622,292号、第5,766,864号，其以引用的方式并入本文中。可使用其它活体外检验来确定生物活性。一般来说，生物活性的测试应提供对期望结果的分析，例如生物活性的增加或减小(与未改变的瘦素相比)、不同的生物活性(与未改变的瘦素相比)、受体亲和性分析或血清半衰期分析。

关于检验方法学的参考文献的上述汇编并不详尽，且所属领域的技术人员应认可适用于测试期望最终结果的其它检验。

XIII.效能、功能性活体内半衰期和药物动力学参数的测量

本发明的一个重要方面是通过在多肽与水溶性聚合物部分接合或不接合的情况下构建瘦素多肽而获得的延长的生物半衰期。瘦素多肽血清浓度的快速降低已使得评估对用接合和未接合瘦素多肽和其变异体进行治疗的生物反应变得重要。在静脉内投药后，本发明的接合和未接合瘦素多肽和其变异体优选也具有延长的血清半衰期，从而使通过例如ELISA方法或初步筛选检验进行测量成为可能。可使用来自BioSource International (Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的ELISA或RIA试剂盒。测量瘦素或其变异体的活体内半衰期的检验的另一实例描述于以下文献中：Kozlowski等人，BioDrugs 15：419(2001)；Bailon等人，Bioconj.Chem.12：195(2001)；Youngster等人，Current Pharm.Design 8：2139(2002)；美国专利第6,524,570号、第6,250,469号、第6,180,096号、第6,177,074号、第6,042,822号、第5,981,709号、第5,591,974号、第5,908,621号、第5,738,846号，其以引用的方式并入本文中。测量G-CSF或其变异体的活体内半衰期的检验的另一实例描述于美国专利第5,824,778号(其以引用的方式并入本文中)中，采用与测量瘦素的血清半衰期相同的方法。活体内生物半衰期的测量如本文所述而进行。

可根据任何以下方案来测定包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的效能和功能性活体内半衰期，例如Clark，R.等人，J.Biol Chem.271，36，21969-21977(1996)；美国专利第5,711,944号、第5,382,657号、第6,646,110号、第6,555,660号、第6,166,183号、第5,985,265号、第5,824,778号、第5,773,581号、第6,586,398号、第5,583,272号和美国专利申请公开案第2003/0198691A1号，其以引用的方式并入本文中。

可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每个处理组N＝5只动物)中评估包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的药物动力学参数。动物将经静脉内接受每只大鼠25μg的单剂量或经皮下接受每只大鼠50μg的单剂量，并且将根据预定时程采集约5-7个血样，对于未与水溶性聚合物接合的包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽来说，通常历时约6小时；并且对于包含非天然编码氨基酸并与水溶性聚合物接合的瘦素多肽来说，通常历时约4天。在数个物种中充分研究瘦素多肽的药物动力学数据并且可直接将所述数据与关于包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽所获得的数据进行比较。关于与瘦素相关的研究，参看Mordenti J.等人，Pharm.Res.8(11)：1351-59(1991)。

可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每个处理组N＝5只动物)中评估包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的药物动力学参数。动物将经静脉内接受每只大鼠10μg的单剂量或经皮下接受每只大鼠20μg的单剂量，并且将根据预定时程采集约5-7个血样，对于未与水溶性聚合物接合的包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽来说，通常历时约6小时；并且对于包含非天然编码氨基酸并与水溶性聚合物接合的瘦素多肽来说，通常历时约4天。在数个物种中充分研究瘦素多肽的药物动力学数据并且可直接将所述数据与关于包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽所获得的数据进行比较。关于与瘦素相关的研究，参看Mordenti J.等人，Pharm.Res.8(11)：1351-59(1991)。

可在正常Sprague-Dawley雄性大鼠(每个处理组N＝5只动物)中评估包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的药物动力学参数。动物将经静脉内接受每只大鼠75μg的单剂量或经皮下接受每只大鼠150μg的单剂量，并且将根据预定时程采集约5-7个血样，对于未与水溶性聚合物接合的包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽来说，通常历时约6小时；并且对于包含非天然编码氨基酸并与水溶性聚合物接合的瘦素多肽来说，通常历时约4天。在数个物种中充分研究瘦素多肽的药物动力学数据并且可直接将所述数据与关于包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽所获得的数据进行比较。关于与瘦素相关的研究，参看Mordenti J.等人，Pharm.Res.8(11)：1351-59(1991)。

可通过所属领域中已知的各种检验来测定本发明的瘦素多肽的比活性。本发明的经纯化瘦素蛋白质的生物活性使得通过注射投予人类患者瘦素蛋白质可显示显而易见的生物活性结果：降低葡萄糖水平、降低食欲、展现生理学代谢变化、增加血管生成、增加创伤愈合或这些结果的任何组合。可通过与Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)中类似的方法来测试根据本发明获得并纯化的瘦素突变蛋白或其片段的生物活性。可用于测定瘦素生物活性的另一测定hEPO活性的生物检验是正常红细胞小鼠检验(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))。可通过本文中所描述或所参考或所属领域的技术人员已知的方法来测试根据本发明获得并纯化的瘦素多肽突变蛋白或其片段的生物活性。

可类似地用于测试瘦素多肽或其变异体的生物活性的测量hG-CSF活体内生物活性的检验的其它实例描述于美国专利第5,681,720号、第5,795,968号、第5,824,778号、第5,985,265号和Bowen等人，Experimental Hematology 27：425-432(1999)中，各文献均以引用的方式并入本文中。

XIV.投药和医药组合物

本发明的瘦素多肽或蛋白质任选地(包括但不限于)与合适的医药载剂组合用于治疗用途。例如，这些组合物包含治疗有效量的化合物和医药学上可接受的载剂或赋形剂。所述载剂或赋形剂包括(但不限于)生理盐水、缓冲生理盐水、右旋糖、水、甘油、乙醇和/或其组合。制备适用于投药模式的调配物。一般来说，所属领域中熟知投予蛋白质的方法，并且所述方法可用于投予本发明的多肽。

根据所属领域中熟知的方法，任选地在疾病的一种或一种以上适当的活体外和/或活体内动物模型中测试包含一种或一种以上本发明的多肽的治疗组合物，从而证实功效、组织代谢并且估算剂量。具体来说，最初可通过本文中的非天然氨基酸同源物相对于天然氨基酸同源物(包括(但不限于)经修饰包括一个或一个以上非天然氨基酸的瘦素多肽与天然氨基酸瘦素多肽的比较)的活性、稳定性或其它合适的量度(即，在相关检验中)来确定剂量。

通过通常用于引导分子与血液或组织细胞最终接触的任何途径进行投药。本发明的非天然氨基酸多肽是任选地与一种或一种以上医药学上可接受的载剂一起以任何合适的方式投予。可使用向患者投予本发明上下文中的所述多肽的合适方法，并且虽然可使用超过一种途径来投予特定组合物，但特定途径通常可提供比另一途径即时并且有效的作用或反应。

医药学上可接受的载剂是部分地由所投予的特定组合物以及用于投予组合物的特定方法决定。因此，存在本发明的医药组合物的多种合适的调配物。

可由多种途径投予多肽组合物，所述途径包括(但不限于)口服、静脉内、腹膜内、肌肉内、经皮、皮下、局部、舌下或直肠方式。包含经修饰或未经修饰的非天然氨基酸多肽的组合物也可通过脂质体投予。所属领域的技术人员通常已知所述投药途径和适当的调配物。

单独或与其它合适的组分组合的包含非天然氨基酸的瘦素多肽也可制成通过吸入投予的气雾剂调配物(即，其可“雾化”)。气雾剂调配物可放置到加压的可接受推进剂(例如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气等)中。

适于肠外投予(例如，通过关节内(在关节中)、静脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和皮下途径)的调配物包括水性和非水性的等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性的无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。包装的核酸的调配物可在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中呈递。

肠外投药和静脉内投药为优选的投药方法。具体来说，已用于天然氨基酸同源物治疗剂的投药途径(包括(但不限于)通常用于EPO、GH、G-CSF、GM-CSF、IFN、白细胞介素、抗体和/或任何其它医药学上传递蛋白的投药途径)与目前使用的调配物一起提供本发明多肽的优选投药途径和调配物。

在本发明的上下文中，视应用而定，投予患者的剂量足以随时间在患者体内产生有益的治疗反应，或包括(但不限于)抑制病原体感染，或其它适当活性。通过特定载体或调配物的功效和所使用的非天然氨基酸多肽的活性、稳定性或血清半衰期和患者的病状以及欲治疗患者的体重或表面积来确定剂量。剂量大小也由特定患者体内伴随特定载体、调配物等的投予产生的任何有害副作用的存在、性质和程度决定。

在确定病状的治疗或预防(包括(但不限于)调控能量平衡、肥胖管理、调节葡萄糖、调节脂质代谢、调节下丘脑—垂体神经内分泌功能、治疗不孕不育症、促进免疫功能、促进造血、增加血管生成、增加创伤愈合或降低血清脂质)中欲投予的载体或调配物的有效量时，医师评价循环血浆含量、调配物毒性、疾病进展和/或(相关时)抗非天然氨基酸多肽抗体的产生。

例如投予70公斤患者的剂量通常在等于当前使用的治疗性蛋白质的剂量的范围内，所述范围可针对相关组合物的活性或血清半衰期的改变而进行调节。本发明的载体可通过任何已知的常规疗法来补充治疗条件，所述常规疗法包括抗体投予、疫苗投予、投予细胞毒性剂、天然氨基酸多肽、核酸、核苷酸类似物、生物反应调节剂等。

关于投药，本发明的调配物是以由相关调配物的LD-50或ED-50和/或对各种浓度的非天然氨基酸的任何副作用(包括(但不限于)当关系到患者的体重和整体健康时)的观测结果所确定的速率投予。可通过单次剂量或分剂量实现投药。

如果经历调配物输液的患者出现发热、发冷或肌肉疼痛，那么他/她接受适当剂量的阿司匹林(aspirin)、布洛芬(ibuprofen)、醋氨酚(acetaminophen)或其它疼痛/发热控制药物。在即将输液前30分钟，用阿司匹林、醋氨酚或(包括但不限于)苯海拉明(diphenhydramine)对经历输液反应(例如发热、肌肉疼痛和发冷)的患者进行前驱用药。哌替啶(meperidine)是用于不能对退热剂和抗组胺剂迅速作出反应的更为严重的发冷和肌肉疼痛。视反应的严重性而减缓或停止细胞输液。

本发明的人类瘦素多肽可直接投予哺乳动物个体。通过通常用于向个体引入瘦素多肽的任何途径进行投药。根据本发明的实施例的瘦素多肽组合物包括适于口服、经直肠、局部、吸入(包括(但不限于)通过气雾剂)、经颊(包括(但不限于)舌下)、经阴道、肠外(包括(但不限于)皮下、肌肉内、皮内、关节内、胸膜内、腹膜内、脑内、动脉内或静脉内)、局部(即，皮肤与粘膜表面，其包括气管表面)以及透皮投予的瘦素多肽组合物，但在任何既定情况下最合适的途径将视所治疗病状的性质和严重性而定。投药可为局部或全身性投药。化合物的调配物可在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中呈递。本发明的瘦素多肽可制备为单位剂量可注射形式(包括(但不限于)溶液、悬浮液或乳液)与医药学上可接受的载剂的混合物。也可通过连续输液(使用(包括但不限于)微型泵，例如渗透泵)、单次团注或缓释储槽式调配物来投予本发明的瘦素多肽。

适于投药的调配物包括水溶液和非水溶液(等张无菌溶液)，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使调配物等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。可由先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂来制备溶液和悬浮液。

本发明的医药组合物可包含医药学上可接受的载剂。医药学上可接受的载剂是部分由欲投予的特定组合物以及用于投予组合物的特定方法决定。因此，存在本发明的医药组合物的多种合适的调配物(包括可选的医药学上可接受的载剂、赋形剂或稳定剂)。(例如参看Remington′s Pharmaceutical Sciences，第17版，1985)。

合适的载剂包括：缓冲剂，其含有磷酸盐、硼酸盐、HEPES、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(小于约10个残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；二价金属离子，例如锌、钴或铜；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；成盐抗衡离子，例如钠；和/或非离子型表面活性剂，例如Tween^TM、Pluronics^TM或PEG。

本发明的瘦素多肽(包括与例如PEG等水溶性聚合物连接的瘦素多肽)也可通过持续释放系统或作为持续释放系统的一部分来投予。持续释放组合物包括(包括但不限于)呈成形物品(包括(但不限于)薄膜或微胶囊)形式的半渗透性聚合物基质。持续释放基质包括生物可相容材料，例如聚(甲基丙烯酸2-羟基乙酯)(Langer等人，J.Biomed.Mater.Res.，15：167-277(1981)；Langer，Chem.Tech.，12：98-105(1982))、乙烯乙酸乙烯酯(Langer等人，同上文)或聚-D-(-)-3-羟基丁酸(EP 133,988)、聚丙交酯(聚乳酸)(美国专利第3,773,919号；EP 58,481)、聚乙交酯(乙醇酸聚合物)、聚丙交酯-共-聚乙交酯(乳酸与乙醇酸的共聚物)、聚酐、L-谷氨酸与γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物(U.Sidman等人，Biopolymers，22，547-556(1983))、聚原酸酯、多肽、透明质酸、胶原蛋白、硫酸软骨素、羧酸、脂肪酸、磷脂、多糖、核酸、聚氨基酸、氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、异亮氨酸)、多核苷酸、聚乙烯丙烯、聚乙烯吡咯烷酮以及硅酮。持续释放组合物也包括脂质体捕获的化合物。含有所述化合物的脂质体是由本身已知的方法来制备：DE 3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl.Acad，Sci U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl Acad.Sci U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

通过脂质体捕获的瘦素多肽可由以下文献中描述的方法来制备：例如，DE3,218,121；Epstein等人，Proc.Natl Acad.Sci.U.S.A.，82：3688-3692(1985)；Hwang等人，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，77：4030-4034(1980)；EP 52,322；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949；EP 142,641；日本专利申请案83-118008；美国专利第4,485,045号和第4,544,545号；以及EP 102,324中。脂质体的组成和尺寸为众所周知的或能够由所属领域的技术人员根据经验容易地确定。脂质体的一些实例描述于(例如)Park JW等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 92：1327-1331(1995)；Lasic D和Papahadjopoulos D(编)：MEDICALAPPLICATIONS OF LIPOSOMES(1998)；Drummond DC等人，Liposomal drug delivery Systems for cancer therapy，Teicher B(编)：CANCER DRUG Discovery and Development(2002)；Park JW等人，Clin.Cancer Res.8：1172-1181(2002)；Nielsen UB等人，Biochim.Biophys.Acta 1591(1-3)：109-118(2002)；Mamot C等人，Cancer Res.63：3154-3161(2003)中。所引用的所有参考文献和专利都是以引用的方式并入本文中。

在本发明的上下文中，向患者投予的剂量应足以随时间在个体中产生有益反应。通常，每剂肠外投予的本发明的瘦素多肽的总的医药有效量在每天每公斤患者体重约0.01微克到每公斤患者体重约100微克，或者每天每公斤体重约0.05毫克到每公斤患者体重约1毫克的范围内，但这是以治疗判断为依据。给药频率也是以治疗判断为依据，并且本发明的聚乙二醇化瘦素多肽通常可通过上述任何投药途径投予。

XV.本发明的瘦素多肽的治疗用途

本发明的瘦素多肽适用于治疗多种病症。

一方面，本发明的瘦素多肽以某种方法用于治疗肥胖症，所述方法包含投予肥胖个体有效量的本文所定义的经修饰瘦素多肽的化合物以在所述个体中诱导体重减轻。另一方面，本发明的瘦素多肽投予高于理想体重10％或10％以上的患者有效量的本文所定义的经修饰瘦素多肽的化合物以在所述个体中诱导体重减轻。另一方面，本发明的瘦素多肽用于以有效量的本文所定义的经修饰瘦素多肽的化合物治疗处于体重增加或持续体重增加的风险中的患者以维持或降低所述个体的患者体重。另一方面，本发明的瘦素多肽用于以有效量的本文所定义的经修饰瘦素多肽的化合物治疗处于体重增加或持续体重增加的风险中的患者以维持或降低所述个体的体脂肪。在本发明的另一方面，可向患甲状腺病状的患者投予本文所揭示的经修饰瘦素多肽以预防和/或帮助体重调节或抵制由所述甲状腺病状引起的体重调节。

本发明的瘦素激动剂多肽可适用于例如治疗病状(包括(但不限于)与代谢疾病相关的病状)、调控能量平衡、肥胖管理、调节葡萄糖、调节脂质代谢、调节下丘脑-垂体神经内分泌功能、治疗不孕不育症、促进免疫功能、促进造血、增加血管生成、增加创伤愈合或降低血清脂质。在本发明的另一实施例中，包括非天然编码氨基酸的瘦素多肽可使核心体温增加.1-1℃或1℃以上，且这一测量可适用于测定患者代谢的增加。

本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重0.1mg-0.5mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重0.1-3.0mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重0.5mg-1.5mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重0.1-2.0mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重0.2-1.0mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重1.0mg-1.5mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重2.0mg-3.0mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重2.0mg-2.5mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重1.5mg-2.0mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重2.0mg-4.0mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重3.0mg-5.0mg投予有需要的患者。本发明的瘦素多肽可以每千克患者体重4.0mg或4.0mg以上投予有需要的患者。

瘦素的平均量可变化且尤其应基于取得资格的医师的推荐和处方。瘦素的确切量是个见仁见智的问题，受以下因素影响，例如所治疗的病状的确切类型、所治疗的患者的病状以及组合物中的其它成分。

本发明方法可用于治疗体脂肪百分比高于推荐体脂肪百分比(即，至少在“过重”范围内或至少在“肥胖”范围内)的人类。女性与男性之间，体脂肪百分比将有所不同。具体来说，对于女性，本发明方法可用于治疗具有以下体脂肪百分比的女性人类：至少约25％、高于25％、至少约26％、高于26％、至少约27％、高于27％、至少约28％、高于28％、至少约29％、高于29％、至少约30％、高于30％、至少约31％、高于31％、至少约32％、高于32％、至少约33％、高于33％、至少约34％、高于34％、至少约35％、高于35％、至少约40％、高于40％。对于男性，本发明方法可用于治疗具有以下体脂肪百分比的男性人类：至少约14％、高于14％、至少约15％、高于15％、至少约16％、高于16％、至少约17％、高于17％、至少约18％、高于18％、至少约19％、高于19％、至少约20％、高于20％、至少约21％、高于21％、至少约22％、高于22％、至少约23％、高于23％、至少约24％、高于24％、至少约25％、高于25％、至少约30％或高于30％。体脂肪百分比可使用所属领域中接受的任何方法估算，包括例如近红外相互作用、双重能量X射线吸光测定法、体密度测量、生物电阻抗分析等。

本发明方法可用于治疗腰围大于推荐腰围的人类。腰围是确定腹部脂肪含量和肥胖症风险的另一广泛使用的量度。过量的腹部脂肪，即当与总体脂肪不成比例时，被视为与肥胖症相关的风险因素的预测因子。认为腰围超过40英寸的男性存在风险。腰围为35英寸或35英寸以上的女性存在风险。在一个实施例中，可使用本文所揭示的化合物作为腰围超过40英寸的男性人类的体重减轻治疗。在另一个实施例中，可使用本文所揭示的化合物作为腰围超过35英寸的女性人类的体重减轻治疗。

投予本发明的瘦素产物会产生可自市面上购得的瘦素制剂所显示的任何活性(在人类中)。含有瘦素糖蛋白产物的医药组合物可经调配以使其浓度有效用于经由各种方式投予经受可受瘦素激动剂或拮抗剂影响的病症的人类患者，所述瘦素激动剂或拮抗剂例如(但不限于)抗肥胖激动剂、抗脂质激动剂、葡萄糖降低激动剂或血管生成激动剂，可单独使用或作为病状或疾病的一部分使用。瘦素糖蛋白产物的平均量可变化且尤其应基于取得资格的医师的推荐和处方。瘦素的确切量是个见仁见智的问题，受以下因素影响，例如所治疗的病状的确切类型、所治疗的患者的病状以及组合物中的其它成分。因此，本发明瘦素可用于中断或调节能量平衡、能量调控、肥胖症管理、血清脂质、血清葡萄糖、调节葡萄糖、调节脂质代谢、调节下丘脑-垂体神经内分泌功能、治疗不孕不育症、促进免疫功能、促进造血、增加血管生成或增加创伤愈合。本发明还提供投予治疗有效量的另一活性剂，例如抗糖尿病剂、抗脂质剂、食欲抑制剂或其它药剂。欲给予的量可由所属领域的技术人员基于瘦素疗法容易地确定。

本发明的瘦素多肽可与一种或一种以上适用于治疗肥胖症的其它治疗剂组合，所述治疗剂例如其它影响能量消耗、糖酵解、糖异生、糖原分解、脂肪分解、脂肪生成、脂肪吸收、脂肪储存、脂肪排泄、饥饿感和/或饱腹感和/或渴望机理、食欲/动机、食物摄取或G-I动力的抗肥胖药物。本发明的另一个实施例包括包含具有一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽以及抗肥胖剂和医药学上可接受的载剂的医药组合物。进一步说明本发明的是包含具有一个或一个以上偶合于PEG的非天然编码氨基酸的瘦素多肽、抗肥胖剂和医药学上可接受的载剂的医药调配物。其它实施例包括包含具有一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽的医药调配物，其用于制备适用于治疗肥胖症的药物。其它实施例包括包含具有一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽的医药调配物，其中一个或一个以上所述非天然编码氨基酸经聚乙二醇化，所述调配物用于制备适用于治疗肥胖症的药物。在本发明的一个实施例中，抗肥胖剂是：PYY、PYY_3-36、PYY激动剂、5HT转运蛋白抑制剂；NE转运蛋白抑制剂；饥饿激素拮抗剂；H3拮抗剂/反向激动剂；MCH1R拮抗剂；MCH2R激动剂/拮抗剂；MC3R激动剂；NPY1拮抗剂；NPY4激动剂；NPY5拮抗剂；瘦素；瘦素激动剂/调节剂；瘦素衍生物；类鸦片拮抗剂；食欲素拮抗剂；BRS3激动剂；11βHSD-1抑制剂；CCK-A激动剂；CNTF；CNTF激动剂/调节剂；CNTF衍生物；Cox-2抑制剂；GHS激动剂；5HT2C激动剂；5HT6拮抗剂；单胺再吸收抑制剂；UCP-1、2和3活化剂；β3激动剂；甲状腺激素β激动剂；PDE抑制剂；FAS抑制剂；DGAT1抑制剂；DGAT2抑制剂；ACC2抑制剂；糖皮质激素拮抗剂；酰基-雌激素；脂肪酶抑制剂；脂肪酸转运蛋白抑制剂；二羧酸酯转运蛋白抑制剂；葡萄糖转运蛋白抑制剂；血清素再吸收抑制剂；阿米雷司(aminorex)；安非克拉(amphechloral)；苯丙胺；阿索开；苄非他明(benzphetamine)；对氯苯丁胺(chlorphentermine)；氯苄雷司(clobenzorex)；氯福雷司(cloforex)；氯胺雷司(clominorex)；氯特胺(clortermine)；环己异丙甲胺(cyclexedrine)；右旋安非他命(dextroamphetamine)；二苯甲氧啶(diphemethoxidine)、N-乙基苯丙胺；芬布酯(fenbutrazate)；非尼雷司(fenisorex)；芬普雷司(fenproporex)；氟多雷司(fludorex)；氟氨雷司(fluminorex)；糠基甲基苯丙胺(furfurylmethylamphetamine)；左苯丙胺(levamfetamine)；左法哌酯(levophacetoperane)；美芬雷司(mefenorex)；甲氨苯丙酮(metamfepramone)；甲基苯丙胺(methamphetamine)；纳美芬(nalmefene)；去甲伪麻黄碱(norpseudoephedrine)；喷托雷司(pentorex)；苯甲曲秦(phendimetrazine)；芬美曲秦(phenmetrazine)；菲托姆化合物57(phytopharm compound 57)；匹西雷司(picilorex)；托吡酯；唑尼沙胺(zonisamide)或其组合。所属领域的技术人员将认可在治疗上可对有需要的患者有效的其它治疗剂组合或相继投药，且Cheng等人的美国专利公开案第20080319019号和Dey等人的美国专利公开案第20080261981号中提出其它组合和实施例，所述文献以全文引用的方式并入本文中。

实例

提供以下实例来说明(但不限制)所主张的发明。

实例1

本实例描述用于选择在hGH中并入非天然编码氨基酸的优选位点的许多组可能的标准中的一组。

本实例说明如何选择hGH多肽内的优选位点供引入非天然编码氨基酸。使用由与受体细胞外域的两个分子(hGHbp)复合的hGH构成的晶体结构3HHR来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。使用其它hGH结构(例如1AXI)来检查晶体结构数据集之间一级和二级结构元件的可能的变化。这些结构的坐标可获自蛋白质数据库(PDB)(Bernstein等人，J.Mol.Biol.1997，112，第535页)或经由可在万维网上以rcsb.org获得的结构生物信息学研究联合实验室PDB(The Research Collaboratory for Structural Bioinformaties PDB)获得。结构模型3HHR含有hGH的整个成熟22kDa序列，但因晶体无序性而缺少残基148-153和C末端F191残基。存在两个由C53与C165和C182与C185形成的二硫桥。本实例中所使用的序列编号是根据SEQ ID NO：48中所示的成熟hGH(22kDa变异体)的氨基酸序列。

使用以下标准来评估用于引入非天然编码氨基酸的各hGH位置：(a)根据3HHR、1AXI和1HWG的结构分析(与hGHbp单体或二聚物接合的hGH的晶体学结构)，残基不应干扰与任一hGHbp的结合；(b)残基不应受丙氨酸或同源物扫描诱变影响(Cunningham等人，Science(1989)244：1081-1085，和Cummingham等人，Science(1989)243：1330-1336)；(c)残基应为表面暴露的并且展现与周围残基的最小范德华力(van der Waals)或氢键合相互作用；(d)残基应在hGH变异体中缺失或可变(例如Tyr35、Lys38、Phe92、Lys140)；(e)残基在经非天然编码氨基酸取代后会产生保守性变化；并且(f)残基可存在于高度可挠区(包括(但不限于)CD环)或结构刚性区(包括(但不限于)螺旋B)中。另外，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)对hGH分子进行进一步计算以评估各蛋白质原子突出的程度。因此，在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸并入(但不限于)hGH中的一个或一个以上以下位置中：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、351、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：48或在其它已知hGH序列中的相应位置)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1或3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：29、33、35、37、39、49、57、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、186和187(SEQ ID NO：2或由SEQ ID NO：1或3编码的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155(SEQ ID NO：48或在其它已知hGH序列中的相应位置)。

在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：30、74、103(SEQ ID NO：48或在其它已知hGH序列中的相应位置)。在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在一个或一个以上以下位置处进行取代：35、92、143、145(SEQ ID NO：48或在其它已知hGH序列中的相应位置)。

在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、29、30、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、52、55、57、59、65、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、111、112、113、115、116、119、120、122、123、126、127、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、158、159、161、168、172、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192(即，在蛋白质的羧基末端)(SEQ ID NO：48或在其它已知hGH序列中的相应位置)。在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：30、35、74、92、103、143、145(SEQ ID NO：48或在其它已知hGH序列中的相应位置)。在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接：35、92、143、145(SEQ ID NO：48或在其它已知hGH序列中的相应位置)。

一些用于产生hGH拮抗剂的位点包括：1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123、127、或位置1之前的添加，或其任何组合(SEQ ID NO：48或在任何其它GH序列中的相应位置)。利用激动剂设计的标准(c)-(e)选择这些位点。拮抗剂设计还可包括位点I残基的定点修饰以增加与hGHbp的结合亲和力。

实例2

本实例详述包括非天然编码氨基酸的hGH多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。本实例还描述一种评估经修饰hGH多肽的生物活性的方法。

克隆hGH和其片段的方法详述于美国专利第4,601,980号、第4,604,359号、第4,634,677号、第4,658,021号、第4,898,830号、第5,424,199号和第5,795,745号中，所述文献是以引用的方式并入本文中。编码全长hGH或缺乏N末端信号序列的hGH的成熟形式的cDNA分别以SEQ ID NO：21和SEQ ID NO：22展示。

使用所引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的hGH。O-RS优先利用非天然编码氨基酸使O-tRNA氨酰基化。接着，所述翻译系统回应经编码的选择密码子而将非天然编码氨基酸插入hGH中。

表2：O-RS和O-tRNA序列

用含有经修饰hGH基因和正交氨酰基tRNA合成酶/tRNA对(对所需的非天然编码氨基酸具特异性)的质粒转化大肠杆菌允许将非天然编码氨基酸位点特异性地并入hGH多肽中。在37℃下在含有0.01-100mM特定非天然编码氨基酸的培养基中生长的转化大肠杆菌以高保真性和效率表达经修饰hGH。经His标记的含有非天然编码氨基酸的hGH由大肠杆菌宿主细胞以包涵体或聚集体形式产生。溶解聚集体并且在6M盐酸胍中在变性条件下进行亲和性纯化。在4℃下在50mM TRIS-HCl(pH 8.0)、40μM CuSO₄和2％(w/v)Sarkosyl中透析过夜，由此进行再折叠。然后针对20mM TRIS-HCl(pH 8.0)、100mM NaCl、2mM CaCl₂透析所述物质，接着去除His标签。参看Boissel等人，(1993)268：15983-93。hGH的纯化方法在所属领域中为熟知的且由SDS-PAGE、Western印迹分析或电喷雾-电离离子阱质谱等证实。

图6是经纯化的hGH多肽的SDS-PAGE。使用ProBond镍螯合树脂(Invitrogen，Carlsbad，CA)经由制造商提供的标准经His标记的蛋白质纯化程序纯化经His标记的突变hGH蛋白质，接着经阴离子交换柱纯化，之后装载到凝胶上。泳道1展示分子量标记物，且泳道2表示未并入非天然氨基酸的N-His hGH。泳道3-10含有分别在各位置Y35、F92、Y111、G131、R134、K140、Y143和K145包含非天然氨基酸对乙酰基苯丙氨酸的N-His hGH突变体。

为进一步评估经修饰hGH多肽的生物活性，使用测量hGH与其受体的相互作用的下游标记物的检验。hGH与其内源性产生的受体的相互作用使得人类IM-9淋巴细胞系的转录家族成员STAT5的信号转导子和活化子发生酪氨酸磷酸化。从IM-9cDNA文库中鉴别出STAT5的两种形式，即STAT5A和STAT5B。例如，参看Silva等人，Mol.Endocrinol.(1996)10(5)：508-518。IM-9细胞上的人类生长激素受体对人类生长激素具有选择性，这是因为大鼠生长激素与人类促乳素均不产生可检测的STAT5磷酸化。重要的是，大鼠GHR(L43R)胞外域和具有G120R的hGH与刺激pSTAT5磷酸化的hGH有效竞争。

用本发明的hGH多肽刺激IM-9细胞。从ATCC(Manassas，VA)购买人类IM-9淋巴细胞，且使之在补充有丙酮酸钠、青霉素、链霉素(Invitrogen，Carlsbad，San Diego)和10％热失活胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)的RPMI 1640中生长。使IM-9细胞在检验培养基(无酚红RPMI、10mM Hepes、1％热失活木炭/葡聚糖处理FBS、丙酮酸钠、青霉素和链霉素)中饥饿过夜，之后在37℃下用12点剂量范围的hGH多肽刺激10分钟。用1％甲醛固定受刺激的细胞，之后在冰上用90％冰冷甲醇透化1小时。在室温下用一次磷酸基-STAT5抗体(Cell Signaling Technology，Beverly，MA)细胞内染色30分钟，接着用PE接合的二次抗体细胞内染色，由此检测STAT5磷酸化的程度。在FACS阵列中获取样品，并用Flowjo软件(Tree Star Inc.，Ashland，OR)分析所获得的数据。EC₅₀值是从利用SigmaPlot由平均荧光强度(MFI)对蛋白质浓度作图所得的剂量反应曲线获得。

下表3概述以突变hGH多肽产生的IM-9数据。用所述人类IM-9细胞测试在不同位置具有非天然氨基酸取代的各种hGH多肽。具体来说，图7的图A展示经His标记的hGH多肽的IM-9数据，且图7的图B展示经His标记的包含针对Y143的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸取代的hGH的IM-9数据。使用相同检验评估包含聚乙二醇化的非天然氨基酸的hGH多肽的生物活性。

实例3

本实例详述含羰基的氨基酸的引入以及其与含氨氧基的PEG的后续反应。

本实例说明一种产生合并有含酮的非天然编码氨基酸的4HB多肽的方法，所述多肽随后与约5,000MW的含氨氧基的PEG反应。根据实例1(hGH)的标准鉴别的各残基35、88、91、92、94、95、99、101、103、111、120、131、133、134、135、136、139、140、143、145和155、根据实例32(hIFN)的标准鉴别的残基、根据实例36(hG-CSF)的标准鉴别的各残基59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167和171、或根据实例40(hEPO)的标准鉴别的各残基21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128分别由具有以下结构的非天然编码氨基酸取代：

用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入hGH中的序列为SEQ ID NO：2(hGH)和SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌

)，以及上文实例2中所述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入hIFN中的序列为SEQ ID NO：24(hIFN)和SEQ ID NO：4(muttRNA)，以及上文实例2中所述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入hG-CSF中的序列为SEQ ID NO：29(hG-CSF)和SEQ ID NO：4(muttRNA)，以及上文实例2中所述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。用于将对乙酰基-苯丙氨酸位点特异性地并入hEPO中的序列为SEQ ID NO：38(hEPO)和SEQ ID NO：4(muttRNA)，以及上文实例2中所述的16、17或18(TyrRS LW1、5或6)。

包含含羰基的氨基酸的4HB多肽变异体在经修饰后与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应：

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n为3并且N为约5,000MW。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化4HB以10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 6.0)、25mMHepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 4.5)中，与10倍到100倍过量的含氨氧基的PEG反应，并且随后在室温下搅拌10-16小时(Jencks，W.J.Am.Chem，Soc.1959，81，第475页)。随后，将PEG-4HB稀释于适当缓冲液中供立即纯化和分析。

实例4

与由通过酰胺键联与PEG连接的羟胺基组成的PEG接合。

具有以下结构的PEG试剂是使用实例3中所述的程序与含酮的非天然编码氨基酸偶合：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n＝4并且N为约20,000MW。反应、纯化和分析条件如实例3中所述。

实例5

本实例详述将两种不同的非天然编码氨基酸引入4HB多肽中。

本实例说明一种产生hGH多肽的方法，所述多肽在以下残基中的两个位置处并入包含酮官能团的非天然编码氨基酸：E30、E74、Y103、K38、K41、K140和K145。如实例1和2中所述制备hGH多肽，但将抑制因子密码子(suppressor codon)引入核酸内的两个不同位点处。

本实例说明一种产生hIFN多肽的方法，所述多肽在根据实例32鉴别的残基中的两个位置处并入包含酮官能团的非天然编码氨基酸，其中X^*表示非天然编码氨基酸。如实例32和33中所述制备hIFN多肽，但将抑制因子密码子引入核酸内的两个不同位点处。

本实例说明一种产生hG-CSF多肽的方法，所述多肽在以下残基中的两个位置处并入包含酮官能团的非天然编码氨基酸：W59X^*和T134X^*；LI3IX^*和S67X^*；S67X^*和Q91X^*；TT34X^*和Ser77X^*(如SEQ ID NO：29中，或在SEQ ID NO：28、30、35或36中的相应氨基酸)，其中X^*表示非天然编码氨基酸。如实例36和37中所述制备hG-CSF多肽，但将抑制因子密码子引入核酸内的两个不同位点处。

本实例说明一种产生hEPO多肽的方法，所述多肽在以下残基中的两个位置处并入包含酮官能团的非天然编码氨基酸：N24X^*和G113X^*；N38X^*和Q115X^*；N36X^*和S85X^*；N36X^*和A125X^*；N36X^*和A128X^*；Q86X^*和S126X^*，其中X^*表示非天然编码氨基酸。如实例40和41中所述制备hEPO多肽，但将抑制因子密码子引入核酸内的两个不同位点处。

实例6

本实例详述4HB多肽与含酰肼的PEG的接合以及后续的原位还原。

合并有含羰基的氨基酸的4HB多肽是根据实例2和实例3、实例33和实例3、实例37和实例3以及实例41和实例3中所述的程序来制备。具有以下结构的含酰肼的PEG在经修饰后与4HB多肽接合：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-X-NH-NH₂

其中R为甲基，n＝2且N＝10,000MW，并且X为羰基(C＝O)。将含有对乙酰基苯丙氨酸的经纯化4HB以0.1-10mg/mL溶解于25mM MES(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 6.0)、25mM Hepes(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 7.0)或10mM乙酸钠(Sigma Chemical，St.Louis，MO)(pH 4.5)中，与1倍到100倍过量的含酰肼的PEG反应，并且通过加入溶解于H₂O中直到最终浓度为10-50mM的储备液1MNaCNBH₃(Sigma Chemical，St.Louis，MO)原位还原相应的腙。在黑暗环境中在4℃到室温下进行反应达18-24小时。通过加入约pH 7.6的1M Tris(Sigma Chemical，St.Louis，MO)直到最终Tris浓度为50mM来终止反应，或将反应稀释于适当缓冲液中供立即纯化。

实例7

本实例详述将含炔的氨基酸引入4HB多肽中以及用mPEG-叠氮化物使其衍生化。

以下残基35、88、91、92、94、95、99、101、131、133、134、135、136、140、143、145和155各经以下非天然编码氨基酸取代(hGH；SEQ ID NO：2)：

用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入hGH中的序列为SEQ ID NO：2(hGH)、SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌)，以及上文实例2中所述的9、10或11。根据实例32鉴别的hIFN的任何残基均经这个非天然编码氨基酸取代。用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入hIFN中的序列为SEQ ID NO：24(hIFN)、SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌

)，以及上文实例2中所述的9、10或11。hG-CSF的以下残基59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167和171各经这个非天然编码氨基酸取代。用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入hG-CSF中的序列为SEQ ID NO：29(hG-CSF)、SEQ ID NO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌

)，以及上文实例2中所述的9、10或11。hEPO的以下残基21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128各经这个非天然编码氨基酸取代。用于将对炔丙基-酪氨酸位点特异性地并入hEPO中的序列为SEQ ID NO：38(hEPO)、SEQ IDNO：4(muttRNA，詹氏甲烷球菌

)，以及上文实例2中所述的9、10或11。含有所述炔丙基酪氨酸的4HB多肽在大肠杆菌中表达并且使用实例3中所述的条件加以纯化。

将含有炔丙基-酪氨酸的经纯化4HB以0.1-10mg/mL溶解于PB缓冲液(100mM磷酸钠，0.15M NaCl，pH＝8)中并且向反应混合物中加入10倍到1000倍过量的含叠氮基的PEG。随后，将催化量的CuSO₄和铜丝加入反应混合物中。在混合物经培育(包括(但不限于)在室温或37℃下约4小时，或在4℃下过夜)后，加入H₂O并且通过透析膜过滤混合物。可包括(但不限于)通过实例3中所述的类似程序来分析样品的添加。

在本实例中，PEG将具有以下结构：

R-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)(CH₂)_n-N₃

其中R为甲基，n为4并且N为10,000MW。

实例8

本实例详述用炔丙基酪氨酸取代4HB多肽中的大的疏水性氨基酸。

hGH的一个以下区域中存在的Phe、Trp或Tyr残基：1-5(N末端)、6-33(A螺旋)、34-74(A螺旋与B螺旋之间的区，A-B环)、75-96(B螺旋)、97-105(B螺旋与C螺旋之间的区，B-C环)、106-129(C螺旋)、130-153(C螺旋与D螺旋之间的区，C-D环)、154-183(D螺旋)、184-191(C末端)(SEQ ID NO：2)，是如实例7中所述经以下非天然编码氨基酸取代。类似地，hIFN的一个以下区域中存在的Phe、Trp或Tyr残基：1-9(N末端)、10-21(A螺旋)、22-39(A螺旋与B螺旋之间的区)、40-75(B螺旋)、76-77(B螺旋与C螺旋之间的区)、78-100(C螺旋)、101-110(C螺旋与D螺旋之间的区)、111-132(D螺旋)、133-136(D螺旋与E螺旋之间的区)、137-155(E螺旋)、156-165(C末端)(如SEQ ID NO：24中，或由其它IFN多肽编码的相应氨基酸)，是如实例7中所述经以下非天然编码氨基酸取代。同样，hG-CSF的一个以下区域中存在的Phe、Trp或Tyr残基：1-10(N末端)、11-39(A螺旋)、40-70(A螺旋与B螺旋之间的区)、71-91(B螺旋)、92-99(B螺旋与C螺旋之间的区)、100-123(C螺旋)、124-142(C螺旋与D螺旋之间的区)、143-172(D螺旋)、173-175(C末端)，包括短螺旋区段，即位于A螺旋与B螺旋之间的44-53处的由310螺旋(44-47)和α螺旋(48-53)组成的迷你E螺旋(如SEQ ID NO：29中，或无作为分泌信号序列的N末端30个氨基酸的SEQ ID NO：28或30、SEQ ID NO：35或36的相应氨基酸)，是如实例7中所述经以下非天然编码氨基酸取代。hEPO的一个以下区域中存在的Phe、Trp或Tyr残基：1-7(N末端)、8-26(A螺旋)、27-54(AB环，含有β折叠1(39-41)和迷你B′螺旋(47-52))、55-83(B螺旋)、84-89(BC环)、90-112(C螺旋)、113-137(CD环，含有迷你C′螺旋(114-121)和β折叠2(133-135))、138-161(D螺旋)、162-166(C末端)，是如实例7中所述经以下非天然编码氨基酸取代：

PEG在经修饰后连接到包含含炔的氨基酸的4HB多肽变异体上。所述PEG将具有以下结构：

Me-PEG(N)-O-(CH₂)₂-N₃

并且偶合程序将遵循实例7中的程序。这个过程会产生4HB多肽变异体，其包含大致与一种天然存在的大的疏水性氨基酸等比容的非天然编码氨基酸并且在所述多肽内的不同位点处经PEG衍生物修饰。

实例9

本实例详述由一个或一个以上PEG连接子进行分隔的4HB多肽同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生。

使实例7中产生的含炔的4HB多肽变异体与以下形式的双官能PEG衍生物反应：

N₃-(CH₂)_n-C(O)-NH-(CH₂)₂-O-PEG(N)-O-(CH₂)₂-NH-C(O)-(CH₂)_n-N₃

其中n为4并且PEG的平均MW为约5,000，以产生两个4HB分子由PEG实体分隔开的相应4HB多肽同型二聚物。4HB多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。将如同实例7和实例3中进行偶合、纯化和分析。

实例10

本实例详述糖部分与4HB多肽的偶合。

一个以下残基29、30、33、34、35、37、39、40、49、57、59、66、69、70、71、74、88、91、92、94、95、98、99、101、103、107、108、111、122、126、129、130、131、133、134、135、136、137、139、140、141、142、143、145、147、154、155、156、159、183、186和187(hGH，SEQ ID NO：2)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。类似地，一个以下残基1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165(如SEQ ID NO：24中，或由其它IFN多肽编码的相应氨基酸)是经以下非天然编码氨基酸取代。一个以下残基30、31、33、58、59、61、63、64、66、67、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170和171(如SEQ ID NO：29中，或SEQ ID NO：28、30、35、36或其它G-CSF多肽中的相应氨基酸)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。一个以下残基21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、162、163、164、165、166(如SEQ ID NO：38中，或由其它EPO多肽编码的相应氨基酸)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。

包含含羰基的氨基酸的4HB多肽变异体在经修饰后与N-乙酰基葡糖胺(GlcNAc)的β-连接氨氧基类似物反应。在100mM水性乙酸钠缓冲液(pH 5.5)中混合4HB多肽变异体(10mg/mL)与氨氧基糖(21mM)，并且在37℃下培育7小时到26小时。通过在环境温度下在150mM HEPES缓冲液(pH 7.4)中培育接合糖的4HB多肽(5mg/mL)与UDP-半乳糖(16mM)和β-1，4-半乳糖基转移酶(0.4单位/毫升)达48小时而使第二种糖与第一种糖酶促偶合(Schanbacher等人，J.Biol.Chem.1970，245，5057-5061)。

实例11

本实例详述聚乙二醇化4HB多肽拮抗剂的产生。

一个以下残基1、2、3、4、5、8、9、11、12、15、16、19、22、103、109、112、113、115、116、119、120、123或127(hGH，SEQ ID NO：2或在SEQ ID NO：1或3中的相应氨基酸)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。一个以下残基2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165(hIFN；SEQ ID NO：24或在SEQID NO：23或25中的相应氨基酸)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代；包含这些取代之一的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂，这取决于所选择的位点和所需的活性。一个以下残基22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137(hIFN；SEQ ID NO：24或在SEQ ID NO：23或25中的相应氨基酸)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。一个以下残基6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127、145(hG-CSF；SEQ ID NO：29或在SEQ ID NO：28、30、35或36中的相应氨基酸)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。一个以下残基2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159(hEPO；SEQ ID NO：38或在SEQ ID NO：37或39中的相应氨基酸)是如实例3中所述经以下非天然编码氨基酸取代。

包含含羰基的氨基酸的4HB多肽变异体在经修饰后将与以下形式的含氨氧基的PEG衍生物反应：

R-PEG(N)-O-(CH₂)_n-O-NH₂

其中R为甲基，n为4并且N为20,000MW，以产生在多肽内的单一位点处经PEG衍生物修饰的包含非天然编码氨基酸的4HB多肽拮抗剂。如同实例3中进行偶合、纯化和分析。

实例12

4HB分子直接进行连接的4HB多肽同型二聚物、异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物的产生

包含含炔的氨基酸的4HB多肽变异体可与另一种包含含叠氮基的氨基酸的4HB多肽变异体直接偶合，各变异体在(不限于)实例10中所述的位点处包含非天然编码氨基酸取代。这将产生相应的4HB多肽同型二聚物，其中两个4HB多肽变异体在位点II结合界面处实体连接。4HB多肽可以类似方式与一种或一种以上其它多肽偶合形成异质二聚物、同型多聚物或异质多聚物。如同实例3、实例6以及实例7中进行偶合、纯化和分析。

实例13

PEG-OH+Br-(CH₂)_n-C≡CR′→PEG-O-(CH₂)_n-C≡CR′

            A                    B

使聚烷二醇(P-OH)与烷基卤化物(A)反应形成醚(B)。在这些化合物中，n为1到9的整数并且R′可为直链或支链、饱和或不饱和的C1到C20烷基或杂烷基。R′也可为C3到C7饱和或不饱和的环状烷基或环状杂烷基，经取代或未经取代的芳基或杂芳基，或经取代或未经取代的烷芳基(所述烷基为C1到C20饱和或不饱和烷基)或杂烷芳基。通常，PEG-OH为具有800道尔顿到40,000道尔顿(Da)的分子量的聚乙二醇(PEG)或单甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

实例14

mPEG-OH+Br-CH₂-C≡CH→mPEG-O-CH₂-C≡CH

用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后，将溶解于二甲苯中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液(0.56mL，5mmol，50当量，Aldrich)和催化量的KI加入溶液中，并且将所得混合物加热到回流并持续2小时。随后加入水(1mL)并且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)并且分离有机层，用无水Na₂SO₄干燥，并将体积缩减到约2mL。将此CH₂Cl₂溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用数份冷乙醚洗涤并干燥，得到炔丙基-O-PEG。

实例15

mPEG-OH+Br-(CH₂)₃-C≡CH→mPEG-O-(CH₂)₃-C≡CH

用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理具有20,000Da的分子量的mPEG-OH(mPEG-OH 20kDa；2.0g，0.1mmol，Sunbio)。随后，将50当量的5-溴-1-戊炔(0.53mL，5mmol，Aldrich)和催化量的KI加入混合物中。将所得混合物加热到回流并持续16小时。随后加入水(1mL)并且在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)并且分离有机层，用无水Na₂SO₄干燥，并将体积缩减到约2mL。将此CH₂Cl₂溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物，用数份冷乙醚洗涤并干燥，得到相应炔。5-氯-1-戊炔可用于类似反应中。

实例16

(1)m-HOCH₂C₆H₄OH+NaOH+Br-CH₂-C≡CH→m-HOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

(2)m-HOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH+MsCl+N(Et)₃→m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

(3)m-MsOCH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH+LiBr→m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH

(4)mPEG-OH+m-Br-CH₂C₆H₄O-CH₂-C≡CH→mPEG-O-CH₂-C₆H₄O-CH₂-C≡CH

首先向3-羟基苄醇(2.4g，20mmol)溶于THF(50mL)和水(2.5mL)中的溶液中加入粉末状氢氧化钠(1.5g，37.5mmol)，随后加入溶解于二甲苯中的80重量％溶液形式的炔丙基溴溶液(3.36mL，30mmol)。在回流下加热反应混合物6小时。向混合物中加入10％柠檬酸(2.5mL)并且在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用MgSO₄干燥并浓缩，得到3-炔丙基氧基苄醇。

在0℃下，将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入化合物3(2.0g，11.0mmol)溶于CH₂Cl₂中的溶液中，并且将反应液放置到冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(2.4g，9.2mmol)溶解于THF(20mL)中并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流并持续1小时，随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用无水Na₂SO₄干燥并浓缩，得到所需溴化物。

将mPEG-OH 20kDa(1.0g，0.05mmol，Sunbio)溶解于THF(20mL)中并且在冰浴中冷却所述溶液。在强烈搅拌下历经数分钟加入NaH(6mg，0.25mmol)，接着加入上文所获得的溴化物(2.55g，11.4mmol)和催化量的KI。去除冷却浴，并且将所得混合物加热到回流并持续12小时。向混合物中加入水(1.0mL)并在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)并且分离有机层，用无水Na₂SO₄干燥，并将体积缩减到约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中，产生白色沉淀物，收集所述沉淀物以得到PEG衍生物。

实例17

mPEG-NH₂+X-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR′→mPEG-NH-C(O)-(CH₂)_n-C≡CR′

如上所示，也可通过使含有末端官能团的聚(乙二醇)聚合物与含有炔官能团的反应性分子偶合来获得末端含炔的聚(乙二醇)聚合物。n介于1与10之间。R′可为H或C1到C4的小烷基。

实例18

(1)HO₂C-(CH₂)₂-C≡CH+NHS+DCC→NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH

(2)mPEG-NH₂+NHSO-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH→mPEG-NH-C(O)-(CH₂)₂-C≡CH

将4-戊炔酸(2.943g，3.0mmol)溶解于CH₂Cl₂(25mL)中。加入N-羟基琥珀酰亚胺(3.80g，3.3mmol)和DCC(4.66g，3.0mmol)并且在室温下搅拌溶液过夜。所得粗NHS酯7未经进一步纯化即用于下一反应中。

将具有5,000Da的分子量的mPEG-NH₂(mPEG-NH₂，1g，Sunbio)溶解于THF(50mL)中并且将混合物冷却到4℃。在强烈搅拌下逐份加入NHS酯7(400mg，0.4mmol)。将混合物搅拌3小时，同时升温到室温。随后加入水(2mL)并在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(50mL)并且分离有机层，用无水Na₂SO₄干燥，并将体积缩减到约2mL。将此CH₂Cl₂溶液逐滴加入乙醚(150mL)中。收集所得沉淀物并在真空中干燥。

实例19

本实例表示聚(乙二醇)的甲烷磺酰基酯(其也可称作聚(乙二醇)的甲烷磺酸酯或甲磺酸酯)的制备。可通过类似程序制备相应的甲苯磺酸酯和卤化物。

mPEG-OH+CH₃SO₂Cl+N(Et)₃→mPEG-O-SO₂CH₃→mPEG-N₃

在氮气下，将150mL甲苯中的mPEG-OH(MW＝3,400，25g，10mmol)共沸蒸馏2小时并且将溶液冷却到室温。将40mL无水CH₂Cl₂和2.1mL无水三乙胺(15mmol)加入溶液中。在冰浴中冷却所述溶液并且逐滴加入1.2mL经蒸馏的甲烷磺酰氯(15mmol)。在氮气下，在室温下搅拌溶液过夜，并且通过加入2mL无水乙醇来中止反应。在真空下蒸发所述混合物以去除溶剂(主要是除甲苯之外的溶剂)，过滤，再次真空浓缩并且随后在100mL乙醚中沉淀。用数份冷乙醚洗涤滤液并在真空下干燥，得到甲磺酸酯。

将甲磺酸酯(20g，8mmol)溶解于75ml THF中并且将溶液冷却到4℃。向冷却的溶液中加入叠氮化钠(1.56g，24mmol)。在氮气下，将反应加热到回流并持续2小时。随后蒸发溶剂并且用CH₂Cl₂(50mL)稀释残余物。用NaCl溶液洗涤有机馏分并且用无水MgSO₄干燥。将体积缩减到20ml，并通过加入150ml冷的无水乙醚中使产物沉淀。

实例20

(1)N₃-C₆H₄-CO₂H→N₃-C₆H₄CH₂OH

(2)N₃-C₆H₄CH₂OH→Br-CH₂-C₆H₄-N₃

(3)mPEG-OH+Br-CH₂-C₆H₄-N₃→mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃

可使用美国专利5,998,595中所述的方法制备4-叠氮基苄醇，所述专利是以引用的方式并入本文中。在0℃下，将甲烷磺酰氯(2.5g，15.7mmol)和三乙胺(2.8mL，20mmol)加入4-叠氮基苄醇(1.75g，11.0mmol)溶于CH₂Cl₂中的溶液中，并且将反应液放置到冰箱中达16小时。常用处理得到呈浅黄色油状的甲磺酸酯。将所述油状物(9.2mmol)溶解于THF(20mL)中并且加入LiBr(2.0g，23.0mmol)。将反应混合物加热到回流并持续1小时并且随后冷却到室温。向混合物中加入水(2.5mL)并在真空下去除溶剂。用乙酸乙酯(3×15mL)萃取残余物并且用饱和NaCl溶液(10mL)洗涤合并的有机层，用无水Na₂SO₄干燥并浓缩，得到所需溴化物。

用THF(35mL)中的NaH(12mg，0.5mmol)处理mPEG-OH 20kDa(2.0g，0.1mmol，Sunbio)，并且向混合物中加入溴化物(3.32g，15mmol)和催化量的KI。将所得混合物加热到回流并持续12小时。将水(1.0mL)加入混合物中并在真空下去除溶剂。向残余物中加入CH₂Cl₂(25mL)并且分离有机层，用无水Na₂SO₄干燥，并将体积缩减到约2mL。逐滴加入乙醚溶液(150mL)中，产生沉淀物，收集所述沉淀物以得到mPEG-O-CH₂-C₆H₄-N₃。

实例21

NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H+N₃-CH₂CH₂CO₂-NHS→N₃-CH₂CH₂-C(O)NH-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H

将NH₂-PEG-O-CH₂CH₂CO₂H(MW 3,400Da，2.0g)溶解于NaHCO₃饱和水溶液(10mL)中并且将溶液冷却到0℃。在强烈搅拌下加入丙酸3-叠氮基-1-N-羟基琥珀酰亚胺酯(5当量)。3小时后，加入20mL H₂O并且在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5NH₂SO₄将pH值调节到3并且加入NaCl直到浓度为约15重量％。用CH₂Cl₂(100mL×3)萃取反应混合物，用Na₂SO₄干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物并在真空下干燥，得到ω-羧基-叠氮化物PEG衍生物。

实例22

mPEG-OMs+HC≡CLi→mPEG-O-CH₂-CH₂-C≡C-H

在强烈搅拌下，向如所属领域中已知所制备并冷却到-78℃的乙炔锂(4当量)溶于THF中的溶液中逐滴加入mPEG-OMs溶于THF中的溶液。3小时后，使反应升温到室温并通过加入1mL丁醇中止反应。随后加入20mL H₂O并且在室温下再搅拌混合物45分钟。用0.5N H₂SO₄将pH值调节到3并且加入NaCl直到浓度为约15重量％。用CH₂Cl₂(100mL×3)萃取反应混合物，用Na₂SO₄干燥并浓缩。用冷乙醚沉淀后，通过过滤收集产物并在真空下干燥，得到1-(丁-3-炔基氧基)-甲氧基聚乙二醇(mPEG)。

实例23

使用以下文献中描述的方法将含叠氮基的氨基酸和含乙炔的氨基酸位点选择性地并入蛋白质中：L.Wang等人，(2001)，Science 292：498-500；J.W.Chin等人，Science301：964-7(2003)；J.W.Chin等人，(2002)，Journal of the American Chemical Society124：9026-9027；J.W.Chin和P.G.Schultz，(2002)，Chem Bio Chem 11：1135-1137；J.W.Chin等人，(2002)，PNAS United States of America 99：11020-11024；以及L.Wang和P.G.Schultz，(2002)，Chem.Comm.1-10。并入氨基酸后，随即在37℃下，在存在2mM PEG衍生物、1mM CuSO₄和约1mg铜丝的情况下，用磷酸盐缓冲液(PB)(pH 8)中的0.01mM蛋白质进行环加成反应达4小时。

实例24

本实例描述对乙酰基-D，L-苯丙氨酸(pAF)和m-PEG-羟胺衍生物的合成。

使用先前描述于Zhang，Z.，Smith，B.A.C，Wang，L.，Brock，A.，Cho，C.和Schultz，P.G.，Biochemistry，(2003)42，6735-6746中的程序合成外消旋pAF。

为合成m-PEG-羟胺衍生物，完成以下程序。向在室温(RT)下搅拌1小时的(N-t-Boc-氨氧基)乙酸(0.382g，2.0mmol)和1，3-二异丙基碳化二亚胺(0.16mL，1.0mmol)溶于二氯甲烷(DCM，70mL)中的溶液中加入甲氧基-聚乙二醇胺(m-PEG-NH₂，7.5g，0.25mmol，Mt.30K，来自BioVectra)和二异丙基乙胺(0.1mL，0.5mmol)。在室温下搅拌反应液48小时，接着浓缩到约100mL。将混合物逐滴加入冷乙醚(800mL)中。经t-Boc保护的产物沉淀析出并通过过滤加以收集，用乙醚(3×100mL)洗涤。再溶解于DCM(100mL)中并且在乙醚(800mL)中沉淀两次，由此进一步纯化所述产物。在真空中干燥产物，得到7.2g(96％)，通过NMR和茚三酮测试(Nihydrin test)加以确认。

上文所获得的经保护产物(7.0g)的Boc脱除是在0℃下在50％TFA/DCM(40mL)中进行1小时并且接着在室温下进行1.5小时。在真空中去除大部分TFA后，通过向残余物中加入二噁烷(1mL)中的4N HCl使羟胺衍生物的三氟乙酸盐转化为盐酸盐。将沉淀物溶解于DCM(50mL)中并且在乙醚(800mL)中再沉淀。通过过滤收集最终产物(6.8g，97％)，用乙醚(3×100mL)洗涤，在真空中干燥，在氮气下储存。使用相同程序合成其它PEG(5K、20K)羟胺衍生物。

实例25

本实例描述用于包含非天然氨基酸的hGH多肽的表达和纯化方法。宿主细胞已用正交tRNA、正交氨酰基tRNA合成酶和hGH构建体实现转化。

首先，在37℃下使转化的DH10B(fis3)细胞的一小部分冷冻甘油储备液在2ml含100μg/ml氨苄西林的确定成分培养基(补充有亮氨酸、异亮氨酸、痕量金属和维生素的葡萄糖基本培养基)中生长。当OD₆₀₀达到2-5时，转移60μl到60ml含100μg/ml氨苄西林的新制确定成分培养基中，且再在37℃下生长到OD₆₀₀为2-5。转移50ml培养物到5升发酵罐(Sartorius BBI)中的2升含100μg/ml氨苄西林的确定成分培养基中。用碳酸钾控制发酵罐pH值为pH 6.9，温度为37℃，空气流速为51pm，且用聚亚烷基消泡剂KFO F119(Lubrizol)处理泡沫。自动调节搅拌器速度以维持溶解氧水平≥30％，且如果搅拌器速度达到其最大值，那么使用纯氧补充空气搅动。37℃下8小时后，以指数增长速率向培养物中馈入确定成分培养基的50倍浓缩物以维持0.15小时^-1的比生长速率。当OD₆₀₀达到约100时，加入对乙酰基-苯丙氨酸的外消旋混合物直到最终浓度为3.3mM，且将温度降低到28℃。0.75小时后，加入异丙基-b-D-硫代半乳糖吡喃糖苷直到最终浓度为0.25mM。使细胞在28℃下再生长8小时，制成小球，且在进一步处理之前冷冻在-80℃下。

使用ProBond镍螯合树脂(Invitrogen，Carlsbad，CA)，经由Invitrogen的使用手册提供的标准经His标记的蛋白质纯化程序纯化经His标记的突变hGH蛋白质，接着经阴离子交换柱纯化。

浓缩经纯化的hGH到8mg/ml，且将缓冲液更换成反应缓冲液(20mM乙酸钠、150mM NaCl、1mM EDTA，pH 4.0)。以20：1PEG∶hGH的摩尔比向hGH溶液中加入MPEG-羟基胺粉末。在28℃下，在平缓摇动下进行反应达2天。经由阴离子交换柱从未反应的PEG和hGH中纯化PEG-hGH。

在进入动物实验之前，由三个检验评估各聚乙二醇化突变hGH的品质。通过在非还原条件(Invitrogen)下用MES SDS电泳缓冲液电泳4-12％丙烯酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶来检查PEG-hGH的纯度。用考马斯蓝对凝胶染色。基于密度测定扫描，PEG-hGH色带的纯度大于95％。利用动力学LAL检验，使用Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA²试剂盒测试各PEG-hGH中内毒素的水平，且这一水平为每剂量小于5EU。用IM-9pSTAT5生物检验(实例2中提及)评估PEG-hGH的生物活性，且EC₅₀值小于35nM。

实例26

本实例描述用于评估包含非天然氨基酸的hGH多肽的纯化和均质性的方法。

图8是在位置92处包含非天然氨基酸的hGH多肽的SDS-PAGE。凝胶的泳道3、4和5展示在位置92处包含共价连接于5kDa、20kDa或30kDa PEG分子的对乙酰基-苯丙氨酸的hGH。图11中展示其它包含聚乙二醇化的非天然氨基酸的hGH多肽。将5微克各PEG-hGH蛋白质装载于各SDS-PAGE上。图11的图A：泳道1，分子量标记物；泳道2，WHO rhGH参考标准物(2μg)；泳道3和7，30KPEG-F92pAF；泳道4，30KPEG-Y35pAF；泳道5，30KPEG-R134pAF；泳道6，20KPEG-R134pAF；泳道8，WHO rhGH参考标准物(20μg)。图11的图B：泳道9，分子量标记物；泳道10，WHO rhGH参考标准物(2μg)；泳道11，30KPEG-F92pAF；泳道12，30KPEG-K145pAF；泳道13，30KPEG-Y143pAF；泳道14，30KPEG-G131pAF；泳道15，30KPEG-F92pAF/G120R；泳道16，WHO rhGH参考标准物(20μg)。图9展示聚乙二醇化hGH多肽(5kDa、20kDa或30kDa PEG)在IM-9细胞中的生物活性；各方法如实例2中所述来进行。

可通过蛋白水解降解(包括(但不限于)胰蛋白酶裂解)，接着质谱分析来评估hGH-PEG接合物的纯度。Pepinsky B.等人，J，Pharmcol.& Exp.Ther.297(3)：1059-66(2001)。进行胰蛋白酶消化的方法还描述于欧洲药典(European Pharmacopoeia)(2002)第4版，第1938页中。对所述方法进行修改。在50mM TRIS-HCl(pH 7.5)中透析样品过夜。将rhGH多肽与胰蛋白酶(TPCK处理的胰蛋白酶，Worthington)以66∶1的质量比一起在37℃水浴中培育4小时。在冰上培育样品数分钟以终止消化反应，接着在HPLC分析期间维持在4℃下。将消化的样品(约200μg)用0.1％三氟乙酸装载于25×0.46cmVydac C-8柱(珠粒尺寸5μm，孔径尺寸

)上，且在30℃下经70分钟用0到80％乙腈的梯度洗脱，其中流动速率为1ml/min。由214nm下的吸光度监测胰蛋白酶肽的洗脱。

图10的图A描绘hGH的一级结构，其中指出胰蛋白酶裂解位点且用箭头指明非天然氨基酸取代F92pAF(从Becker等人，Biotechnol Appl Biochem.(1988)10(4)：326-337修改的图)。图B展示以下肽的叠加胰蛋白酶图：由包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(30K PEG His₆-F92pAF rhGH，标记为A)、由包含非天然编码氨基酸的hGH多肽产生的肽(His₆-F92pAF rhGH，标记为B)和由野生型hGH产生的肽(WHO rhGH，标记为C)。WHO rhGH与His₆-F92pAF rhGH的胰蛋白酶图的比较揭示仅有两个峰位移，肽峰1和肽峰9，且其余峰为相同的。这些差异是由于在表达的His₆-F92pAF rhGH的N末端添加His₆而引起，导致峰1位移；而峰9的位移是由于残基92处的苯丙氨酸经对乙酰基-苯丙氨酸取代而引起。图C-展示图B的峰9的放大图。His₆-F92pAF与30K PEG His₆-F92pAF rhGH胰蛋白酶图的比较揭示His₆-F92pAF rhGH在聚乙二醇化后峰9消失，从而证实这一修饰对肽9具有特异性。

实例27

本实例描述由两个各包含非天然氨基酸的hGH多肽形成的同型二聚物。

图12比较经His标记的在位置92处包含对乙酰基-苯丙氨酸取代的hGH多肽与这一经修饰多肽经由具有如实例25中关于hGH的聚乙二醇化所述的官能团和反应性的双官能连接子连接的同型二聚物的IM-9检验结果。

实例28

本实例描述充当hGH拮抗剂的hGH多肽的单体和二聚物。

虽然已在位点II中引入G120R取代的hGH突变蛋白能够结合单个hGH受体，但不能使两个受体二聚。所述突变蛋白可能通过占据受体位点但不活化细胞内信号传导路径而充当活体外hGH拮抗剂(Fuh，G.等人，Science 256：1677-1680(1992))。图13的图A展示测量具有G120R取代的hGH对pSTAT5的磷酸化作用的IM-9检验数据。如图13的图B中所示，在同一位置(G120)处合并有非天然氨基酸的hGH多肽产生的分子也充当hGH拮抗剂。构建图13的图B中所示的hGH拮抗剂的二聚物，其中利用具有如实例25中关于hGH的聚乙二醇化所述的官能团和反应性的双功能连接子连接。图14展示这种二聚物在IM-9检验中也缺乏生物活性。

进行其它检验，比较包含G120pAF取代的hGH多肽与经G120pAF修饰的hGH多肽经由PEG连接子连接的二聚物。使诱导STAT5的磷酸化的WHO hGH与剂量-反应范围的单体和经由PEG连接子连接的二聚物竞争。还进行表面受体竞争研究，展示单体和二聚物与GH竞争IM-9和大鼠GHR(L43R)/BAF3细胞上的细胞表面受体结合。二聚物充当比单体有效的拮抗剂。表5展示这些研究的数据。

实例29

本实例详述hGH活性和hGH多肽对hGH受体的亲和性的测量。

大鼠GH受体的克隆和纯化 将大鼠GH受体(GHR ECD，氨基酸S29-T238)的细胞外域与C末端6His标签同框克隆于pET20b载体(Novagen)中的Nde I与Hind III位点之间。引入L43突变成R的突变以进一步接近人类GH受体结合位点(Souza等人，Proc Natl Acad Sci USA.(1995)92(4)：959-63)。通过在30℃下用0.4mM IPTG诱导4-5小时，在BL21(DE3)大肠杆菌细胞(Novagen)中产生重组蛋白质。溶解细胞后，通过将小球再悬浮于含30mL 50mM Tris(pH 7.6)、100mM NaCl、1mM EDTA、1％TritonX-100的杜恩斯液(dounce)中洗涤四次，且用无Triton X-100的相同缓冲液洗涤两次。此时，包涵体由超过95％GHR ECD组成且将其溶解于0.1M Tris(pH 11.5)、2M脲中。借助于使包涵体溶液的等分试样穿过经50mM Tris(pH 7.8)、1M L-精氨酸、3.7mM胱胺、6.5mM半胱胺平衡的S100(Sigma)凝胶过滤柱实现再折叠。合并含可溶性蛋白质的洗脱部分，且针对50mM Tris(pH 7.6)、200mM NaCl、10％甘油透析。根据制造商的说明书，短暂离心样品以去除任何沉淀且与Talon树脂(Clontech)的等分试样一起培育。用20体积补充有5mM咪唑的透析缓冲液洗涤树脂后，用含120mM咪唑的透析缓冲液洗脱蛋白质。最后，针对50mM Tris(pH 7.6)、30mM NaCl、1mM EDTA、10％甘油透析样品过夜，短暂离心以去除任何沉淀，调节到20％甘油最终浓度，等分试样并储存在-80℃下。使用消光系数计算值ε＝65,700M^-1·cm^-1，由OD(280)量度蛋白质浓度。

GH与GHR的结合的Biocore^TM分析

使用制造商推荐的标准胺偶合程序，将约600-800RU可溶性GHR ECD固定于Biacore^TM CMS芯片上。即使大部分受体因这种技术而失活，但在实验中发现，这一程度的固定足以产生约100-150RU的最大特异性GH结合反应，而结合动力学无显著变化。例如，参看Cunningham等人，J Mol Biol.(1993)234(3)：554-63，和Wells JA.Proc Natl Acad Sci USA(1996)93(1)：1-6)。

将含各种浓度的野生型或突变GH(0.1-300nM)的HBS-EP缓冲液(Biacore^TM，Pharmacia)以40μl/min的流动速率喷射于GHR表面上并持续4-5分钟，且喷射后监测解离达15分钟。用4.5M MgCl₂的15秒脉冲使表面再生。至少100个再生循环后，仅观察到极小的结合亲和力损失(1-5％)。使用无受体固定的参考细胞减去任何缓冲液体积效应和非特异性结合。

用BiaEvaluation 4.1软件(BIACORE^TM)处理从GH滴定实验获得的动力学结合数据。“二价分析物”缔合模型提供令人满意的拟合(chi²值一般小于3)，与所建议的依次1∶2(GH∶GHR)二聚合一致(Wells JA.Proc Nail Acad Sci USA(1996)93(1)：1-6)。平衡解离常数(Kd)以个别速率常数的比率(k_off/k_on)计算。

表6指出使用固定于CMS芯片上的大鼠GHR ECD(L43R)从Biacore^TM获得的结合参数。

GHR稳定细胞系

惯常，使IL-3依赖性小鼠细胞系BAF3在RPMI 1640、丙酮酸钠、青霉素、链霉素、10％热失活胎牛血清、50μM 2-巯基乙醇和10％WEHI-3细胞系条件培养基(作为IL-3来源)中传代。所有细胞培养物都维持在37℃下5％CO₂的加湿氛围中。

使用BAF3细胞系产生大鼠GHR(L43R)稳定细胞克隆2E2-2B12-F4。简单来说，用15μg含全长大鼠GHR(L43R)cDNA的线性化pcDNA3.1质粒电穿孔1×10⁷个中度汇合的BAF3细胞。回收转染的细胞并持续48小时，之后利用限制稀释在含800μg/mlG418和5nM WHO hGH的培养基中克隆。通过用针对人类GHR(R&D Systems，Minneapolis，MN)的抗体表面染色来鉴别表达GHR的转染子，且在FACS阵列(BDBiosciences，San Diego，CA)上分析。然后，在BrdU增殖检验(如下所述)中就针对WHO hGH的增殖活性筛选表达良好水平GHR的转染子。再在存在1.2mg/ml G418和5nM hGH的情况下进行两轮所要转染子的重复亚克隆，随即产生表面受体表达和增殖能力的概况恒定的稳定转染的大鼠GHR(L43R)细胞克隆。所产生的细胞克隆2E2-2B12-F4惯常维持在加有1.2mg/ml G418但无hGH的BAF3培养基中。

通过BrdU标记所测得的增殖

将表达血清饥饿大鼠GHR(L43R)的BAF3细胞系2E2-2B12-F4以5×10⁴个细胞/孔的密度涂于96孔板中。用12点剂量范围的hGH蛋白质活化细胞且同时用50μM BrdU(Sigma，St.Louis，MO)作标记。培养48小时后，在室温下用100μl BD cytofix/cytoperm溶液(BD Biosciences)固定/透化细胞30分钟。为暴露BrdU抗原决定基，在37℃下每孔用30μg DNase(Sigma)处理固定/透化的细胞达1小时。用APC接合的抗BrdU抗体(BD Biosciences)进行免疫荧光染色，使得能够在FACS阵列上进行样品分析。

表7展示通过pSTAT5(IM-9)和BrdU增殖检验概述出的PEG hGH突变体的生物活性。WHO hGH表示各检验之间比较的单位。

实例30

本实例描述测量聚乙二醇化hGH的活体外和活体内活性的方法。

细胞结合检验

在0℃下，在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)的未标记GH、hGH或GM-CSF的情况下并且在存在¹²⁵I-GH(约100,000cpm或1ng)的情况下，在PBS/1％BSA(100μl)中一式两份培育细胞(3×10⁶)达90分钟(总体积：120μl)。然后，将细胞再悬浮并层铺于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上，并离心(1000g；1分钟)。通过切去管的末端收集离心块，且离心块和上清液分别在γ计数器(Packard)中计数。

特异性结合(cpm)既定为无竞争者存在下的总结合(一式两份的平均值)减去在100倍过量的未标记GH存在下的结合(非特异性结合)(cpm)。测量所使用的各细胞类型的非特异性结合。每隔数天使用同一种¹²⁵I-GH制剂进行实验，且所述实验应展示内在一致性。¹²⁵I-GH展示与产生GH受体的细胞结合。虽然所述结合以剂量依赖性方式受到未标记天然GH或hGH抑制，但不受GM-CSF或其它阴性对照组抑制。hGH与类似于天然GH的天然¹²⁵I-GH竞争结合的能力表明，受体以同等程度良好地识别这两种形式。

聚乙二醇化hGH的活体内研究

将PEG-hGH、未经修饰的hGH和缓冲溶液投予小鼠或大鼠。结果将显示，本发明的聚乙二醇化hGH与未经修饰的hGH相比具有优良的活性和延长的半衰期，此由体重显著增加来指示。

接合和非接合hGH和其变异体的活体内半衰期的测量

所有动物实验都是在AAALAC鉴定为合格的设施中并且根据圣路易斯大学(St.Louis University)的实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案执行。将大鼠个别地圈养在12小时照明/黑暗循环室内的笼中。动物可随意取用合格的Purina啮齿动物食物5001和水。对于切除垂体的大鼠，饮用水另外含有5％葡萄糖。

药物动力学研究

在进入动物实验之前，由三个检验评估各聚乙二醇化突变hGH的品质。通过在非还原条件(Invitrogen，Carlsbad，CA)下用MES SDS电泳缓冲液电泳4-12％丙烯酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶来检查PEG-hGH的纯度。用考马斯蓝对凝胶染色。基于密度测定扫描，PEG-hGH色带的纯度大于95％。利用动力学LAL检验，使用Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA²试剂盒测试各PEG-hGH中内毒素的水平，且这一水平为每剂量小于5EU。然后，将细胞再悬浮并层铺于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上，并离心(1000g；1分钟)。通过切去管的末端收集离心块，且离心块和上清液分别在γ计数器(Packard)中计数。

特异性结合(cpm)既定为无竞争者存在下的总结合(一式两份的平均值)减去在100倍过量的未标记GH存在下的结合(非特异性结合)(cpm)。测量所使用的各细胞类型的非特异性结合。每隔数天使用同一种¹²⁵I-GH制剂进行实验，且所述实验应展示内在一致性。¹²⁵I-GH展示与产生GH受体的细胞结合。虽然所述结合以剂量依赖性方式受到未标记天然GH或hGH抑制，但不受GM-CSF或其它阴性对照组抑制。hGH与类似于天然GH的天然¹²⁵I-GH竞争结合的能力表明，受体以同等程度良好地识别这两种形式。

聚乙二醇化hGH的活体内研究

将PEG-hGH、未经修饰的hGH和缓冲溶液投予小鼠或大鼠。结果将显示，本发明的聚乙二醇化hGH与未经修饰的hGH相比具有优良的活性和延长的半衰期，此由体重显著增加来指示。

接合和非接合hGH和其变异体的活体内半衰期的测量

所有动物实验都是在AAALAC鉴定为合格的设施中并且根据圣路易斯大学(St.Louis University)的实验动物管理和使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)批准的方案执行。将大鼠个别地圈养在12小时照明/黑暗循环室内的笼中。动物可随意取用合格的Purina啮齿动物食物5001和水。对于切除垂体的大鼠，饮用水另外含有5％葡萄糖。

药物动力学研究

在进入动物实验之前，由三个检验评估各聚乙二醇化突变hGH的品质。通过在非还原条件(Invitrogen，Carlsbad，CA)下用MES SDS电泳缓冲液电泳4-12％丙烯酰胺NuPAGE Bis-Tris凝胶来检查PEG-hGH的纯度。用考马斯蓝对凝胶染色。基于密度测定扫描，PEG-hGH色带的纯度大于95％。利用动力学LAL检验，使用Charles River Laboratories(Wilmington，MA)的KTA²试剂盒测试各PEG-hGH中内毒素的水平，且这一水平为每剂量小于5EU。用IM-9pSTAT5生物检验(实例2中描述)评估PEG-hGH的生物活性，且证实EC₅₀值小于15nM。

在从Charles River Laboratories获得的雄性Sprague-Dawley大鼠(261-425g)中相互比较经PEG修饰的生长激素化合物的药物动力学性质，并且与非聚乙二醇化生长激素进行比较。通过手术在颈动脉中安装导管以用于血液采集。成功安装导管后，在给药前将动物分配给处理组(每组3到6只)。皮下给予动物1mg/kg化合物，剂量体积为0.41-0.55ml/kg。在各时间点经由留置导管采集血液样品并采集到经EDTA涂布的微量离心管中。离心后采集血浆，且在分析之前储存在-80℃下。使用BioSource International (Camarillo，CA)或Diagnostic Systems Laboratories(Webster，TX)的抗体夹心生长激素ELISA试剂盒测量化合物浓度。使用对应于所给予的类似物的标准物计算浓度。使用建模程序WinNonlin(Pharsight，4.1版)估算药物动力学参数。使用利用线性向上/对数向下梯形积分的非隔室分析(Noncompartmental analysis)，一致地给浓度数据加权。

图15展示大鼠在单次皮下给药后的平均(+/-S.D.)血浆浓度。给予大鼠(每组n＝3-4)1mg/kg单次团注剂量的hGH野生型蛋白质(WHO hGH)、经His标记的hGH多肽(his-hGH)或经His标记的在位置92处包含共价连接于30kDa PEG的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽(30KPEG-pAF92(his)hGH)。经指定的时间间隔获取血浆样品并检验所述注射化合物。30KPEG-pAF92(his)hGH与对照hGH相比具有显著延长的循环。

图16展示大鼠在单次皮下给药后的平均(+/-S.D.)血浆浓度。给予大鼠(每组n＝3-6)1mg/kg单次团注剂量的蛋白质。比较在6个不同位置处各包含共价连接于30kDa PEG的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽与WHO hGH和(his)-hGH。经指定的时间间隔获取血浆样品并检验所述注射化合物。表8展示图16中所示的单次剂量hGH多肽投药的药物动力学参数值。通过非隔室分析(Pharsight，4.1版)评估浓度对时间的曲线。所示的值是平均值(+/-标准偏差)。Cmax：最大浓度；末期t_1/2：末期半衰期；AUC_{0 →inf}：外推到无穷大的浓度-时间曲线下面积；MRT：平均滞留时间；Cl/f：表观总血浆清除率；Vz/f：末期阶段内的表观分布体积。

表8：1mg/kg单次剂量皮下团注投药在正常雄性Sprague-Dawley大鼠中的药物动力学参数值

药效学研究

从Charles River Laboratories获得切除垂体的雄性Sprague-Dawley大鼠。垂体是在3-4周龄时通过手术去除。使动物适应三周的时间，在此期间监测体重。包括研究开始前7天时间内体重增加0-8g的动物并随机分配给处理组。皮下投予大鼠团注剂量或每日剂量。在整个研究中，每日依次给大鼠称重、麻醉、放血并给药(适当时)。使用肝素化毛细管从眼窝窦中采集血液并放置于经EDTA涂布的微量离心管中。通过离心分离血浆，且在分析之前储存在-80℃下。

图17展示切除垂体的大鼠在单次皮下给药后的平均(+/-S.D.)血浆浓度。给予大鼠(每组n＝5-7)2.1mg/kg单次团注剂量的蛋白质。展示在2个不同位置(位置35、92)处各包含共价连接于30kDa PEG的非天然氨基酸对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的结果。经指定的时间间隔获取血浆样品并检验所述注射化合物。

肽IGF-1是生长调节素或胰岛素样生长因子家族的成员。IGF-1介导生长激素的许多生长促进作用。使用针对所提供的大鼠/小鼠IGF-1标准物的竞争性结合酶免疫检验试剂盒(Diagnosic Systems Laboratories)测量IGF-1浓度。通过t测试使用双尾分布型不成对相等方差确定显著差异。图18的图A展示在切除垂体的大鼠中对化合物的评估。皮下给予大鼠(每组n＝5-7)单次剂量或每日剂量。每日依次给动物称重、麻醉、放血并给药(适当时)。展示安慰剂处理、野生型hGH(hGH)、经His标记的hGH((his)hGH)和在位置35和92处包含共价连接于30kDa PEG的对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的体重结果。图18的图B-展示投予单次剂量的包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸的hGH多肽后对循环血浆IGF-1水平的影响的图。竖线表示标准偏差。在图18的图A中，30KPEG-pAF35(his)hGH  化合物第9天的体重增加在统计学上与30KPEG-pAF92(his)hGH化合物不同(p＜0.0005)，不同之处在于观察到较大的体重增加。

图18的图C展示在切除垂体的大鼠中对化合物的评估。皮下给予大鼠(每组n＝11)单次剂量或每日剂量。每日依次给动物称重、麻醉、放血并给药(适当时)。展示安慰剂处理、野生型hGH(hGH)和在位置92、134、145、131和143处包含共价连接于30kDa PEG的对乙酰基-苯丙氨酸的hGH多肽的体重结果。图18的图D-展示与安慰剂处理和野生型hGH相比，投予单次剂量的包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸(位置92、134、145、131、143)的hGH多肽后对循环血浆IGF-1水平的影响的图。图18的图E展示对应于包含聚乙二醇化的非天然编码氨基酸(位置92、134、145、131、143)的hGH多肽的平均(+/-S.D.)血浆浓度。经指定的时间间隔获取血浆样品并检验所述注射化合物。竖线表示标准偏差。

实例31

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的安全性和/或功效的人类临床试验。

目的  比较皮下投予的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hGH与一种或一种以上市售hGH产品(包括(但不限于)Humatrope^TM(Eli Lilly & Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)和Saizen/Serostim^TM(Serono))的安全性和药物动力学。

患者  在研究中招募18名年龄介于20-40岁之间并且体重介于60-90kg之间的健康志愿者。所述个体应不会具有临床上显著异常的针对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选和B型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液疾病史；严重肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢疾病、神经病史；贫血或癫痫病史；已知对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白具有过敏性；对含咖啡因的饮料的习惯性和重度消费者；在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内曾接触hGH；在进入研究的7天内患病；以及研究前身体检查或在进入研究的14天内临床实验室评估时具有显著异常。可对所有个体评估安全性，并且定时采集所有血液采集物用于药物动力学分析。所有研究都是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。

研究设计  其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机性、两个周期的交叉研究。将18名个体随机分配到两个治疗顺序组中的一组中(每组9名个体)。使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH和所选市售产品，在大腿上部经两个分开的给药期以皮下团注形式投予GH。投予市售产品的剂量和频率是按照包装标签中所指示来进行。可通过包括其它个体组而在研究中加入使用市售产品的其它剂量、给药频率或所需的其它参数。各给药期由14天的清除期分隔开。对于两个给药期的每一时期来说，在给药之前至少12小时以及给药后72小时将个体限制在研究中心，但在给药期之间不必如此。如果也存在其它剂量、频率或其它参数，那么也可加入其它个体组来测试聚乙二醇化hGH。这一研究中可使用多种获准供人类使用的GH调配物。Humatrope^TM(Eli Lilly & Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)和Saizen/Serostim^TMSerono)是获准供人类使用的市售GH产品。hGH的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH。

血液取样在投予hGH之前和之后，通过直接静脉穿刺连续取血。在给药之前约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样品)以及在给药后大致以下时间：30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时，获得静脉血样(5mL)用于测定血清GH浓度。将各血清样品分为两个等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。以干冰运输血清样品。在第1天初始给药前即刻、第4天早晨、第16天给药前即刻以及第19天早晨进行空腹临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。

生物分析方法  使用 ELISA试剂盒程序(Diagnostic Systems Laboratory[DSL]，Webster TX)来测定血清GH浓度。

安全性测定  在每次给药(第1天和第16天)之前以及在每次给药后6小时、24小时、48小时和72小时即刻记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试与基线相比的变化。另外，评估生命体征测量结果(包括血压)和身体检查结果与研究前相比的变化。

数据分析  通过从给药后的每一个值减去通过对给药前30分钟、20分钟和10分钟时采集的三个样品的GH水平取平均值而测定出的平均基线GH浓度而关于给药前基线GH浓度来修正给药后血清浓度值。如果给药前血清GH浓度低于检验的定量水平，那么其不包括在平均值的计算中。由关于基线GH浓度所修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用BIOAVL软件的最新版本，通过利用Digital Equipment Corporation VAX8600计算机系统的不依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；到达峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形规则计算的从时间零时到最后血液取样时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及根据消除速率常数计算的末期消除半衰期(t_1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区域中，通过连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。对于每一次治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存调配物/未经保存调配物)。

安全性结果  在各处理组中，不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测试或血压相比无临床显著变化，并且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比也无显著变化。两个处理组的安全性概况看来应类似。

药物动力学结果  比较各时间点所测量的所有18名个体在接受单次剂量的一种或一种以上市售hGH产品(包括(但不限于)Humatrope^TM(Eli Lilly & Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM(Novo-Nordisk)、Genotropin^TM(Pfizer)和Saizen/Serostim^TM(Serono))与接受包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH后的平均血清GH浓度-时间概况(未关于基线GH水平进行修正)。所有个体都应具有在正常生理学范围内的给药前基线GH浓度。根据关于给药前平均基线GH浓度所修正的血清数据来测定药物动力学参数，并且测定C_max和t_max。所选的临床比较物(Humatrope^TM(Eli Lilly & Co.)、Nutropin^TM(Genentech)、Norditropin^TM  (Novo-Nordisk)、Genotropin^TM  (Pfizer)、Saizen/Serostim^TM(Serono))的平均t_max都比包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的t_max显著更短。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的末期半衰期相比，所测试的市售hGH产品的末期半衰期的值显著更短。

尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行，但预期将在其它患者群体中出现类似的吸收特征和安全性概况；所述群体例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、预存自体程序中的患者或计划择期手术的患者。

总之，皮下投予的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH应为安全的，并且被健康男性个体良好耐受。根据不利事件的相对发生率、临床实验值、生命体征和身体检查结果，市售形式的hGH与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH的安全性概况应相当。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hGH潜在地向患者和保健提供者(health care provider)提供巨大临床效用。

实例32

本实例描述用于选择在hIFN中并入非天然编码氨基酸的优选位点的许多组可能的标准中的一组。

本实例说明如何选择hIFN多肽内的优选位点供引入非天然编码氨基酸。使用晶体结构PDB ID 1RH2和NMR结构1ITF(24种不同的NMR结构)来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。这些结构的坐标可获自蛋白质数据库(PDB)或经由可在万维网上以rcsb.org获得的结构生物信息学研究联合实验室PDB获得。

本实例中所使用的序列编号是根据SEQ ID NO：24中所示的成熟hIFN的氨基酸序列。

使用以下标准来评估用于引入非天然编码氨基酸的各hIFN位置：(a)根据与hIFNbp接合的hIFN的晶体学结构的结构分析，残基不应干扰与任一hIFNbp的结合；(b)残基不应受丙氨酸扫描诱变影响；(c)残基应为表面暴露的并且展现与周围残基的最小范德华力或氢键合相互作用；(d)残基应在hIFN变异体中缺失或可变；(e)残基在经非天然编码氨基酸取代后会产生保守性变化；并且(f)残基可存在于高度可挠区(包括(但不限于)CD环)或结构刚性区(包括(但不限于)螺旋B)中。位点评估中所使用的公开案包括：Bioconj.Chemistry 2001(12)195-202；Current Pharmaceutical Design 2002(8)2139-2157；Neuroimmunology 2001(12)，857-859；BBRC 1994(202)1445-1451；Cancer Biotherapy+Radiopharmaceuticals 1998(第13卷)143-153；Structure 1996(14)1453-1463；JMB 1997(274)661-675。另外，可利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)对hIFN分子进行进一步计算以评估各蛋白质原子突出的程度。因此，在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在(不限于)hIFN的一个或一个以上以下位置处进行取代(如SEQ ID NO：24中，或其它IFN中的相应氨基酸)：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165或166(即，在羧基末端)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：100、106、107、108、111、113、114。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：41、45、46、48、49。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：61、64、65、101、103、110、117、120、121、149。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：6、9、12、13、16、96、156、159、160、161、162。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165。在一些实施例中，如下或其它位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、12、13、16、19、20、22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、40、41、42、45、46、48、49、50、51、58、61、64、65、68、69、70、71、73、74、77、78、79、80、81、82、83、85、86、89、90、93、94、96、97、100、101、103、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、117、118、120、121、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137、148、149、152、153、156、158、159、160、161、162、163、164、165、166(即，在羧基末端)。在一些实施例中，水溶性聚合物在一个或一个以上如下氨基酸位置处偶合于IFN多肽：6、9、12、13、16、41、45、46、48、49、61、64、65、96、100、101、103、106、107、108、110、111、113、114、117、120、121、149、156、159、160、161和162(SEQ ID NO：24或在SEQ ID NO：23、25或任何其它IFN多肽中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的IFN多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸以提供拮抗剂：2、3、4、5、7、8、16、19、20、40、42、50、51、58、68、69、70、71、73、97、105、109、112、118、148、149、152、153、158、163、164、165；包含这些取代之一的hIFN多肽可潜在地充当弱拮抗剂或弱激动剂，这取决于预定的选择位点和所需活性。人类IFN拮抗剂包括(但不限于)在以下位置具有取代的拮抗剂：22、23、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、35、74、77、78、79、80、82、83、85、86、89、90、93、94、124、125、127、128、129、131、132、133、134、135、136、137或其任何组合(hIFN；SEQ ID NO：24或在SEQ ID NO：23或25中的相应氨基酸)。

实例33

本实例详述经修饰hIFN多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。

本实例说明包括非天然编码氨基酸的hIFN多肽可如何在大肠杆菌中表达。参看Nagata等人，Nature，第284卷，316-320(1980)，和美国专利第4,364,863号。编码全长hIFN或缺乏N末端信号序列的hIFN的成熟形式的cDNA分别以SEQ ID NO：26和SEQID NO：27展示。在优化序列以在不改变氨基酸序列的情况下克隆和表达之后，将编码全长和成熟hIFN的cDNA插入pBAD HISc、pET20b和pET19b表达载体中。

如实例2中关于hGH表达所述，使用所引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的hIFN。

实例34

本实例描述测量聚乙二醇化IFN的活体外和活体内活性的方法。

细胞结合检验

在0℃下，在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)的未标记IFN、hIFN或GM-CSF的情况下并且在存在¹²⁵I-IFN(约100,000cpm或1ng)的情况下，在PBS/1％BSA(100μl)中一式两份培育细胞(3×10⁶)达90分钟(总体积：120μl)。然后，将细胞再悬浮并层铺于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上，并离心(1000g；1分钟)。通过切去管的末端收集离心块，且离心块和上清液分别在γ计数器(Packard)中计数。

特异性结合(cpm)既定为无竞争者存在下的总结合(一式两份的平均值)减去在100倍过量的未标记IFN存在下的结合(非特异性结合)(cpm)。测量所使用的各细胞类型的非特异性结合。每隔数天使用同一种¹²⁵I-IFN制剂进行实验，且所述实验应展示内在一致性。¹²⁵I-IFN展示与Daudi细胞结合。虽然所述结合以剂量依赖性方式受到未标记天然IFN或hlFN抑制，但不受GM-CSF或其它阴性对照组抑制。hIFN与类似于天然IFN的天然¹²⁵I-IFN竞争结合的能力表明，受体以同等程度良好地识别这两种形式。

聚乙二醇化IFN的活体内研究

将PEG-hIFN、未经修饰的hIFN和缓冲溶液投予小鼠或大鼠。结果将显示，本发明的聚乙二醇化hIFN与未经修饰的hIFN相比具有优良的活性和延长的半衰期，此由每只小鼠使用相同剂量而对病毒复制的抑制作用显著增加来指示。

接合和非接合hIFN和其变异体的活体内半衰期的测量

使用雄性Sprague Dawley大鼠(约7周龄)。投药当天，测量各动物的体重。三只大鼠的尾静脉中各静脉内注射每千克体重100μg非接合和接合hIFN样品。注射后1分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时，在CO₂麻醉下从各大鼠抽取500μl血液。血液样品储存在室温下达1.5小时，接着通过离心(4℃，18000×g，5分钟)分离血清。血清样品储存在-80℃下直到分析当天。样品在冰上解冻后，通过IFN活体外活性检验定量血清样品中活性IFN的量。

抗病毒活性

所属领域的技术人员已知许多检验测量细胞对病毒的耐受程度(McNeill TA，JImmunol Methods.(1981)46(2)：121-7)。这些检验一般可分为三种类型：抑制细胞病变效应；形成病毒斑块；和降低病毒产率。病毒细胞病变效应检验测量经IFN预处理且接着感染病毒的细胞培养物中所诱导的保护程度。举例来说，水泡性口炎病毒是一种适用于这类检验的病毒。这一类型的检验宜筛选许多不同的IFN，因为其可在96孔板中进行。斑块减少检验测量经IFN处理的细胞培养物对斑块形成病毒(例如麻疹病毒)的抵抗性。这一检验的一个益处在于其可精确测量50％的斑块形成减少。最后，病毒产率检验测量在例如单个生长周期期间从细胞释放的病毒的量。所述检验适用于测试IFN抵抗不引起细胞病变效应或不在靶细胞培养物中形成斑块的病毒的抗病毒活性。感染复数(moi)是使用斑块减少检验或病毒产率检验时所考虑的一个重要因素。

其它临床上重要的干扰素特征也在实验室环境中容易地检验。一个所述特征是干扰素多肽结合于特异性细胞表面受体的能力。举例来说，一些IFNα-2b与作为临床试验中最广泛使用的IFN的IFNα-2b相比展现不同的细胞表面性质。虽然IFNα-2b是一种有效的抗病毒剂，但其会引起明显的不良副作用。展现与IFNα-2b不同的结合性质的干扰素可能不会产生同样的不良作用。因此，与IFNα-2b弱竞争细胞上的结合位点的干扰素受到临床关注。所属领域中熟知竞争性干扰素结合检验(Hu等人，J Biol Chem.(1993)6月15日；268(17)：12591-5；Di Marco等人，(1994)Biochem.Biophys.Res.Comm.202：1445-1451)。一般来说，所述检验包括培育细胞培养物细胞与经¹²⁵I标记的IFNα-2b与相关未标记干扰素的混合物。然后去除未结合干扰素，且测量结合标记(且延伸到结合的经¹²⁵I标记的IFNα-2b)的量。通过比较在存在或不存在竞争干扰素的情况下结合于细胞的标记的量，可计算相对结合亲和力。

IFNα的另一突出作用是其抑制细胞生长的能力，这在测定抗肿瘤作用中至关重要。生长抑制检验已十分完善，且通常取决于细胞计数、或氚化胸腺嘧啶([³H]胸腺嘧啶)或另一放射性标记的摄取。已证实人类类淋巴母细胞Daudi细胞系对IFNα极其敏感，且所述细胞系已用于测量许多IFNα和衍生的杂合多肽中的抗增殖活性(Meister等人，JGen Virol.(1986)8月；67(Pt 8)：1633-43)。这一细胞系已因其能够在悬浮培养物中生长而更容易使用(Evinger和Pestka，(1981)Methods Enzymol.79：362-368)。IFNα还展现许多免疫调节活性(Zoon等人，(1986)，The Biology of the Interferon System.Cantell和Schellenkens编，Martinus Nyhoff Publishers，Amsterdam)。

虽然IFN最初是由病毒学家发现，但其首次临床使用(1979年)是作为骨髓瘤的治疗剂(Joshua等人，(1997)Blood Rev.11(4)：191-200)。此后，IFNα已显示有效抵抗多种因病毒、恶性肿瘤、血管生成、过敏、发炎和纤维变性引起的疾病(Tilg，(1997)Gastroenterology.112(3)：1037-1021)。还证实其有效治疗转移性肾癌和慢性骨髓白血病(Williams和Linch，(1997)Br.J.Hosp.Med.57(9)：436-439)。Gresser(1997)J.Leukoc.Biol.61(5)：567-574和Pfeffer(1997)Semin.Oncol.24(03期，增刊9)：S9-S63S969中综述IFN的临床使用。

实例35

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的安全性和/或功效的人类临床试验。

目的  比较皮下投予的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hIFN与市售hIFN产品RoferonA

或IntronA

的安全性和药物动力学。

患者  在研究中招募18名年龄介于20-40岁之间并且体重介于60-90kg之间的健康志愿者。所述个体应不会具有临床上显著异常的针对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选和B型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液疾病史；严重肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢疾病、神经病史；贫血或癫痫病史；已知对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白具有过敏性；对含咖啡因的饮料的习惯性和重度消费者；在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内曾接触hIFN；在进入研究的7天内患病；以及研究前身体检查或在进入研究的14天内临床实验室评估时具有显著异常。可对所有个体评估安全性，并且定时采集所有血液采集物用于药物动力学分析。所有研究都是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。

研究设计  其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机性、两个周期的交叉研究。将18名个体随机分配到两个处理顺序组中的一组中(每组9名个体)。使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN和所选市售产品，在大腿上部经两个分开的给药期以皮下团注形式投予IFN。投予市售产品的剂量和频率是按照包装标签中所指示来进行。可通过包括其它个体组而在研究中加入使用市售产品的其它剂量、给药频率或所需的其它参数。各给药期由14天的清除期分隔开。对于两个给药期的每一时期来说，在给药之前至少12小时以及给药后72小时将个体限制在研究中心，但在给药期之间不必如此。如果也存在其它剂量、频率或其它参数，那么也可加入其它个体组来测试聚乙二醇化hIFN。这一研究中可使用多种获准供人类使用的IFN调配物。RoferonA

和/或IntronA是获准供人类使用的市售IFN产品。hIFN的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN。

血液取样  在投予hIFN之前和之后，通过直接静脉穿刺连续取血。在给药之前约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样品)以及在给药后大致以下时间：30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时，获得静脉血样(5mL)用于测定血清IFN浓度。将各血清样品分为两个等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。以干冰运输血清样品。在第1天初始给药前即刻、第4天早晨、第16天给药前即刻以及第19天早晨进行空腹临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。

生物分析方法  使用ELISA试剂盒程序(BioSource International(Camarillo，CA))来测定血清IFN浓度。

安全性测定  在每次给药(第1天和第16天)之前以及在每次给药后6小时、24小时、48小时和72小时即刻记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试与基线相比的变化。另外，评估生命体征测量结果(包括血压)和身体检查结果与研究前相比的变化。

数据分析  通过从给药后的每一个值减去通过对给药前30分钟、20分钟和10分钟时采集的三个样品的IFN水平取平均值而测定出的平均基线IFN浓度而关于给药前基线IFN浓度来修正给药后血清浓度值。如果给药前血清IFN浓度低于检验的定量水平，那么其不包括在平均值的计算中。由关于基线IFN浓度所修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用BIOAVL软件的最新版本，通过利用Digital Equipment Corporation VAX8600计算机系统的不依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；到达峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形规则计算的从时间零时到最后血液取样时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及根据消除速率常数计算的末期消除半衰期(t_1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区域中，通过连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。对于每一次治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存调配物/未经保存调配物)。

安全性结果  在各处理组中，不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测试或血压相比无临床显著变化，并且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比也无显著变化。两个处理组的安全性概况看来应类似。

药物动力学结果  比较各时间点所测量的所有18名个体在接受单次剂量的市售hIFN(例如Roferon A

或Intron A

)与接受包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN后的平均血清IFN浓度-时间概况(未关于基线IFN水平进行修正)。所有个体都应具有在正常生理学范围内的给药前基线IFN浓度。根据关于给药前平均基线IFN浓度所修正的血清数据来测定药物动力学参数，并且测定C_max和t_max。hIFN(例如Roferon

)的平均t_max比包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的t_max显著更短。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的末期半衰期相比，hIFN(例如IntronA

)的末期半衰期的值显著更短。

尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行，但预期将在其它患者群体中出现类似的吸收特征和安全性概况；所述群体例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、预存自体程序中的患者或计划择期手术的患者。

总之，皮下投予的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN应为安全的，并且被健康男性个体良好耐受。根据不利事件的相对发生率、临床实验值、生命体征和身体检查结果，hIFN(例如Roferon A

)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN的安全性概况应相当。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hIFN潜在地向患者和保健提供者提供巨大临床效用。

实例36

本实例描述用于选择在hG-CSF中并入非天然编码氨基酸的优选位点的许多组可能的标准中的一组。

本实例说明如何选择hG-CSF多肽内的优选位点供引入非天然编码氨基酸。使用由两个与受体细胞外域的两个分子(hG-CSFbp)复合的hG-CSF分子构成的晶体结构1CD9来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。使用其它hG-CSF结构(包括(但不限于)1PGR、1RHG和1GNC)来检查晶体结构数据集之间一级、二级或三级结构元件的可能的变化。这些结构的坐标可获自蛋白质数据库(PDB)(Bernstein等人，J.Mol.Biol.1997，112，第535页)或经由可在万维网上以rcsb.org获得的结构生物信息学研究联合实验室PDB获得。结构模型1CD9含有hG-CSF的整个成熟19kDa序列，但无N末端残基1-4和残基129-136。存在两个由C37与C43和C65与C75形成的二硫桥。

本实例中所使用的序列编号是根据SEQ ID NO：29中所示的成熟hG-CSF的氨基酸序列。

使用以下标准来评估用于引入非天然编码氨基酸的各hG-CSF位置：(a)根据1CD9和1RHG的结构分析(与hG-CSFbp接合的hG-CSF的晶体学结构)，残基不应干扰与任一hG-CSFbp的结合；(b)残基不应受丙氨酸扫描诱变影响(Reidhaar-Olson JF等人，Biochemistry(1996)7月16日；35(28)：9034-41；Young DC等人，Protein Sci.(1997)6月；6(6)：1228-36；Layton等人，(1997)JBC 272(47)：29735-29741)；(c)残基应为表面暴露的并且展现与周围残基的最小范德华力或氢键合相互作用；(d)残基应在hG-CSF变异体中缺失或可变；(e)残基在经非天然编码氨基酸取代后会产生保守性变化；并且(f)残基可存在于高度可挠区(包括(但不限于)CD环)或结构刚性区(包括(但不限于)螺旋B)中。另外，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)对hG-CSF分子进行进一步计算以评估各蛋白质原子突出的程度。因此，在一些实施例中，一个或一个以上非天然编码氨基酸在(不限于)hG-CSF的一个或一个以上以下位置处进行取代(如SEQ ID NO：29中，或在SEQ ID NO：28、30、35或36中的相应氨基酸)：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、127、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即，在羧基末端)。

在一些实施例中，本发明的G-CSF多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：30、31、33、58、59、61、63、64、66、67、68、77、78、81、87、88、91、95、101、102、103、130、131、132、134、135、136、137、156、157、159、160、163、164、167、170、171(SEQ ID NO：29或在SEQ ID NO：28、30、35或36中的相应氨基酸)。在一些实施例中，本发明的G-CSF多肽在一个或一个以上以下位置处包含一个或一个以上非天然存在氨基酸：59、63、67、130、131、132、134、137、160、163、167和171(如SEQ ID NO：29中，或在SEQ ID NO：28、30、35或36中的相应氨基酸)。在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、31、33、34、35、38、39、40、41、44、45、46、47、48、49、50、51、53、54、55、56、58、59、61、63、64、66、67、68、69、70、71、72、73、77、78、81、84、87、88、91、92、94、95、97、98、99、101、102、103、105、106、108、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、126、1.27、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、142、143、144、145、146、147、148、156、157、159、160、163、164、166、167、170、171、173、174、175、176(即，在羧基末端)(SEQ ID NO：29或在SEQ ID NO：28、30、35或36中的相应氨基酸)。

一些用于产生hG-CSF拮抗剂的位点包括：6、7、8、9、10、11、12、13、16、17、19、20、21、23、24、28、30、41、47、49、50、70、71、105、106、109、110、112、113、116、117、120、121、123、124、125、127、145或其任何组合(如SEQ ID NO：29中，或在SEQ ID NO：28、30、35或36中的相应氨基酸)。利用激动剂设计的标准(c)-(e)选择这些位点。拮抗剂设计还可包括受体结合区的定点修饰以增加与hG-CSFbp的结合亲和力。

实例37

本实例详述经修饰hG-CSF多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。

本实例说明包括非天然编码氨基酸的hG-CSF多肽可如何在大肠杆菌中表达。hG-CSF的分离和G-CSF在例如大肠杆菌等宿主细胞中的产生描述于例如美国专利第4,810,643号、第4,999,291号、第5,580,755号和第6,716,606号中，所述专利是以引用的方式并入本文中。编码全长hG-CSF、hG-CSF的成熟形式(蛋氨酰基hG-CSF)、和hG-CSF的成熟形式的变异体的cDNA分别以SEQ ID NO：31、32和33展示。在优化序列以在不改变氨基酸序列(SEQ ID NO：34)的情况下克隆和表达之后，将编码全长和成熟hG-CSF的cDNA插入pBAD HISc、pET20b和pET19b表达载体中。

如实例2中关于hGH表达所述，使用所引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的hG-CSF。

实例38

聚乙二醇化hG-CSF的活体外和活体内活性

将PEG-hG-CSF、未经修饰的hG-CSF和缓冲溶液投予小鼠或大鼠。结果将显示，本发明的聚乙二醇化hG-CSF与未经修饰的hG-CSF相比具有优良的活性和延长的半衰期，此由每只小鼠使用相同剂量而中性粒细胞的量显著增加且白细胞计数最大值发生偏移来指示。

³ H-胸腺嘧啶检验。使用标准方法进行³H-胸腺嘧啶检验。从处死的雌性Balb C小鼠中获得骨髓。短暂悬浮骨髓细胞，离心并再悬浮于生长培养基中。在96孔微量滴定板的各孔中放入含约10,000个细胞的160μl等分试样。向各孔中加入经纯化的G-CSF类似物(如上所制备)样品并培育68小时。向各孔中加入氚化胸腺嘧啶，使之再培育5小时。5小时的培育时间后，采集细胞，过滤并彻底清洗。将过滤物加入含闪烁流体的小瓶中。计数β发射(LKB Betaplate闪烁计数器)。一式三份分析标准物和类似物，用适当的稀释液再检验实质上高于或低于标准曲线的样品。结果以一式三份类似物数据的平均值相对于未改变的重组人类G-CSF标准物结果来报导。

基于³H-胸腺嘧啶并入的增加检验人类骨髓细胞的增殖诱导。用Ficoll-Hypaque(1.077g/ml，Pharmacia)对健康供体的人类骨髓进行密度分割，且将低密度细胞悬浮于含10％胎牛血清和谷氨酰胺青霉素-链霉素的伊思考夫培养基(Iscove′s medium)(GIBCO)中。接着，将2×10⁴个人类骨髓细胞与对照培养基或实例37的重组大肠杆菌衍生的hG-CSF物质一起在37℃下在含5％CO₂的空气中在96孔平底板中培育2天。一式两份检验样品且浓度在10,000倍范围内变化。然后，每孔对培养物脉冲输送0.5μCi³H-胸腺嘧啶(New England Nuclear，Boston，Mass.)并持续4小时。如Venuta等人，Blood，61，781(1983)中所述，测量³H-胸腺嘧啶摄取。在这一检验中，人类G-CSF分离株可诱导以对照上清液约4-10倍的水平将³H-胸腺嘧啶并入人类骨髓细胞中。本发明的大肠杆菌衍生的hG-CSF物质具有类似的性质。

WEHI-3B D ⁺ 分化诱导。如Metcalf，Int.J.Cancer，25，225(1980)中所述，在半固体琼脂培养基中检验本发明的hG-CSF多肽诱导鼠类髓单核细胞白血病细胞系WEHI-3B D⁺分化的能力。将重组hG-CSF产物和培养基对照组与每孔约60个WEHI-3B D⁺细胞一起在37℃下在含5％ CO₂的空气中培育7天。在24孔平底板中培育样品，且浓度在2000倍范围内变化。将集落分为未分化、部分分化或完全分化的，且用显微镜计数集落细胞计数。发现大肠杆菌衍生的hG-CSF物质诱导分化。

CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM检验。发现人类G-CSF和hG-CSF的天然分离株引起人类骨髓细胞增殖和分化。在CFU-GM[Broxmeyer，等人，Exp.Hematol.，5，87，(1971)]、BFU-E和CFU-GEMM检验[Lu等人，Blood，61，250(1983)]中，使用健康人类志愿者的低密度的非粘附骨髓细胞测量这些活性。使用500单位的G-CSF或hG-CSF比较CFU-GM、BFU-E和CFU-GEMM的生物活性。

用低密度非粘附骨髓细胞进行集落检验。用Ficoll-Hypaque(密度为1.077g/cm³；Pharmacia)对人类骨髓细胞进行密度分割。然后，将低密度细胞再悬浮于含胎牛血清的伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove′s modified Dulbecco′s medium)中，且在37℃下放置在法肯组织培养皿(Falcon tissue culture dish)(第3003号，Becton Dickinson，Cockeysville，Md.)中1.5小时以研究粘附性。

培养基对照组是由伊思考夫改良杜尔贝可培养基加上10％FCS、0.2mM氯化血红素和1单位重组促红细胞生成素组成。对于CFU-GM检验，将1×10⁵个靶细胞涂于1ml包括补充的麦考氏5A培养基(McCoy′s 5A medium)和10％热失活胎牛血清的0.3％琼脂培养基中。给培养物的集落(每个聚集体超过40个细胞)评分，且在培养第7天评估形态。集落数以由一式四份的板测定的平均值±SEM表示。

对于BFU-E和CFU-GEMM检验，将细胞(1×10⁵)加入伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Gibco)、0.8％甲基纤维素、30％胎牛血清、0.05nM 2-巯基乙醇、0.2mM氯化血红素和3单位重组促红细胞生成素的1ml混合物中。在5％CO₂和5％O₂的加湿氛围中培育培养皿。使用Reming Bioinstruments(Syracuse，N.Y.)的氧减压器获得低氧张力。培育14天后，给集落评分。集落数既定为由一式两份的板测定的平均值±SEM。

预期CFU-GM检验中所形成的集落全部是氯乙酸酯酯酶阳性和非特异性酯酶(α-乙酸萘酯酯酶)阴性，类型上与粒细胞集落一致。当在CFU-GM检验中通过连续稀释检验时，预期天然G-CSF与hG-CSF具有每毫克纯蛋白质约1×10⁸U的比活性。重要的是，注意到hG-CSF因在大肠杆菌中产生而极纯且不含其它可能的哺乳动物生长因子。因此，当在存在重组促红细胞生成素的情况下加入hG-CSF时，其能够支持混合型集落形成(CFU-GEMM)和BFU-E。

细胞结合检验。测试鼠类WEHI-3BD⁺和人类周边血液骨髓白血病细胞制剂(ANLL)结合¹²⁵I-G-CSF的能力。用PBS/1％ BSA将鼠类和新鲜获得的人类周边血液骨髓白血病细胞洗涤三次。在0℃下，在不存在或存在各种浓度(体积：10μl)的未标记G-CSF、hG-CSF或GM-CSF的情况下并且在存在¹²⁵I-G-CSF(约100,000cpm或1ng)的情况下，在PBS/1％BSA(100μl)中一式两份培育WEHI-3BD⁺细胞(5×10⁶)或新鲜白血病细胞(3×10⁶)达90分钟(总体积：120μl)。然后，将细胞再悬浮并层铺于350μl塑料离心管中的200μl冰冷FCS上，并离心(1000g；1分钟)。通过切去管的末端收集离心块，且离心块和上清液分别在γ计数器(Packard)中计数。

特异性结合(cpm)既定为无竞争者存在下的总结合(一式两份的平均值)减去在100倍过量的未标记G-CSF存在下的结合(非特异性结合)(cpm)。测量所使用的各细胞类型的非特异性结合。每隔数天使用同一种¹²⁵I-G-CSF制剂进行实验，且所述实验应展示内在一致性。¹²⁵I-G-CSF展示与WEHI-3B D⁺白血病细胞结合。虽然所述结合以剂量依赖性方式受到未标记天然G-CSF或hG-CSF抑制，但不受GM-CSF抑制。hG-CSF与类似于天然G-CSF的天然¹²⁵I-G-CSF竞争结合的能力表明，受体以同等程度良好地识别这两种形式。

G-CSF诱导从白血病患者获得的低密度骨髓细胞的粒细胞和单核细胞的分化。在单独培养基中或在存在1×10⁵单位的hG-CSF的培养基中培养患者的细胞达4天。在单独培养基中培育的对照培养物的细胞的类型是前髓细胞，而在hG-CSF存在下培养的细胞将展示骨髓类型的成熟细胞，包括后髓细胞、巨大杆状和节状中性粒细胞和单核细胞。从形态上评估至少100个细胞的实际分化。经hG-CSF处理的细胞由胚细胞、髓细胞、后髓细胞、杆状加节状中性粒细胞、前单核白细胞和单核细胞组成。预期对照细胞是胚细胞。

接合和非接合hG-CSF和其变异体的活体内半衰期的测量。使用雄性Sprague Dawley大鼠(约7周龄)。投药当天，测量各动物的体重。三只大鼠的尾静脉中各静脉内注射每千克体重100μg非接合和接合hG-CSF样品。注射后1分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时，在CO₂麻醉下从各大鼠抽取500μl血液。血液样品储存在室温下达1.5小时，接着通过离心(4℃，18000×g，5分钟)分离血清。血清样品储存在-80℃下直到分析当天。样品在冰上解冻后，通过G-CSF活体外活性检验定量血清样品中活性G-CSF的量。

接合和非接合hG-CSF和其变异体在健康大鼠中的活体内生物活性的测量。使用hG-CSF在SPF Sprague Dawley大鼠中的活体内生物作用的测量来评估接合和非接合G-CSF和其变异体的生物功效。大鼠到达当天，将大鼠随机分派成6组。使动物休息7天的时间，在此期间排除状况不佳或极端体重的个体。休息时期开始时大鼠的体重范围为250-270g。

投药当天，使大鼠禁食16小时，接着皮下注射每千克体重100μg hG-CSF或其变异体。各hG-CSF样品注射到6只随机分配的大鼠的组中。在给药之前和在给药后6、12、24、36、48、72、96、120和144小时，从大鼠尾静脉中抽取300μg经EDTA稳定的血液的血液样品。分析血液样品的以下血液学参数：血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积、平均细胞容积、平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞血红蛋白、白细胞计数、白细胞分类计数(中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞)。基于这些测量，评估接合和非接合hG-CSF和其变异体的生物功效。

接合和非接合hG-CSF和其变异体在患化学疗法诱发型中性粒细胞减少症的大鼠中 的活体内生物活性的测量。本分析使用SPF Sprague Dawley大鼠。大鼠到达当天，将大鼠随机分派成6组。使动物休息7天的时间，在此期间排除状况不佳或极端体重的个体。休息时期开始时大鼠的体重范围为250-270g。

投予hG-CSF样品之前24小时，腹膜内给大鼠注射每千克体重50mg环磷酰胺(CPA)以诱发模拟由抗癌化学疗法产生的中性粒细胞减少症的中性粒细胞减少症。在第0天，皮下注射每千克体重100μg hG-CSF或其变异体。各hG-CSF样品注射到6只随机分配的大鼠的组中。在给药之前和在给药后6、12、24、36、48、72、96、120、144和168小时，从大鼠尾静脉中抽取300μl经EDTA稳定的血液的血液样品。分析血液样品的以下血液学参数：血红蛋白、红细胞计数、红细胞压积、平均细胞容积、平均细胞血红蛋白浓度、平均细胞血红蛋白、白细胞计数、白细胞分类计数(中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、单核细胞)。基于这些测量，评估接合和非接合hG-CSF和其变异体的生物功效。

实例39

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的安全性和/或功效的人类临床试验。

目的  比较皮下投予的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hG-CSF与市售hG-CSF产品NEULASTA

或NEUPOGEN

的安全性和药物动力学。

患者  在研究中招募18名年龄介于20-40岁之间并且体重介于60-90kg之间的健康志愿者。所述个体应不会具有临床上显著异常的针对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选和B型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液疾病史；严重肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢疾病、神经病史；贫血或癫痫病史；已知对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白具有过敏性；对含咖啡因的饮料的习惯性和重度消费者；在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内曾接触hG-CSF；在进入研究的7天内患病；以及研究前身体检查或在进入研究的14天内临床实验室评估时具有显著异常。可对所有个体评估安全性，并且定时采集所有血液采集物用于药物动力学分析。所有研究都是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。

研究设计  其应为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机性、两个周期的交叉研究。将18名个体随机分配到两个处理顺序组中的一组中(每组9名个体)。使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF和所选市售产品，在大腿上部经两个分开的给药期以皮下团注形式投予G-CSF。投予市售产品的剂量和频率是按照包装标签中所指示来进行。可通过包括其它个体组而在研究中加入使用市售产品的其它剂量、给药频率或所需的其它参数。各给药期由14天的清除期分隔开。对于两个给药期的每一时期来说，在给药之前至少12小时以及给药后72小时将个体限制在研究中心，但在给药期之间不必如此。如果也存在其它剂量、频率或其它参数，那么也可加入其它个体组来测试聚乙二醇化hG-CSF。这一研究中可使用多种获准供人类使用的G-CSF调配物。以NEUPOGEN

销售的非格司亭和/或以NEULASTA销售的培非格司亭是获准供人类使用的市售G-CSF产品。hG-CSF的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF。

血液取样  在投予hG-CSF之前和之后，通过直接静脉穿刺连续取血。在给药之前约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样品)以及在给药后大致以下时间：30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时，获得静脉血样(5mL)用于测定血清G-CSF浓度。将各血清样品分为两个等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。以干冰运输血清样品。在第1天初始给药前即刻、第4天早晨、第16天给药前即刻以及第19天早晨进行空腹临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。

生物分析方法  使用ELISA试剂盒程序(BioSource International(Camarillo，CA))来测定血清G-CSF浓度。

安全性测定  在每次给药(第1天和第16天)之前以及在每次给药后6小时、24小时、48小时和72小时即刻记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试与基线相比的变化。另外，评估生命体征测量结果(包括血压)和身体检查结果与研究前相比的变化。

数据分析  通过从给药后的每一个值减去通过对给药前30分钟、20分钟和10分钟时采集的三个样品的G-CSF水平取平均值而测定出的平均基线G-CSF浓度而关于给药前基线G-CSF浓度来修正给药后血清浓度值。如果给药前血清G-CSF浓度低于检验的定量水平，那么其不包括在平均值的计算中。由关于基线G-CSF浓度所修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用BIOAVL软件的最新版本，通过利用Digital Equipment Corporation VAX 8600计算机系统的不依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；到达峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形规则计算的从时间零时到最后血液取样时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及根据消除速率常数计算的末期消除半衰期(t_1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区域中，通过连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。对于每一次治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存调配物/未经保存调配物)。

安全性结果  在各处理组中，不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测试或血压相比无临床显著变化，并且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比也无显著变化。两个处理组的安全性概况看来应类似。

药物动力学结果  比较各时间点所测量的所有18名个体在接受单次剂量的市售hG-CSF(NEUPOGEN

或NEULASTA

)与接受包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF后的平均血清G-CSF浓度-时间概况(未关于基线G-CSF水平进行修正)。所有个体都应具有在正常生理学范围内的给药前基线G-CSF浓度。根据关于给药前平均基线G-CSF浓度所修正的血清数据来测定药物动力学参数，并且测定C_max和t_max。hG-CSF(NEUPOGEN)的平均t_max比包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的t_max显著更短。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的末期半衰期相比，hG-CSF(NEUPOGEN)的末期半衰期的值显著更短。

尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行，但预期将在其它患者群体中出现类似的吸收特征和安全性概况；所述群体例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、预存自体程序中的患者或计划择期手术的患者。

总之，皮下投予的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF应为安全的，并且被健康男性个体良好耐受。根据不利事件的相对发生率、临床实验值、生命体征和身体检查结果，hG-CSF(NEUPOGEN

)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF的安全性概况应相当。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hG-CSF潜在地向患者和保健提供者提供巨大临床效用。

实例40

本实例描述用于选择在hEPO中并入非天然编码氨基酸的优选位点的许多组可能的标准中的一组。

本实例说明如何选择hEPO多肽内的优选位点供引入非天然编码氨基酸。使用由与受体细胞外域的两个分子(hEPObp)复合的hEPO(具有包括24、38、83在内的位点突变)构成的晶体结构1CN4来确定可引入一个或一个以上非天然编码氨基酸的优选位置。使用其它hEPO结构(包括(但不限于)1EER(24、28、83、121、122处的突变)和1BUY)来检查晶体结构数据集之间一级、二级或三级结构元件的可能的变化。这些结构的坐标可获自蛋白质数据库(PDB)(Bernstein等人，J.Mol.Biol.1997，112，第535页)或经由可在万维网上以rcsb.org获得的结构生物信息学研究联合实验室PDB获得。结构模型1CN4含有hEPO的整个成熟18kDa序列，但因晶体无序性而缺少残基124-130、N末端A1和C末端T163、G164、D165和R166残基。存在两个由C7与C161和C29与C33形成的二硫桥。

本实例中所使用的序列编号是根据SEQ ID NO：38中所示的成熟hEPO(18kDa变异体)的氨基酸序列。

使用以下标准来评估用于引入非天然编码氨基酸的各hEPO位置：(a)根据1CN4、1EER和1BUY的结构分析(与hEPObp接合的hEPO的晶体学结构)，残基不应干扰与任一hEPObp的结合；(b)残基不应受丙氨酸扫描诱变影响(Bittorf，T.等人，FEBS，336：133-136(1993)；Wen，D.等人，JBC，269：22839-22846(1994)；和Elliott，S.等人，Blood，89：493-502(1997))；(c)残基应为表面暴露的并且展现与周围残基的最小范德华力或氢键合相互作用；(d)残基应在hEPO变异体中缺失或可变(Bittorf，T.等人，FEBS，336：133-136(1993)；Wen，D.等人，JBC，269：22839-22846(1994))；(e)残基在经非天然编码氨基酸取代后会产生保守性变化；并且(f)残基可存在于高度可挠区(包括(但不限于)CD环)或结构刚性区(包括(但不限于)螺旋B)中。另外，利用Cx程序(Pintar等人，Bioinformatics，18，第980页)对hEPO分子进行进一步计算以评估各蛋白质原子突出的程度。因此，在一些实施例中，在(不限于)hEPO的一个或一个以上以下位置处并入一个或一个以上非天然编码氨基酸：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即，在羧基末端)或其组合(SEQID NO：38或在SEQ ID NO：37或39中的相应氨基酸)。

合并一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位点的子集包括(但不限于)：EPO中的1、2、4、9、17、20、21、24、25、27、28、30、31、32、34、36、37、38、40、50、53、55、58、65、68、72、76、79、80、82、83、85、86、87、89、113、115、116、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、134、136、159、162、163、164、165和166(SEQ ID NO：38或在SEQ ID NO：37或39中的相应氨基酸)。合并一个或一个以上非天然编码氨基酸的例示性位置包括：EPO中的21、24、28、30、31、36、37、38、55、72、83、85、86、87、89、113、116、119、120、121、123、124、125、126、127、128、129、130、162、163、164、165和166(SEQ IDNO：38或在SEQ ID NO：37或39中的相应氨基酸)。

在一些实施例中，一个或一个以上如下位置处的非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：位置1(即，在N末端)之前、1、2、3、4、5、6、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、21、23、24、25、26、27、28、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、65、68、72、75、76、77、78、79、80、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、111、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、136、140、143、144、146、147、150、154、155、157、158、159、160、162、163、164、165、166、167(即，在羧基末端)(SEQ ID NO：38或在SEQ ID NO：37或39中的相应氨基酸)。在一些实施例中，如下或其它位置处的一个或一个以上非天然存在氨基酸与水溶性聚合物连接，包括(但不限于)以下位置：21、24、38、83、85、86、89、116、119、121、124、125、126、127和128或其组合(SEQID NO：38或在SEQ ID NO：37或39中的相应氨基酸)。

一些用于产生hEPO拮抗剂的位点包括：2、3、5、8、9、10、11、14、15、16、17、18、20、23、43、44、45、46、47、48、49、50、52、75、78、93、96、97、99、100、103、104、107、108、110、131、132、133、140、143、144、146、147、150、154、155、159或其任何组合(hEPO；SEQ ID NO：38或在SEQ ID NO：37或39中的相应氨基酸)。利用激动剂设计的标准(c)-(e)选择这些位点。拮抗剂设计还可包括位点I残基的定点修饰以增加与hEPObp的结合亲和力。

实例41

本实例详述经修饰hEPO多肽在大肠杆菌中的克隆和表达。

本实例说明包括非天然编码氨基酸的hEPO多肽可如何在大肠杆菌中表达。一般如Matthews等人，(1996)PNAS 93：9471-76中所述来制备编码hEPO的核苷酸序列。使用胎儿肝脏、成体肝脏、胎儿肾脏和成体肾脏cDNA文库作为克隆编码全长和成熟hEPO的cDNA的模板，其中胎儿肝脏得到最佳结果。用于克隆全长和成熟hEPO的引物分别是5′cagttacatatgggagttcacgaatgtcctgcctgg3′SEQ ID NO：44；和5′cagttacatatgctccaccaagattaatctgtg3′SEQ ID NO：45。3′引物序列是5′ctgcaactcgagtcatctgtcccctgtcctgcag3′SEQ ID NO：46。克隆的反应条件是94℃下2分钟，94℃下30秒循环30次，50℃下1分钟，72℃下2分钟和72℃下7分钟，接着是4℃的反应终点。三个分子被鉴别为编码全长hEPO、缺乏N末端信号序列的hEPO的成熟形式、和hEPO的成熟形式的变异体，各自分别以SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：41和SEQID NO：42展示。在优化序列以在不改变氨基酸序列(SEQ ID NO：43)的情况下克隆和表达之后，将编码全长和成熟hEPO的cDNA插入pBAD HISc与pET20b表达载体中。

如实例2中关于hGH表达所述，使用所引入的包含正交tRNA(O-tRNA)和正交氨酰基tRNA合成酶(O-RS)的翻译系统来表达含有非天然编码氨基酸的hG-CSF。

实例42

由正常红细胞小鼠检验测定聚乙二醇化hEPO的活体外和活体内活性

将PEG-hEPO、未经修饰的hEPO和缓冲溶液投予小鼠。结果将显示，本发明的聚乙二醇化hEPO与未经修饰的hEPO相比具有优良的活性和延长的半衰期，此由每只小鼠使用相同剂量而网织红细胞的量显著增加并且网织红细胞计数最大值发生偏移来指示。

所属领域中已知正常红细胞小鼠生物检验(Pharm.Europa Spec.Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2))。用BSA-PBS稀释样品。皮下投予7-15周龄的正常健康小鼠0.2ml本发明的聚乙二醇化hEPO。在从投药后72小时开始的4天时间内，通过对尾静脉穿刺抽取血液并稀释，使得1ml 0.15μmol吖啶橙染色溶液中存在1μl血液。染色时间为3到10分钟。在流式细胞仪中，利用显微荧光测定法，通过分析红色荧光直方图(根据所分析的30,000个血细胞)进行网织红细胞计数。各研究组每天由5只小鼠组成，且小鼠仅放血一次。

生物检验  另外，使用hEPO受体结合检验和根据Ba/F3-huhEPOR细胞增殖测定生物活性的细胞增殖检验来评估本发明的hEPO多肽的活体外生物活性。各检验的方案描述于Wrighton等人，(1997)Nature Biotechnology 15：1261-1265和美国专利第5,773,569号和第5,830,851号中。根据本发明制备的hEPO多肽的EC₅₀值是产生用重组促红细胞生成素获得的最大活性的50％所需的化合物浓度。

实例43

包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的安全性和/或功效的人类临床试验。

目的  比较皮下投予的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化重组人类hEPO与市售hEPO产品PROCRIT

或ARANESP

的安全性和药物动力学。

患者  在研究中招募18名年龄介于20-40岁之间并且体重介于60-90kg之间的健康志愿者。所述个体应不会具有临床上显著异常的针对血液学或血清化学以及阴性尿毒物学筛选、HIV筛选和B型肝炎表面抗原的实验值。其不应具有任何以下迹象：高血压；任何原发性血液疾病史；严重肝病、肾病、心血管疾病、胃肠疾病、泌尿生殖系统疾病、代谢疾病、神经病史；贫血或癫痫病史；已知对细菌或哺乳动物来源的产品、PEG或人类血清白蛋白具有过敏性；对含咖啡因的饮料的习惯性和重度消费者；在进入研究的30天内参与任何其它临床试验或经输血或献血；在进入研究的3个月内曾接触hEPO；在进入研究的7天内患病；以及研究前身体检查或在进入研究的14天内临床实验室评估时具有显著异常。可对所有个体评估安全性，并且定时采集所有血液采集物用于药物动力学分析。所有研究都是在机构伦理委员会批准和患者同意下进行。

研究设计  其为在健康男性志愿者中的第I阶段、单一中心、开放标记、随机性、两个周期的交叉研究。将18名个体随机分配到两个处理顺序组中的一组中(每组9名个体)。使用相等剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO和所选市售产品，在大腿上部经两个分开的给药期以皮下团注形式投予EPO。投予市售产品的剂量和频率是按照包装标签中所指示来进行。可通过包括其它个体组而在研究中加入使用市售产品的其它剂量、给药频率或所需的其它参数。各给药期由14天的清除期分隔开。对于两个给药期的每一时期来说，在给药之前至少12小时以及给药后72小时将个体限制在研究中心，但在给药期之间不必如此。如果也存在其它剂量、频率或其它参数，那么也可加入其它个体组来测试聚乙二醇化hEPO。这一研究中可使用多种获准供人类使用的EPO调配物。以PROCRIT

销售的阿法依伯汀和/或以ARANESP

销售的达依泊汀(darbepoitein)是获准供人类使用的市售EPO产品。hEPO的实验调配物为包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO。

血液取样  在投予EPO之前和之后，通过直接静脉穿刺连续取血。在给药之前约30分钟、20分钟和10分钟(3个基线样品)以及在给药后大致以下时间：30分钟和1小时、2小时、5小时、8小时、12小时、15小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、60小时和72小时，获得静脉血样(5mL)用于测定血清促红细胞生成素浓度。将各血清样品分为两个等分试样。将所有血清样品储存在-20℃下。以干冰运输血清样品。在第1天初始给药前即刻、第4天早晨、第16天给药前即刻以及第19天早晨进行空腹临床实验测试(血液学、血清化学和尿分析)。

生物分析方法  使用放射免疫检验(RIA)试剂盒程序(Diagnostic Systems Laboratory[DSL]，Webster TX)来测定血清促红细胞生成素浓度。市售RIA是双抗体竞争方法，使用人类尿促红细胞生成素的兔多克隆抗血清作为一次抗体和经¹²⁵I标记的人类尿促红细胞生成素作为示踪物。在标准物和品质对照样品中，用阿法依伯汀或达依泊汀代替DSL试剂盒中所提供的尿促红细胞生成素。检验中所使用的标准浓度是7.8、15.6、31.3、50、62.5、100和125mIU/mL。灵敏度是定义为产生容许精度的最低标准浓度的平均本底拟合值，为8.6mIU/mL，且检验范围通过品质对照稀释液扩展到2,000mIU/mL。

安全性测定  在每次给药(第1天和第16天)之前以及在每次给药后6小时、24小时、48小时和72小时即刻记录生命体征。安全性测定是基于不利事件的发生率和类型以及临床实验测试与基线相比的变化。另外，评估生命体征测量结果(包括血压)和身体检查结果与研究前相比的变化。

数据分析  通过从给药后的每一个值减去通过对给药前30分钟、20分钟和10分钟时采集的三个样品的促红细胞生成素水平取平均值而测定出的平均基线促红细胞生成素浓度而关于给药前基线促红细胞生成素浓度来修正给药后血清浓度值。如果给药前血清促红细胞生成素浓度低于检验的定量水平，那么其不包括在平均值的计算中。由关于基线促红细胞生成素浓度所修正的血清浓度数据测定药物动力学参数。使用BIOAVL软件的最新版本，通过利用Digital Equipment Corporation VAX 8600计算机系统的不依赖于模型的方法来计算药物动力学参数。测定以下药物动力学参数：峰值血清浓度(C_max)；到达峰值血清浓度的时间(t_max)；通过使用线性梯形规则计算的从时间零时到最后血液取样时间(AUC_0-72)的浓度-时间曲线下面积(AUC)；以及根据消除速率常数计算的末期消除半衰期(t_1/2)。在对数-线性浓度-时间曲线的末期线性区域中，通过连续数据点的线性回归来估算消除速率常数。对于每一次治疗，计算药物动力学参数的平均标准偏差(SD)和变异系数(CV)。计算参数平均值的比率(经保存调配物/未经保存调配物)。

安全性结果  在各处理组中，不利事件的发生率分布相同。与基线或研究前临床实验测试或血压相比无临床显著变化，并且身体检查结果和生命体征测量结果与研究前相比也无显著变化。两个处理组的安全性概况看来应类似。

药物动力学结果  比较各时间点所测量的所有18名个体在接受单次剂量的市售hEPO(PROCRIT

或ARANESP

)与接受包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO后的平均血清促红细胞生成素浓度-时间概况(未关于基线促红细胞生成素水平进行修正)。所有个体都应具有在正常生理学范围内的给药前基线促红细胞生成素浓度。根据关于给药前平均基线促红细胞生成素浓度所修正的血清数据来测定药物动力学参数，并且测定C_max和t_max。hEPO(PROCRIT

)的平均t_max比包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的t_max显著更短。与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的末期半衰期相比，hEPO(PROCRIT

)的末期半衰期的值显著更短。

尽管本发明的研究是在健康男性个体中进行，但预期将在其它患者群体中出现类似的吸收特征和安全性概况；所述群体例如患有癌症或慢性肾衰竭的男性或女性患者、儿童肾衰竭患者、预存自体程序中的患者或计划择期手术的患者。

总之，皮下投予的单一剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO应为安全的，并且被健康男性个体良好耐受。根据不利事件的相对发生率、临床实验值、生命体征和身体检查结果，hEPO(PROCRIT

)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的安全性概况相当。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO潜在地向患者和保健提供者提供巨大临床效用。

实例44：

瘦素包涵体制剂溶解、再折叠、纯化

包涵体制剂溶解：通过将细胞糊状物混合于4℃包涵体(IB)缓冲液I(50mM TrispH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1％Triton X-100；4℃)中直到最终含固量为10％，使细胞糊状物再悬浮。使再悬浮的物质穿过微流化器总计两次，由此使细胞溶解。离心(10,000g；15min；4℃)并倾析上清液。通过将IB离心块再悬浮于额外体积的IB缓冲液I(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；1％Triton X-100；4℃)中来洗涤IB离心块并使再悬浮的物质穿过微流化器总计两次。离心(10,000g；15min；4℃)并倾析上清液。将IB离心块再悬浮于1体积的缓冲液II(50mM Tris pH 8.0；100mMNaCl；1mM EDTA；4℃)中。离心(10,000g；15min；4℃)并倾析上清液。将IB离心块再悬浮于1/2体积的缓冲液II(50mM Tris pH 8.0；100mM NaCl；1mM EDTA；4℃)中。将IB等分于适当容器中。离心(10,000g；15min；4℃)并倾析上清液。溶解包涵体或储存在-80℃下直到进一步使用。

包涵体溶解：将包涵体溶解于溶解缓冲液(20mM Tris，pH 8.0；8M脲；10mM β-ME)中直到最终浓度在10-15mg/mL之间。在室温下，在恒定混合下培育溶解的IB达1小时。通过离心(12,000g；20min.；4℃)去除不可溶物质。如果蛋白质浓度较高，那么必要时，通过用额外的溶解缓冲液稀释来调节蛋白质浓度。

再折叠：通过用50mM甘氨酸(pH 9.0)、1M脲、0.2mM半胱氨酸、2.0mM胱氨酸稀释到最终蛋白质浓度为1.0mg/mL来进行再折叠。在4℃下再折叠24小时。

纯化：通过0.22μM PES过滤器过滤再折叠反应液。将物质装载到以缓冲液A(20mMTris，pH 8.0)平衡的Q HP柱(GE Healthcare)上。用20CV到100％缓冲液B(20mMTris，pH 8.0；250mM NaCl)的线性梯度洗脱瘦素。汇集单体瘦素。

聚乙二醇化和纯化：取Q HP池并且浓缩到2.0mg/mL。用10％冰乙酸将pH值滴到4.0。加入12∶1摩尔过量的PEG。在28℃下培育72小时。向PEG反应液中加入最终为50mM的Tris碱并用反渗透水(RO water)稀释10倍。确保传导率＜1mS/cm并且pH值介于8.0-9.0之间。将物质装载到以缓冲液A(20mM Tris，pH 8.0)平衡的Q HP柱(GE Healthcare)上。用50CV到100％B(20mM Tris，pH 8.0；250mM NaCl)的线性梯度洗脱PEG-瘦素。汇集PEG-瘦素并且将缓冲液更换为20mM Tris，pH 7.5；100mMNaCl。将PEG物质浓缩到1-2mg/mL并且使用0.22μm PES过滤器进行过滤杀菌。储存在4℃下。

实例45：

研究标题：瘦素化合物在ob/ob B6小鼠中的初步功效

目的：评估天然(WT)人类瘦素化合物和由Ambrx专有技术产生的经PEG修饰的人类瘦素化合物在ob/ob突变小鼠中的功效。将根据测试物对给药后特定时间点所获得的体重(BW)的影响来检验测试物的功效。

测试物：

1.重组人类瘦素(RnD系统)

2.人类PEG-瘦素变异体1

3.人类PEG-瘦素变异体2

4.人类PEG-瘦素变异体3

5.人类PEG-瘦素变异体4

测试物品质/调配物：

20.0mM Tris

100-150mM NaCl

pH-8.0

储备液浓度：

1.瘦素(RnD)：0.5mg/mL的PBS溶液

2.人类PEG-瘦素变异体1：0.11mg/mL

3.人类PEG-瘦素变异体2：TBD

4.人类PEG-瘦素变异体3：TBD

5.人类PEG-瘦素变异体4：TBD

动物：从哈兰实验室(Harlan Labs)接收30只在研究开始时约为8周龄的处于良好状态下的雌性ob/ob突变小鼠，并且在研究开始前使其适应研究场所至少3天。小鼠将在测试物投予当天称重。这些动物将圈养在标准的无病原体条件下，随意取食食物(Purina食物5008)和水。

供应商/动物接收日期

哈兰实验室。08-1-29，接收动物。

动物组：所有化合物都将皮下投予

组1(n＝5)：皮下注射0mg/kg(PBS)

组2(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg瘦素(RnD)

组3(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素变异体1

组4(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素变异体2

组5(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素变异体3

组6(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素变异体4

程序：

将在投予测试物之前对动物称重。调配化合物以便以5×BW(以□L计)投予。将皮下投予测试物至肩胛背区域中。动物将接受单次测试物注射(第1天)。

数据收集/终点：将每日在各天大致相同的时间对动物称重。将记录体重且用于与各个别动物给药前的体重相比较来评估食物摄取。7天结束时，将给动物服用镇静剂以进行终点血液采集。将分析血清的二次终点(例如脂联素水平)。

终止：将对所有动物实施安乐死以采集组织物质。

实例46

将合成瘦素基因克隆(经优化以用于大肠杆菌表达)于pVK6抑制系统中。产生7种琥珀突变体(H46、T66、S67、W100、E105、D108、G111)，且使用公开的SAR信息将这些突变体用于以30K PEG聚乙二醇化。

野生型是经纯化的且所有突变体均将经聚乙二醇化，H46聚乙二醇化(H46pAF)的数据可展示于本申请案随附的靠后的图(图19中的SDS-PAGE以及图20和21中的色谱图)中。

其目前使用的方法是：

纯化包涵体，溶解于8M脲中

在0.3-1mg/ml下，在pH 8下，用氧化还原对再折叠

用Q HP FPLC纯化单体

调节pH值到4以供聚乙二醇化(仍未优化，其中丢失许多物质)

在标准条件(27℃，12倍过量的PEG，48-72小时)下聚乙二醇化

用另一Q HP FLPC纯化聚乙二醇化的蛋白质

总之，皮下投予的单次剂量的包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO是安全的，并且被健康男性个体良好耐受。根据不利事件的相对发生率、临床实验值、生命特征和身体检查结果，hEPO(PROCRIT

)与包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO的安全性概况是相当的。包含非天然编码氨基酸的聚乙二醇化hEPO潜在地向患者和保健提供者提供巨大临床效用。

实例47

本研究是设计用于评估当与天然人类瘦素(图22-24中的rH瘦素)相比时，5种不同的经PEG修饰的人类瘦素化合物(PEG-瘦素H46、PEG-瘦素W100、PEG-瘦素E105、PEG-瘦素D108、PEG-瘦素G111)在ob/ob突变小鼠中的功效。瘦素(一种16kDa蛋白质)是由脂肪组织产生且被认为在体重调控中发挥重要作用。由于瘦素对饱腹感、能量消耗和代谢有影响，因此瘦素是肥胖患者体重减轻和体重管理的可行的治疗选择。已在突变ob/ob小鼠中进行了评估瘦素治疗潜力的最初研究。这些小鼠缺乏功能性瘦素，且因此具有降低的活性、降低的代谢且遗传性肥胖。我们假设，由于PEG-瘦素的PK概况有所改良，投予PEG-瘦素与投予天然人类瘦素的动物相比会引起体重减轻增强和食物消耗减少。雌性ob/ob突变小鼠在研究开始时为约8周龄。在研究开始时，投予小鼠单次皮下剂量的五种不同的PEG-瘦素变异体中的一种、天然人类瘦素或媒剂对照组。处理后7天内，每日记录体重和食物消耗。如所预测，我们观察到，经PEG-瘦素变异体处理的小鼠在7天时间内体重减轻增强且食物消耗减少。处理后7天内，经天然人类瘦素或媒剂对照组处理的小鼠的体重未减轻且食物消耗稍有增强。总之，我们已展示，当与经单次剂量的天然人类瘦素处理的小鼠相比时，在ob/ob小鼠中单次皮下投予PEG-瘦素变异体会引起体重减轻增强和食物消耗减少。这表明，当与市售化合物相比时，Ambrx化合物有治疗性优势。

结果与结论

体重

当与经天然人类瘦素或媒剂对照组处理的小鼠相比时，单次PEG-瘦素变异体处理会在ob/ob小鼠中引起体重减轻增强。

研究第2天到研究第5天与研究第1天的体重变化百分比在所有经PEG-瘦素变异体处理的组与经天然人类瘦素或媒剂对照组处理的组之间明显不同。

研究第2天到研究第5天，经PEG-瘦素变异体处理的小鼠展现体重减轻。截至研究第4天，经PEG-AXL4处理的小鼠的体重减轻超过10％(与研究第1天相比)。

食物消耗

当与经单次天然人类瘦素或媒剂对照组注射处理的小鼠相比时，单次PEG-瘦素变异体处理会在ob/ob小鼠中引起食物消耗减少。

经天然人类瘦素或媒剂对照组处理的小鼠的每日食物消耗为6-9克。研究第2天到研究第4天，经PEG-瘦素变异体处理的小鼠的每日食物消耗为0.4-5克。截至研究第5天，经PEG-瘦素处理的小鼠与经天然人类瘦素或媒剂对照组处理的小鼠具有类似的食物消耗。

当与经媒剂对照组处理的小鼠相比时，经PEG-瘦素变异体处理的小鼠的总食物消耗显著减少。

总之，我们已展示，当与经单次天然人类瘦素注射处理的小鼠相比时，在ob/ob小鼠中单次皮下投予PEG-瘦素变异体会在处理后7天内引起体重减轻明显增强和食物消耗明显减少。这一功效表明，当与市售化合物相比时，Ambrx化合物有治疗性优势。

方法

将雌性ob/ob突变小鼠(8周龄)个别地圈养在标准的无病原体的环境中，使其随意取食食物和水。在研究开始时，投予小鼠单次皮下剂量的五种不同的PEG-瘦素变异体中的一种、聚乙二醇化前的瘦素变异体、天然人类瘦素或媒剂对照组。处理后7天内，每天在大致相同的时间测量体重和食物消耗并作记录。由单因素ANOVA测定各组平均值之间的统计学差异，p＜0.05。

实例48

本研究是设计用于评估7种PEG-瘦素类似物在瘦素反应正常的小鼠中的功效、长效概况和最佳浓度，并且测量体重、食物摄取和血糖的变化。这7种不同的经PEG修饰的人类瘦素化合物包括PEG-瘦素H46、PEG-瘦素W100、PEG-瘦素E105、PEG-瘦素G111、PEG-瘦素D108、PEG-瘦素G112和PEG-瘦素S120。

动物：各处理组中使用8只11周龄的C57BL/6J品系雄性小鼠。给其喂食正常饲料且每笼保持两只小鼠，进行12小时照明/12小时黑暗循环。

动物组：所有化合物都皮下投予

组1(n＝8)：媒剂对照组，皮下注射PBS，每周一次

组2(n＝8)：媒剂对照组2，皮下注射PBS，每日

组3(n＝8)：阳性对照组，每日皮下注射1.0mg/kg瘦素

瘦素(购自实验室资源)

组4(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素H46

组5(n＝8)：皮下注射0.25mg/kg PEG-瘦素H46

组6(n＝8)：皮下注射0.1mg/kg PEG-瘦素H46

组7(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素W100

组8(n＝8)：皮下注射0.25mg/kg PEG-瘦素W100

组9(n＝8)：皮下注射0.1mg/kg PEG-瘦素W100

组10(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素E105

组11(n＝8)：皮下注射0.25mg/kg PEG-瘦素E105

组12(n＝8)：皮下注射0.1mg/kg PEG-瘦素E105

组13(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素G111

组14(n＝8)：皮下注射0.25mg/kg PEG-瘦素G111

组15(n＝8)：皮下注射0.1mg/kg PEG-瘦素G111

组16(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素D108

组17(n＝8)：皮下注射0.25mg/kg PEG-瘦素D108

组18(n＝8)：皮下注射0.1mg/kg PEG-瘦素D108

组19(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素G112

组20(n＝8)：皮下注射0.25mg/kg PEG-瘦素G112

组21(n＝8)：皮下注射0.1mg/kg PEG-瘦素G112

组22(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素S120

组23(n＝8)：皮下注射0.25mg/kg PEG-瘦素S120

组24(n＝8)：皮下注射0.1mg/kg PEG-瘦素S120

程序：

在投予PBS、rh瘦素或本发明的瘦素多肽之前，对动物称重。所有测试物都皮下投予，且接受本发明的PEG-瘦素多肽变异体的动物在第0天经由单次测试物注射接受所述测试物。

数据收集/终点：在处理后第0、1、3、5和7天，对所有动物称重。测量动物的食物摄取(以克计)，且在处理后第0、1、3、5和7天进行这些测量。在处理后第0天和第3天记录所有动物的核心体温(以摄氏度为计量单位)，在处理后第0天和第7天记录所有动物的血糖水平(以mg/dl为计量单位)，且对每只动物进行NMR研究以确定研究期内身体组成、脂肪质量和体脂肪百分比的变化。

图32中展示从这一实验收集的数据的一些图，包括PEG-瘦素H46(0.5mg/kg)和PEG-瘦素G111(0.5mg/kg)的数据、和.5mg/kg处理组的平均(±所示的平均标准误差(SEM))体重，这一体重以相对于起始体重的百分比展示且与阳性和阴性对照组(每日rh瘦素和PBS)相比较。

实例49

本研究是设计用于评估7种不同的经PEG修饰的人类瘦素化合物对预防喂食高脂肪饮食的小鼠(饮食诱导型肥胖症(DIO)小鼠模型)体重增加的影响，所述化合物包括PEG-瘦素H46、PEG-瘦素W100、PEG-瘦素E105、PEG-瘦素G111、PEG-瘦素D108、PEG-瘦素G112和PEG-瘦素S120。

动物：各处理组中使用8只15周龄的C57BL/6J品系雄性小鼠。给其喂食正常饲料直到方案开始，然后在第0天，将其转换为高脂肪饮食。除非另作说明，否则各研究组都是从研究的第0天到第14天喂食高脂肪饮食(一个对照组仍接受常规饲料)。给予经本发明的瘦素多肽处理的动物两次每周一次的0.5mg/kg注射，一次在第0天且一次在第7天。每笼保持两只小鼠，进行12小时照明/12小时黑暗循环。

动物组：所有化合物都皮下投予

组1(n＝8)：媒剂对照组，皮下注射PBS，每周一次

组2(n＝8)：对照组2，皮下注射PBS，每日

组3(n＝8)：阳性对照组，每日皮下注射1.0mg/kg瘦素

瘦素(购自实验室资源)

组4(n＝8)：对照组3，给小鼠喂食正常食物且每周用PBS处理一次。

组5(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素H46

组6(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素W100

组7(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素E105

组8(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素G111

组9(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素D108

组10(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素G112

组11(n＝8)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素S120

数据收集/终点：在处理后第0、3、7、10和14天测量所有动物的体重(以克计)并作记录。测量动物的食物摄取(以克计)，且在处理后第0、3、7、10和14天进行测量并作记录。在处理后第0天和第14天测量所有动物的血糖水平(以mg/dl计)并作记录，且对每只动物进行NMR研究以确定研究期内身体组成、脂肪质量和体脂肪百分比的变化。

图30中展示从这一实验收集的数据的一些图，包括PEG-瘦素H46(0.5mg/kg)和PEG-瘦素G111(0.5mg/kg)的数据、和.5mg/kg处理组的平均(±所示的平均标准误差(SEM))体重，这一体重以相对于起始体重的百分比展示且与阳性和阴性对照组(每日rh瘦素和PBS)相比较。

实例50

本研究是设计用于比较天然瘦素多肽和本发明的经PEG修饰的瘦素多肽在插入导管的大鼠中的药物动力学性质。利用对给药后特定时间点所获得的血清样品中的人类瘦素具有特异性的ELISA检验测试物的药物动力学。

本实验中所使用的本发明多肽是PEG30K-H46瘦素、PEG30K-W100瘦素、PEG30K-D108瘦素和PEG30K-G111瘦素。各具有如下储备液浓度和必要稀释液制剂：

瘦素变异体	储备液浓度	稀释液	总体积
				PEG30K-H46瘦素	0.11mg/mL	1360μL+136μLPBS	1.5mL
PEG30K-W100瘦素	0.19mg/mL	790μL+710μLPBS	1.5mL
				PEG30K-D108瘦素	0.46mg/mL	327μL+1176μLPBS	1.5mL
PEG30K-G111瘦素	0.44mg/mL	341μL+1160μLPBS	1.5mL

动物：通过手术给16只在研究开始时重约250-275克的雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠安置颈静脉导管。从Charles River Lab接收动物，且在研究开始前使其适应3天，并且在研究开始当天对大鼠称重。这些动物圈养在标准的无病原体条件下，随意取食食物和水。

动物组：所有化合物都皮下投予

组1(n＝5)：皮下注射1.0mg/kg rh瘦素，瘦素(购自实验室资源)

组2(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素H46

组3(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素W100

组4(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素E105

组5(n＝5)：皮下注射0.5mg/kg PEG-瘦素G111

在投予瘦素或瘦素变异体之前，对动物称重。调配化合物以便以1×BW(以μL计)投予。在肩胛背区域中进行测试物的皮下投予。动物在零时接受单次测试物注射，然后在特定时间点，从动物抽取全血，采集到SST微量采集管中。使血清凝结30分钟，之后离心。将血清转移到聚丙烯滴定管中，用微带密封并储存在-80℃下直到用ELISA分析以测定瘦素血清浓度。

数据收集/终点：每只动物都用于完整的PK时程，从颈静脉导管抽取约0.25mL全血。血液采集后即刻用0.1mL生理盐水冲洗导管，且各测试物的采集时间点是：放血前、给药后1、2、4、8、24、32、48、56、72和96小时。这一数据的图可见于图31中，且展示单次剂量的四种所测试的本发明的特异性PEG-瘦素多肽中每一者的血清半衰期，这四种多肽是针对rh瘦素进行测试，其半衰期为所投予的rh瘦素的8倍和10倍。

实例49

本研究是设计用于评估组合疗法的作用，所述组合疗法组合本发明的瘦素多肽与FGF-21、FGF-21突变蛋白、包括一个或一个以上非天然编码氨基酸的FGF-21、上述任何聚乙二醇化的FGF-21多肽、人类生长激素或可与本发明的瘦素多肽组合使用的已知抗肥胖剂。

在研究开始前，给饮食诱导型肥胖症小鼠(例如C57BL/6小鼠)喂食高脂肪饮食(HFD)并持续6周(每组n＝6)。

动物组：

组1(n＝6)：对照组，单独媒剂调配物

组2(n＝6)：PBS对照组

组3(n＝6)：rh瘦素，1.0mg/kg

组4(n＝6)：胰淀素(治疗有效量)

组5(n＝6)：胰淀素+重组人类瘦素(1.0mg/kg)

组6(n＝6)：胰淀素+PEG-瘦素多肽(1.0mg/kg)

组7(n＝6)：FGF-21+PEG-瘦素多肽(1.0mg/kg)

组8(n＝6)：FGF-21(治疗有效量)

经由渗透泵用胰淀素预处理两周，然后用以上所揭示的各组中的主题化合物预处理4周(可测试其它已知的抗肥胖剂且这些抗肥胖剂可与本发明多肽一起使用)。所有小鼠都具有用于预处理的渗透泵。对于组4-7，在研究持续时间(第2-6周)内，将使用渗透泵进行药物投予。使用聚乙二醇化瘦素多肽的组将以每周皮下给药的方式进行测试物的投予(第2-6周)。

终点：

每日测量食物消耗和体重

每周由QMR测量(组合处理开始后)脂肪质量和瘦肉质量

测量呼吸商、温度和代谢血清水平

在给药前和研究终止时采集血液以获得代谢概况或最低脂联素和胰岛素水平。

应了解，本文中所述的实例和实施例仅出于说明性目的且将提示给所属领域的技术人员根据其作出的各种修改和变化，且所述修改和变化欲包括在本申请案的精神和权限、以及随附权利要求书的范围内。本文中所引用的所有公开案、专利和专利申请案出于所有目的以全文引用的方式并入本文中。

表9：所引用的瘦素序列

Claims (82)

1.一种包含一个或一个以上非天然编码氨基酸的瘦素多肽。

2.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上翻译后修饰。

3.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述多肽是与连接子、聚合物或生物活性分子连接。

4.根据权利要求3所述的瘦素多肽，其中所述多肽是与水溶性聚合物连接。

5.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述多肽是与双官能聚合物、双官能连接子或至少一个其它4HB多肽连接。

6.根据权利要求5所述的瘦素多肽，其中所述双官能连接子或双官能聚合物是与第二多肽连接。

7.根据权利要求6所述的瘦素多肽，其中所述第二多肽是瘦素多肽。

8.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。

9.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物是与所述瘦素多肽中存在的非天然编码氨基酸连接。

10.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上调节所述瘦素多肽对瘦素受体的亲和性的氨基酸取代、添加或缺失。

11.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上增加所述瘦素多肽的稳定性或溶解性的氨基酸取代、添加或缺失。

12.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上增加所述瘦素多肽在重组宿主细胞中的表达或所述瘦素多肽的活体外合成的氨基酸取代、添加或缺失。

13.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上增加所述瘦素多肽的蛋白酶抗性的氨基酸取代、添加或缺失。

14.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸可与不与所述多肽中20种常见氨基酸中的任一者反应的连接子、聚合物或生物活性分子反应。

15.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、肼基、酰肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

16.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基。

17.根据权利要求16所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R₁为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；R₂为H、烷基、

芳基、经取代烷基和经取代芳基；并且R₃为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，

并且R₄为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

18.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含氨氧基。

19.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含酰肼基。

20.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含肼基。

21.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含氨基脲基。

22.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮基。

23.根据权利要求22所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基、经取代芳基或不存在；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

24.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含炔基。

25.根据权利要求24所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸具有以下结构：

其中n为0-10；R1为烷基、芳基、经取代烷基或经取代芳基；X为O、N、S或不存在；m为0-10；R2为H、氨基酸、多肽或氨基末端修饰基，并且R3为H、氨基酸、多肽或羧基末端修饰基。

26.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。

27.根据权利要求26所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物具有介于约0.1kDa与约50kDa之间的分子量。

28.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含含羰基的氨基酸的4HB多肽与包含氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的水溶性聚合物反应来制备。

29.根据权利要求28所述的瘦素多肽，其中所述氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基是通过酰胺键联与所述水溶性聚合物连接。

30.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含羰基的水溶性聚合物与包含包括氨氧基、肼基、酰肼基或氨基脲基的非天然编码氨基酸的多肽反应来制备。

31.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含含炔的氨基酸的瘦素多肽与包含叠氮部分的水溶性聚合物反应来制备。

32.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其是通过使包含含叠氮基的氨基酸的瘦素多肽与包含炔部分的水溶性聚合物反应来制备。

33.根据权利要求15所述的瘦素多肽，其中所述叠氮基或炔基是通过酰胺键联与水溶性聚合物连接。

34.根据权利要求4所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物是支化或多臂聚合物。

35.根据权利要求34所述的瘦素多肽，其中所述支化聚合物的各支链具有介于约1kDa与约100kDa之间的分子量。

36.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述多肽为4HB拮抗剂。

37.根据权利要求36所述的瘦素多肽，其中所述多肽包含一个或一个以上翻译后修饰、连接子、聚合物或生物活性分子。

38.根据权利要求37所述的瘦素多肽，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。

39.根据权利要求36所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸存在于所述4HB多肽的位点II区内。

40.根据权利要求36所述的瘦素多肽，其中所述多肽阻止4HB受体的二聚。

41.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含糖部分。

42.根据权利要求3所述的瘦素多肽，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过糖部分与所述多肽连接。

43.一种分离核酸，其包含编码瘦素多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含至少一个选择密码子。

44.根据权利要求43所述的分离核酸，其中所述选择密码子是选自由琥珀密码子、赭石密码子、蛋白石密码子、独特密码子、稀有密码子和四碱基密码子组成的群组。

45.一种制备根据权利要求3所述的瘦素多肽的方法，所述方法包含使包含非天然编码氨基酸的分离瘦素多肽与包含与所述非天然编码氨基酸反应的部分的连接子、聚合物或生物活性分子接触。

46.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚合物包含选自由水溶性聚合物和聚(乙二醇)组成的群组的部分。

47.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

48.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述氨氧基、肼、酰肼或氨基脲部分是通过酰胺键联与所述连接子、聚合物或生物活性分子连接。

50.根据权利要求45所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸残基包含炔部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含叠氮部分。

51.根据权利要求46所述的方法，其中所述非天然编码氨基酸残基包含叠氮部分，并且所述连接子、聚合物或生物活性分子包含炔部分。

52.根据权利要求48所述的方法，其中所述叠氮部分或炔部分是通过酰胺键联与连接子、聚合物或生物活性分子连接。

53.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的平均分子量。

54.根据权利要求46所述的方法，其中所述聚(乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。

55.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的瘦素多肽和医药学上可接受的载剂。

56.根据权利要求55所述的组合物，其中所述非天然编码氨基酸是与水溶性聚合物连接。

57.一种治疗患有由瘦素调节的病症的患者的方法，其包含向所述患者投予治疗有效量的根据权利要求55所述的组合物。

58.一种细胞，其包含根据权利要求43所述的核酸。

59.根据权利要求58所述的细胞，其中所述细胞包含正交tRNA合成酶或正交tRNA。

60.一种制备包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽的方法，所述方法包含在允许所述包含非天然编码氨基酸的瘦素多肽表达的条件下培养包含一个或一个以上编码瘦素多肽且包含选择密码子的多核苷酸、正交RNA合成酶和正交tRNA的细胞；以及纯化所述瘦素多肽。

61.一种增加瘦素多肽的血清半衰期或循环时间的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述瘦素多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。

62.一种由多核苷酸编码的瘦素多肽，其中所述多核苷酸包含选择密码子，并且其中所述多肽包含至少一个非天然编码氨基酸。

63.根据权利要求62所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与连接子、聚合物、水溶性聚合物或生物活性分子连接。

64.根据权利要求63所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。

65.根据权利要求64所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸包含羰基、氨氧基、酰肼基、肼基、氨基脲基、叠氮基或炔基。

66.根据权利要求64所述的瘦素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约0.1kDa与约100kDa之间的分子量。

67.根据权利要求64所述的瘦素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分是支化或多臂聚合物。

68.根据权利要求67所述的瘦素多肽，其中所述聚(乙二醇)部分具有介于约1kDa与约100kDa之间的分子量。

69.一种组合物，其包含根据权利要求63所述的瘦素多肽和医药学上可接受的载剂。

70.一种瘦素多肽，其包含一个或一个以上增加所述瘦素多肽在重组宿主细胞中的表达的氨基酸取代、添加或缺失。

71.一种瘦素多肽，其包含通过共价键与所述瘦素多肽在单一氨基酸处连接的水溶性聚合物。

72.根据权利要求72所述的瘦素多肽，其中所述水溶性聚合物包含聚(乙二醇)部分。

73.根据权利要求72所述的瘦素多肽，其中所述与所述水溶性聚合物共价连接的氨基酸是非天然编码氨基酸。

74.根据权利要求10所述的瘦素多肽，其中所述非天然编码氨基酸是与聚(乙二醇)分子连接。

75.一种瘦素多肽，其包含至少一个连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述连接子、聚合物或生物活性分子是通过经核糖体并入所述瘦素多肽中的非天然编码氨基酸的官能团与所述瘦素多肽连接。

76.根据权利要求75所述的多肽，其中所述多肽是经单聚乙二醇化。

77.根据权利要求75所述的多肽，其中所述多肽是瘦素多肽。

78.一种多肽，其包含与一个或一个以上非天然编码氨基酸连接的连接子、聚合物或生物活性分子，其中所述非天然编码氨基酸是经核糖体并入所述多肽中的预选位点处。

79.根据权利要求78所述的多肽，其中所述多肽是瘦素多肽。

80.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上调节所述瘦素多肽的免疫原性的氨基酸取代、添加或缺失。

81.根据权利要求1所述的瘦素多肽，其中所述瘦素多肽包含一个或一个以上调节所述瘦素多肽的血清半衰期或循环时间的氨基酸取代、添加或缺失。

82.一种调节瘦素多肽的免疫原性的方法，所述方法包含用一个或一个以上非天然编码氨基酸取代所述瘦素多肽中的任何一个或一个以上天然存在氨基酸。

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