CN1308680A - 用于蛋白质生产和传递的g－csf基因编码区上游的基因组序列 - Google Patents

用于蛋白质生产和传递的g－csf基因编码区上游的基因组序列 Download PDF

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Abstract

公开了分离的核酸分子,所述分离的核酸分子与G－CSF基因编码区上游的一个确定基因组区在严格条件下杂交,或者与其有至少80%序列同一性;也公开了一种DNA构成物,所述DNA构成物含有作为用于同源重组的导向序列的DNA分子。

Description

用于蛋白质生产和传递的G-CSF基因编码区上游的基因组序列
                     发明领域
本发明涉及基因组DNA。
                      发明背景
目前用治疗蛋白治疗疾病的方法包括给予在体外生产的蛋白和基因治疗。体外生产蛋白一般包括将编码目的蛋白的外源DNA引入到培养的合适宿主细胞中。在另一方面，基因疗法包括给予患者包含目的治疗蛋白编码序列的基因工程细胞、质粒或病毒。
也可以用基因导向技术，以所需的方式通过改变某些治疗蛋白的内源基因的表达来生产某些治疗蛋白。参阅例如美国专利第5,641,670、5,733,761和5,272,071号、WO 91/06666、WO91/06667和WO 90/11354，所有这些都通过引用整体结合到本文中。
                    发明概述
本发明是基于对人粒细胞集落刺激因子(“G-CSF”)基因编码序列5’的基因组DNA的鉴定和测序。此DNA例如可以用于DNA构建物vs，当将该构建物通过同源重组整合到哺乳动物细胞的基因组时，所述构建物改变(例如增加)内源G-CSF基因在该细胞中的表达。“内源G-CSF基因”意指编码G-CSF的基因组(即染色体)拷贝。所述构建物包含导向序列和转录调节序列，所述导向序列包括或来自于最近公开的5′非编码序列。所述转录调节序列最好在序列上与内源G-CSF基因的转录调节序列不同。所述导向序列引导所述调节序列整合到靶基因的G-CSF编码序列内区域或其上游区中，以使该调节序列操作性连接至所述内源编码序列。所述“操作性连接的”是指所述调节序列可以控制内源G-CSF编码序列的表达。所述构建物还可以包含易于选择已稳定整合所述构建物的细胞的选择性标记基因和/或另一个操作性连接至启动子的编码序列。
在一个实施方案中，所述DNA构成物包括：(a)一个导向序列，(b)一个调节序列，(c)一个外显子，和(d)一个剪接供体位点。导向序列引导其自身和元件(b)至(d)整合到靶基因G-CSF编码序列中的一个区域内或其上游的一个区域。一旦整合后，元件(b)能控制元件(c)和(d)及内源基因的所有下游编码序列的转录。在所述构成物中，外显子通常在调节序列的3’端，而剪接供体位点在所述外显子的3’末端。
在另一个实施方案中，所述DNA构成物包括：(a)一个导向序列，(b)一个调节序列，(c)一个外显子，(d)一个剪接供体位点，(e)一个内含子，和(f)一个剪接受体位点；其中，导向序列引导其自身和元件(b)至(f)的整合，以致元件(b)至(f)是在内源基因内或其上游。然后所述调节序列控制产生一个转录物，所述转录物不仅包括元件(c)至(f)，还包括内源G-CSF编码序列。最好是，得自构成物的内含子和剪接受体位点位于所述构成物中的剪接供体位点的下游。
所述导向序列与发生同源重组的基因组中预先选择的靶位点同源。它包含SEQ ID NO:5的至少20(例如至少50或100)个连续的核苷酸，SEQ ID NO:5代表相对于人G-CSF基因的转录起始位点的核苷酸-6578至-364。所谓“同源”是指所述导向序列与其基因组靶位点相同或足够相似，以使所述导向序列和靶位点可以进行同源重组。只要同源重组可以以有效频率发生，那么小部分的碱基对错配可以接受。为了易于同源重组，所述导向序列最好为至少约20(例如至少50、100、250、400或1000)个碱基对(“bp”)长。所述导向序列也可以包括SEQ ID NO:5所包含区以外的基因组序列，只要其包括此区中的至少20个核苷酸。例如，可以由位于SEQ ID NO:5和G-CSF基因的内源转录起始序列之间的序列衍生另外的导向序列。
由于可能存在于G-CSF基因的基因座上的多态性，在任何给定的哺乳动物物种中任何给定的基因组靶位点的核苷酸组成都可以发生微小改变。对应于SEQ ID NO:5的这种多态变异体(尤其是人多态变异体)的导向序列属于本发明的范围。
在同源重组时，将所述构建物的调节序列整合到细胞染色体中G-CSF基因编码序列上游的预先选定的区。产生的包含得自所述构建物的调节序列的新转录单位改变了靶G-CSF基因的表达。如此产生的G-CSF蛋白在序列上与未改变的内源基因编码的G-CSF蛋白可以相同，或者由于同源重组引入的变化，与野生型G-CSF蛋白相比可以包含氨基酸残基的添加、置换或减少。
改变基因表达包括使在所获得的细胞中通常沉默(即基本不表达)的基因活化(或引起表达)，增加或减少基因的表达水平，和改变基因的调节模式，使得该模式不同于在所获得的细胞中的模式。“所获得的细胞”意指在同源重组前的细胞。
使用本发明的DNA构建物改变内源G-CSF基因在哺乳动物细胞中表达的方法也属于本发明的范围。该方法包括以下步骤：(ⅰ)将所述DNA构建物引入到哺乳动物细胞中；(ⅱ)将所述细胞保持在允许所述构建物和与所述导向序列同源的基因组靶位点之间发生同源重组的条件下，以产生同源重组细胞；和(ⅲ)将所述同源重组细胞保持在允许G-CSF编码序列于得自所述构建物的调节序列控制下表达的条件下。至少部分所述基因组靶位点位于内源G-CSF基因编码序列的5’。即所述基因组靶位点可以包含编码序列以及5′非编码序列。
本发明的特征还在于转染或感染的细胞，在所述细胞中所述构建物与在内源G-CSF基因的一个或两个等位基因中的内源ATG起始密码子上游的基因组DNA进行同源重组。这种转染或感染的细胞也称为同源重组细胞，具有改变的G-CSF表达模式。这些细胞特别用于体外生产G-CSF和通过基因治疗传递G-CSF。制备和使用这种细胞的方法也包括在本发明中。所述细胞可以来源于脊椎动物源，诸如哺乳动物(例如人、非人类的灵长类、母牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)。
本发明还涉及体外或体内将上述构建物经同源重组引入到宿主细胞的基因组中产生哺乳动物G-CSF蛋白的方法。然后将所述同源重组细胞保持在使所述G-CSF蛋白转录、翻译和可选地分泌的条件下。
本发明的特征还在于分离的核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:5或其互补物的至少20(例如至少30、50、100、200或1000)个连续核苷酸的序列，或包含与SEQ ID NO:5相同、只是有不妨碍与所述导向序列同源重组的多态变异或其它微小变异(例如少于序列的5％)的序列。在一个实施方案中，本发明的分离的核酸包括SEQ ID NO:5的连续100个碱基对的区段。例如所述分离的DNA可以包含SEQ IDNO:5的核苷酸1-100、101-200、201-300、301-400、401-500、501-600、 601-700、701-800、801-900、901-1000、1001-1100、1101-1200、1201-1300、1301-1400、1401-1500、1501-1600、1601-1700、1701-1800、1801-1900、1901-2000、2001-2100、2101-2200、2201-2300、2301-2400、2401-2500、2501-2600、2601-2700、2701-2800、2801-2900、2901-3000、3001-3100、3101-3100、3101-3200、3201-3300、3301-3400、3401-3500、3501-3600、3601-3700、3701-3800、3801-3900、3901-4000、4001-4100、4101-4200、4201-4300、4301-4400、4401-4500、4501-4600、4601-4700、4701-4800、4801-4900、4901-5000、5001-5100、5101-5200、5201-5300、5301-5400、5401-5500、5501-5600、5601-5700、5701-5800、5801-5900、5901-6000、6001-6100、6101-6200或6136-6235或其互补物。SEQ IDNO:5的这些区段或其互补物也用作本发明构建物中的导向序列。
在所述分离的DNA中，得自SEQ ID NO:5的序列没有连接至编码全长G-CSF的序列，或至少没有以和在任何天然基因组中出现的构型相同的构型(即被相同的非编码序列分隔)连接。因此本文使用的术语“分离的DNA”不表示染色体或大段的基因组DNA(这可能掺入到粘粒或酵母人工染色体中)，染色体或大段的基因组DNA不仅包括部分或全部SEQ ID NO:5，而且包括完整的G-CSF编码序列和所有的位于G-CSF编码序列和存在于细胞基因组中对应于SEQ IDNO:5的序列之间的序列。它确实包括但不限于，(ⅰ)掺入到质粒或病毒中的DNA；或(ⅱ)作为独立于其它序列的单独分子存在的DNA，例如通过聚合酶链式反应(“PCR”)或限制性内切核酸酶处理产生的片段。所述分离的DNA最好不包含编码完整G-CSF前体(即具有内源分泌信号肽的完整G-CSF)的序列。
本发明还包括包含一种分离的DNA，其包含的一条链包含至少100(例如至少200、400或1000)个核苷酸长并与SEQ ID NO:5的等长片段或其互补物具有至少80％(例如至少85％、90％、95％或98％)序列同一性的序列。所述序列不连接至完整G-CSF编码序列，或至少没有以和在任何天然基因组中出现的构型相同的构型连接。
在特定多肽或核酸分子被认为与参比多肽或核酸分子具有明确百分率的同一性或保守性的情况下，通过Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法确定同一性或保守性的百分率，所述算法具体为ALIGN程序(2.0版)或其等效程序中，需要时使用12的隙宽补偿参数和4的缺口补偿参数。其它所有参数都设定为它们的默认状态。ALIGN的使用权很容易获得。参见例如国际互联网http://www2.igh.cnrs.fr/bin/align-guess.cgi。
本发明的特征还在于一种方法，该方法通过提供其内源G-CSF基因已如本文所述活化的细胞，并将该细胞植入动物(例如哺乳动物如人、非人类的灵长类、母牛、猪、马、山羊、绵羊、猫、狗、兔、小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)中，所述细胞在所述动物中分泌G-CSF，从而将G-CSF传递给所述动物。本发明还包括一种方法，该方法通过提供其内源G-CSF基因已如本文所述活化的细胞，并在允许该细胞表达和分泌G-CSF的条件下体外培养该细胞，从而产生G-CSF。
本发明的分离的DNA例如可以用作用于(当与合适的下游引物共同使用时)获得内源G-CSF基因的调节区和/或编码序列的上游PCR引物源，或用作指示在人染色体制备物中染色体179存在的杂交探针。它也可以如下所述用于改变内源G-CSF基因在脊椎动物细胞中表达的方法。
除非另有定义，否则本文使用的所有科技术语都具有和本发明所属领域的一般技术人员的通常理解相同的含义。以下描述了典型方法和材料，但是与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料也可以用来实施和检验本发明。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献都通过引用整体结合到本文中。在有冲突的情况下，以本说明书包括定义为准。所述材料、方法和实施例仅起说明作用，并无限制意图。
由以下的详述和权利要求将明显看出本发明的其它特征和优势。
                     附图简述
图1是一个显示人类G-CSF基因的基因组结构的示意图。
图2是一个显示由质粒pHGCSF1和pHGCSF4的插入片段包括的人类G-CSF基因组区的示意图。
图3显示人类G-CSF基因的部分序列(SEQ ID NO:1)，包括ATG起始密码子的5’端序列的6578个核苷酸。还显示由所述编码序列编码的一段部分多肽序列(SEQ ID NO:2)。下划线是指从基因组插入片段和G-CSF/3噬菌体克隆中的噬菌体臂的连接点获得的序列。
图4是一个显示本发明的一个构成物的示意图。所述构成物包含一个第一导向序列(1)；一个可扩增的标记基因(AM)；一个选择性标记基因(SM)；一个调节序列；一个CAP位点；一个编码G-CSF部分信号肽的外显子；一个不配对的剪接供体位点(SD)；和一个第二导向序列(2)。黑框显示编码DNA，而点框显示转录的但未翻译的序列。
图5显示SEQ ID NO:5，一个人类G-CSF转录起始位点上游的基因组序列。
图6显示在本发明的一个构成物中使用的第一导向序列(SEQ IDNO:6)。
图7显示在本发明的一个构成物中使用的第二导向序列(SEQ IDNO:7)。
                   发明详述
本发明基于对人G-CSF基因的编码序列的上游序列的核苷酸组成的研究。
G-CSF是一种细胞因子，它刺激定向为嗜中性白细胞/粒细胞谱系的造血祖细胞的增生和分化。G-CSF通常用于预防化学疗法造成的嗜中性白细胞减少症和与骨髓移植结合使用。慢性特发性和先天性嗜中性白细胞减少性疾病在注射G-CSF后也显示出得到改进。
人类G-CSF基因编码包含30个氨基酸信号肽的204或207个氨基酸的前体蛋白质。人类G-CSF基因组图谱如图1所示。所述图谱是根据2960bp公开的序列(HUMGCSFG，基因库登录号X03656)构建的，该序列的起始点在相对于翻译起始点的位置-363(除非另外详细说明，否则本文所提到的所有位置都是相对于翻译起始点而言)。所述基因包括5个外显子和4个内含子，第一外显子编码信号肽的13 2/3个氨基酸(即第一外显子包括编码所述信号肽的13个密码子和第14个密码子中的前两个核苷酸)。人类G-CSF基因5’序列
为了获得含有G-CSF基因上游序列的基因组DNA，在λEMBL-3(Clontech目录第#HL0062d号)中的人类白细胞基因组文库用经PCR产生的729bp寡核苷酸探针进行筛选。该探针包括G-CSF外显子1和2，且用命名为102和105的两种寡核苷酸引物由人类基因组DNA进行扩增，这两种引物都是按照可得到的G-CSF基因组DNA序列(图1)设计的。引物102的5’末端对应于位置-345，且引物的序列为5’-TATCAGCGGCTCAGCCTTTG-3’(SEQ ID NO:3)。引物105的5’末端对应于位置+384，且引物的序列为5’-CCACCTCACTCACCAGCTTCTC-3’(SEQID NO:4)。
用放射性标记的729bp探针筛选了大约150万个重组噬菌体。分离出4个独立的噬菌斑。其中一个，命名为克隆G-CSF/3，用于以后的研究。
将来自噬菌体G-CSF/3的一个6.5kb HindⅢ-KpnⅠ片段亚克隆到质粒pBluescript Ⅱ SK+(Stratagene,La Jolla,CA)中产生质粒pHGCSF1，质粒pHGCSF1包含G-CSF基因的上游序列和整个蛋白质编码区域。另一个上游亚克隆pHGCSF4由3.3kb SalⅠ片段制备，pHGCSF4和pHGCSF1的所述插入片段有大约0.4kb的重叠(图2)。
按照Sanger方法对pHGCSF1和pHGCSF4质粒进行序列测定。将序列数据对比得到紧接人类G-CSF基因的转录起始位点上游的一个6.6kb区域的序列，始于位置-6578。这个序列是SEQ ID NO:1的一部分，如图3所示。
在SEQ ID NO:1的5’末端的19bp(图3下划线)，得自在G-CSF/3噬菌体克隆中的所述基因组插入片段和噬菌体臂的连接点。因此，这个19bp区域中的SalⅠ位点不存在于从噬菌体文库获得的人类基因组中。位置-6578和-364(SEQ ID NO:5)之间的序列是来自先前公开的G-CSF基因组序列的上游区域的人类基因组序列，且以前没有报道过。
为了改变内源G-CSF基因的表达，将含有SEQ ID NO:5的核苷酸1470至4723的一个DNA片段克隆到质粒pGG13中一个CMV启动子和一个新霉素抗性基因的上游。核苷酸1470至4723(SEQ ID NO:6)代表在图4中图示的第一导向序列。对于图4的第二导向序列，将含有G-CSF基因序列的核苷酸4728至5979(相对于翻译起始位点)(SEQID NO:7)的一个DNA片段克隆到所述CMV启动子和新霉素抗性基因的下游。将pGG13质粒引入显示出几乎没有或没有G-CSF基因表达的人成纤维细胞中，允许和内源G-CSF基因同源重组。筛选在质粒引入后抗G418的细胞，以鉴定G-CSF基因表达增加的细胞，假如pGG13和所述基因组DNA之间的同源重组发生在内源G-CSF基因周围，这就是所期望的。一般方法学改变内源G-CSF表达
用上述G-CSF上游序列，按照美国专利第5,641,670号所一般叙述的方法，可以改变内源人类G-CSF基因的表达。图4显示示一个策略。在这个策略中，已设计出的导向构成物包括一个第一导向序列、一个可扩增标记基因、一个选择性标记基因、一个调节区、一个CAP位点、一个外显子、一个剪接供体位点和一个第二导向序列；其中，第一导向序列与所述基因上游的一个第一个靶位点同源；所述外显子编码的氨基酸序列与G-CSF信号肽的前13 2/3氨基酸的序列相同或功能相当(即第一外显子包括编码所述信号肽的13个密码子和第14个密码子中的前两个核苷酸)；第二导向序列与第一靶位点下游的第二靶位点同源并终止于G-CSF编码序列内或其上游。在这个策略中，第一和第二靶位点在同源重组前的染色体中是紧密相连的，但是这样一个构象是不需要的(见下面所述)。同源重组细胞将产生一个mRNA前体，该前体相当于外源外显子和剪接供体位点及剪接供体位点和G-CSF基因的转录终止序列之间的任何序列，包括G-CSF内含子、外显子和3’非翻译区(图4)。这个转录物剪接的结果产生一个mRNA，在该mRNA中，外源外显子融合到内源G-CSF基因的外显子2。该mRNA翻译产生一个前体G-CSF。在所述DNA构成物中包括编码外显子允许对信号肽作任何设想的修饰。
其它的方案也可采用。例如，第一和/或第二靶位点可以在G-CSF基因的第一内含子中。或者，所述DNA构成物可以设计为从5’端到3’端包括：一个第一导向序列、一个可扩增标记基因、一个选择性标记基因、一个调节区、一个CAP位点、一个外显子、一个剪接供体位点、一个内含子、一个剪接受体位点和一个第二导向序列。对于该策略，第二靶位点的5’末端最好少于通常G-CSF翻译起始位点上游的60bp，目的是避开不希望的ATG起始密码子。从同源重组基因座产生的mRNA前体将包括外源外显子、外源剪接供体位点、外源内含子、外源剪接受体位点、第二导向序列和第二导向序列与内源基因3’非转录区之间的任何序列。该转录物的剪接将产生一个mRNA，该mRNA可翻译产生一个人类G-CSF前体，该前体含有正常的G-CSF分泌信号序列或基因工程分泌信号序列。可以改变外源内含子的大小并因此改变外源调节区相对于所述基因编码区的位置，以使调节区功能最佳。
在任一活化策略中，第一和第二靶位点不需要紧密相连或甚至互相离得很近。当它们没有相互紧密连接时，G-CSF基因的正常上游区的一部分和/或编码区的一部分将会在同源重组时删除。DNA构建物
本发明的DNA构建物至少包括导向序列和调节序列。它还可以包括外显子；或外显子和未配对的剪接供体位点；或外显子、剪接供体位点、内含子和剪接受体位点。如果所述外显子存在，则位于所述调节序列的3′，且未配对的剪接供体位点位于所述外显子的3′端。如果存在所述内含子和所述剪接受体位点，则位于所述剪接供体位点的3′。另外，在侧翼为未配对的剪接供体位点的所述外显子之前，可以有多个外显子和内含子(以及合适的剪接供体和受体位点)。在所述构建物中的DNA被认为是外源的，因为该DNA不是宿主细胞基因组的原始部分。外源DNA可以具有与在通过病毒载体转染或感染之前的细胞中存在的内源基因组DNA部分相同或不同的序列。本文使用的“转染”是指通过化学或物理方法，诸如磷酸钙或氯化钙共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔、微注射、微粒轰击或biolistic介导的摄取，将质粒引入到细胞中。本文所用的“感染”是指通过病毒感染将病毒载体引入到细胞中。在下文详细描述了包括于本发明的DNA构建物中的各种元件。
所述DNA构建物还可以包括顺式作用或反式作用病毒序列(例如包装信号)，从而能够将所述构建物经病毒载体感染传递到细胞的核中。必要时，所述DNA构建物可以由病毒生活周期的各步(诸如在逆转录病毒中整合酶介导的整合或附加体维持)中脱离出来。通过病毒序列的合适的缺失或突变，诸如在逆转录病毒载体中整合酶编码区的缺失，可以实现脱离。关于所述构建的其它细节和病毒载体的用途见于Robbins等人，Pharmacol.Ther.80：35-47,1998；和Gunzburg等人，Mol.Med.Today 1:410-417,1995，通过引用结合到本文中。导向序列
导向序列使得目的序列同源重组到在宿主基因组中选定位点。导向序列与其在宿主基因组中的相应靶位点同源(即能够与其同源重组)。
环状DNA构建物可以使用一个导向序列或两个或两个以上单独的导向序列。线性DNA构建物可以包含两个或两个以上单独的导向序列。与已知的导向序列同源的靶位点可以位于G-CSF基因编码区的外显子和/或内含子内、位于所述编码区的上游并紧接所述编码区或位于所述编码区的上游并距所述编码区有一段距离。
在所述构建物中的两个导向序列的第一个(或者如果在该构建物中只有一个导向序列，则是完整的导向序列)得自新近公开的G-CSF编码序列的上游基因组区。此导向序列例如包含SEQ ID NO:1的一部分，例如对应于位置-6578至-364(SEQ ID NO:5)的20个连续的核苷酸。在所述构建物中的两个导向序列的第二个可以导向所述编码序列的上游基因组区(例如也含有SEQ ID NO:5的一部分)，或导向所述编码序列的外显子或内含子。
所述导向序列另外可以包括得自以前公开的G-CSF基因区的序列，包括本文描述的那些区，以及在结构未特征鉴定但本领域技术人员可以作出图谱的上游更远的区。
可以利用基因组片段与包含全部或部分SEQ ID NO:5的探针杂交的能力，鉴定用作导向序列的所述基因组片段。这种探针可使用得自SEQ ID NO:5的引物经PCR产生。调节序列
所述DNA构建物的调节序列可以包含一个或多个启动子(例如组成型启动子、组织特异性启动子或诱导型启动子)、增强子、支架结构连接区或基质附着部位、负调节元件、转录因子结合位点，或这些元件的组合。
所述调节序列可以得自真核生物(例如哺乳动物)或病毒基因组。有用的调节序列包括但不限于调节SV40早期或晚期基因、巨细胞病毒基因和腺病毒主要晚期基因表达的那些调节序列。它们还包括得自编码小鼠金属硫蛋白-Ⅰ、延伸因子-1α、胶原蛋白(例如胶原蛋白Ⅰαl、胶原蛋白Ⅰα2和胶原蛋白Ⅳ)、肌动蛋白(例如γ-肌动蛋白)、免疫球蛋白、HMG-辅酶A还原酶、甘油醛磷酸脱氢酶、3-磷酸甘油酸激酶、胶原酶、溶基质素、纤连蛋白、波形蛋白、纤溶酶原激活物抑制剂Ⅰ、胸腺素β4、组织金属蛋白酶抑制剂、核糖体蛋白、主要组织相溶性复合体分子和人白细胞抗原的基因的调节区。
所述调节序列最好包含转录因子结合位点，诸如TATA框、CCAAT框、AP1、Sp1或NF-κB结合位点。标记基因
如果需要，所述构建物可以包括编码目的多肽、操作性连接至其自身启动子的序列。其实例应为选择性标记基因，它可用来易化对导向事件的鉴别。也可以使用可扩增的标记基因，它用来易化对具有共扩增的侧翼DNA序列的细胞的选择。可以通过在选择可扩增基因表达的介质存在下培养，鉴别包含扩增拷贝的可扩增标记基因的细胞。活化的内源G-CSF基因将同扩增的选择性标记基因串联扩增。包含多拷贝活化内源基因的细胞可以产生很高水平的G-CSF，并因此可用于体外生产蛋白和基因治疗。
选择性标记基因和可扩增的标记基因互相之间不必处于紧接状态。可扩增的标记基因和选择性标记基因可以是相同的基因。一个或两个所述标记基因可以位于所述DNA构建物的内含子中。在美国专利第5,641,670号中描述了合适的可扩增的标记基因和选择性标记基因。外源外显子
所述DNA构成物可以进一步包含一个外显子，即拷贝进入RNA且存在于成熟的mRNA分子中的DNA序列。在所述构成物中的外显子在本文是指一个外源外显子。外源外显子可能相同或不同于人类G-CSF基因的第一外显子。或者，外源外显子编码一个或多个氨基酸残基，或部分编码一个氨基因酸残基(即含有一个密码子的一个或两个核苷酸)。当所述外显子含有一段编码序列时，所述DNA构成物应该这样设计，在转录和剪接时，产生的mRNA的阅读框符合目标G-CSF基因的编码区的阅读框。也就是说，外源外显子被剪接至内源外显子，其剪接方式使得不改变从内源外显子得到的部分mRNA的合适的阅读框。
在导向构成物中包括编码外显子，使得可以产生融合蛋白质，该蛋白质含有内源G-CSF蛋白质序列和外源蛋白质序列。这样一种杂合蛋白质可以将两种或两种以上蛋白质的结构的、酶的、或配体结合或受体结合的特性结合到一条多肽中。例如，外源外显子可编码细胞膜锚着点、改进细胞分泌的信号肽、前导序列、酶区、辅因子结合区或附加表位，后者使从重组基因座产生的G-CSF杂合蛋白质容易被纯化。剪接供体位点
外源外显子的3’末端侧翼是剪接供体位点。剪接供体位点是一段序列，该序列引导RNA转录物的一个外显子剪接到RNA转录的另一外显子的剪接受体位点。通常，第一外显子位于第二外显子的5’，且位于第一外显子的3’末端的剪接供体位点与位于第二外显子5’一侧的剪接受体位点配对。剪接供体位点有一个特征性共有序列，表示为(A/C)AGGURAGU(这里R表示嘌呤)，在第四和第五位置的GU是必需的(Jackson,Nucleic Acids Rearch 19:3715-3798,1991)。剪接供体共有序列的前3个碱基是所述外显子的最后三个碱基：也就是说，它们没有被剪接掉。在根据它们能影响mRNA剪接途径中的合适反应的能力在功能上定义剪接供体。
作为实例，当一个或多个间插核苷酸的存在对于使外源外显子符合靶基因的第二外显子的阅读框不是必需时，剪接供体位点可同ATG密码子的3’端紧密相联。当外源外显子编码符合靶基因编码序列的读框的一个或多个氨基酸时，剪接供体位点最好位于外源编码序列的3’端并与其紧密相连。
所述外源外显子侧翼的剪接供体位点在所述构成物中是不配对的，即在所述结构中在剪接供体位点下游没有伴随的可被剪接至剪接供体位点的剪接受体位点。在所述构成物的不配对的剪接供体位点同源重组到G-CSF编码序列上游的靶位点中后，所述不配对的剪接供体位点同G-CSF内源外显子的一个内源剪接受体位点进行功能配对。从同源重组的G-CSF基因产生的转录物的加工导致将该外源外显子剪接到一个内源外显子的剪接受体位点。
本发明的所述构成物还可以包括一个剪接受体位点。这个位点与一个剪接供体位点结合，引导将一个外显子剪接到另一个外显子。剪接受体位点有一个特征性序列，表示为(Y)10NYAG(SEQ IDNO:8)，这里Y表示任何嘧啶，N表示任何核苷酸(Jackson,NucleicAcids Research 19,3715-3798,1991)。内含子
所述DNA构成物中可以可选地包括一个内含子。内含子是位于剪接供体位点和剪接受体位点之间的一个或多个核苷酸的一段序列，且可以形成成熟的mRNA分子时从前体RNA分子中剪接去掉。CAP位点
所述DNA构建物可以可选地包含CAP位点。CAP位点是与所述调节区有关并由其使用的特异性转录起始位点。此CAP位点在所述构建物中相对于所述调节序列的位置，使得同源重组后，所述调节序列控制在所述CAP位点开始合成转录物。另一方面，在所述构建物中不包括CAP位点，转录装置将由于在靶基因中缺乏合适的用作CAP位点的位点而定位。另外的DNA元件
所述构建物可以另外包含影响通过同源重组产生的RNA或蛋白的结构或稳定性的序列。所述DNA构建物可选地可以包括细菌复制起点和细菌抗生素抗性标记或其它的选择性标记，便于在细菌或任何其它合适的克隆/宿主系统中大规模繁殖质粒。
所述DNA构建物的所有上述元件互相之间都可操作性连接或以功能方式排列。即在所述构建物和靶基因组DNA之间同源重组后，所述调节序列可以操纵初级RNA转录物的产生，所述初级RNA转录物起始于CAP位点(可选地包括在所述构建物中)，并包括(ⅰ)相应于所述构成物的外显予和剪接供体位点的序列，假设它们存在的话，和(ⅱ)位于该剪接供体位点和内源基因的转录终止位点之间的序列。后一序列可以包括G-CSF基因的内源调控区以及通常不被转录的邻近序列。在一个操作性连接的构型中，所述导向构成物的剪接供体位点引导剪接至内源G-CSF基因的外显子之一侧翼的一个剪接受体位点的剪接事件，使得可以由完全剪接的成熟转录物产生蛋白质。剪接受体位点可以是内源的，使得将剪接事件导向一个内源外显子。在另一个实施方案中，剪接受体位点包括在所述导向构成物中，剪接事件去掉由导向构成物引入的外源内含子。
在所述DNA构建物中元件的顺序可以改变。当所述构建物是环状质粒或病毒载体时，在产生的结构中元件的相对顺序例如可以是：导向序列、质粒DNA(包含在微生物和其它适合的宿主中用于选择和/或复制导向质粒的序列)、选择性标记、调节序列、外显子和不配对的剪接供体位点。
当所述构建物为线性时，该顺序例如可以是：第一个导向序列、选择性标记基因、调节序列、外显子和剪接供体位点；或为另一种顺序：第一个导向序列、调节序列、外显予、选择性标记基因和第二个导向序列。所述元件的顺序也可以是：第一个导向序列、选择性标记基因、调节序列、外显子、剪接供体位点、内含子、剪接受体位点、可选的内部核糖体进入位点和第二个导向序列。
另一方面，所述顺序可以是：第一个导向序列、第一个选择性标记基因、调节序列、外显子、剪接供体位点、第二个导向序列和第二个选择性标记基因；或为：第一个导向序列、调节序列、外显子、剪接供体位点、第一个选择性标记基因、第二个导向序列和第二个选择性标记基因。在位于所述第一个选择性标记侧翼的导向序列和在宿主基因组中的同源序列之间的重组导致所述第一个选择性标记的定向整合，而所述第二个选择性标记未被整合。所需转染或感染的细胞是那些用第一个选择性标记而不是第二个选择性标记稳定转染或感染的细胞。可以通过在包含选择第一个标记表达的介质和选择抗第二个标记的另一种介质的培养基中生长，选择这样的细胞。预计已通过非同源重组的机制而不正确整合导向构建物的转染或感染的细胞应表达所述第二个标记基因，从而在所选择培养基中被杀死。
有时在所述构建物中包括正选择性标记，以便于选择包含扩增拷贝的该标记的细胞。在此实施方案中，构建物元件的川页序例如可以是：第一个导向序列、可扩增的正选择性标记、第二个选择性标记(可选的)、调节序列、外显子、剪接供体位点和第二个导向DNA序列。
所述构建物的各种元件可以由天然来源(例如基因组DNA)获得，或者可以使用基因工程技术或合成方法产生。所述构建物的调节区、CAP位点、外显子、剪接供体位点、内含子和剪接受体位点可以作为完整单元由例如人延伸因子-1α(GenBank序列HUMEF1A)基因或巨细胞病毒(GenBank序列HEHCMVP1)立即早期区中分离。这些元件还可以由单独的基因分离。转染或感染和同源重组
可以将本发明的DNA构建物作为单个DNA构建物或作为分开的DNA序列引入到诸如原代细胞、继代细胞或无限增殖化细胞的细胞中，使所述DNA加入到转染或感染细胞的染色体或核DNA中。所述DNA可以作为线性、双链(在一个或两个末端具有或不具有单链区)、单链或环状分子引入。所述DNA构成物或其RNA等同物也可以作为病毒核酸引入。
当将所述构建物以两个独立的DNA片段引入到宿主细胞中时，所述两个片段在一个片段的3′末端和在另一个片段的5′末端具有DNA序列同源性(重叠)，同时一个片段具有第一个导向序列，而另一个片段具有第二个导向序列。当引入到细胞中时，所述两个片段可以进行同源重组，以形成在原来两个片段之间的重叠区侧翼具有第一个和第二个导向序列的单个分子。于是产物分子的形式适于和细胞靶位点同源重组。可以使用多于两个的片段，设计它们中的每一个，以使它们互相之间进行同源重组，最终形成适于同如上所述的细胞靶位点同源重组的产物。
本发明的DNA构建物如果自身不含有选择性标记，则其可与包含这种标记的另一个构建物共转染或共感染。可以用限制酶在一个或多个位点切割导向质粒，以在转染或感染前产生线性或有缺口的分子。产生的游离DNA末端增加了目的同源重组事件的发生频率。此外，可以用外切核酸酶处理所述游离的DNA末端，以产生突出的5′或3′单链DNA末端(例如至少30个核苷酸长，最好100-1000个核苷酸长)，增加目的同源重组事件的发生频率。在此实施方案中，在所述导向序列和基因组靶之间的同源重组将产生两个拷贝所述导向序列，位于包含在引入的质粒中的元件侧翼。
可以通过各种物理或化学方法，包括电穿孔、微注射、微粒轰击、磷酸钙沉淀、脂质体传递或Polybrene介导或DEAE葡聚糖介导的转染，(最好在体外)将所述DNA构建物转染到细胞中。
如本领域所述(参阅例如Capecchi,Science 24:1288-1292,1989)，将转染或感染的细胞保持在允许同源重组的条件下。所谓“感染细胞”是指使用病毒载体将DNA或RNA分子引入到其中(或其祖细胞中)的细胞。已知可用作载体的病毒包括腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒、腮腺炎病毒、脊髓灰质炎病毒、慢病毒、逆转录病毒、新培斯病毒和诸如金丝雀痘病毒的牛痘病毒。当将所述同源重组细胞保持在足以允许所述DNA转录的条件下时，由所述DNA构建物引入的调节区将改变G-CSF基因的转录。
可以通过表型筛选或通过用针对G-CSF的酶联免疫吸附测定(ELISA)分析培养上清液，鉴定同源重组细胞(即已进行目的同源重组的细胞)。可由R & D Synstems(Minneapolis,MN)获得检测G-CSF的市售ELISA试剂盒。还可以通过DNA和RNA印迹分析或通过聚合酶链式反应(PCR)筛选，鉴定同源重组细胞。
本文使用的术语“原代细胞”包括(ⅰ)存在于分离自脊椎动物组织源的细胞悬浮液中的细胞(在它们贴壁之前，即附着到在诸如皿或烧瓶的组织培养支持基体之前)，(ⅱ)存在于得自组织的外植块中的细胞，(ⅲ)第一次贴壁培养的细胞，和(ⅳ)由这些贴壁培养细胞产生细胞悬浮液。原代细胞也可以是在人或动物中天然产生的细胞。
继代细胞是在随后的所有培养步骤的细胞。即从培养支持基体取出第一次贴壁培养的原代细胞并再次平板培养(传代细胞)，本文将它们称为继代细胞，包括在随后传代中的所有细胞。继代细胞株包括已经传代一次或几次的继代细胞。通常继代细胞在培养中具有有限次数的平均群体倍增，并具有接触抑制、贴壁依赖性生长的特性(贴壁依赖性不适用于在悬浮培养中繁殖的细胞)。原代和继代细胞不是无限增殖的。
无限增殖化细胞是在培养中具有明显地无限制性生命期的细胞系(与细胞株相反，定义“株”专用于原代和继代细胞)。
选择用于转染或感染的细胞可以分为四种类型或四类:(ⅰ)获得的产生或包含不超过痕量的G-CSF蛋白的细胞，(ⅱ)产生或包含蛋白的细胞，但蛋白量不是所需的量(诸如其量低于所获得的细胞类型生理正常的水平)，(ⅲ)以所获得的细胞类型的生理正常水平产生所述蛋白的细胞，但其含量或产量可增大或增强，和(ⅳ)需要改变其中的编码所述蛋白的基因的调节或诱导模式的细胞。
通过本发明方法转染或感染的原代、继代和无限增殖化细胞可以由各种组织获得并包括可以在培养中保持的所有合适的细胞类型。例如，合适的原代和继代细胞包括成纤维细胞、角质形成细胞、上皮细胞(例如乳房上皮细胞、肠上皮细胞)、内皮细胞、神经胶质细胞、神经细胞、血液的组成成分(例如淋巴细胞、骨髓细胞)、肌细胞和这些体细胞类型的前体。当要在基因治疗中使用所述同源重组细胞时，最好由要给予转染或感染原代或继代细胞的个体获得原代细胞。然而，可以由同一物种的供体(即不是受体的个体)获得原代细胞。
用于蛋白产生或基因治疗的无限增殖化人细胞系的实例包括但不限于，2780AD卵巢癌细胞(Van der Blick等，Cancer Res.,48:5927-5932,1988)、A549(美国典型培养物保藏中心(“ATCC”)CCL185)、BeWo(ATCC CCL 98)、Bowes黑素瘤细胞(ATCC CRL9607)、CCRF-CEM(ATCC CCL 119)、CCRF-HSB-2(ATCC CCL120.1)、COLO201(ATCC CCL 224)、COLO205(ATCC CCL 222)、COLO 320DM(ATCC CCL 220)、COLO 320HSR(ATCC CCL220.1)、Daudi细胞(ATCC CCL 213)、Detroit 562(ATCC CCL138)、HeLa细胞及HeLa细胞衍生物(ATCC CCL2、2.1和2.2)、HCT116(ATCC CCL 247)、HL-60细胞(ATCC CCL 240)、HT1080细胞(ATCC CCL 121)、IMR-32(ATCC CCL 127)、Jurkat细胞(ATCC TIB 152)、K-562白血病细胞(ATCC CCL 243)、KB癌细胞(ATCC CCL 17)、KG-1(ATCC CCL 246)、KG-1a(ATCC CCL246.1)、LS123(ATCC CCL 255)、LS174T(ATCC CCL CL-188)、LS180(ATCC CCL CL-187)、MCF-1乳癌细胞(ATCC BTH 22)、MOLT-4细胞(ATCC CRL 1582)、Namalwa细胞(ATCC CRL 1432)、NCI-H498(ATCC CCL 254)、NCI-H508(ATCC CCL 253)、NCI-H548(ATCC CCL 249)、NCI-H716(ATCC CCL 251)、NCI-H747(ATCC CCL 252)、NCI-H1688(ATCC CCL 257)、NCI-H2126(ATCC CCL 256)、Raji细胞(ATCC CCL 86)、RD(ATCC CCL136)、RPMI 2650(ATCC CCL 30)、RPMI 8226细胞(ATCC CCL155)、SNU-C2A(ATCC CCL 250.1)、SNU-C2B(ATCC CCL 250)、SW-13(ATCC CCL 105)、SW48(ATCC CCL 231)、SW403(ATCCCCL 230)、SW480(ATCC CCL 227)、SW620(ATCC CCL 227)、SW837(ATCC CCL 235)、SW948(ATCC CCL 237)、SW1116(ATCC CCL 233)、SW1417(ATCC CCL 238)、SW1463(ATCC CCL234)、T84(ATCC CCL 248)、U-937细胞(ATCC CRL 1593)、WiDr(ATCC CCL 218)和WI-38VA13亚系2R4细胞(ATCC CCL 75.1)以及通过融合人细胞和其它物种的细胞产生的异种杂交瘤细胞。可以使用次级人成纤维细胞株，诸如WI-38(ATCC CCL 75)和MRC-5(ATCCCCL 171)。此外，原代、继代或无限增殖化人细胞，以及来自其它物种的原代、继代或无限增殖化细胞，可以用于体外产生蛋白或基因治疗。表达G-CSF的细胞
本发明的同源重组细胞以所需的水平表达G-CSF，并可用于体外产生G-CSF和基因治疗。产生蛋白
按照本发明的同源重组细胞可以用于体外生产G-CSF。将所述细胞保持在本领域描述的导致蛋白表达的条件下。可以由细胞裂解物或细胞上清液中纯化所述G-CSF蛋白。可以通过本领域已知的常规药物途径(例如口服、静脉内、肌内、鼻内、肺、经粘膜、皮内、经皮、直肠、鞘内、皮下、腹膜内或病灶内)，将包含所述G-CSF蛋白的药用组合物传递给人或动物。口服可能需要采取保护蛋白以免在胃肠道降解的措施：例如包囊在聚合的微囊中。基因治疗
本发明的同源重组细胞可用作同源重组细胞系群、同源重组原代或继代细胞群、同源重组克隆细胞株或细胞系、同源重组异源细胞株或细胞系以及细胞混合物，在该混合物中至少存在一种代表前述四类同源重组细胞之一的细胞。这些细胞可在传递体系中用于刺激造血祖细胞的增生和分化，或用于可用G-CSF治疗的任何其它病症。例如，所述细胞可用于预防化学疗法造成的中性粒细胞减少症；治疗正在进行或已经经过脊骨髓移植的患者；或治疗慢性特发性和先天性中性白细胞减少的失调。
将同源重组原代细胞、克隆细胞株或异源细胞株以足够的量通过合适的途径，给予需要治疗或预防异常或不良症状的个体，以表达或产生生理学相关水平的蛋白或外源DNA。生理学相关水平接近体内通常产生所述产物的水平或为导致异常或不良症状改善的水平。如果所述细胞与具有免疫能力的受体同源，则所述细胞可以静脉内、动脉内、皮下、腹膜内、网膜内、肾被囊下(subrenal capsularly)、鞘内、颅内或肌内给予或植入。
如果所述细胞不同源而所述受体具有免疫能力，则可以将要给予的所述同源重组细胞封入一个或多个半透性屏障装置中。所述装置的渗透性特性使得在将所述细胞植入到受治疗者中时防止其离开所述装置，但治疗性蛋白可以自由透过，并可以离开所述屏障装置进入植入体附近的局部区域或进入体循环。参见例如美国专利第5,641,670、5,470,731、5,620,883、5,487,737号和1999年4月16日提交的标题为“治疗性蛋白的传递”的共有美国专利中请(发明人：Justin C,Lamsa和Douglas A.Treco)，所有这些文献都通过引用结合到本文中。所述屏障装置可以在任何合适的位置植入：例如腹膜内、鞘内、皮下、肌内、肾被囊内或网膜内。
屏障装置特别有用，使得可以植入同源重组无限增殖化细胞、来自其它物种的同源重组细胞(同源重组异种细胞)或来自非组织相容性匹配供体的细胞(同源重组同种异体细胞)来治疗患者。所述装置将细胞保留在体内的固定位置，同时保护所述细胞免受宿主免疫系统的排斥。当治疗方案由于任一原因要停止时，屏障装置还通过使所述细胞立即去除，提供方便的短期(即瞬时)治疗。在没有用于短期基因治疗的屏障装置的情况下，也可以使用转染或感染的异种细胞和同种异体细胞。在此情况下，将在体内传递由所述细胞产生的G-CSF，直至宿主的免疫系统排斥所述细胞为止。
为此目的可以使用许多合成、半合成或天然的滤膜，包括但不限于纤维素、乙酸纤维素、硝化纤维、聚砜、聚偏二氟乙烯、聚氯乙烯聚合物和聚氯乙烯衍生物的聚合物。可以使用屏障装置，以使得来自其它物种的原代、继代或无限增殖化细胞用于人类的基因治疗。
用于本发明的基因治疗的另一类装置是其中包埋所述细胞的可植入的胶原基质。在WO 97/15195中描述了这种可以包含将所述细胞附着于微珠上的装置，该文献通过引用结合到本文中。
给予剂量或植入所需要的细胞的数量取决于几种因素，包括所述蛋白的表达水平、宿主动物的大小和病症以及与植入方法相关的限制。通常在成年人或其它类似大小的动物中植入的细胞的数量在1×104至5×1010的范围内，最好为1×108至1×109。如果需要，它们可以在患者的多个部位同时或者在几个月或几年的时间内植入。所述给予可以根据需要重复。
                     其它实施方案
应当理解，虽然已经描述了本发明及其详述，但先前的描述意在说明，并不限制由所附权利要求书的范围确立的本发明的范围。
其它方面、优势和修改在以下权利要求书的范围内。
 序列表<110>   Transkaryotic Therapies Inc.<120>   用于产生和传递蛋白的基因组序列<130>   07236/017WO1<150>   US 60/084,648<151>   1998年5月7日<160>   8<170>   FastSEQ for Windows, 版本3.0<210>   1<211>   6679<212>   DNA<213>   Homo sapiens<400>   1gtcgacctgc aggtcaacgg atcacttgag gacagtagtt caagaccagc ctgggcagca    60tagggagact gtctctacga aaaatcaaaa aattatggcc gggcatggtg gctcacgtct    120gtaatccctg aactttggga catcaaggca agtggatcac ttgaggtcag gagttcgaga    180ctagcctggc caacatggtg aaaccctatc tccactaaaa aatacaaaaa ttagccaggc    240atggtggcag gcacctgtaa tcccggctac tcaggaggct gaggcaggag aatcacttga    300acccaggagg cggaggttgc agtgagctga gatcacacca ctgcactcca gcctgggtga    360cagagcaaga ctctatctca aaaaaaataa aaaaataaaa aaattagcca ggcatggtag    420tgcacacctc tagtctcagc tactcaggag gctgaggtgg gaggatcact tgaacctggg    480gcagtcaagg ctacagtgag ccaagatcat gccactacac tccagcctgg gcaacagaga    540gagaccctgt ctctaaaaaa ataataataa taaagaaaaa aaaagctctg tttatgtctc    600ctggtccata catactacta tgtatatagt ttgcaaactc aaagatccag atagtcaatt    660ttttaggctt gtgggccgta tggtctctgt cacaatcact ctgccctgtc tttctagcac    720aaaagcagct ataaacaata catacatgaa ttttttatag acatcgagat ttgaatttca    780tatgattttt acattttata aaataatctt tttaaaaatt ttcccctaac catttaaaag    840tgtaaaagcc ggccagcgcg ccatcgtcac gcctgtaatt ccagcacttt gggaggctga    900ggtgggcaga tcacttgaga tcaacagttc gagaccagcc tggccaacat agcaaaaccc    960catttctact aaaaataaaa aaattagctg ggcatagtgg tgcacacctg tgatcccagc    1020tacttgggag gctgaggcag gagaatcgct tgaacctggg aagcggaggt tgcagtgagc    1080caacatcatg ccactgcact ccagcctggg tgacagagtg agacttcgtc tcaacgaaaa    1140aaaaaagtgt aaaagccatt cctaattcag tgtacatcag tgtacatact caggtctgcg    1200tactcctgct ctgaggcata cctgagaagt agagttgctt ggtcacagga catacacatt    1260tccacattaa ctagacacta ccaagttgcc atccaagga9 gttttttttt tacaatctac    1320actcccccca gcaacaaatg agagttactc cagatccttt acaaagatgc tctaagccca    1380gtaccagatg aaaacaggaa gtgggagggg aagctgccag ccccttctaa ccatgaagaa    1440atacctggta 9agccttctg gatgctggaa ggatgaataa cgggggtctc tggagcctgc    1500cccctgtcag atcactgtga cttctgagcc tccagtccag tctcagcccc atgtgtcatg    1560gccagtgata atgagccctc actctctgtt tggtctttat tctccccatg tggggctgaa    1620gtctggattg agccgttatt caagatgtac agctttcttg acaggaaagt agtgtcacag    1680aaacagcagg ggcttggcaa gatgatctaa ctgcaaatcc tacctggctc agccaccagc    1740tagttctgtg atcttgaaca agttttttca cttctctgag gccatccctt ggctacaaca    1800caccagttgg ttgacaggat gaaatgacga agtcccttac acctgtaatc ccagcacttt    1860gggaggccaa ggcgggtgga tggcttgagc ctgagaggtg acagcatgcc ggcagtcctc    1920acagccctcg ttcgctctcg gcgcctcctc tgcctgggct cccacttcgg tggcacttga    1980ggagcccttc agcccaccgc tgcactgtgg gagccccttt ctgggctggc caaggccaga    2040gccggctccc tcagcttgca gggaggtgtg gagggagagg ctcaagcagg aaccggggct    2100gcgcacggcg cttgagggcc agctggagtt ccgggtgggc gtgggcttgg cgggccccgc    2160actcggagca gcgggccagc cctgccaggc cccgggcaat gagaggctta gcacccgggc    2220cagcggctgc ggagggtgta ctgggtgccc cagcagtgcc agcccgccgg cgctgtgctc    2280gctcgatttc tcactgggcc ttagcagcct tcccgcgggg cagggctcgg gacctgcagc    2340ccgccatgcc tgagcctccc ctccatgggc tcctgtgcgg cccgagcctc cccgacgagc    2400accaccccct gctccacagc gcccagtccc atcgaccacg caagggctga gaagtgcggg    2460cgcacggcac cgggactggc aggcagctac ccctgcagcc ctggtgcgga atccactggg    2520tgaagctagc tgggctcctg agtctggtgg agactcggag aacctttatg tctagctcag    2580ggatcgtaaa tacaccaatc agcaccctgt gtctagctca gggtctgtga atgcaccaat    2640ccacactctg tatctagcta ctctgatggg gccttggaga acctttatgt ctagctcagg    2700gattgtaaat acaccaatcg gcactctgta tctagctcaa ggtttgtaaa cacaccaatc    2760agcaccctgt gtctagctca gggtatgtga atgcaccaat cgacagtctg tatctggcta    2820ctttcatggg catccgtgtg aagagaccac caaacaggct ttgtgtgagc aataaagctt    2880ctatcacctg ggtgcaggtg ggctgagtcc gaaaagagag tcagcgaagg gagataaggg    2940tggggccgtt ttataggatt tgggtaggta aaggaaaatt acagtcaaag ggggtttgtt    3000ctctggcggg caggagtggg gggtcgcaag gtgctcagtg ggggtgcttt ttgagccagg    3060atgagccagg aaaaggactt tcacaaggta atgtcatcaa ttaaggcaag gacccgccat    3120ttacacctct tttgtggtgg aatgtcatca gttaagttgg ggcagggcat attaacttct    3180tttgtgattc ttcagttact tcaggccatc tgggcgtata tgtgcaagtt acaggggatg    3240cgatggcttg gcttgggctc agaggcttga cagctactct ggtggggcct tggagaatgt    3300ttgtgtcgac actctgtatc tagttaatct agtggggacg tggagaacct ttgtgtctag    3360ctcagggatt gtaaacgcac caatcagcgc cctgtcaaaa cagaccactc ggctctacca    3420atcagcagga tgtgggtggg gccagataag agaataaaag caggctgccc gagccagcag    3480tggcaacgcg cacaggtccc tatccacaat atggcagctt tgttcttttg ctgtttgcga    3540taaatcttgc tactgctcgc tttttgggtc cacactgctt ttatgagctg taacactcac    3600cacgaaggtc tgcagcttca ctcctgaagc cactaagacc acgagcccac cgggaggaat    3660gaacaactcc ggccgcgctg ccttaagagc tataacactc accgcgaagg tctgcagctt    3720cactcctcag ccagcgagac cacgaaccca ccagaaggaa gaaactgcga acacatctga    3780acatcagaag gaacaaactc cagatgcacc accttaagag ctgtaacact cactgcgagg    3840gtccgcggct tccttcttga agtcagtgag accaagcact caccagtttc ggacacaagc    3900ccaggagttt gagatcagcc tgggcaacat gatgaaatgc cct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Claims (34)

1．DNA构成物，所述DNA构成物在同源重组整合到哺乳动物细胞的基因组中后，改变内源G-CSF基因在所述细胞中的表达所述构成物包括：(ⅰ)一个含有SEQ ID NO:5的至少20个连续核苷酸的导向序列和(ⅱ)一个转录调节序列。
2．权利要求1的所述DNA构成物，其中所述构成物还包括一个外显子和一个剪接供体位点。
3．权利要求2的所述DNA构成物，其中所述构成物还包括剪接供体位点下游的一个内含子和一个剪接受体位点。
4．权利要求1的所述DNA构成物，其中所述构成物还包括一个选择性标记基因。
5．权利要求1的所述DNA构成物，其中所述导向序列包含SEQ IDNO:5的至少50个连续核苷酸。
6．分离的核酸，包括SEQ ID NO:5的至少20个连续核苷酸或者其互补体，其中所述分离的核酸不编码全长G-CSF。
7．权利要求6的所述分离的核酸，其中所述分离的核酸包括SEQID NO:5的至少50个连续核苷酸或者其互补体。
8．权利要求6的所述分离的核酸，其中所述分离的核酸包括SEQID NO:5的至少100个连续核苷酸或者其互补体。
9．权利要求6的所述分离的核酸，其中所述分离的核酸包括SEQID NO:5的至少200个连续核苷酸或者其互补体。
10．权利要求6的所述分离的核酸，其中所述分离的核酸包括SEQID NO:5的至少500个连续核苷酸或者其互补体。
11．权利要求6的所述分离的核酸，其中所述分离的核酸包括SEQID NO:5的核苷酸1470至4723或者其互补体。
12．权利要求6的所述分离的核酸，其中所述分离的核酸包括SEQID NO:5或者其互补体。
13．分离的核酸，其包含的一条链包含的核苷酸序列(ⅰ)长度为至少100个核苷酸和(ⅱ)在高度严格杂交条件下与SEQ ID NO:5或者其互补体杂交。
14．权利要求13的所述分离的核酸，其中所述核苷酸序列的长度为至少200个核苷酸。
15．权利要求13的所述分离的核酸，其中所述核苷酸序列的长度为至少400个核苷酸。
16．权利要求13的所述分离的核酸，其中所述核苷酸序列的长度至少为1000个核苷酸。
17．分离的核酸，其包含的一条轻链所包含的核苷酸序列(ⅰ)长度为至少100个核苷酸和(ⅱ)与SEQ ID NO:5的等长片段的核苷酸序列有至少80％序列同一性。
18．权利要求17的所述分离的核酸，其中所述核苷酸序列的长度为至少200个核苷酸。
19．权利要求18的所述分离的核酸，其中所述核苷酸序列的长度为至少400个核苷酸。
20．权利要求18的所述分离的核酸，其中所述核苷酸序列的长度为至少1000个核苷酸。
21．用权利要求1的所述DNA构成物稳定地转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源G-CSF编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA已经经过同源重组。
22．用权利要求2的所述DNA构成物稳定地转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源G-CSF编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA已经经过同源重组。
23．用权利要求3的所述DNA构成物稳定地转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源G-CSF编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA已经经过同源重组。
24．用权利要求4的所述DNA构成物稳定地转染的同源重组细胞，所述DNA构成物与内源G-CSF编码序列的ATG起始密码子上游的基因组DNA已经经过同源重组。
25．一种在哺乳动物细胞中改变内源G-CSF基因表达的方法，所述方法包括
将权利要求1的所述DNA构成物引入所述细胞；
维持细胞在允许在所述构成物和与所述导向序列同源的基因组靶位点之间发生同源重组的条件下，产生同源重组细胞；和
在允许于转录调节序列的控制下表达所述G-CSF编码序列的条件下，维持所述同源重组细胞。
26．一种在哺乳动物细胞中改变内源G-CSF基因表达的方法，所述方法包括
将权利要求4的所述DNA构成物引入所述细胞；
维持细胞在允许在所述构成物和与导向序列同源的基因组靶位点之间发生同源重组的条件下，产生同源重组细胞；和
在允许于转录调节序列的控制下表达所述G-CSF编码序列的条件下，维持所述同源重细胞。
27．一种将G-CSF传递到动物的方法，包括
提供权利要求21的所述细胞，和
将所述细胞植入动物中，其中所述细胞分泌G-CSF。
28．一种将G-CSF传递到动物的方法，包括
提供权利要求22的所述细胞，和
将所述细胞植入动物中，其中所述细胞分泌G-CSF。
29．一种将G-CSF传递到动物的方法，包括
提供权利要求23的所述细胞，和
将所述细胞植入动物中，其中所述细胞分泌G-CSF。
30．一种将G-CSF传递到动物的方法，包括
提供权利要求24的所述细胞，和
将所述细胞植入动物中，其中所述细胞分泌G-CSF。
31．一种生产G-CSF的方法，包括
提供权利要求21的所述细胞，和
在允许所述细胞表达和分泌G-CSF条件下，体外培养所述细胞。
32．一种生产G-CSF的方法，包括
提供权利要求22的所述细胞，和
在允许所述细胞表达和分泌G-CSF条件下，体外培养所述细胞。
33．一种生产G-CSF的方法，包括
提供权利要求23的所述细胞，和
在允许所述细胞表达和分泌G-CSF条件下，体外培养所述细胞。
34．一种生产G-CSF的方法，包括
提供权利要求24的所述细胞，和
在允许所述细胞表达和分泌G-CSF条件下，体外培养所述细胞。
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