KR20230145148A - 망막 질환에 대한 유전자 요법 - Google Patents
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Abstract
바이러스 벡터는 트랜스진 작제물을 포함한다. 일부 구현예에서, 트랜스진 작제물은 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열이다. 다른 구현예에서, 트랜스진 작제물은 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트이다.
Description
관련 출원에 대한 상호 참조
본 출원은 2021년 2월 12일에 출원된 가출원 제63/149,122호를 우선권으로 주장하고 이의 정식 출원이며, 이는 그 전문이 본원에 참조로서 포함된다.
서열 목록의 제출
[0001] 110 킬로바이트 크기(MS-Windows에서 측정)이고 2022년 2월 11일에 생성된 Sequence_Listing으로 명명된 파일을 포함하는 서열 목록이 본원에 제공되고, 그 전체가 참조로서 포함된다.
분야
[0002] 본 개시는 어셔 증후군(Usher syndrome) 타입 II A, 어셔 증후군 타입 2C, 색소성 망막염 39(retinitis pigmentosa 39), 색소성 망막염 25, 바그너 증후군(Wagner syndrome), 또는 연령 관련 황반 변성(age related macular degeneration)을 치료하기 위한 유전자 요법에 관한 것이다.
[0003] 어셔 증후군 타입 2는 복합 실명 및 난청의 주요 원인이다. 색소성 망막염(RP)은 유전성 실명의 주요 원인이다. 어셔 증후군 2A(Ush2A) 돌연변이는 색소성 망막염 사례의 대략 20%를 일으키는 것으로 추정되고, 단일의 가장 큰 원인일 수 있다. 증후군 어셔 2A 증후군은 어린 나이(early age)에 청력 상실을 수반하며, 청년 내지 중년에 시각 상실이 발생한다. 비증후군성 실명은 Ush2A 돌연변이에 의해 유발될 수 있으며, 여기서, 청력은 정상이지만 시력 저하가 여전히 발생한다.
[0004] 어셔 증후군 타입 2C(Ush2C), RP 39, RP 25, 바그너 증후군, 및 연령 관련 황반 변성을 유발하는 헤미센틴 돌연변이는 마찬가지로 광수용기 세포 손실을 수반하지만, 어셔 타입 2A보다 훨씬 더 드문 질환이다. 그러나, 이러한 모든 질환은 시력 상실을 초래하고, 아데노-관련 바이러스를 사용한 통상적인 유전자 요법에 너무 큰 유전자의 돌연변이를 수반한다.
[0005] 바이러스 유전자 요법 벡터는 X-연관 형태의 중증 복합 면역 결핍증의 치료에서 이들의 첫 번째 주요 임상적 성공을 발견하였다. 레트로바이러스 벡터는 장기 면역 재구성을 달성했지만, 대상체의 30%에서 생명을 위협하는 급성 림프 백혈병을 야기하였다. 아데노-관련 바이러스(AAV)와 같은 다른 벡터 시스템은 제한된 능력을 갖고 간세포 암종의 발달과 관련이 있음에도 불구하고 최근 몇 년 동안 발전하였다. 렌티바이러스 벡터의 염색체 통합은 지속적인 트랜스진 발현을 가능하게 하지만, 삽입 돌연변이유발을 야기할 수 있다. 아데노바이러스 벡터(Ad 벡터)는 분열 세포 및 비분열 세포 둘 모두를 형질도입하여, 빠르고 효율적인 트랜스진 발현을 유도한다. 이들의 첫 번째 반복에서, Ad 벡터는 유도된 및 기존의 면역 반응에 의해 방해를 받았다. 면역 및 염증 반응을 최소화하기 위해, 모든 내인성 Ad 유전자는 완전히 결실된(fd) Ad 벡터를 생성하기 위해 Ad 벡터로부터 절단될(gutted) 필요가 있었다. 캡시드 변형 및 항염증성은 또한 Ad-관련 염증을 감소시켰고, 유전자 요법 접근법이 가능하게 되었다.
[0006] Ush2A 돌연변이에 의해 유발된 어셔 타입 2 증후군에 대한 유전자 요법 접근법은 영향을 받은 엑손(ProQR의 QR-421a)을 스키핑하기 위해 RNA 스플라이싱을 변경하는 것 또는 돌연변이를 해결하기 위해 CRISPR/Cas9 편집을 사용하는 것을 포함하는 것으로 제안되었다. 이러한 접근법은 각각의 개별 돌연변이 또는 돌연변이 영역에 맞춤화된 치료를 필요로 할 것이다. 2018년 현재, UMD-USHbase는 실명과 관련된 Ush2A에서 3083개의 돌연변이를 나열하였다. 가장 흔한 돌연변이는 병원성 돌연변이의 단지 38%를 차지한다. 전체 유전자의 정상 복사체(copy)를 공급하는 것은 모든 Ush2A 돌연변이를 잠재적으로 해결할 수 있는 기성(off-the-shelf) 솔루션일 것이다. 추가적으로, 생체내 CRISPR 편집의 잠재적인 부작용은 암 및 증가된 광수용기 사멸을 포함한다. 이러한 부작용은 유전자의 에피솜 복사체로 피할 수 있다. 유사하게, Ush2C, RP39, RP25, 연령 관련 황반 변성을 유발하는 헤미센틴 돌연변이 및 바그너 증후군은 수천 개의 개별 솔루션을 맞춤화할 필요 없이 각 유전자에 대한 하나의 유전자 요법 접근법으로 해결될 수 있다.
[0007] 추가적으로, 망막 유전자 요법은 유전자의 게놈 복사체에서의 돌연변이의 우세한 부정적인 효과, 망막 기능에 중요한 유전자의 큰 비코딩 영역의 결실로 인해 게놈 편집 접근법을 취하거나 다른 문제를 해결하기 위해 보상 유전자 작제물을 첨가하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 경우에, 5 kb 아데노-관련 바이러스(AAV)가 할 수 있는 것보다 긴 공여자/주형 서열을 사용하여 상동성-독립적 표적화된 통합(HITI) 또는 상동성 재조합(HR)을 사용하여 문제를 해결하는 것이 중요할 수 있다. 아데노바이러스는 최대 30 kb 길이의 주형을 제공할 수 있고, 추가적으로 동일한 벡터에서 CRISPR 편집에 필요한 기구에 맞을 수 있어, 치료 효율을 증가시킨다.
[0008] 또한, Ush2A의 경우에 중요한 전사체의 유전자 길이는 대략 15,000(15 kb)개의 염기쌍이다. AAV의 최대 용량은 대략 4,000개의 염기쌍이다. 렌티바이러스는 또 다른 일반적인 유전자 요법 벡터이지만(게놈 통합의 안전성 문제에도 불구하고) 최대 10,000개의 염기쌍을 갖는다.
[0009] 일 구현예에서, 본 개시는 바이러스 벡터를 제공한다. 본 개시의 구현예에 따르면, 바이러스 벡터는 트랜스진 작제물을 포함하며, 여기서 트랜스진 작제물은 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열, 및 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트 중 하나이다.
[0010] 일 구현예에서, 벡터는 ITR 서열을 제외하고 내인성 유전자가 완전히 결실된다. 또 다른 구현예에서, 벡터는 카고 서열에 대해 최대 10 kb의 공간을 구성하기에 충분한 내인성 아데노바이러스 유전자가 결실된다. 추가 구현예에서, 바이러스 벡터는 완전히 또는 부분적으로 절단된 미미바이러스(mimivirus)이다.
[0011] 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 완전히 또는 부분적으로 절단된 아데노바이러스이다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 타입 5를 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화된다. 추가 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 타입 6을 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화된다. 또 다른 추가 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스를 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화되고 캡시드 단백질로부터 RGD 서열을 제거하도록 변형된다. 또 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 패밀리 A-G의 아데노바이러스를 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화된다. 추가의 구현예에서, 트랜스진 작제물은 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열이다.
[0012] 일 구현예에서, 프로모터 요소는 인간 로돕신 키나제 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, 프로모터 요소는 인간 로돕신 키나제 프로모터이다. 추가 구현예에 따르면, 프로모터 요소는 마우스 로돕신 키나제 프로모터이다. 추가 구현예에서, 프로모터 요소는 유비쿼터스 CMV 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, 프로모터 요소는 어셔린 유전자의 천연 프로모터를 함유하는 어셔린 유전자의 업스트림 비-코딩 서열이다. 또 다른 구현예에서, 프로모터 요소는 합성 a 트랜스듀신 알파-서브유닛 프로모터이다. 추가의 구현예에서, 프로모터 요소는 광수용기간 레티노이드-결합 단백질 프로모터 및 인간 트랜스듀신 알파-서브유닛 프로모터의 최소 서열이다. 추가의 구현예에서, 프로모터 요소는 화학적으로 제어된 tet 유도성 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, 프로모터 요소는 화학적으로 억제된 프로모터이다. 또 다른 구현예에서, 프로모터 요소는 인간 L-옵신 프로모터이다. 추가 구현예에서, 프로모터 요소는 인간 레티노스키신 근위 프로모터 및 인간 광수용기간 레티노이드-결합 단백질 인핸서이다. 추가의 구현예에서, 프로모터 요소는 광수용기에 특이적이다.
[0013] 일 구현예에서, 트랜스진 작제물은 Ush2A로 번역되는 뉴클레오타이드 서열이다. 또 다른 구현예에서, 트랜스진 작제물은 ADGV1로 번역되는 뉴클레오타이드 서열이다. 추가 구현예에서, 트랜스진 작제물은 아이즈 셧(eyes shut) 상동체로 번역되는 뉴클레오타이드 서열이다. 또 다른 구현예에서, 트랜스진 작제물은 헤미센틴으로 번역되는 뉴클레오타이드 서열이다. 추가의 구현예에서, 트랜스진 작제물은 베르시칸으로 번역되는 뉴클레오타이드 서열이다.
[0014] 일 구현예에서, 트랜스진 작제물은 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트이다. 일 구현예에서, DNA 세그먼트는 적어도 Ush2A 유전자의 세그먼트이다. 또 다른 구현예에서, DNA 세그먼트는 적어도 ADGV1 유전자의 세그먼트이다. 또 다른 구현예에서, DNA 세그먼트는 적어도 아이즈 셧 상동체 유전자의 세그먼트이다. 추가의 구현예에서, DNA 세그먼트는 적어도 헤미센틴 유전자의 세그먼트이다. 또 다른 구현예에서, DNA 세그먼트는 적어도 베르시칸 유전자의 세그먼트이다.
[0015] 일 구현예에서, 트랜스진 작제물은 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트이다.
[0016] 일 구현예에서, 본 개시는 조성물을 제공한다. 본 개시의 구현예에 따르면, 조성물은 바이러스 벡터 및 패킹 플라스미드를 포함하며, 바이러스 벡터는 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열, 및 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트로부터 선택되는 트랜스진 작제물을 함유한다.
[0017] 일 구현예에서, 본 개시는 망막 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 본 개시의 구현예에 따르면, 망막 질환을 치료하는 방법은 트랜스진 작제물을 포함하는 바이러스 벡터를 제공하는 단계를 포함하며, 여기서 트랜스진 작제물은 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열, 및 (b) 10 kb 초과의 망막 유전자의 DNA 세그먼트 중 하나이다.
[0018] 일 구현예에서, 망막 질환은 어셔 증후군 타입 II A, 어셔 증후군 타입 2C, 색소성 망막염 39, 색소성 망막염 25, 바그너 증후군, 및 연령 관련 황반 변성으로 구성되는 군으로부터 선택된다.
서열 목록의 간단한 설명
[0019] SEQ ID NO. 1은 USH2A에 대한 DNA 서열을 보여준다.
[0020] SEQ ID NO. 2는 CMV 프로모터 뒤의 USH2A에 대한 DNA 서열을 보여준다.
[0021] SEQ ID NO. 3: 로돕신 키나제 프로모터 뒤의 USH2A에 대한 DNA 서열을 보여준다.
[0022] 도 1은 아데노바이러스 벡터의 성분을 예시한다. 특히, 도 1A는 본 개시의 구현예에 따른 벡터 게놈 모델의 설계를 예시하며, 도 1B는 본 개시의 구현예에 따른 pPaC 패키징 발현 플라스미드의 설계를 예시하며, 도 1C는 본 개시의 구현예에 따른 숙주 세포 내에 공동-트랜스펙션에 의한 벡터 캡시드화를 예시하며, 도 1D는 본 개시의 구현예에 따른 패키징된 벡터의 방출을 예시한다.
[0023] 도 2는 본 개시의 구현예에 따른 혈우병 8 유전자 전달 벡터를 이용한 시험 세포의 형질도입을 예시한다.
[0024] 도 3은 특정 유전자 전사에 대해 시험하기 위한 마우스 망막 세포의 트랜스펙션을 예시한다.
[0025] 도 4는 (1) 강제 클로닝(forced cloning) 및 (2) 재조합공학에 의한 스터핑(stuffing)에 의한 USH2A 벡터의 작제화를 예시한다.
[0023] 도 2는 본 개시의 구현예에 따른 혈우병 8 유전자 전달 벡터를 이용한 시험 세포의 형질도입을 예시한다.
[0024] 도 3은 특정 유전자 전사에 대해 시험하기 위한 마우스 망막 세포의 트랜스펙션을 예시한다.
[0025] 도 4는 (1) 강제 클로닝(forced cloning) 및 (2) 재조합공학에 의한 스터핑(stuffing)에 의한 USH2A 벡터의 작제화를 예시한다.
[0026] 본 개시의 임의의 구현예가 상세하게 설명되기 전에, 본 개시는 이의 적용에서 하기 설명에 제시되거나 도면에 예시된 구성요소의 배열 및 구성의 세부사항으로 제한되지 않는 것으로 이해되어야 한다. 본 개시는 다른 구현예가 가능하고, 다양한 방식으로 실시되거나 수행될 수 있다. 또한, 본원에서 사용되는 어구 및 용어는 설명의 목적을 위한 것이며 제한하는 것으로 간주되어서는 안 되는 것으로 이해된다. 본원에서 "포함하는(including)", "포함하는(comprising)" 또는 "갖는(having)"의 사용 및 이들의 변형은 이후에 열거된 항목 및 이들의 등가물뿐만 아니라 추가 항목을 포함하는 것을 의미한다. 본원에서 "필수적으로 포함하는(including essentially)" 및 "필수적 요소로 하여 구성되는(consisting essentially of)" 및 이들의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목뿐만 아니라 등가물 및 추가 항목을 포함하는 것을 의미하며, 단, 이러한 등가물 및 추가 항목은 전체의 특성, 용도 또는 제조를 본질적으로 변경하지 않는다. 본원에서 "~로 구성되는(consisting of)" 및 이의 변형의 사용은 이후에 열거된 항목 및 이러한 항목만을 포함하는 것을 의미한다.
[0027] 도면을 참조하여, 유사한 번호는 전체에 걸쳐 유사한 요소를 지칭한다. 용어 제1, 제2 등은 다양한 요소, 성분, 영역, 및/또는 섹션을 기재하기 위해 본원에서 사용될 수 있지만, 이러한 요소, 성분, 영역 및/또는 섹션은 이러한 용어들에 의해 제한되어서는 안 된다는 것으로 이해될 것이다. 이러한 용어는 하나의 요소, 성분, 영역 및/또는 섹션을 다른 요소, 성분, 영역 및/또는 섹션과 구별하기 위해서만 사용된다. 따라서, 제1 요소, 성분, 영역 또는 섹션은 본 개시로부터 벗어남 없이 제2 요소, 성분, 영역 또는 섹션으로 언급될 수 있다.
[0028] 본 개시의 수치 범위는 근사치이고, 따라서 달리 명시되지 않는 한 범위 밖의 값을 포함할 수 있다. 수치 범위는 임의의 하한 값과 임의의 상한 값 사이에 적어도 2개의 단위의 분리가 존재하는 한, 하한 값 및 상한 값(달리 구체적으로 언급되지 않는 한)으로부터의 모든 값을 1 단위의 증분으로 포함한다. 예로서, 조성, 물리적 또는 다른 특성, 예컨대, 예를 들어, 중량 기준 성분의 양 등이 10 내지 100인 경우, 모든 개별 값, 예컨대, 10, 11, 12 등, 및 하위 범위, 예컨대, 10 내지 44, 55 내지 70, 97 내지 100 등이 명시적으로 열거되는 것으로 의도된다. 명시적 값을 함유하는 범위(예를 들어, 1, 또는 2, 또는 3 내지 5, 또는 6, 또는 7의 범위)의 경우, 임의의 2개의 명시적 값 사이의 임의의 하위 범위가 포함된다(예를 들어, 범위 1 내지 7은 하위 범위 1 내지 2; 2 내지 6; 5 내지 7; 3 내지 7; 5 내지 6 등을 포함함). 1보다 작은 값을 함유하거나 1보다 큰 분수(예를 들어, 1.1, 1.5 등)를 함유하는 범위의 경우, 1 단위는 적절하게는 0.0001, 0.001, 0.01 또는 0.1인 것으로 간주된다. 10 미만의 한 자리 숫자를 포함하는 범위(예를 들어, 1 내지 5)의 경우, 1 단위는 통상적으로 0.1인 것으로 간주된다. 이들은 단지 구체적으로 의도된 것의 예이며, 열거된 최소 값과 최대 값 사이의 수치 값의 모든 가능한 조합은 본 개시에서 명시적으로 언급되는 것으로 간주되어야 한다.
[0029] "밑에", "아래", "낮은", "위", "높은" 등과 같은 공간 용어는 설명을 용이하게 하기 위해 도면에 예시된 바와 같은 다른 요소(들) 또는 특징(들)에 대한 하나의 요소 또는 특징의 관계를 기재하는 것으로 본원에서 사용될 수 있다. 공간적으로 상대적인 용어는 사용 또는 예시에서의 배향에 따라 상이한 배향을 포함하도록 의도되는 것으로 이해될 것이다. 예를 들어, 도면에서 디바이스가 뒤집힌 경우, 다른 요소 또는 특징의 "아래" 또는 "밑에"로서 기재된 요소는 다른 요소 또는 특징의 "위"로 배향될 것이다. 따라서, 예시적인 용어 "아래"는 위와 아래의 배향 둘 모두를 포함할 수 있다. 디바이스는 달리 배향될 수 있고(90°또는 다른 배향으로 회전됨), 본원에서 사용되는 공간적으로 상대적인 기술어가 이에 따라 해석될 수 있다.
[0030] 본원에서 사용되는 용어 "및/또는"은 관련된 열거된 항목 중 하나 이상의 임의의 및 모든 조합을 포함한다. 예를 들어, "A 및/또는 B"와 같은 어구에서 사용될 때, 어구 "및/또는"은 A 및 B 둘 모두; A 또는 B; A(단독); 및 B(단독)를 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 어구에서 사용되는 용어 "및/또는"은 "A, B 및 C"는 하기 구현예들 각각을 포함하는 것으로 의도된다: A, B 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A(단독); B(단독); 및 C(단독).
[0031] 달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 용어 및 과학 용어는 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본원에서 사용되는 명명법 및 하기에 기재되는 세포 배양, 분자 유전학, 및 핵산 화학 및 혼성화에서의 실험실 절차는 당 분야에 널리 공지되고 통상적으로 사용되는 것들이다. 표준 기술은 재조합 핵산 방법, 폴리뉴클레오타이드 합성, 및 미생물 배양 및 형질전환(예를 들어, 전기천공, 리포펙션)에 사용된다. 일반적으로, 효소 반응 및 정제 단계는 제조사의 사양에 따라 수행된다. 기술 및 절차는 일반적으로 당 분야의 통상적인 방법 및 다양한 일반적인 참고문헌에 따라 수행되며(일반적으로, 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2d ed. (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY] 참조, 이는 본원에 참조로서 포함됨), 이는 본 문헌 전반에 걸쳐 제공된다. 단위, 접두사, 및 기호는 이들의 SI 허용 형태로 표시될 수 있다. 달리 명시하지 않는 한, 핵산은 5'에서 3' 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록되고; 아미노산 서열은 각각 아미노에서 카복실 방향으로 왼쪽에서 오른쪽으로 기록된다. 아미노산은 본원에서 이들의 일반적으로 알려진 3 문자 기호에 의해 또는 IUPAC-IUB 생화학적 명명법 위원회에 의해 권장되는 1 문자 기호로 지칭될 수 있다. 마찬가지로, 뉴클레오타이드는 이들의 일반적으로 허용되는 단일 문자 코드로 지칭될 수 있다. 달리 제공되지 않는 한, 본원에서 사용되는 소프트웨어, 전기 및 전자 용어는 문헌[New IEEE Standard Dictionary of Electrical and Electronics Terms(5.sup.th edition, 1993)]에 정의된 바와 같다.
[0032] 본원에서 사용되는 용어 "아데노바이러스 벡터"는 아데노바이러스에 기반하고 유전 물질을 전달하는 데 사용되는 임의의 유전자 작제물 또는 바이러스 작제물을 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "결실된 아데노바이러스" 또는 "결실된 아데노바이러스 벡터"는 이로부터 결실된 하나 이상의 내인성 유전자 또는 유전자 단편을 갖는 임의의 및 모든 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 대조적으로, 본원에서 사용되는 용어 "완전히 결실된 아데노바이러스" 및 "완전히 결실된 아데노바이러스 벡터"는 내부 말단 반복부(ITR) 및 패키징 신호(ψ)를 제외한 모든 내인성 아데노바이러스 유전자 및 유전 물질이 결실된 임의의 및 모든 아데노바이러스 및 아데노바이러스 벡터를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아데노바이러스 벡터 게놈"은 아데노바이러스 벡터에서 발견되는 유전 물질을 포함한다.
[0033] 선택된 폴리펩타이드를 "인코딩하는" 서열 또는 "코딩 서열"은 적절한 조절 서열(또는 "제어 요소")의 제어 하에 놓일 때 생체내에서 폴리펩타이드로 전사되고(DNA의 경우) 번역되는(mRNA의 경우) 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5'(아미노) 말단에서 시작 코돈 및 3'(카복시) 말단에서 번역 종결 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치할 수 있다. 코딩 서열의 전사 및 번역은 통상적으로 전사 프로모터, 전사 인핸서 요소, 샤인 및 델라가모 서열, 전사 종결 신호, 폴리아데닐화 서열(번역 정지 코돈의 3'에 위치함), 번역 개시의 최적화를 위한 서열(코딩 서열의 5'에 위치함), 및 번역 종결 서열을 포함하지만 이로 제한되지 않는 "제어 요소"에 의해 조절된다.
[0034] 본원에서 사용되는 용어 "결실하다" 또는 "결실된"은 말소, 소거, 또는 제거를 의미한다.
[0035] 본원에서 사용되는 용어 "결실된 Ad(바이러스) 벡터" 및 "절단된-", "미니-", "결실된-", "델타" 또는 "유사-벡터"는 ITR을 갖는 선형 벡터 모듈을 지칭한다. 이러한 벡터는 또한 일부 구조적 및/또는 비구조적 유전자 서열 및/또는 하나 이상의 관심 유전자 또는 트랜스진을 코딩할 수 있다.
[0036] 용어 "발현"은 세포에서 내인성 유전자, 트랜스진 또는 코딩 영역의 전사 및/또는 번역을 지칭한다.
[0037] "유전자 전달 벡터", "GDV", "유전자 전달 벡터" 또는 "유전자 전달 비히클"은 본 개시의 패키징된 벡터 모듈을 포함하는 조성물이다.
[0038] 본원에서 사용되는 용어 "유전자 발현 작제물"은 프로모터, 적어도 관심 유전자의 단편, 및 폴리아데닐화 신호 서열을 지칭한다. 본 개시의 벡터 모듈은 유전자 발현 작제물을 포함할 수 있다.
[0039] 본원에서 사용되는 용어 "관심 유전자", "GOI" 및 "트랜스진"은 기능이 의학적 관심이고 천연 플라비바이러스 유전자가 아닐 수 있는 유전자를 코딩하는 유전자를 지칭한다. 관심 유전자는 RNA 또는 단백질 수준에서 이의 효과를 발휘하는 것일 수 있다. 관심 유전자의 예는 치료 유전자, 면역조절 유전자, 바이러스 유전자, 박테리아 유전자, 단백질 생산 유전자, 억제 RNA 또는 단백질, 및 조절 단백질을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[0040] "유전자 서열"은 뉴클레오타이드의 순서를 지칭한다. 유전자 서열은 조절될 수 있다. 유전자 발현의 조절은 (1) 유전자 구조에 대한 변경(부위-특이적 재조합효소(예를 들어, Cre-loxP 시스템에 기반한 Cre)는 프로모터와 유전자 사이에 삽입된 서열을 제거함으로써 유전자 발현을 활성화시킬 수 있음); (2) 유도(덮음) 또는 억제의 완화에 의한, 전사의 변화; (3) mRNA에 혼입된 특정 서열에 의한 또는 siRNA에 의한, mRNA 안정성의 변화; 및 (4) mRNA의 서열에 의한, 번역의 변화 중 하나에 의해 달성될 수 있다. 결실된 아데노바이러스는 또한 "고성능" 아데노바이러스로 지칭된다. 이러한 결실된 아데노바이러스는 최대 33kb의 유전자 서열을 수용할 수 있다.
[0041] 용어 "이종성"은 일반적으로 자연과 밀접하게 관련된 것으로 발견되지 않는 DNA 서열의 임의의 조합에 사용된다.
[0042] 용어 "상동성"은 한 쌍의 구조 또는 유전자들 사이에 공유 조상의 존재를 지칭한다.
[0043] "숙주 세포" 또는 "패키징 세포"는 바이러스 입자를 생산하기 위해 아데노바이러스 또는 아데노바이러스 벡터 게놈 또는 변형된 게놈을 패키징할 수 있는 세포이다. 이는 누락된 유전자 생성물 또는 이의 등가물을 제공하도록 조작될 수 있다. 따라서, 패키징 세포는 아데노바이러스 게놈을 아데노바이러스 입자에 패키징할 수 있다. 이러한 입자의 생산은 게놈이 복제되고 감염성 바이러스를 조립하는데 필요한 단백질이 생산되는 것을 필요로 한다. 입자는 또한 바이러스 입자의 성숙에 필요한 특정 단백질을 필요로 할 수 있다. 이러한 단백질은 벡터, 패키징 작제물에 의해 또는 패키징 세포에 의해 제공될 수 있다. 본 개시에 따른 패키징 세포주를 제조하는 데 사용될 수 있는 예시적인 숙주 세포(HC)는 A549, HeLa, MRC5, W138, CHO 세포, Vero 세포, 인간 배아 망막 세포, 또는 숙주 세포가 아데노바이러스의 성장을 허용하는 한 임의의 진핵 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 일부 숙주 세포주는 지방세포, 연골세포, 상피, 섬유모세포, 아교모세포종, 간세포, 각질세포, 백혈병, 림프모세포양, 단핵구, 대식세포, 근모세포, 및 뉴런을 포함한다. 다른 세포 타입은 일차 세포 배양물, 예를 들어, 인간 일차 전립선 세포, 인간 배아 망막 세포, 인간 줄기 세포로부터 유래된 세포를 포함하지만 이로 제한되지 않는다. 진핵생물 이배체 및 이수체 세포주는 본 개시의 범위 내에 포함된다. 패키징 세포는 재조합 바이러스 벡터의 고역가 스톡을 생성하기 위해 이러한 생성물에 대해 적절한 수준으로 본원에 기재된 상이한 작제물의 생성물을 발현시킬 수 있는 세포여야 한다.
[0044] "면역 반응"은 세포성 또는 체액성 면역 반응과 같은 후천성 면역 반응이다.
[0045] 본원에서 사용되는 용어 "도입하는" 또는 "트랜스펙션"은 숙주 세포로의 발현 벡터의 전달을 지칭한다. 벡터는 트랜스펙션(이는 통상적으로 물리적 수단(예를 들어, 칼슘 포스페이트 트랜스펙션, 전기천공, 미세주입 또는 리포펙션)에 의해 이종성 DNA 또는 RNA의 세포 내로의 삽입을 의미함); 감염(이는 통상적으로 감염원, 즉, 바이러스에 의한 도입을 지칭함); 또는 형질도입(transduction)(이는 통상적으로 바이러스에 의한 세포의 안정적인 감염 또는 바이러스 제제(예를 들어, 박테리오파지)를 통해 한 미생물에서 다른 미생물로의 유전 물질의 전달을 의미함)에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 바이러스 또는 다른 비히클일 수 있다.
[0046] 용어 "패키징 작제물" 또는 "패키징 발현 플라스미드"는 원형의 이중-가닥 DNA 분자의 조작된 플라스미드 작제물을 지칭하며, 여기서 DNA 분자는 프로모터의 제어 하에 있는 아데노바이러스 구조 또는 비구조 유전자의 적어도 서브세트를 포함한다. "패키징 작제물"은 독립적인 바이러스 복제가 감염, 바이러스 입자 및/또는 바이러스 입자로 패키징되는 이러한 유전 물질의 효율적인 패키징을 가능하게 하는 하나 초과의 ITR 또는 유전 정보를 포함하지 않는다.
[0047] 본원에서 사용되는 용어 "플라스미드"는 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있는, 염색체 DNA로부터 분리된 염색체외 DNA 분자를 지칭한다. 많은 경우에, 이는 원형이고 이중 가닥이다.
[0048] 용어 "프로모터"는 특정 유전자의 전사를 촉진하는 DNA의 조절 영역을 의미한다. 프로모터는 일반적으로 특정 코딩 서열에 대한 적절한 전사 개시 부위에서 RNA 합성을 개시하도록 RNA 폴리머라제 II를 지시할 수 있는 TATA 박스를 포함한다. 프로모터는 전사 개시 속도에 영향을 미치는, 업스트림 프로모터 요소로 지칭되는, 일반적으로 TATA 박스의 업스트림 또는 5'에 위치하는 다른 인식 서열을 추가로 포함할 수 있다.
[0049] 용어 "트랜스펙션"은 DNA 또는 RNA로서 세포 유전 물질로의 도입(예를 들어, 본 개시의 단리된 핵산 분자 또는 작제물의 도입)를 지칭한다. 본원에서 사용되는 용어 "형질도입"은 본 개시의 DNA로서 또는 GDV에 의한 세포 DNA로의 도입을 지칭한다. 본 개시의 GDV는 표적 세포로 형질도입될 수 있다.
[0050] 용어 "벡터"는 숙주 세포의 감염에 사용되며 폴리뉴클레오타이드가 삽입될 수 있는 핵산을 지칭한다. 벡터는 흔히 레플리콘이다. 발현 벡터는 내부에 삽입된 핵산의 전사를 가능하게 한다. 일부 공통 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스, 파지, 재조합 발현 카세트, 및 트랜스포존을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다. 용어 "벡터"는 또한 한 위치에서 다른 위치로 유전자의 전달을 돕는 요소를 지칭할 수 있다.
[0051] 용어 "벡터 모듈"은 아데노바이러스 비리온에 패키징된 아데노바이러스 유전자 조성물을 지칭한다.
[0052] 본 개시의 구현예에 따르면, 아데노바이러스 벡터가 제공된다. 아데노바이러스 벡터는 DNA 세그먼트 또는 DNA 서열인 트랜스진 작제물을 포함한다. 일 구현예에서, 아데노바이러스 벡터는 캡시드에 함유된다. 일 구현예에서, 캡시드는 어셔 증후군 타입 II A, 어셔 증후군 타입 2C, 색소성 망막염 39, 색소성 망막염 25, 바그너 증후군, 또는 연령 관련 황반 변성의 치료에서, 또는 돌연변이에 의한 Ush2A, ADGRV1, 아이즈 셧 동족체, 헤미센틴, 또는 베르시칸(VCAN)의 손실에 의해 유발된 망막 광수용기 변성의 예방에서 유전자 요법으로서 제공된다.
바이러스 벡터
[0053] 본 개시의 벡터는 아데노바이러스 및 미미바이러스로 구성되는 군으로부터 선택된 바이러스에 기반한다. 바람직하게는, 바이러스 벡터는 아데노바이러스에 기반한다. 본 개시내용에서 사용되는 바이러스 벡터는 헬퍼 바이러스의 부재 하에 패키징된, 완전히 결실된 (fd) 바이러스, 및 더욱 특히, fd 아데노바이러스로서 설계된다. 바이러스 벡터는 캡시드의 2개의 독립적으로 변형 가능한 성분 중 하나이며, 다른 하나는 원형 패키징 발현 플라스미드이다.
[0054] 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 Ad 벡터이다.
[0055] 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 완전히 결실되고 헬퍼 바이러스가 없는 Ad 벡터이다.
[0056] 일 구현예에서, 아데노바이러스 벡터(70), 바람직하게는 fd 아데노바이러스 벡터는 도 1에 도시된 바와 같이, 유전자 작제물을 수용할 수 있고, 역 말단 반복 서열(ITR)(72, 72) 및 패키징 신호(ψ)(73)를 전달할 수 있다. 결실된 내인성 유전자는 크기-보상 스터퍼(size-compensating stuffer)(75)로 대체된다. 도시된 구현예에서, 이러한 스터퍼(75)는 인간 유전자 5-아미노이미다졸-4-카복사미드 리보뉴클레오타이드 포르밀트랜스퍼라제 유전자(ATIC)의 단편으로부터 제조된다. 추가 구현예에서, 비제한적으로 인간 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제와 같은 다른 스터퍼 서열이 사용될 수 있다.
[0057] fd 염기 벡터 게놈 모듈은 상이한 길이의 트랜스진 작제물(76)에 대해 조작된다. 일부 구현예에서, fd 염기 벡터 게놈 모듈은 1 kb, 또는 5 kb, 또는 10 kb, 또는 30 kb, 또는 25 kb, 또는 30 kb, 또는 35 kb, 및 바람직하게는, 10 kb, 또는 10 kb 초과, 또는 12 kb, 또는 15 kb, 또는 18 kb, 또는 20 kb 내지 22 kb, 또는 25 kb, 또는 28 kb, 또는 30 kb, 또는 32 kb, 또는 35 kb 미만의 트랜스진 작제물에 대해 조작된다.
[0058] 일 구현예에서, 트랜스진 작제물(76)은 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열이다.
[0059] 일 구현예에서, 프로모터는 광수용기에 특이적이다. 광수용기 특이적 프로모터의 비제한적인 예는 인간 로돕신 키나제 프로모터, 마우스 로돕신 키나제 프로모터, 유비쿼터스 CMV 프로모터, 유비쿼터스 CAG 프로모터, 어셔린 유전자의 천연 프로모터를 함유한 어셔린 유전자의 업스트림 비-코딩 서열, 합성 a 형질도입 알파-서브유닛 프로모터, 광수용기간 레티노이드-결합 단백질 프로모터, 인간 트랜스듀신 알파-서브유닛 프로모터의 최소 서열, 화학적으로 제어된 tet 유도성 프로모터, 인간 L-옵신 프로모터, 레티노스키신 근위 프로모터, 인간 광수용기간 레티노이드-빈딘 단백질 인핸서, 및 이들의 조합을 포함하지만, 이로 제한되지 않는다.
[0060] 특정 구현예에서, 프로모터는 인간 로돕신 키나제 프로모터, 마우스 로돕신 키나제 프로모터, 유비쿼터스 CMV 프로모터, 유비쿼터스 CAG 프로모터, 어셔린 유전자의 천연 프로모터를 함유하는 어셔린 유전자의 업스트림 비-코딩 서열, 합성 a 트랜스듀신 알파-서브유닛 프로모터, 광수용기간 레티노이드-결합 단백질 프로모터 및 인간 트랜스듀신 알파-서브유닛 프로모터의 최소 서열, 화학적으로 억제된 프로모터, 인간 L-옵신 프로모터, 및 인간 레티노스키신 근위 프로모터 및 인간 광수용기간 레티노이드 결합 단백질 인핸서로 구성되는 군으로부터 선택된다.
[0061] 일 구현예에서, 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임은 뉴클레오타이드 서열이다. 일 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 광수용기 특이적 단백질로 번역된다. 뉴클레오타이드 서열의 비제한적인 예는 Ush2A, ADGV1, 아이즈 셧 동족체, 헤미센틴, 베르시칸, 및 이들의 조합으로부터 선택된 유전자에 의해 인코딩된 단백질로 번역되는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일 구현예에서, 뉴클레오타이드 서열은 Ush2A, ADGV1, 아이즈 셧 상동체, 헤미센틴, 및 베르시칸으로 구성되는 군으로부터 선택된 유전자에 의해 인코딩된 단백질로 번역된다.
[0062] 일 구현예에서, 트랜스진 작제물은 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트이다. 10 kb보다 긴 망막 유전자의 적합한 DNA 세그먼트의 비제한적인 예는 Ush2A 유전자의 게놈 서열, ADGV1 유전자의 게놈 서열, 아이즈 셧 상동체 유전자의 게놈 서열, 헤미센틴 유전자의 게놈 서열, 베르시칸 유전자의 게놈 서열, 및 이들의 조합을 포함한다.
[0063] 상이한 트랜스진 발현 카세트는 fd 염기 게놈 벡터 모듈로 성공적으로 이동되었다. Ad 벡터 게놈의 에피솜 위치로 인해, 세포 게놈으로의 재조합은 예상되지 않았고 관찰된 적이 없다.
패킹 플라스미드
[0064] 일 구현예에서, 바이러스 벡터에는 패킹 플라스미드가 제공된다.
[0065] 원형 패키징 발현 플라스미드(pPac)는 도 1에 도시된 바와 같이 초기 유전자 E2 및 E4와 함께 후기 유전자(LI, L2, L3, L4, L5)를 트랜스(in trans)로 제공하도록 개발된다. LITR, 패키징 신호(ψ), 초기 유전자 E1, E3 및 단백질 IX 유전자는 원형 pPac에 존재하지 않는다.
[0066] 일 구현예에서, 상이한 패키징 플라스미드는 벡터 모듈을 상이한 혈청형, 예컨대, Ad2(pPaC2), Ad5(pPaC5), Ad6(pPaC6), Ad4(pPaE4) 및 Ad35(pPaB35)의 캡시드로 캡슐화한다.
트랜스펙션
[0067] 일 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패킹 플라스미드는 패키징 세포로 트랜스펙션된다.
[0068] 일 구현예에서, 패키징 세포는 하나 이상의 바이러스 벡터 및 하나 이상의 플라스미드를 함유할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 패키징 세포는 적어도 하나, 바람직하게는 2개 이상, 및 더욱 바람직하게는 3개 이상의 바이러스 벡터 및 하나의 패킹 플라스미드를 포함한다.
[0069] 여전히 도 1을 참조하면, 바이러스 벡터(70) 및 플라스미드(82)는 공동 트랜스펙션을 통해 진핵 숙주 세포 또는 패키징 세포(85)로 도입된다. 도시된 특정 구현예에서, 바이러스 벡터(70) 및 플라스미드(82)는 최적화된 표준화된 1주 공동-트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 패키징 세포(85) 내로 공동-트랜스펙션된다.
[0070] 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스 벡터, 특히 fd 아데노바이러스 벡터이고, 패키징 세포는 비제한적으로 인간 배아 신장 세포(HEK293) 및 PerC.6 세포와 같은 세포주로부터 유래된다. fd 아데노바이러스 벡터를 패키징하는데 필요한 패키징 세포는 아데노바이러스 벡터의 E1 영역 내에 코딩된 유전자를 발현하도록 변형되어야 한다. 특정 구현예에서, 패키징 세포는 아데노바이러스 벡터의 E1 영역 내에 코딩된 유전자를 발현하도록 변형된 HEK293-유래 Q7 패키징 세포이다.
[0071] 캡시드
[0072] 본 개시의 구현예에 따르면, 도 1에 도시된 바와 같이, 바이러스 벡터(70) 및 플라스미드(82)를 함유하는 패킹 세포(85)가 캡시드화된다.
[0073] 바이러스 벡터(70) 및 플라스미드(82)를 함유하는 패키징 세포(85)는 아데노바이러스 또는 미미바이러스의 혈청형의 캡시드로 전달된다. 일 구현예에서, 캡시드는 아데노바이러스에 기반하고 캡시드 단백질로부터 RGD 서열을 제거하도록 변형된다. 일 구현예에서, 캡시드는 아데노바이러스 패밀리 A-G에 기반한다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스의 Ad2, Ad5, Ad6 및 Ad35 혈청형의 캡시드, 및 이들의 조합으로 전달된다. 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 Ad6 혈청형의 캡시드로 전달된다.
[0074] 제공된 구현예에서, fd 벡터 게놈 모듈은 벡터 게놈 모듈 및 패키징 발현 플라스미드의 표준화된 공동-트랜스펙션 프로토콜에 의해 캡시드화된다. 현재 기술은 세포 당 2,000개의 패키지 바이러스 게놈을 제공하며, 기술 발전은 미래에 생산 효율을 증가시킬 수 있다. 이후, 패키지 벡터는 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제된다.
망막 질환의 치료
[0075] 일 구현예에서, 바이러스 벡터는 유전적 돌연변이에 의해 유발된 망막 질환의 치료를 위해 제공된다. 바이러스 벡터는 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합에 따를 수 있다. 추가 구현예에서, 바이러스 벡터는 적어도 하나의 바이러스 벡터 및 적어도 하나의 패킹 플라스미드를 포함하는 조성물로서 제공된다. 또 다른 구현예에서, 패키징 세포가 제공되며, 여기서 패키징 세포는 적어도 하나의 바이러스 벡터 및 적어도 패킹 플라스미드를 함유한다. 추가의 구현예에서, 캡시드가 제공되며, 여기서 캡시드는 적어도 하나의 바이러스 벡터 및, 바람직하게는 적어도 하나의 패킹 플라스미드를 함유한다. 바이러스 벡터, 패킹 플라스미드, 및 패키징 세포는 본원에 기재된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합에 따를 수 있다. 추가 구현예에서, 바이러스 벡터 및 패킹 플라스미드를 함유하는 패키징 세포는 캡시드에 캡시드화된다.
[0076] 일 구현예에서, 바이러스 벡터, 조성물, 패키징 세포 및/또는 캡시드는 대상체의 눈, 바람직하게는 포유동물 대상체, 및 더욱 바람직하게는 인간 대상체에 주사된다. 바이러스 벡터는 망막하 또는 유리체내로 눈에 주사되어 광수용기를 감염시켜, 이들이 트랜스진 작제물이 인코딩하는 단백질을 발현시키게 한다. 추가 구현예에서, 바이러스 벡터에는 패킹 플라스미드가 제공된다. 바이러스 벡터 및 패킹 혈장은 패키징 세포로 트랜스펙션될 수 있다. 패키징 세포는 캡시드로 캡시드화될 수 있다. 바이러스 벡터, 패킹 플라스미드, 패키징 세포 및 캡시드는 본원에 제공된 임의의 구현예 또는 구현예들의 조합에 따라 독립적일 수 있다.
예 및 사례 연구
[0077] 본원에 논의된 방법 및 조성물은 망막 질환을 유발하는 돌연변이의 교정을 가능하게 하여, 광수용기 사멸 및 실명을 예방한다. 본원에 제공된 방법 및 조성물은 예를 들어, 어셔 증후군 타입 II A, 어셔 증후군 타입 2C, 색소성 망막염 39, 색소성 망막염 25, 바그너 증후군, 또는 헤미센틴 돌연변이로 인한 연령 관련 황반 변성의 진행을 예방한다.
[0078] 본원에 기재된 유전자 요법을 위한 바이러스 벡터는 큰 트랜스진이 전달될 필요가 있을 때 구체적으로 조작된다. 예를 들어, 바이러스 벡터는 약 12 kb의 전체 발현 카세트를 위해 면역 억제 분자와 함께 CMV 즉시 초기 프로모터/인핸서로부터 구동되는 전장 인간 응고 인자 VIII cDNA(7 kb)를 전달할 수 있다. 이러한 벡터로 형질도입된 섬유모세포는 포커스(focus) 및 쉐도우(shadow)로서 인자 VIII를 생산하였다.
[0079] 일 구현예에서, 광범위하게 활성인 CMV 즉시 초기 프로모터/인핸서는 광수용기 특이적 인간 로돕신 키나제(RK) 프로모터의 활성을 측정하기 위한 표준으로서 사용되었으며, 이에 대해 매우 강력한 변이체가 동정되었고, 콘(cone) 및 로드(rod) 둘 모두에서 유전자 발현을 구동한다. 보편적인 CMV 즉시 초기 프로모터/인핸서 프로모터는 미세아교세포에서 기능하여 유해한 염증 반응을 유도할 수 있기 때문에(도 3), 이는 RK의 활성의 게이지로서만 사용될 것이다. 향상된 녹색 형광 단백질(GFP)은 상이한 벡터의 프로모터 활성을 시험하는 데 사용된다.
[0080] 향상된 녹색 형광 단백질(GFP) 유전자는 생체내 전기천공 연구에서 시험 유전자로 사용되었다. PBS 중 개개의 정제된 플라스미드 DNA의 용액(5 mg/ml) 대략 0.5 ㎕가 32-게이지 무딘-말단 바늘을 갖는 Hamilton 주사기를 사용하여 신생아 마우스의 망막하 공간에 주사되었다. 펄스 발생기를 사용하여 5개의 사각 펄스를 적용함으로써 전기천공이 수행되었다. 전기천공 후 21일에, 마우스는 희생되고, 망막 섹션이 벡터 흡수에 대해 분석되었다. 도 3에 예시된 바와 같이, 두 프로모터 모두는 광수용기 세포에서 GFP 발현을 필적할만한 수준으로 유도하였다. 광범위하게 반응성인 CMV 프로모터는 또한 미세아교세포에서 GFP 트랜스진 발현을 유도하였다. 따라서, 광범위하게 활성인 CMV 프로모터를 사용하는 벡터는 염증 반응을 개시하기 더 쉬울 수 있다.
[0081] 본 개시에 유용한 프로모터는 FGP 발현을 연구하기 위해 통합될 것이다. RK 프로모터의 활성이 확인되면, 광수용기에서 USH2A의 발현을 유도하는 이의 능력이 조사될 것이다. 이러한 벡터 게놈 분자의 설계는 이미 생산된 CMV-GFP 벡터의 설계를 따를 것이다. 발현 카세트는 특정 RK 프로모터, GFP 서열 및 인간 성장 호르몬 폴리아데닐화 부위(HT-pA)를 함유할 것이다. 이는 도 4에 도시된 바와 같이 바이러스 벡터로 쉽게 이동할 수 있도록 필요한 클로닝 요소와 함께 전체적으로 합성될 것이다. 조립된 작제물의 무결성은 시퀀싱에 의해 확인될 것이다.
[0082] 추가 실험/사례 연구의 목적을 위해, 벡터 게놈 모듈은 표준 공동-트랜스펙션 프로토콜을 사용하여 인간 Ad5(또는 다른 인간 혈청형)에 패키징될 것이다.
[0083] 형질감염 연구에서 발현 카세트를 조사하기 위해, 시험관내 연구를 위해 3개의 상이한 시험 세포, HEK293, 환자 iPSC, 및 Y79 망막모세포종 세포가 사용되었다. 모든 실험은 적어도 3회 수행된다. 지속적으로 우세린을 생산하지 않는 HEK293 세포 및 미분화 환자 iPSC 세포는 우세린 단백질 생산을 연구하는데 매우 적합하다. RK 프로모터의 활성을 평가하기 위해, 이들 세포는 Crx 및 Spl 전사 인자를 인코딩하는 플라스미드로 공동트랜스펙션된다. 트랜스진 전사는 상이한 세트의 USH2A 프로브를 사용한 RT-qPCR 및 폴리클로날 항-어셔린 항체로 고정된 세포의 면역염색에 의한 단백질 생산에 의해 측정될 것이다. GFP 발현 수준은 FACS에 의해 측정된다. Y79 망막모세포종 세포는 엑손 62를 스키핑하는 스플라이스 변이체에서 USH2A를 구성적으로 발현한다. 벡터-전달된 트랜스진의 발현은 엑손 62 특이적 RT-qPCR 프로브로 구성적으로 전사된 USH2A로부터 분화될 수 있다. Y79 세포에서 RK 프로모터 활성을 조사하기 위해 전사 인자가 제공될 필요는 없다. 제2 단계에서, 캡시드화된 벡터는 상이한 감염 다중도에서 시험 세포를 형질도입하는 데 사용될 것이다. 이전 연구에서, 가장 높은 수준의 트랜스진 발현은 48시간 후에 관찰된다. 조직 배양 세포에서 트랜스진 발현의 백분율 및 세포당 트랜스진 발현 수준은 FACS에서 면역형광에 의해 정량적으로 분석될 것이다.
[0084] 연구는 벡터 게놈 모듈 플라스미드 및 패키징된 벡터를 전달하는 GHFP 및 USH2A로 수행된다. USH2 및 상염색체 열성 RP는 상염색체 열성이지만, X-관련 유전 질환이 아니며, 인간 또는 마우스에서 성별-관련 표현형 차이는 보고된 적이 없다. 그럼에도 불구하고, C57BI/6 야생형 마우스는 두 성별 모두의 GFP 시험 및 Usha2a 녹아웃(USH2A 시험용)에 사용된다. 분자, 생화학적 및 영상화 연구를 위해 그룹당 4마리의 마우스가 포함되는 한편, 전기-레티노그램 기록을 위해 그룹당 8마리의 마우스가 포함된다. 트랜스진이 없는 벡터 게놈 모듈은 음성 대조군으로 사용될 것이다.
[0085] 1개월령의 마우스에는 망막하 주사 절차에 의해 캡시드화된 벡터가 주사된다. ≤ 1 ㎕ 부피의 2 × 109 IU/ml 농도의 벡터 현탁액이 전달될 것이다.
[0086] 전기천공 후 21일에, 광수용기가 이의 분화를 마치거나, 또는 형질도입 후 7일에 트랜스진 발현이 이의 최대 수준에 도달하고 주사-관련 상처가 완전히 회복될 때 마우스가 희생된다. 전체 마운트 망막 및 망막 섹션은 벡터 흡수에 대해 분석된다. 효과적인 트랜스진 발현이 보이면, 3개월 및 6개월에 치료 효과 및 염증 및 독성 반응을 조사하기 위해 추가 마우스가 추가될 것이다.
[0087] 전기천공 및 형질도입 후 벡터 DNA를 흡수한 세포를 국소화하기 위한 ITR-특이적 프로브를 사용한 인시튜 PCR 외에, GFP 시험 유전자가 직접 시각화된다. 처리된 녹아웃 마우스에서 어셔린 발현은 면역형광 및 공초점 현미경으로 검출될 것이다. 세포 당 트랜스진 발현 세포의 수 및 트랜스진 발현 강도는 ImageJ 프로그램을 사용하여 채점될 것이다. 또한, 망막에서 GFP 및 USH2A 발현은 반정량적 면역블롯팅 분석에 의해 평가될 것이다. 동시에, 망막 섹션은 염증 및 면역 반응의 증거에 대해 면역 조직학에 의해 검사된다. 어셔린은 광수용기에서 Ush2 단백질 복합체 완전성에 필수적이므로, 본 발명자들은 처리된 Ush2a 녹아웃 망막에서 USH2 단백질 복합체의 구조를 조사할 것이다. 동물 당 4개의 섹션으로부터 평균이 취해졌다. 실험군 및 대조군 당 4마리의 마우스로부터의 데이터(눈 모의-주사 또는 대조군 벡터로 처리됨)는 스튜던트 t-검정 및/또는 일원 ANOVA를 사용하여 비교될 것이다. Ush2a 녹아웃 마우스는 1세 이하의 망막 변성을 나타내지 않기 때문에, 본 발명자들은 바이러스 벡터 형질도입 3개월 및 6개월 후에 망막전위도(ERG) 및 광간섭 단층촬영(OCT)을 사용하여 마우스에서 망막 건강을 평가하지만 망막 변성의 구조를 평가하지 않을 것이다. 이전 ERG 및 OCT 데이터의 표준 편차에 기반하여, 실험군 및 대조군 당 8마리의 마우스가 시험될 것이다. ERG 및 OCT 데이터를 분석하기 위해 스튜던트 t-검정 및 이원 ANOVA가 수행될 것이다.
[0088] 다수의 구현예 및 관련 방법이 본원에서 상세히 설명되었지만, 이에 대한 수정 및 변형이 가능하며, 이들 모두는 본 발명의 진정한 사상 및 범위 내에 속한다는 것이 명백해야 한다. 또한, 다수의 변형 및 변경이 당업자에게 용이하게 일어날 것이기 때문에, 본 발명을 도시되고 기재된 정확한 구성 및 작동으로 제한하는 것이 바람직하지 않으며, 따라서, 모든 적합한 수정 및 균등물은 본 개시의 범위 내에 속하는 것으로 분류될 수 있다.
SEQUENCE LISTING
<110> Greffex, Inc.
<120> GENE THERAPY FOR RETINAL DIEASES
<130> 543346.22
<150> US 63/149,122
<151> 2021-02-12
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 15612
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
atgaattgtc ctgtactgag cctcggtagc ggctttttgt tccaagtcat agaaatgctc 60
atctttgcgt acttcgcgtc aatatctctt acagagtctc ggggtctctt cccaaggctt 120
gaaaatgtag gagcgtttaa aaaggtttcc atcgtaccaa cccaggctgt atgtggcctt 180
cctgaccgca gtactttttg ccactcttcc gccgctgctg agtcaattca gttttgcact 240
cagcggttct gcattcaaga ttgcccctat cggtcttctc acccaacata tacggcactg 300
ttttctgcgg ggcttagttc ctgtattacc cctgacaaga atgatcttca ccctaacgcg 360
cactcaaata gtgcatcatt tatcttcgga aaccacaaat cctgtttttc ttctcctccg 420
tcccccaaac tgatggcctc ctttacgttg gcggtttggc ttaaaccgga acaacaagga 480
gtaatgtgcg tgattgagaa gacggttgat ggacaaatcg tctttaagct gacgatatca 540
gagaaagaga cgatgtttta ttaccggacg gtgaatgggc tgcaaccccc gattaaagta 600
atgactctcg gtcggatcct cgtgaagaaa tggattcacc tgagtgtaca agtccatcaa 660
actaagattt cattttttat caacggagtc gagaaggacc ataccccatt taacgctagg 720
acattgagtg ggagcattac agatttcgcc tccggaacgg tacagatcgg ccaatccttg 780
aatggattgg aacaattcgt cggaagaatg caggacttcc ggctgtacca ggtagcactg 840
acaaatcgag agatccttga agtctttagt ggggacctgt tgcggctgca tgcccaatca 900
cactgccggt gtccaggttc tcacccgagg gtacacccgc tggctcagcg gtactgtata 960
ccaaatgatg ccggggacac agcagataac agagtcagtc gacttaaccc ggaggcacac 1020
cctctctcat tcgtaaacga caacgacgtg gggacttctt gggtgtctaa cgtcttcaca 1080
aatataacac aactgaatca aggcgtcacc atctccgttg acctcgagaa cgggcagtat 1140
caggtgttct atattattat acaatttttc agtccacagc ccacggagat acgaatccag 1200
cggaagaaag agaattccct ggactgggaa gactggcagt acttcgctcg caattgcggg 1260
gcgtttggca tgaagaataa cggagacctg gagaagcctg attccgtgaa ctgccttcag 1320
ctctcaaact tcacccccta ctcaagaggg aatgtgacat tctcaattct tactccgggc 1380
cccaattatc ggcccgggta caacaacttt tataacacgc cttccctgca agaatttgta 1440
aaggcaaccc aaatcagatt tcacttccat ggacaatact ataccactga aacagccgtt 1500
aatctgaggc accgctacta cgccgtggat gaaatcacga tcagtggacg gtgtcagtgc 1560
catggccacg ctgataactg cgacacaact agccaaccat acagatgcct ctgcagccaa 1620
gaaagtttca ctgagggcct tcactgtgat agatgcctgc ccctttataa cgataagcct 1680
ttcaggcaag gagaccaagt ttatgcgttt aactgcaaac catgccaatg caacagccat 1740
tccaagtcct gtcattacaa catttccgtc gacccttttc catttgagca ttttagggga 1800
gggggcggag tatgtgatga ctgcgaacat aacactactg gtagaaactg tgagttgtgc 1860
aaagattact tctttcgcca agtgggtgcg gatccatccg cgatcgacgt atgtaagccc 1920
tgtgactgtg acaccgtcgg gacgcggaat ggatctatcc tttgtgatca aataggtggg 1980
caatgcaatt gtaaacgaca cgtatcaggt aggcagtgca accagtgtca aaatggattc 2040
tacaatctcc aggaactcga ccctgacgga tgtagtccat gcaactgtaa cacctctggc 2100
accgtagacg gtgacataac atgtcatcag aatagtggac agtgtaaatg taaggctaat 2160
gttatcgggc tcaggtgcga tcattgcaat ttcggtttta agttcctccg ctcatttaat 2220
gatgtagggt gtgaaccgtg tcagtgtaac cttcacggta gtgttaacaa gttttgtaac 2280
ccccattctg gtcagtgcga gtgcaagaag gaggccaagg ggttgcaatg cgatacttgc 2340
cgcgaaaatt tttatgggct tgatgtaacc aactgtaagg cgtgcgactg cgatactgca 2400
ggatctctgc caggaactgt gtgcaacgcg aaaactggac agtgcatttg taaaccgaat 2460
gtggaaggac gacagtgcaa caagtgcctg gagggaaatt tttatctccg gcagaacaac 2520
tcatttctct gtctcccatg taattgcgat aaaactggca ccattaatgg cagcttgctt 2580
tgtaataaaa gcactggaca atgcccctgc aagctgggag ttacggggct gcggtgtaac 2640
caatgcgaac cacaccggta caatctcacc atcgacaatt tccaacattg tcagatgtgt 2700
gaatgcgatt ccctcgggac actccctggc acgatatgtg accccattag tggccaatgc 2760
ctgtgtgtac ccaaccgaca gggtcgacga tgtaatcagt gtcagccagg attttacata 2820
agcccgggaa acgccacagg ttgcctgccc tgctcatgtc acacgacggg agcagtcaat 2880
cacatatgca atagcctcac tgggcaatgc gtgtgccaag acgcaagcat tgctggtcag 2940
cgctgtgatc agtgcaaaga tcactacttc gggtttgacc cacagacagg tcggtgccag 3000
ccgtgcaact gccaccttag cggtgcattg aacgaaacat gtcatttggt aacgggtcag 3060
tgcttttgca aacaatttgt aacgggttcc aagtgtgacg catgtgttcc ttctgccagc 3120
catcttgacg ttaacaatct ccttggttgt tctaagactc catttcagca accaccgcca 3180
agaggccagg tccaaagctc atcagccatc aacctctcat ggtcacctcc cgattcaccg 3240
aacgcgcact ggttgaccta ctcattgctc cgcgatggat tcgagattta taccaccgag 3300
gaccaatatc cgtattccat tcagtacttt ctggacactg acttgctgcc ctatactaaa 3360
tatagttatt atatcgagac gaccaatgtg cacggttcta cgcgatctgt ggccgtcaca 3420
tataagacta agcctggagt gcctgaaggt aatctgactt tgagctacat aatcccaatt 3480
ggatccgaca gcgtgaccct tacgtggacc acgctttcca accaatcagg accaattgaa 3540
aaatacatct tgtcttgcgc tccgttggcg gggggtcaac cctgcgtctc atatgagggc 3600
catgagacaa gtgcgactat atggaatctc gttccctttg caaagtatga cttttctgta 3660
caagcctgca catctggcgg atgcctgcat agtcttccaa tcacagttac cacagcacaa 3720
gcaccccccc agaggttgag cccgccaaag atgcaaaaga tttcttctac ggaactccat 3780
gtggagtgga gtcctccggc agaactcaat ggtattatca ttaggtatga actgtacatg 3840
cgacggctta gatctaccaa agagactacg agtgaggagt cacgcgtgtt tcagtcatct 3900
ggctggttgt caccccattc attcgtggag tctgcaaatg aaaacgcgtt gaagcctcct 3960
caaacaatga ctacgataac tggacttgag ccatatacta aatatgagtt tagagtactg 4020
gctgtcaaca tggccggctc cgtctcaagt gcatgggttt ccgagcgcac aggcgaatcc 4080
gcgcctgtct tcatgatacc ccccagtgtt tttcctctgt ctagttactc cctcaacata 4140
tcttgggaaa agcctgcgga caacgtgacc agaggtaagg tcgtgggcta cgatatcaac 4200
atgctgtcag agcagtcccc acagcagagc atcccgatgg ccttttcaca actcttgcat 4260
acggccaaat cacaagaact gtcatacacg gtcgagggac ttaaacctta tcggatctac 4320
gagtttacga tcacgctgtg caactcagtc gggtgtgtca cttctgcgag cggtgcaggc 4380
cagacgcttg cagcagcgcc agcgcagctc aggccccctt tggtcaaggg aataaattct 4440
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cagctcgaaa ggagagagtc ttcactgcct gcactcatga ccactatgat gaaaggaatc 4560
cgctttattg gaaacgggta ctgcaaattc cccagctcca cgcaccctgt gaatacggat 4620
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caatacagcg atggtaaatg gcacgagata atcgcgatta gacaccaggc gtttgggcag 4860
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gatcctgaaa taatacagaa gggttttgtc ggatgcctta aggacgtgca ttttatgaaa 5040
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tctgcgtgta ctcatgtagg ctgcacgaac tcaagttggg tacttctcta tactgcccag 6420
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ccagagggtg tacccgcccc gaaggcccac tcttacagcc ctgacagctt caatgtgagc 6780
tggactgaac ccgaataccc aaatggcgta ataaccagtt atggactgta cctcgatggt 6840
atattgatac ataattcttc cgaacttagt tatagggcct acggatttgc tccgtggagc 6900
ttgcacagtt tccgggtcca ggcttgcacc gcgaaaggtt gcgccctggg tccgctcgtg 6960
gaaaatcgaa cactcgaggc cccacctgag gggaccgtga atgtgtttgt taagacacag 7020
ggaagtcgaa aagcgcatgt ccgatgggag gccccattta gacctaatgg cttgcttacg 7080
cactctgtgt tgttcacggg gatcttctac gtcgaccctg taggtaataa ttacacattg 7140
ctgaacgtca ccaaggtgat gtactccgga gaggaaacta acctttgggt actgattgac 7200
ggcctggtac cgtttacgaa ctatacagtt caagtgaaca tcagtaacag ccaagggtcc 7260
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ccccgccttt catctgctac tcctacttca ttgcaggttg tgtggtcaac ccccgcgaga 7380
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ggtttcctcg agctcttttc caatccttca gcaagcttgt cctacgaagt ttctgatctc 7500
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ctgctggatg tcaaaagtcg aatgatgctg gtcacgtggc aacatccgag aaagtccaac 7680
ggcgttataa ctcactacaa catttacctg catggtcggc tttacttgcg caccccagga 7740
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gaggcatgta cgtccaaagg atgctcactt agccccgaaa gccagaccgt ttggacgctt 7860
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ataatcagct ggcagccccc tactcatccg aatggtctcg tcgaaaattt cacgatagaa 7980
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caagttacgt ggaaaccccc actgatccag aatggtgaca tactgagtta cgagatacat 8280
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actcacctca ttccgtttac gaactatagt gtcacaatcg tggcctgtag cggtggtaac 8400
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tctggggagt caaaggccca cataaaaaag aatgacccag taccagttaa gtgctgcgaa 10080
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cacttgtaat aa 15612
<210> 2
<211> 35289
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 2
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gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg tagctcttga tccggcaaac 2400
aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa 2460
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gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca 2700
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cttagacatg acaccattaa cacaagcaac aaaagaaaaa ataaattcaa catcatcaaa 30540
attaaaaact tttgtgggcc gggcatggtg gctcaagcct gtaatcccag cactttggga 30600
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<210> 3
<211> 35067
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
tcgaccgatg cccttgagag ccttcaaccc agtcagctcc ttccggtggg cgcggggcat 60
gactatcgtc gccgcactta tgactgtctt ctttatcatg caactcgtag gacaggtgcc 120
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aatctcagac acatacacac actcacacaa ccccatcttt gttcttgctt caattttgtt 22980
ttagatacaa tcgcaaccat acactctgta ataacatcac tgccaaatac tcaaaccaca 23040
tgaaaaggca aagtgccttt tctattgtgg aaataagccc atgttgggga gaaatcctgg 23100
gaatctcgca caagaaacgc ttatttacgt gtccagggcc gcctctgcca tgtttaccac 23160
aaataatact ttaaacttca aaagaaacgc acacacagtc taaggaacaa tgaaggcttt 23220
tatatagtcc aatgaaaatg ctttggaaaa tgaaaagtat aagaactgac agtacatggg 23280
gatttttttg tctcagaatc ttaatggaga atataaacta taagcaggaa ataggtcaga 23340
tataacagca gacaaatcag tttcaagaag tcctacaagg aaaaatttgt gcaaaatgtc 23400
aggttgctaa ttattcattc agtaaacatt tagggaatgt gccaagcagt cttctaagcc 23460
ctggggattc agcgacaaac aaaaacagat gcagcttctg ctctcaaaag ctgacatcct 23520
ggctgggcgc tgtggctcat gcctgtaatc ccagcacttt gggaggccga ggcaggcaga 23580
tcacctgagg tcaggagttc aaaaccagcc tggccaacgt ggtgaaaccc tatctctact 23640
aaaaatacaa aattagccag gtgtggtggc aggcgcctgt agtcccagct acttgagagg 23700
ccgaggcagg agaatcactt caacccggga ggtggagttt gcagcgagcc aagatcgcac 23760
cactgcactc cagcctgggc gaaaagagtg aaactctatc tcaaaaaaaa aaaaaaaagg 23820
aagctgccat cctaatgggg gaagacaatt tgaacagatt gaatagaaac acatgcagca 23880
aaacagggtg atgggatgaa agcatgatgg gctgctactt tggtctaagc ggtcaaggaa 23940
ggcttctctg aggaggtgag gcctgaataa caagaaacca ggacggtgaa gggcagaggg 24000
aagaattctg ggtgaagggg acaaggagcc agaggcgctg gagtggaaag agctgggccc 24060
acttggaggc acagggcgga ggggctagca gcaggcgcag ggagagctgc tgagggggca 24120
gataggaggc aggcaggcag cacagggttt gtggggcagg gcaaagtgct taagaaaagc 24180
caaggaatgg ctttaagtag ggtctgacat catccgattt ccatttttaa aagattactg 24240
tgctgtgaag cccagaaagg ccgagagaaa acaaattact tagattactt cagcctacag 24300
gacttcacag ggtgtctgtg gggatttggg aagtgttagt gtcaaagtgt atctgagatc 24360
tgaggccagg tgtggtggct cacgcctgta atcccagcac tctgggaggc tgagataggc 24420
agataacttg aggtcaggag tttgagacca gcctggccaa catggtgaaa ccccatctct 24480
actaaaaaca gaaaaactag ccaggcattg tggtgcgcac ctgtaatccc agctactcag 24540
gaggctgagg caggagaatc gcttgaacca gagattgcgc cactgcactc cagcctgggt 24600
gacagagcga gactccgttg tcttaattta aaaaaaaaaa aaaaaaatct atctgaggca 24660
gaacaataga acgcggcaaa cgtgaagaaa ctttcagatt ctcctcccac ctggcacgct 24720
gctcccctcc cccatcgctc tctcagctga tgacagggaa aggaagccca ggctgcaccc 24780
cctcaccaaa tgctgaccgc cccaggcagg aaggaggctg cccttgctct cagccaaggc 24840
cagctgcacc ggtagtgctt gggattccaa ggcctccatg cctgggactc tcacctctgt 24900
ccctgcccct actctccctt gtaccagagc aggacaggct ctcacagcct acctttggaa 24960
cagaacagga cacacattta aaaaccctct ctaaactcta caaacccaga gaaagtccta 25020
ctttcttgtt ccaagaaacc tctttatcgt tgttagttct taacatcaca tttctgcttt 25080
ggcctacttc aattgggctt ctagatccaa tattccaagg caacggcttc ttacaatatg 25140
tgcaaaacaa acagtccctt ttctgttctc aaatgcattc taaaaggttg gaatttcaca 25200
acttttcttc tgctggttcc tccacagtac acctaccaag cctttacccc aaggctttct 25260
tgaccctctt ctctataaaa tccaggccat cccatcctgt ctcatgtctt caaaaagatc 25320
tacgtggcag agacattcca atctccatct cccccatgac atcttttcag aactccagac 25380
tactcaactt ctgtgctctt cagtccaaat ggcgtctcaa accagatggt tatcagatgg 25440
ctacaggagg cattacggaa tgtatcatct tctgaatgtg aaccacatca gatgcaatac 25500
agagaaacac acactctcca ggcacagcaa accatgccac agaacgctcg ggctttacct 25560
gtgatgggaa gcttgggctg cagtgtgtac agctgggcag gggtctgatg tgggttcatt 25620
ccatatctca agggcatctg agatacgcct ttgctgtact gtttcctgaa ataatctgaa 25680
attgcttcat catattgtgc cgtatgagtg aatgcctaca aaaagcgtaa gttttgtgag 25740
acacgagcag cactttccaa agtggggaca agatggtttt ctacgtccac agcaaacaac 25800
atctcctcac tattcagtgc tatgtggtgg ctgcacaaca cgatgacacc atgaatgaca 25860
gcaaagcact gaatggccca acaaattacc cctttccaat tctttttcaa tctttttttt 25920
tttttttgag acaaagtctc actctgctgc ccaggctaga gtgcagtggt gtgatgtcag 25980
cttactgcaa cttccacctc ctgggttcaa gcgattctcc tgcctcagtc tcccgagtag 26040
ctgggattac aggcgtacca caccacacca cactcggcta atttttgtat tttcagtaga 26100
gacagggttt caccacattg gccaggctgg tctcaaactc ctgacctcag gtgatccgcc 26160
cgcctcggcc tcccaaagtg ctaggattac aggcgtgagc caccgcgccc agctctcttt 26220
caatcttttt gacagaacac ctctgtaata gctggtttct ccatttttaa caaaaggata 26280
gcagctccaa gcaaagcttt ggtaggtaat gcaatctacc aagaactgaa tactgcttgg 26340
tctggcaaac actgcactcc atggatgtaa cttacaatat catgaaagtg catcccacct 26400
tcaaggctaa ctggcgtcta gtctccaagg aggtgtcctt actctcggag ctctgcatct 26460
ccgtggacac caccacatag tcctctggtt cacacaccac tgtcactcga gcgtggtttt 26520
tggctgcagc tctcagtaag gttactccac ctttgaagaa caaaagactt attgattttt 26580
gtatgtccct atcagcttat gaaccgcttt taaataaagt cattgtgcat gtacttccat 26640
tttaattcct gacttaaaaa tcaggaaaat aagctgggcg cagtggctca tgcctggaat 26700
cccagcactt tgggaggctg aggcaggtgg atcacctgag gtcaggagtt cgagaccact 26760
ctggccaaca tggcgaaatt ccatctctat aaaaaataca aaaaaaatta gccaggcgtg 26820
gtggtgtgca cctgtaatcc cagctactca ggaggctgag gcaagagaat cacttgagcc 26880
caggaggcag aggttgcagt cagccaaaac tgtgccactg tactccagcc tgggtgacac 26940
agcaagactt catctcaaaa aaataaaaat aaaataaata aataaataaa tcaggaaaat 27000
aacccagatg catctctgca tacaaaaaaa gcttagaaaa tataaatgaa aaaaagaaaa 27060
tataaatgaa ttatagtaat cccaaaacac aatccagaag tagctatttt ctttctattt 27120
cctcagtaat aaaattcaaa atgaaatctc actaaaattt aaataatcct ctcctctcag 27180
tcttctaaaa tggtttttct gacttaccaa tgtcaatttg ctccacagcc tcctcaacag 27240
ttacacctgg agaagccact gtctttacaa agggatagag attgcaggca acaactctat 27300
aaaacaaaga cgaatctggc tgtcattaaa aagtccactc atgtggttta cagctatcta 27360
ggaaaaaaac aagtcagtac tattaacgta aacaaaagcc atagagaact aatatataaa 27420
ctgtgagcct gacattttag aattctaacg agtgtgttaa aaagtcaggg tgtcctgctg 27480
gggtcgagca gaggtaattt agtcagcagg tgctccccgg atctgaatac acagtactcc 27540
ctccacgtca cactgcaacg ctgctgcttg cataacctta gctacccaga accaccaagc 27600
catgaaaaat ttatagaaca ttttaataga agtataaagt acaagattac agataacatt 27660
ctcattttgg aatgtgatca ctattatcca gaacattaga atttagattc tttttccagt 27720
ggattggcac aatgatgaaa aatatcagag cattctaagg gtgaaacatt tgttttgcct 27780
tcagagaggt cataaaaatg atggtaacag gaatgccaaa agaataattt aaaatacaga 27840
agtaatctaa aattaacaat cagtgaagta cagttccact cctaggcctg tagtgcgagg 27900
agctctacgg gcaggctcca aacaagccta actgctgaaa actaattaaa aaaaacaaaa 27960
acaaaaacag aagaacagaa ttggagggga aacattttgc agctcatctt tattaagtct 28020
actgccctcc tactaaaacc agacaaatgt cacaagaaaa ctagagacca gtatctctta 28080
ggtatcttca cacaaaaact ctcaacaaaa cactaacaaa ctgaatccag aaaaatgcaa 28140
aaaccacctg atcatctcaa tagatgtaca aaaaggatct gacacaattc aacaggtatt 28200
catatagaaa cactcagcaa attaaaaata gaagggaact tactgaacat gacaaagtgt 28260
aagaaaaacc cacagctaac atcatacttg atggtgaaag actaaaatac ttgtctactc 28320
aactcagaaa caagacaaga ggccaggcgc agtggctcat gcctataatc ccagcacttt 28380
gggaggctga gccaggcaga tcacctgagg tcagaagttc gagaccagcg tggccaatat 28440
ggtaaaaccc catctctact aaaaatacaa aaattagccg ggcaaggtgg cgcacgcctg 28500
caatcccagc actttgggag gctcaggagg atggatcaac tgaggttgga agttcaagac 28560
cagcctgacc aacatggaga aaccccatct ctactaaaaa tacaaaatta gccaggcaag 28620
gtggcacatg cctgtaaccc caggctgaag caagataatc acttaaaccc gggaggcgga 28680
ggtcacagtg agccaagatc acgcaactgc actccgcctt gggcaacaag agcaaaacgc 28740
catcttaaaa aaaagaaaca aaacaataat gtccattctt accacttcta ctgaacactg 28800
tactagaagt tctagccaga gcaattagca aagaaaagaa aataaaaggc atcaggactg 28860
gaaagaaagc agtgaagtta tatctatttg cagatgatac cacctagtat acagaaaatc 28920
ccaaattcac aaaaataacc ttttagcact aataaatgag ttcagcaaag ccgcaggata 28980
tatgatcaat atataaaaat caattgtatt aaaatataca ttagcagtga atgagaaaaa 29040
aattaagaaa acaattctac ttcacaagac aatgttaaag aaattaaaga caccccatgt 29100
tcacagactg gaagatttaa tattcttagg atggtaacat ttcccaaatt gatctacaga 29160
ttcaacacaa tacctatgaa aattccaact gcgttgtttt gcagaaatgg acaagctgat 29220
tctaaaaatc atgtggaaat gcaagggact ctgaagagtc aaagtcatct tgaataaaaa 29280
aaacgaagtt ggggccgggc gcagtggctc acgcctgtaa tcctagcact ttgggaggcc 29340
gaggcgggcg gatcacgagg tcaggagatc gagaccatcc tggcgaacac ggtgaaaccc 29400
tgtctctact aaaaatacaa aaaaattagc tgcgcatggt agcgggcgcc tatagtccca 29460
gctactcggg aggctgaggc aggagaaggg cgtgaacccg ggaggcagag cttgcagtga 29520
gccaagatcg cgccactgca ctccagcctg ggcaacagag ccagactccg tctcaaaaac 29580
aaaacaaaac aaaacaaaca aacaaacaaa aaacagaaaa atgaagttgg aggactcaca 29640
cttgctgatt tcaaaatttg ttaccagcct atagtaatag tgtagtactg gcataacagc 29700
aggcacatgg accaagggtg ccaagaccat tcgattgggc aaagaacagt cttttcaaca 29760
aatgatgctg agacaactag acagccacat acaaaataaa ataagacttc tatttcatgt 29820
ctgtatatga aaattaactt aaaatgaacc aaagacttaa gtataagagc taacactaaa 29880
ataactctta aaagaaatgt acacacgccg ggtgcggtgg ctcacacttg taatcccagc 29940
actttgggag accgaggcag gtggatcacc tgaggtcagg agttcaagac cagcctggcc 30000
aacatggaga aaccccgtct ctactaaaaa cacaaaaaaa ttagctgggc gtggtggcgg 30060
gcacctgtaa tcacagctac ttgcgaggct gaggcatgag aatcgcttga acccaggagg 30120
cgaaggttgc agtgagccga gatcacgcca ctgcactcca gcctgggcaa caagagcgaa 30180
actccatctc aaaaaaaaaa aaaaaaagaa agaaaatata cacaaaaatc ttcatcactg 30240
aggattaggc aatggtttct tagacatgac accattaaca caagcaacaa aagaaaaaat 30300
aaattcaaca tcatcaaaat taaaaacttt tgtgggccgg gcatggtggc tcaagcctgt 30360
aatcccagca ctttgggagg ccaaggcggg cagataaccc gaggtcagga attcaagacc 30420
aacctggcca acatagtgaa accctatctc tattaaaaat ccaaaaaaat tagccaagtg 30480
tggtggcggg cacctgtaac cccagctact catgagactg aggcagaatc gcttgaatcc 30540
gggaggtgga ggttgcagtg agccaagatg acgccactgt gctccagcct gggcgagagt 30600
aagactccgt ctcaaaaaaa agaaaaaact tgtgatgatc aaaggaaacc atcaagaaag 30660
gctaacacaa tccatagaat gagaggaaat aaacttacaa ctcaataata aacagataaa 30720
tacctcaact aaaaatggac aagaggtctc aacagacatt tctccaaagg aggtaaacaa 30780
ctggctagga agcacatcca acggtgttcc acattatttg gaaagcaaat tataaccaca 30840
atgagatgcc acttcagaac ccctagaatg actagaatca aaaagacaga tagtaacgtt 30900
gatgaggatg tggagaaact ggagccccat ccagcacact gctgctggaa atgtaaaatg 30960
gtgcagcact ctgaaataca gggtcgcagt tcctcaaaag ctaaacatag ttaccatatg 31020
accaaggaat tccactccta ggtatatacc ccaatgaaac gaatgtgtat gtccacacaa 31080
aaacttatac acaaatattt atagctgcat tattcataat attcaaaaag tagaaacaac 31140
ccaaatgtcc atcaacaaat gaactgataa acaacagggt atgaccacac aatggattat 31200
ttttcagcac taaaaacgaa atgaactatt gatactatgc tataacatgg ataaaccttg 31260
aaaacatgct aagtgaaaga agccaggaac aaaaaaacca tatattgtta gattctattt 31320
atatgaaaat gtccactaca ggcaaatcag acacgtaaca attggtggtt gccgaggctg 31380
gaggacgttg gggaaatgga gaataaatgc gtatgggtat agggtttagg gtgggggtga 31440
tgaatatgtt ttaatattgg atgtggcaat taatatggtt tggatgtgtg tcctctccaa 31500
atctcatttt gcaatgtgat ccccaatgtt ggaggtgggg cctggtggga gatgattggg 31560
tcacggggga gatcccttat gaatggcttg gtgccctccc cataatgagt cctcactctg 31620
agttcatgta gagctggttg tttaacagag ccgggcaggc cgggcgtggt ggctcacacc 31680
taatcccagc actttgggag gccggggtgg gtgcatcatt tgaggtcagg agttccaaga 31740
gcagcctgac caacatggtg aaaccccatc tctactaaaa atagtaaaaa tgagttgggc 31800
gtggtgacaa acgcctgtaa tctcagctac tcaggaggct gaggcaggag aatcacttga 31860
acacaggagg cagaggttgc agtgagccaa ggtcatgcca ctgaactcca acctgagcaa 31920
cagagcgaga ccctgtctca aaataaaatt aaattaaatt aagaataaaa gttaaaaagt 31980
aaaagagctg ggcaactcct cctctccctc tctcttgctt cttctctcat gggatatgcc 32040
agctccccct ctgctttcca ctgtgattat aaacttcctg aggccctcac cagaagttga 32100
tgctggcacc acacttcttg tactgtctat agaatcacga gccaaaataa acctgttttc 32160
ataaattacc cagcttctag tattccttta tagcaatgca gaacagacta acacagtaat 32220
ggttgcacaa cttctgtgaa ccactgattt gtacatttta aattggtgag ttgtatggta 32280
tgtggattag atctcaataa agctgttacg tatatttaag agaaacagcc agtatcttta 32340
tgcaaataac tcagttagtt gtgcaagttg ataattccta atatgaaaac ctgaaatctg 32400
aaatgctcca aaatctgaaa ctttttgagc gtcaacatga cacttggagg aaatgctcac 32460
tgaagcattt cggatttctg agggacgctc aactggcatg ttacctgcaa atattccaaa 32520
atctgaagaa atctgaaatc caagacactt ctgggtccca agcatttcag ataagggata 32580
ctcaacctat acatactaag atttagattg taacttccta aaaaacttca gtatgtattt 32640
tggtatataa atctggccaa accaaaatgc ttacacacat acaaagtcac acagaaggta 32700
cgcagtaaag gtttatagtg agtaagaaaa cacagggaca ccaggtttgg catagtcttt 32760
gtcgttggtt cgtaatgtgt taaaagttta atttcaggtt tttaccttat aagattgaaa 32820
tcaagtctgg ccatgtcagc attatcttct ggaatattac gagctaggat tcctaattta 32880
aaaaagttaa acaaagtcat tagcttcaaa aaacaagtca gattaaggaa tgtctttcaa 32940
catagtgtct tcaatcaaat taaatcccat tgattaaaaa aaaaatttat ttttttgaga 33000
tggtctcact ctatcgccca ggctggattg tagtggcgta atcacaactc actatagccc 33060
tgacctccag ggctcaagtg atcctcctac ctcagcctcc caagtagctg ggactacagg 33120
aatgcatcac cacacccagc tggtcttttc aattttttaa agagaagggg ggtgttgcca 33180
tcttgcccag ggtgatctta aactcctggg ctcaagcggt tctcctgtct cagctctcca 33240
agtgctggga ctacaggcaa gagccaccat gcccagcata atattcttaa ttaaagaata 33300
tcaaacatgt agttggggag ttatcaaaca aaaaaattag gattaacaga tatatctggc 33360
tggccacagt ggctcatgtc tgtaatacca gcactttggg aggctaaggt gggggatcgc 33420
ttgagcccag gtgttcgaga ccagcctggg caacaaggtg agaccccgtc tctataaaaa 33480
atacaaaaat tagctgggtg tggtggcaca tgcctatagt cccagctact tgggaggctg 33540
aggtgggaga actgcttgag cctgggaagc agacagaggc tgcagcgagc catgatcgca 33600
ccactgcact ccagcctggg caagagtata atcctgtctc aaaaaaaaaa aagagagata 33660
tatttaaaaa tctttttctt cagttcttga tcccagtttc ttgagcaata aaatgtaaaa 33720
aaggtaaaag gaattttaca aaactgttgc tagttccaga acagtctatg cgtttctgta 33780
agtcaatggc ttgtctgatg atctgtagcc attcagcttt attcaccaaa ttgtaccaca 33840
actgacaaac taggaggata ccagtttctt gccgtttcgg tttatataca attcattctt 33900
aggtgaacga acaaatgtaa agcactttga aaaaaaaaat tcctttgcaa gtcagttacg 33960
ctgtgatgct ttcttctaag tttgaactat tttaaaagta ttttcatacg atgaaatcta 34020
aatatcttca gcaacttgag caggaaacac cagactctaa attaggtatc aggtcaggac 34080
taatagcaag cagaggaaaa caatctgaat tcatcaagta gtaagacaag ctggatttta 34140
aaccagttct aacgtattat gaaatctggc agcaacttca taacattaac tttatatgta 34200
aatttctctt gagccttttt cttcctttat tttaggacgc tatcaactaa aatattcctg 34260
gaaaccactg actgttttta cattaaagat accaaccact taccagcatg gactgcagga 34320
tgcaaagttt tcacacgtcc ccccaacatt tcaggaaatc ccgtcaactc agagacatct 34380
ctgaaaaaca gataaacaga atggtactac tggtgtggct gaattgtaat tttcactatt 34440
caaagcatct actgttttca tttcaagaga ttttgagcct gaattcaacg tgaaaattct 34500
gattttttaa agtatttcac tatattttat ttcttaagta aaattctatt tacttccgaa 34560
aaaaagttta tttaatttat ttcctaactg ttgtgtatgt tccgtacgat taagggcgaa 34620
ttccagcaca ctggcggccg ttactagtgg atccaacagt ctccacgtaa acggtcaaag 34680
tccccgcggc cctagacaaa tattacgcgc tatgagtaac acaaaattat tcagatttca 34740
cttcctctta ttcagttttc ccgcgaaaat ggccaaatct tactcggtta cgcccaaatt 34800
tactacaaca tccgcctaaa accgcgcgaa aattgtcact tcctgtgtac accggcgcac 34860
accaaaaacg tcacttttgc cacatccgtc gcttacatgt gttccgccac acttgcaaca 34920
tcacacttcc gccacactac tacgtcaccc gccccgttcc cacgccccgc gccacgtcac 34980
aaactccacc ccctcattat catattggct tcaatccaaa ataaggtata ttattgatga 35040
tgattgttta aacatgatga gctcagc 35067
Claims (38)
- 트랜스진 작제물을 포함하는 바이러스 벡터로서, 상기 트랜스진 작제물은 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열, 및 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트 중 하나인, 바이러스 벡터.
- 제1항에 있어서, 벡터에서 ITR 서열을 제외하고 내인성 유전자가 완전히 결실된, 바이러스 벡터.
- 제2항에 있어서, 벡터에서 카고 서열에 대해 최대 10 kb의 공간을 구성하기에 충분한 내인성 아데노바이러스 유전자가 결실된, 바이러스 벡터.
- .
- 제1항에 있어서, 바이러스 벡터가 완전히 또는 부분적으로 절단된(gutted) 미미바이러스(mimivirus)인, 바이러스 벡터.
- 제1항에 있어서, 바이러스 벡터가 완전히 또는 부분적으로 절단된 아데노바이러스인, 바이러스 벡터.
- 제6항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 타입 5를 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화된, 바이러스 벡터.
- 제6항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스 타입 6을 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화된, 바이러스 벡터.
- 제6항에 있어서, 바이러스 벡터가 아데노바이러스를 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화되고 캡시드 단백질로부터 RGD 서열을 제거하도록 변형되는, 바이러스 벡터.
- 제6항에 있어서, 바이러스 벡터가 패밀리 A-G의 아데노바이러스를 기반으로 하는 캡시드에서 캡시드화된, 바이러스 벡터.
- 제6항에 있어서, 트랜스진 작제물이 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 인간 로돕신 키나제 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 인간 로돕신 키나제 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 마우스 로돕신 키나제 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 유비쿼터스 CMV 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 뉴클레오타이드 XXX 내지 YYY의 어셔린 게놈(Usherin genome)의 업스트림 비-코딩 서열인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 합성 a 트랜스듀신 알파-서브유닛 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 광수용기간(inter-photoreceptor) 레티노이드-결합 단백질 프로모터 및 인간 트랜스듀신 알파-서브유닛 프로모터의 최소 서열인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 화학적으로 제어된 tet 유도성 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 화학적으로 억제된 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 인간 L-옵신 프로모터인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 인간 레티노스키신 근위 프로모터(human retinoschisin proximal promoter) 및 인간 광수용기간 레티노이드-결합 단백질 인핸서인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 프로모터 요소가 광수용기에 특이적인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 트랜스진 작제물이 Ush2A로 번역되는 뉴클레오타이드 서열인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 트랜스진 작제물이 ADGV1로 번역되는 뉴클레오타이드 서열인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 트랜스진 작제물이 아이즈 셧(eyes shut) 상동체로 번역되는 뉴클레오타이드 서열인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 트랜스진 작제물이 헤미센틴(Hemicentin)으로 번역되는 뉴클레오타이드 서열인, 바이러스 벡터.
- 제11항에 있어서, 트랜스진 작제물이 베르시칸(Versican)으로 번역되는 뉴클레오타이드 서열인, 바이러스 벡터.
- 제6항에 있어서, 트랜스진 작제물이 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트인, 바이러스 벡터.
- 제29항에 있어서, DNA 세그먼트가 적어도 Ush2A 유전자의 세그먼트인, 바이러스 벡터.
- 제29항에 있어서, DNA 세그먼트가 적어도 ADGV1 유전자의 세그먼트인, 바이러스 벡터.
- 제29항에 있어서, DNA 세그먼트가 적어도 아이즈 셧 상동체 유전자의 세그먼트인, 바이러스 벡터.
- 제29항에 있어서, DNA 세그먼트가 적어도 헤미센틴 유전자의 세그먼트인, 바이러스 벡터.
- 제29항에 있어서, DNA 세그먼트가 적어도 베르시칸 유전자의 세그먼트인, 바이러스 벡터.
- 제5항에 있어서, 트랜스진 작제물이 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트인, 바이러스 벡터.
- 바이러스 벡터 및 패킹 플라스미드를 포함하는 조성물로서, 상기 바이러스 벡터는 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열, 및 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트로부터 선택되는 트랜스진 작제물을 함유하는, 조성물.
- 트랜스진 작제물을 포함하는 바이러스 벡터를 제공하는 단계를 포함하는 망막 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 트랜스진 작제물은 (a) 프로모터 요소, 10 kb보다 긴 망막 유전자의 오픈 리딩 프레임, 및 터미네이터 서열을 포함하는 DNA 서열, 및 (b) 10 kb보다 긴 망막 유전자의 DNA 세그먼트 중 하나인, 방법.
- 제37항에 있어서, 망막 질환이 어셔 증후군 타입 II A, 어셔 증후군 타입 2C, 색소성 망막염 39, 색소성 망막증 25, 바그너 증후군, 및 연령 관련 황반 변성으로 구성되는 군으로부터 선택되는, 방법.
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