KR101077689B1

KR101077689B1 - 허혈성 질환용 저산소상태 유도성 혈관 내피 성장 인자플라스미드

Info

Publication number: KR101077689B1
Application number: KR1020057015480A
Authority: KR
Inventors: 민형 이; 성완 김
Original assignee: 유니버시티 오브 유타 리써치 파운데이션
Priority date: 2003-02-21
Filing date: 2004-02-23
Publication date: 2011-10-27
Also published as: JP2006518604A; KR20050103302A; WO2004076633A3; EP1594549A2; EP1594549B1; JP4652325B2; US7998941B2; EP1594549A4; US7638322B2; ES2339113T3; US20110015257A1; CA2516727A1; US20070149467A1; DE602004025328D1; CA2516727C; ATE456380T1; WO2004076633A2

Abstract

허혈성 질환, 예를 들면, 허혈성 심장 질환을 치료하는데 유효한 플라스미드를 기술한다. 상기 플라스미드는 저산소상태 조건에서 상향조절되는 프로모터(RTP801)의 조절하에 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 발현한다. 허혈성 질환을 치료하기 위한 제약학적 조성물은 저산소상태-조절된 VEGF 플라스미드 및 제약학적으로 수용가능한 운반체의 혼합물을 함유한다. 허혈성 질환을 치료하는 방법은 이런 제약학적 조성물을 허혈성 질환 환자에게 투여하는 단계를 포함한다.

VEGF 플라스미드

Description

허혈성 질환용 저산소상태 유도성 혈관 내피 성장 인자 플라스미드{HYPOXIA INDUCIBLE VEGF PLASMID FOR ISCHEMIC DISEASE}

본 발명은 유전자 치료법에 관한다. 구체적으로, 본 발명은 저산소상태 조건하에 혈관 내피 성장 인자(VEGF)의 증가된 발현을 위한 플라스미드 시스템에 관한다. 상기 플라스미드 시스템은 허혈성 질환 환자, 예를 들면, 허혈성 심장 질환 환자를 치료하는데 이용될 수 있다.

VEGF를 이용한 유전자 치료법은 허혈성 질환, 예를 들면, 허혈성 심장 질환의 새로운 치료법이다. VEGF 유전자의 허혈성 심장으로의 전달은 나신 DNA 주입, 폴리머성 전달체, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관된 바이러스 전달체를 이용하여 달성되었다(M. Azrin, Angiogenesis, protein and gene delivery, 59 Br. Med. Bull. 211-215(2001); J.M. Isner, Myocardial gene therapy, 415 Nature 234-239(2002); J. Kastrup et al., Vascular growth factor and gene therapy to induce new vessels in the ischemic myocardium. Therapeutic angiogenesis, 35 Scand. Cardiovasc. J. 291-296(2001)). 나신 DNA 주입은 안전한데, 그 이유는 세포독성 또는 심각한 면역 반응을 유도하지 않기 때문이다. 이전의 보고에 따르면, VEGF 유전자의 나신 플라스미드 전달은 허혈성 심 근의 치료에서 유효하다(J.F. Symes et al., Gene therapy with vascular endothelial growth factor for inoperable coronary artery disease, 68 Ann. Thorac. Surg. 830-836, discussion 836-837(1999); P.R. Vale et al., Left ventricular electromechanical mapping to assess efficacy of phVEGF(165) gene transfer for therapeutic angiogenesis in chronic myocardial ischemia, 102 Circulation 965-974(2000); C. Sylven et al., Myocardial Doppler tissue velocity improves following myocardial gene therapy with VEGF A165 plasmid in patients with inoperable angina pectoris, 12 Coron. Artery Dis. 239-243(2001)). 하지만, 나신 플라스미드의 주입은 유전자 발현의 효율이 낮다(J.M. Isner, supra).

플라스미드 전달의 효율을 강화시키기 위하여, 폴리머성 유전자 전달체가 개발되었다. 이들 폴리머성 유전자 전달체에는 TerplexDNA와 수용성 지질폴리머(WSLP) 등이 포함된다(D.G. Affleck et al., Augmentation of myocardial transfection using TerplexDNA: a novel gene delivery system, 8 Gene Ther. 349-353(2001); M. Lee et al., Hypoxia-inducible VEGF gene delivery to ischemic myocardium using & water-soluble lipopolymer, 10 Gene Ther. 1535-1542(2003)). 이들 폴리머성 유전자 전달체는 심근으로의 트랜스펙션 효율을 최대 10배 증가시켰다. 이에 더하여, 유전자 발현의 지속 기간이 나신 DNA에 비하여 연장되었다. 폴리머성 운반체에 의한 유전자 발현의 연장된 지속 기간은 DNA를 뉴클레아제로부터 보호할 수 있는 이들 운반체의 능력에 기인한다. 하지만, 이들 폴리 머성 운반체는 세포에 독성을 나타내고, 트랜스펙션 효율이 바이러스 운반체보다 여전히 낮다.

다른 유전자 전달 방법은 유전자 전달 벡터로서 레트로바이러스, 아데노바이러스, 또는 아데노-연관된 바이러스를 이용하는 것이다. 바이러스-매개된 유전자 전달은 높은 유전자 전달과 발현 활성을 보였다. 일반적으로, 바이러스 운반체는 치료 유전자를 전달하는 가장 효율적인 방법으로 간주된다. 하지만, 바이러스-매개된 유전자 전달은 면역원성, 또는 돌연변이 가능성을 암시하는 숙주 크로모좀 통합을 초래한다(M. Azrin, supra). 이에 더하여, DNA를 피포하기 위한 바이러스 입자의 생산은 나신 DNA 또는 폴리머성 운반체만큼 비용-효율적이지 못하다.

이런 이유로, 각 전달 방법은 개별적인 장점과 단점을 보유하며, 유전자 운반체의 선택은 이용가능성 및 표적 질환에 거의 좌우된다.

VEGF를 이용한 유전자 치료법에서 다른 문제점은 유전자 조절 시스템이다. 현재, VEGF는 혈관신생에 가장 효과적인 치료 유전자이다. 기존에, VEGF 및 이의 수용체는 허혈성 조직에서 상향조절되는 것으로 보고되었다(E. Brogi et al., hypoxia-induced paracrine regulation of vascular endothelial growth factor receptor expression, 97 J. Clin. Invest. 469-476(1996)). 이런 이유로, 허혈증에는 VEGF의 효과가 요구되는 것으로 제안되었다(J.S. Lee & A.M. Feldman, Gene therapy for therapeutic myocardial angiogenesis: a promising synthesis of two emerging technologies, 4 Nature Med. 739-742(1998)). 하지만, Springer 등은 외적으로 전달된 VEGF가 정상적인 비-허혈성 조직에 생리학적 효과를 나타낼 수 있음 을 입증하였다(M.L. Springer et al., VEGF gene delivery to muscle: potential role for vasculogenesis in adults, 2 Mol. Cell 549-558(1998)). 이에 더하여, VEGF의 조절되지 않은 연속 발현은 내피 세포-유래된 장벽내 혈관 종양의 형성과 연관한다(R.J. Lee et al., VEGF gene delivery to myocardium: deleterious effects of unregulated expression, 102 Circulation 898-901(2000)). 이는 VEGF 발현이 조절되어야 함을 암시한다. 이런 이유로, 허혈성 조직에서 VEGF 유전자 발현을 국소적으로 강화시키기 위하여 에리트로포이에틴(Epo) 인헨서가 이용되었다. Epo 인헨서와 SV40 프로모터는 시험관내에서 인간 태아 신장 293 세포 및 생체내에서 토끼 허혈성 심근에서 저산소상태 조건하에 VEGF 유전자 발현을 강화시키는 것으로 밝혀졌다(M. Lee et al., supra). 이에 더하여, Su 등은 저산소상태-반응성 요소(HRE)가 허혈성 심근에서, 아데노-연관된 바이러스를 유전자 운반체로 이용한 VEGF 발현을 매개한다는 것을 입증하였다(H. Su et al., Adeno-associated viral vector-mediated hypoxia response element-regulated gene expression in mouse ischemic heart model, 99 Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 9480-9485(2002). 상기 시험에서, VEGF 유전자는 저산소상태 반응 요소(HRE) 및 SV40 프로모터에 의해 조절되었다. 이런 조절된 VEGF 발현 시스템은 더욱 안전한 VEGF 유전자 치료법에 이용되어 원치않는 부작용을 최소화시킬 수 있다.

상기한 내용에 비추어, 조절된 통제하에 VEGF를 발현시키고 폴리머성 담체로 전달될 수 있는 허혈성 질환의 유전자 치료용 플라스미드를 제공하는 것은 전방 기술의 현저한 개량이다.

본 발명의 요약

본 발명의 전형적인 구체예는 플라스미드 pRTP801-VEGF(SEQ ID NO: 13)에 관하는데, 이는 저산소상태 조건하에 상향조절되는 RTP801 프로모터의 조절하에 VEGF를 발현한다.

본 발명의 다른 전형적인 구체예는 아래의 플라스미드이다: pRTP801-725, pRTP801-645, pRTP801-545, pRTP801-495, pRTP801-445, pRTP801-395, pRTP801-Sp1(-).

본 발명의 다른 측면은 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 인코딩하는 발현 카세트에 인접하여 작동가능하게 배치된 저산소상태-조절된 프로모터 요소를 포함하는 플라스미드에 관하는데, 적절한 세포에서 혈관 내피 성장 인자의 발현은 정상산소상태(normoxia)에 비하여 저산소상태(hypoxia)에서 높게 나타난다. 본 발명의 전형적인 구체예에서, 저산소상태-조절된 프로모터 요소는 RTP801 프로모터를 포함한다.

본 발명의 다른 측면은 pRTP801-VEGF(SEQ ID NO:13) 및 제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체의 혼합물을 함유하는 조성물에 관한다.

본 발명의 또 다른 측면은 허혈성 질환을 치료하는 방법에 관하는데, 상기 방법은 pRTP801-VEGF(SEQ ID NO:13) 및 제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체의 혼합물을 함유하는 조성물을 허혈성 질환 환자에 투여하는 단계를 포함한다.

도 1A에서는 인간 RTP801 프로모터의 다양한 길이의 5'-측부 영역을 보유하 는 pRTP801 루시페라제 리포터 벡터 구조의 개요도를 도시한다.

도 1B에서는 RTP801 프로모터의 5'-측부 영역의 저산소상태 반응성을 도시한다: 상기 리포터 구조체는 인간 태아 신장 293 세포에 일시적으로 트랜스펙션시키고, 상기 세포는 정상산소상태(열린 막대) 또는 저산소상태(닫힌 막대) 조건하에 24시간동안 배양하고 루시페라제 활성을 측정하였다.

도 2A에서는 뉴클레오티드 -495 내지 -446 사이에 pRTP801-725의 야생형 RTP801 프로모터의 뉴클레오티드 서열(SEQ ID NO: 11; Sp1 공통 서열은 밑줄로 표시한다) 및 pRTP801-Sp1(-)의 상응하는 영역(SEQ ID NO: 12; 돌연변이 위치는 상자로 표시한다).

도 2B에서는 프로모터 활성에 대한 RTP801 프로모터의 Sp1 요소에서 돌연변이 효과를 도시한다: 플라스미드 pRTP801-725와 pRTP801-Sp1(-)은 인간 태아 신장 293 세포에 일시적으로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포는 정상산소상태(열린 막대) 또는 저산소상태(닫힌 막대) 조건하에 24시간동안 배양하고 루시페라제 활성을 측정하였다.

도 3에서는 RTP801 프로모터의 저산소상태-유도성에서 Sp1의 역할을 도시한다: 플라스미드 pRTP801-725는 Sp1 센스, Sp1 안티센스, HIF-1α 센스, 또는 HIF-1α 안티센스 올리고뉴클레오티드의 존재하에 인간 태아 신장 293 세포에 일시적으로 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포는 정상산소상태 또는 저산소상태 조건하에 24시간동안 배양하고 루시페라제 활성을 측정하였다.

도 4에서는 다양한 세포주에서 RTP801 프로모터의 저산소상태-유도성을 도시 한다: pRTP801-725 플라스미드는 HUVEC, A7R5, NIH3T3, HepG2 세포에 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포는 정상산소상태(열린 막대) 또는 저산소상태(닫힌 막대) 조건하에 24시간동안 배양하고 루시페라제 활성을 측정하였다.

도 5에서는 pEpo-SV-VEGF와 pRTP801-VEGF의 구조를 도시한다: pEpo-SV-VEGF에는 2개 사본의 Epo 인헨서(E)가 SV40 프로모터에 삽입되었고, pRTP801-VEGF에는 RTP801 프로모터가 VEGF cDNA의 상류에 삽입되었다.

도 6에서는 VEGF 발현 유도를 도시한다: 플라스미드 pEpo-SV-VEGF, pRTP801-VEGF, pSV-Luc(음성 대조)는 인간 태아 신장 293 세포에 트랜스펙션시키고, 상기 세포는 정상산소상태(열린 막대) 또는 저산소상태(닫힌 막대) 조건하에 24시간동안 배양하고, 이후 세포 배양 배지를 수집하고 ELISA로 VEGF 농도를 측정하였다.

저산소상태 유도성 유전자 발현 시스템과 방법을 개시하기에 앞서, 본 발명이 본원에 개시된 특정 형태, 처리 단계, 물질에 한정되지 않음은 명백한데, 그 이유는 이런 형태, 처리 단계, 물질이 다소간 변하기 때문이다. 또한, 본원에 이용된 용어는 특정 구체예의 설명을 목적하며 한정을 의도하지 않는데, 그 이유는 본 발명의 범위가 첨부된 특허청구범위 및 이의 등가물에 의해서만 한정되기 때문이다.

본 발명의 배경을 설명하고 이의 실시와 관련된 추가의 상세를 제공하기 위하여 본원에 인용된 간행물과 다른 참고문헌은 순전히 참조로 한다. 본원에 언급된 참고문헌은 본원의 출원일 이전의 간행물일 뿐이다. 본원에 언급된 어떤 참고문헌에서도 본 발명을 개시하지 않는다.

본 명세서 및 첨부된 특허청구범위에서, 단수 형태는 달리 명시하지 않는 경우에 복수 대상을 포함한다. 가령, “플라스미드”를 투여하는 단계를 포함하는 질환의 치료 방법에 대한 참조는 2개 이상의 이런 플라스미드에 대한 참조를 포함하고, “발현 카세트”를 포함하는 플라스미드에 대한 참조는 2개 이상의 이런 발현 카세트에 대한 참조를 포함하며, “제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체”에 대한 참조는 2개 이상의 이런 유전자 전달 운반체에 대한 참조를 포함한다.

본 발명을 기술하고 청구함에 있어, 아래의 용어는 하기의 정의를 따른다:

본 명세서에서 “포함하는”, “보유하는”, “함유하는”, “에 의해 특성화되는”, 이들의 문법적 등가물은 언급되지 않은 부가적 요소 또는 방법 단계를 배제하지 않는 포괄적 또는 열린 용어이다. “포함하는”은 좀더 제한적인 용어“구성되는”및 “본질적으로 구성되는”을 포괄하는 것으로 해석된다.

본 명세서에서 “구성되는” 및 이의 문법적 등가물은 청구항에 명시되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다.

본 명세서에서 “본질적으로 구성되는” 및 이의 문법적 등가물은 명시된 물질이나 단계 및 청구된 발명의 기초적이고 신규한 특성에 물리적인 영향을 주지 않는 물질이나 단계로 청구 범위를 한정한다.

본 명세서에서 “저산소상태”는 혈액에 의한 조직의 적절한 관류에도 불구하고 조직으로의 산소 공급이 생리 수준 미만으로 감소한 상태를 의미한다. 다시 말하면, 저산소상태는 신체 조직에서 산소 결핍과 관련된다. 시험관내 실험과 관련하여, “저산소상태”는 배양된 세포에 공급되는 산소의 양이 대기에서 대략 20% O₂에 비하여 현저하게 적은 상태, 예를 들면, 1% O₂를 의미한다.

본 명세서에서 “정상산소상태”는 신체 조직에 정상적인 또는 생리 수준의 산소 공급을 의미한다. 시험관내 실험과 관련하여, “정상산소상태”는 배양된 세포에 공급되는 산소의 양이 대기에서와 동일(대략 20% O₂)하다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 “투여” 및 유사 용어는 조성물, 예를 들면, 플라스미드와 운반체의 혼합물을 치료 개체에 전달하여, 상기 조성물이 신체 부위에 전달되고 상기 플라스미드가 표적 세포를 트랜스펙션시키도록 하는 것을 의미한다. 따라서, 조성물은 예로써 전신 투여, 전형적으로 피하, 근육내, 정맥내, 또는 복강내 투여에 의해 개체에 투여된다. 하지만, 당분야에 공지된 바와 같이, 심근 유전자 전달을 수행하기 위한 전달 옵션에는 심외막(epicardial), 심내막(endocardial), 관상동맥내(intracoronary), 역관류(retroperfusion), 심막내(intapericardial) 투여 경로가 포함된다(J.M. Isner, supra). 모든 유형의 벡터는 심외막과 심내막 투여 경로를 통한 심근내 주입 및 심막내 주입에 의해 전달될 수 있다. 관상동맥내와 역관류 전달은 바이러스 벡터 또는 다른 벡터에 의해 보호되지 않는 플라스미드 DNA의 순환기내 분해로 인하여, 비-바이러스 유전자 전달 또는 다른 유전자 전달 방법에 적합하지 않다.

“제약학적으로 수용가능한”은 인간에 투여되는 경우에 생리학적으로 관용되고, 전형적으로 알레르기 반응 또는 유사한 원치않는 반응, 예를 들면, 위장 전도(gastric upset), 현기증 등을 유발하지 않는 분자와 조성물을 의미한다. 가령, “제약학적으로 수용가능한”은 연방 정부 또는 주 정부에 의해 승인되었거나, 미국 약전 또는 동물, 특히 인간에게 이용되는 다른 널리 인정된 약전에 기재되었음을 의미한다.

“유전자 전달 운반체” 및 유사 용어는 핵산의 전달을 위한 바이러스와 비-바이러스 벡터를 의미한다. 상기한 바와 같이, 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스, 렌티바이러스를 비롯한 바이러스 벡터는 일반적으로, 치료 유전자를 전달하는데 가장 효율적인 수단으로 간주된다. 나신 DNA는 전형적으로, 수성 운반체, 예를 들면, 물, 완충액 등에 담겨 전달된다. 치료 핵산의 전달에 이용되는 폴리머성 담체에는 양이온성 리포솜(H.M. Temin, Safety considerations in somatic gene therapy of human disease with retrovirus vectors, 1 Human Gene Therapy 111-123(1990)); 소수성 양이온성 폴리머와 지질단백질의 혼합물("Terplex DNA")(U.S. Patent No. 5,679,559); 수용성 지질폴리머(WSLP)(D.G. Affleck et al., supra) 등이 포함된다.

혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 이용한 혈관형성 유전자 치료법은 허혈성 질환에 새로운 치료법이다. 안전하고 효과적인 유전자 치료법을 위하여, VEGF는 조절되어야 하고, VEGF 발현은 허혈성 조직에서 국소적으로 강화되어야 한다. 본 연구에서, RTP801 프로모터의 저산소상태 유도를 담당하는 cis-조절 요소가 확인되었다. cis-조절 요소를 확인하기 위하여, 다양한 방법으로 RTP801 프로모터를 분석하였다. 루시페라제 검사에서, -495 내지 -445 사이의 영역이 저산소상태 유도된 전사를 담당하는 것으로 밝혀졌다. 상기 영역에는 강력한 Sp1 결합 요소가 존재하였다. Sp1 부위의 돌연변이는 RTP801 프로모터의 저산소상태-유도된 전사를 감소시켰다. 이에 더하여, 안티센스 Sp1 올리고뉴클레오티드와의 동시-트랜스펙션이 프로모터 활성을 감소시켰다. 이들 결과는 RTP801 프로모터의 저산소상태 유도가 Sp1에 의해 매개된다는 것을 암시한다.

이에 더하여, 치료 플라스미드로서 RTP801-VEGF(SEQ ID NO:13) 플라스미드를 평가하였다. RTP801 프로모터는 다양한 세포주에서 저산소상태 조건하에 유도성인 것으로 밝혀졌는데, 이는 유전자 치료 목적에 이용되는 프로모터에 바람직한 특성이다. 이들 결과는 RTP801 프로모터가 293(인간 태아 신장) 세포, NIH3T3(생쥐 섬유아세포) 세포, HepG2(인간 간세포) 세포, A7R5(쥐 평활근) 세포, HUVEC(인간 배꼽 혈관 내피) 세포에서 활성이고 유도성임을 확증하였다. pRTP801-VEGF 플라스미드는 RTP801 프로모터를 VEGF-인코딩 플라스미드에 삽입하여 작제하였다. 생성된 pRTP801-VEGF 플라스미드는 Epo(에리트로포이에틴) 인헨서와 SV40 프로모터 시스템을 보유하는 pEpo-SV-VEGF보다 강한 기초 수준과 유도된 수준의 VEGF 발현을 보였다. 이에 더하여, pRTP801-VEGF에 의한 VEGF 발현이 저산소상태 조건하에 유도되었다. 이런 이유로, 저산소상태 조건하에 강한 기초 프로모터 활성과 유도를 보이는 pRTP801-VEGF는 허혈성 질환용 VEGF 유전자 치료법에 이용될 수 있다.

허혈성 질환은 pRTP801-VEGF를 허헐성 질환 환자에 투여함으로써 치료될 수 있다. pRTP801-VEGF 플라스미드는 전형적으로, 제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체와 혼합된다. 나신 DNA를 전달하는 경우에, 플라스미드는 물, 완충액 등과 혼합된다. 폴리머성 운반체를 이용한 전달의 경우에, 플라스미드는 선택된 폴리머성 운반체와 혼합된다. 리포솜을 이용한 전달의 경우에, 플라스미드는 리포솜과 혼합하여 DNA가 리포솜에 통합되도록 한다. 이후, 플라스미드-보유 혼합물은 환자에 투여된다. 가령, 허혈성 심장 질환 환자를 치료하는 경우에, 플라스미드-보유 혼합물은 당분야에 공지된 심근내 주입 절차에 의해 주입된다. 플라스미드에 노출된 세포 일부는 플라스미드를 흡수하고 VEGF를 발현한다. 생물학적 효과를 달성하기 위하여 세포내에 체류해야 하는 단백질을 인코딩하는 유전자는 기초 병리 결함을 교정하기 위하여 상대적으로 대량의 표적 세포 개체군에 전달되어야 하는 반면, 자연적으로 분비되는 단백질을 인코딩하는 유전자는 트랜스펙션된 세포가 상당량의 유전자 산물을 분비하는 경우에, 제한된 수의 세포가 트랜스펙션되어도 긍정적인 효과를 달성할 수 있다. 세포에서 발현된 VEGF는 신호 서열을 보유하고, 따라서 트랜스펙션된 세포로부터 활발하게 분비된다. 분비된 VEGF는 여러 표적 세포의 생활성을 조절하는 외분비 효과를 달성한다.

플라스미드 pRTP801-725, pRTP801-645, pRTP801-545, pRTP801-495, pRTP801-445, pRTP801-395, pRTP801-SP1(-)은 저산소상태에 의해 유도되거나 유도되지 않는 유전자 산물의 발현을 위한 플라스미드 구조체를 제조하는데 유용하다. 가령, 플라스미드 pRTP801-725, pRTP801-645, pRTP801-545, pRTP801-495는 다양한 길이의 RTP801 프로모터 영역을 보유하는데, 이들 모든 플라스미드가 저산소상태 유도성을 보인다. 이들 프로모터 영역은 저산소상태하에서 발현이 유도되는 선택된 유전자 산물의 발현에 효과적인 플라스미드를 작제하는데 이용될 수 있다. 가령, 이들 프로모터 영역은 실시예 10의 절차에 따라, VEGF의 저산소상태-유도성 발현을 보이는 플라스미드를 제조하는데 이용될 수 있다. 다른 예로써, 플라스미드 pRTP801-445와 pRTP801-395는 유전자 산물의 저산소상태-유도성 발현을 유도하지 않도록 절제된 다양한 길이의 RTP801 프로모터 영역을 보유한다. 이런 이유로, 이들 프로모터 영역은 실시예 10의 절차에 따라, VEGF를 상대적으로 낮은 수준으로 발현하고, 저산소상태하에서 발현이 유도되지 않는 플라스미드를 제조하는데 이용될 수 있다. 유사하게, 플라스미드 pRTP801-SP1(-)은 유전자 산물의 저산소상태-유도성 발현을 유도하지 않는 돌연변이된 RTP801 프로모터 영역을 보유한다. 이런 이유로, 상기 프로모터 영역은 실시예 10의 절차에 따라, VEGF를 상대적으로 낮은 수준으로 발현하고, 저산소상태하에서 발현이 유도되지 않는 플라스미드를 제조하는데 이용될 수 있다.

실시예 1: pRTP801-725의 작제

RTP801 프로모터는 당분야에 공지된 절차에 따라 HepG2(인간 간) 세포로부터 얻은 게놈 DNA를 이용한 PCR로 클론하였다. HepG2 세포는 ATCC(Manassas, Virginia)로부터 구하고, 5% CO₂ 배양기에서 10% 소 태아 혈청(FBS)으로 보충된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium)에 유지시켰다. 게놈 DNA는 Qiagen DNeasy Tissue 시스템(Qiagen, Valencia, California)을 이용하여 HepG2 세포로부터 추출하였다. RTP801 프로모터의 증폭을 위한 전방과 후방 프라이머 서열은 각각 SEQ ID NO:2와 SEQ ID NO:3이었다. 용이한 클로닝을 위하여 BglII와 HindIII 제한 엔도뉴클레아제 부위를 전방과 후방 프라이머에 조작하였다. PCR-증폭된 RTP801(725개 염기) 단편은 BglII와 HindIII 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고 겔 전기영동과 용리로 정제하였다. pGL3-프로모터 플라스미드(SEQ ID NO:1)는 Promega(Madison, Wisconsin)로부터 구입하였다. SV40 프로모터는 BglII와 HindIII 제한 엔도뉴클레아제로 절단하여 pGL3-프로모터 플라스미드로부터 제거하고, 플라스미드 골격은 겔 전기영동과 용출로 정제하였다. RTP801 프로모터 단편은 BglII-와 HindIII-절단된 pGL3-프로모터 플라스미드에 결찰시켜 pRTP801-725를 작제하였다. 클론된 RTP801 프로모터의 통합은 당분야에 널리 공지된 절차에 따라 DNA 서열분석으로 확증하였다.

실시예 2: pRTP801-645의 작제

RTP801 프로모터의 5'-영역에서 결실을 PCR로 수행하였다. 후방 프라이머(SEQ ID NO:3)는 실시예 1에서와 동일하였다. 전방 프라이머는 SEQ ID NO:4인데, 이는 BglII 제한 엔도뉴클레아제 부위를 보유하였다. PCR 단편은 실시예 1의 절차에 따라 pGL3-프로모터 벡터에 서브클론하였다. 생성된 플라스미드는 pRTP801-645로 명명되었는데, 그 이유는 뉴클레오티드 -645의 상류 DNA가 결실되었기 때문이다. 프로모터 단편의 통합은 DNA 서열분석으로 확증하였다.

실시예 3: pRTP801-545의 작제

RTP801 프로모터의 5'-영역에서 다른 결실을 PCR로 수행하였다. 후방 프라이머(SEQ ID NO:3)는 실시예 1에서와 동일하였다. 전방 프라이머는 SEQ ID NO:5인데, 이는 BglII 제한 엔도뉴클레아제 부위를 보유하였다. PCR 단편은 실시예 1의 절차에 따라 pGL3-프로모터 벡터에 서브클론하였다. 생성된 플라스미드는 pRTP801-545로 명명되었는데, 그 이유는 뉴클레오티드 -545의 상류 DNA가 결실되었기 때문이다. 프로모터 단편의 통합은 DNA 서열분석으로 확증하였다.

실시예 4: pRTP801-495의 작제

RTP801 프로모터의 5'-영역에서 다른 결실을 PCR로 수행하였다. 후방 프라이머(SEQ ID NO:3)는 실시예 1에서와 동일하였다. 전방 프라이머는 SEQ ID NO:6인데, 이는 BglII 제한 엔도뉴클레아제 부위를 보유하였다. PCR 단편은 실시예 1의 절차에 따라 pGL3-프로모터 벡터에 서브클론하였다. 생성된 플라스미드는 pRTP801-495로 명명되었는데, 그 이유는 뉴클레오티드 -495의 상류 DNA가 결실되었기 때문이다. 프로모터 단편의 통합은 DNA 서열분석으로 확증하였다.

실시예 5: pRTP801-445의 작제

RTP801 프로모터의 5'-영역에서 다른 결실을 PCR로 수행하였다. 후방 프라이머(SEQ ID NO:3)는 실시예 1에서와 동일하였다. 전방 프라이머는 SEQ ID NO:7인데, 이는 BglII 제한 엔도뉴클레아제 부위를 보유하였다. PCR 단편은 실시예 1의 절차에 따라 pGL3-프로모터 벡터에 서브클론하였다. 생성된 플라스미드는 pRTP801-445로 명명되었는데, 그 이유는 뉴클레오티드 -445의 상류 DNA가 결실되었기 때문이다. 프로모터 단편의 통합은 DNA 서열분석으로 확증하였다.

실시예 6: pRTP801-395의 작제

RTP801 프로모터의 5'-영역에서 다른 결실을 PCR로 수행하였다. 후방 프라이 머(SEQ ID NO:3)는 실시예 1에서와 동일하였다. 전방 프라이머는 SEQ ID NO:8인데, 이는 BglII 제한 엔도뉴클레아제 부위를 보유하였다. PCR 단편은 실시예 1의 절차에 따라 pGL3-프로모터 벡터에 서브클론하였다. 생성된 플라스미드는 pRTP801-395로 명명되었는데, 그 이유는 뉴클레오티드 -395의 상류 DNA가 결실되었기 때문이다. 프로모터 단편의 통합은 DNA 서열분석으로 확증하였다.

실시예 7: 저산소상태에 대한 RTP801 프로모터의 반응성의 결실 분석

RTP801 프로모터에서 저산소상태 유도에 필요한 영역을 확인하기 위하여, ATG 번역 개시 코돈으로부터 725 bp 상류까지 RTP801 프로모터의 5'-측부 영역의 다양한 단편을 루시페라제 리포터 유전자 플라스미드에 클론하였다(도 1; 실시예 1- 6).

이들 구조체는 폴리에틸렌이민(PEI; 25,OOO Da)을 유전자 운반체로 이용하여 인간 태아 신장 293 세포에 트랜스펙션시켰다. 293 세포는 5% CO₂에서 10% FBS로 보충된 DMEM에 유지시켰다. 트랜스펙션 검사를 위하여, 이들 세포는 트랜스펙션 24시간 전에 35 ㎜ 세포 배양 접시(Falcon Co., Becton Dickenson, Franklin Lakes, New Jersey)에 5.0 x 1O⁵ 세포/웰의 밀도로 접종하였다. 플라스미드/PEI 복합체는 5/1 N/P 비율로 제조하고 실온에서 30분동안 배양하였다. 세포는 혈청 없는 배지로 2회 세척하고, 2 ㎖의 새로운 혈청-없는 배지를 첨가하였다. 플라스미드/PEI 복합체를 각 접시에 첨가하였다. 이후, 이들 세포는 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 4시간동안 배양하였다. 4시간후, 트랜스펙션 혼합물을 이전하고, FBS를 함유하는 2 ㎖의 새로 운 배지를 첨가하였다.

트랜스펙션된 세포는 저산소상태(1% O₂) 또는 정상산소상태(20% O₂) 조건하에 20시간동안 배양하였다. 배양이후, 세포는 인산염 완충액(PBS)으로 2회 세척하고, 150 ㎕의 리포터 용해 완충액(Promega, Madison, Wisconsin)을 각 웰에 첨가하였다. 실온에서 15분동안 배양한 이후, 세포는 수거하고 마이크로원심분리 튜브에 이전하였다. 15초동안 교반한 이후, 세포는 11,000 rpm에서 3분동안 원심분리하였다. 추출액은 새로운 튜브로 이전하고 사용 때까지 -70℃에 보관하였다. 추출액의 단백질 농도는 BCA 단백질 검사 키트(Pierce, Iselin, New Jersey)를 이용하여 측정하였다. 루시페라제 활성은 96-웰 평판 발광계(Dynex Technologies Inc. Chantilly, Virginia)를 이용하여 상대적 발광 단위(RLU)로 측정하였다. 루시페라제 활성은 60초동안 모니터하고 합계를 구하였다.

루시페라제 최종 수치는 RLU/㎎ 전체 단백질로 보고되었다.

결과로서, pRTP801-725, pRTP801-645, pRTP801-545, pRTP801-495의 활성은 저산소상태 조건하에 증가하였다. 하지만, pRTP801-445의 활성은 증가하지 않았다(도 1). 이들 결과는 저산소상태에 반응하는 cis-조절 요소가 뉴클레오티드 -495 내지 -445 사이에 위치한다는 것을 암시한다. 상기 영역의 서열은 SEQ ID NO: 11이다.

실시예 8: RTP801 프로모터의 유도에서 Sp1의 역할

서열 분석에서 -495 내지 -445 사이의 영역에서 강력한 Sp1 공통 결합 부위 가 존재하는 것으로 밝혀졌다. 상기 Sp1 결합 부위의 돌연변이 효과를 평가하기 위하여, 부위 직접 돌연변이 유발을 수행하였다. GGCG(459-462) 서열을 TTAT 서열로 치환하여, pRTP801-SP1(-)(도 2A; SEQ ID NO:12)을 작제하였다. Sp1 변이 구조체는 pRTP801-725 구조체를 주형으로 하는 QuickChange 부위 직접 돌연변이 유발 키트(Stratagene, La Jolla, California)를 이용하여 발생시켰다. 돌연변이된 Sp1 올리고뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO:9(Sp1 변이체, 상류가닥)와 SEQ ID NO:10(하류가닥)이었다.

플라스미드 pRTP801-725(야생형)와 pRTP801-SP1(-)은 293 세포에 트랜스펙션시키고, 트랜스펙션된 세포는 실시예 7의 절차에 따라 저산소상태 또는 정상산소상태 조건하에 배양하였다. 배양이후, 루시페라제 활성 역시 실시예 7의 절차에 따라 측정하였다. pRTP801-SP1(-)로 트랜스펙션된 세포에서 RTP801 프로모터의 저산소상태 유도는 pRTP801-725로 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소하였다(도 2B). 이런 이유로, 상기 결과는 RTP801 프로모터에서 Sp1 요소가 RTP801 프로모터의 저산소상태 유도에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 암시한다.

Sp1이 RTP801 프로모터의 저산소상태 유도에 중요하다는 것을 입증하는 다른 방법은 Sp1에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 이용하는 것이다(도 3). 안티센스 Sp1 올리고뉴클레오티드는 293 세포에서 pRTP801-725와 함께 동시-트랜스펙션시켰다. 대조로서, 센스 Sp1 올리고뉴클레오티드는 pRTP801-725와 함께 동시-트랜스펙션시켰다. 또한, 안티센스 HIF-1 또는 센스 HIF-1 올리고뉴클레오티드는 pRTP801-725와 동시-트랜스펙션시켜 HIF-1의 효과를 평가하였다. 트랜스펙션된 세 포는 저산소상태 조건하에 20시간동안 배양하였다. 세포 추출액은 세포로부터 준비하고 루시페라제 활성을 측정하였다. 결과로서, 안티센스 Sp1 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션된 세포에서 RTP801 프로모터의 활성은 센스 Sp1 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션된 세포에 비하여 감소하였다(도 3). 이런 결과는 Sp1이 RTP801 프로모터의 저산소상태 유도를 매개한다는 것을 암시한다. 다른 한편, 안티센스 HIF-1 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙션된 세포에서 RTP801 프로모터의 활성이 약간 감소하였는데, 이는 HIF-1의 역할을 암시한다.

실시예 9: 다양한 세포주에서 RTP801 프로모터의 전사 유도

RTP801 프로모터를 다양한 장기에서 유전자 치료법에 적용하기 위하여, RTP801 프로모터가 유전자 발현에서 세포-유형 특이성(cell-type specificity)을 보유하지 않는다는 것을 확인하는 것이 중요하였다. RTP801 프로모터가 다양한 유형의 세포에서 유도될 수 있는 지를 검사하기 위하여, HWEC(인간 배꼽 혈관 내피), A7R5(쥐 평활근), NIH3T3(생쥐 섬유아세포 세포), HepG2(인간 간세포) 세포를 pRTP801-725로 트랜스펙션시켰다. A7R5, NIH3T3, HUVEC 세포는 ATCC로부터 구입하였다. A7R5, NIH3T3, HepG2 세포는 5% CO₂ 배양기에서 10% FBS로 보충된 DMEM에 유지시켰다. HWEC 세포는 5% CO₂ 배양기에서 10% FBS, 2 mM L-글루타민, 1.5 ㎎/㎖ 중탄산나트륨, 0.1 ㎎/㎖ 헤파린, 0.04 ㎎/㎖ 내피 세포 성장 보충물질(ECGS)로 보충된 F-12K 배지에 유지시켰다.

실시예 7의 절차에 따라 수행된 루시페라제 분석에서 RTP801 프로모터는 저 산소상태 조건하에 대략 2~4배의 유전자 발현을 유도하는 것으로 밝혀졌다(도 4). 이런 이유로, RTP801 프로모터는 다양한 세포 유형에서 저산소상태에 의해 유도될 수 있다.

실시예 10: VEGF 발현은 RTP801 프로모터를 매개한다

RTP801 프로모터를 VEGF 유전자 치료법에 적용하기 위하여, VEGF cDNA의 상류에 RTP801 프로모터를 삽입하여 플라스미드 pRTP801 VEGF(SEQ ID NO: 13)를 작제하였다(도 5). 앞서 작제된 pEpo-SV-VEGF 플라스미드는 양성 대조 플라스미드로 이용하였다(M. Lee et al., supra). 기존의 보고서에 따르면, pEpo-SV-VEGF 플라스미드는 24시간의 저산소상태 배양이후 저산소상태 세포에서 VEGF 유전자 발현을 유도하였다. 플라스미드 pRTP801-VEGF와 pEpo-SV-VEGF는 실시예 7의 절차에 따라 PEI를 유전자 운반체로 하여 인간 태아 신장 293 세포에 트랜스펙션시켰다. 플라스미드 pCMV-Luc(Stratagene, La Jolla, California)는 음성 대조로서 트랜스펙션시켰다. 트랜스펙션된 세포는 저산소상태하에 20시간동안 배양하였다. 세포 배양 배지는 수집하고 ELISA로 VEGF 유전자의 발현 수준을 측정하였다.

ELISA는 ChemiKine 인간 혈관 내피 성장 인자 샌드위치 ELISA 키트(Chemicon, Temecula, California)를 이용하여 수행하였다. 1/100 ㎕ 샘플을 마이크로역가 평판의 지정된 웰에 첨가하였다. 25 ㎕의 비오틴화된 토끼 항-인간 VEGF 다클론 항체를 각 웰에 첨가하고, 평판을 실온에서 3시간동안 배양하였다. 배양이후, 평판은 세척 완충액으로 7회 세척하였다. 50 ㎕의 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타아제를 각 웰에 첨가하고, 평판을 실온에서 45분동안 배양하였다. 배양이후, 평판은 세척 완충액으로 7회 세척하였다. 이후, 기질을 각 웰에 첨가하고, 490 nm에서 흡광도를 측정하였다. VEGF 농도의 비교는 스튜던트 t-검정(Student's t-test)으로 수행하였다. 0.05 미만의 P 값은 통계학적으로 유의한 것으로 간주하였다.

결과로서, VEGF 발현 수준은 pRTP801-VEGF 트랜스펙션된 세포와 pEpo-SV-VEGF 트랜스펙션된 세포 모두에서 유도되었다(도 6). 하지만, RTP801 프로모터의 조절하에 VEGF 발현의 기초 또는 유도 수준은 Epo 인헨서-SV40 프로모터의 조절하에 VEGF 발현의 기초 또는 유도 수준보다 높게 나타났다.

서열 목록

SEQ ID NO: 1, 수치 식별자 223: pGL3-프로모터 벡터.

SEQ ID NO:2, 수치 식별자 223: RTP801 전방 프라이머.

SEQ ID NO:3, 수치 식별자 223: RTP801 후방 프라이머.

SEQ ID NO:4, 수치 식별자 223: RTP801-645 전방 프라이머.

SEQ ID NO:5, 수치 식별자 223: RTP801-545 전방 프라이머.

SEQ ID NO:6, 수치 식별자 223: RTP801-495 전방 프라이머.

SEQ ID NO:7, 수치 식별자 223: RTP801-445 전방 프라이머.

SEQ ID NO:8, 수치 식별자 223: RTP801-395 전방 프라이머.

SEQIDNO:9, 수치 식별자 223: Sp1 변이 상향가닥 프라이머.

SEQ ID NO: 10, 수치 식별자 223: Sp1 하향가닥 프라이머.

SEQ ID NO: 13, 수치 식별자 223: 플라스미드 pRTP801-VEGF.

SEQUENCE LISTING <110> University of Utah Research Foundation Lee, Minhyung Kim, Sung Wan <120> Hypoxia-Inducible VEGF Plasmid for Ischemic Disease <130> T10073.PCT <150> US 60/448,961 <151> 2003-02-21 <160> 13 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 5010 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> pGL3-Promoter Vector <400> 1 ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tgcgatctgc atctcaatta 60 gtcagcaacc atagtcccgc ccctaactcc gcccatcccg cccctaactc cgcccagttc 120 cgcccattct ccgccccatc gctgactaat tttttttatt tatgcagagg ccgaggccgc 180 ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt tttggaggcc taggcttttg 240 caaaaagctt ggcattccgg tactgttggt aaagccacca tggaagacgc caaaaacata 300 aagaaaggcc cggcgccatt ctatccgctg gaagatggaa ccgctggaga gcaactgcat 360 aaggctatga agagatacgc cctggttcct ggaacaattg cttttacaga tgcacatatc 420 gaggtggaca tcacttacgc tgagtacttc gaaatgtccg ttcggttggc agaagctatg 480 aaacgatatg ggctgaatac aaatcacaga atcgtcgtat gcagtgaaaa ctctcttcaa 540 ttctttatgc cggtgttggg cgcgttattt atcggagttg cagttgcgcc cgcgaacgac 600 atttataatg aacgtgaatt gctcaacagt atgggcattt cgcagcctac cgtggtgttc 660 gtttccaaaa aggggttgca aaaaattttg aacgtgcaaa aaaagctccc aatcatccaa 720 aaaattatta tcatggattc taaaacggat taccagggat ttcagtcgat gtacacgttc 780 gtcacatctc atctacctcc cggttttaat gaatacgatt ttgtgccaga gtccttcgat 840 agggacaaga caattgcact gatcatgaac tcctctggat ctactggtct gcctaaaggt 900 gtcgctctgc ctcatagaac tgcctgcgtg agattctcgc atgccagaga tcctattttt 960 ggcaatcaaa tcattccgga tactgcgatt ttaagtgttg ttccattcca tcacggtttt 1020 ggaatgttta ctacactcgg atatttgata tgtggatttc gagtcgtctt aatgtataga 1080 tttgaagaag agctgtttct gaggagcctt caggattaca agattcaaag tgcgctgctg 1140 gtgccaaccc tattctcctt cttcgccaaa agcactctga ttgacaaata cgatttatct 1200 aatttacacg aaattgcttc tggtggcgct cccctctcta aggaagtcgg ggaagcggtt 1260 gccaagaggt tccatctgcc aggtatcagg caaggatatg ggctcactga gactacatca 1320 gctattctga ttacacccga gggggatgat aaaccgggcg cggtcggtaa agttgttcca 1380 ttttttgaag cgaaggttgt ggatctggat accgggaaaa cgctgggcgt 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ttgatctttt 3120 ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 3180 tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 3240 aaagtatata tgagtaaact tggtctgaca gttaccaatg cttaatcagt gaggcaccta 3300 tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 3360 ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 3420 gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 3480 gtggtcctgc aactttatcc gcctccatcc agtctattaa ttgttgccgg gaagctagag 3540 taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 3600 tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 3660 ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 3720 tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 3780 ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagtactca accaagtcat 3840 tctgagaata gtgtatgcgg cgaccgagtt gctcttgccc ggcgtcaata cgggataata 3900 ccgcgccaca tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa 3960 aactctcaag gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca 4020 actgatcttc agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc 4080 aaaatgccgc aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc 4140 tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga tacatatttg 4200 aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga aaagtgccac 4260 ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 4320 ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 4380 ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 4440 ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 4500 ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 4560 gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 4620 tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 4680 ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttg ccattcgcca ttcaggctgc 4740 gcaactgttg ggaagggcga tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag cccaagctac 4800 catgataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtacttgg agcggccgca ataaaatatc 4860 tttattttca ttacatctgt gtgttggttt tttgtgtgaa tcgatagtac taacatacgc 4920 tctccatcaa aacaaaacga aacaaaacaa actagcaaaa taggctgtcc ccagtgcaag 4980 tgcaggtgcc agaacatttc tctatcgata 5010 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RTP801 forward primer <400> 2 gaagatctag ctttaggatc caagacgc 28 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RTP801 backward primer <400> 3 cccaagcttg gtgaggacag acgccagg 28 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RTP801-645 forward primer <400> 4 gaagatctct ggtcacgggc tgtcccct 28 <210> 5 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RTP801-545 forward primer <400> 5 gaagatctct gcagccgccg cggatcct 28 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RTP801-495 forward primer <400> 6 gaagatctgg ttcgactgcg agctttct 28 <210> 7 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RTP801-445 forward primer <400> 7 gaagatctgt caccgggcag gagagaac 28 <210> 8 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> RTP801-395 forward primer <400> 8 gaagatctca aggcgggcca cactcccg 28 <210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sp1 mutant upstrand primer. <400> 9 ctggggctca atggattatg ggcccggccg ctgt 34 <210> 10 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Sp1 downstrand primer. <400> 10 acagcggccg ggcccataat ccattgagcc ccag 34 <210> 11 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 ggttcgactg cgagctttct ggggctcaat ggaggcgggg cccggccgct 50 <210> 12 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Mutant Sp1 site. <400> 12 ggttcgactg cgagctttct ggggctcaat ggattatggg cccggccgct 50 <210> 13 <211> 4425 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Plasmid pRTP801-VEGF. <400> 13 ggtaccgagc tcttacgcgt gctagcccgg gctcgagatc tagctttagg atccaagacg 60 ctgggggcaa ccattttcct tgcccgccgc cccctcacgc ttccctgcct ctcctcctag 120 cctggtcacg ggctgtcccc tcctccagca atgcaaccct ataataaaca agtctttcct 180 tgatcctccc ctgccgcgag cgccctcggg gaccttggca gctgcagccg ccgcggatcc 240 tttccagaaa gggggcgtgg cggtgggtcg gggttcgact gcgagctttc tggggctcaa 300 tggaggcggg gcccggccgc tgtcaccggg caggagagaa cgttgcttac gtgcgcccgg 360 agtccattgg ccaaggcggg ccacactccc gggtctggat tgggtcgtgg cgcagagaag 420 gcgtggcctc gccgcgctag tccttatagg ctgctccgcg ctggtgctag ggcgcagcag 480 gccaaggggg aggtgcgagc gtggacctgg gacgggtctg ggcggctctc ggtggttggc 540 acgggttcgc acacccattc aagcggcagg acgcacttgt cttagcagtt ctcgctgacc 600 gcgctagctg gtgagtgtcc cttctgtgtg tgggtcctag agctcgcggt ctggtctggt 660 ctggtcccca gactgacgcc tggtcggtcc ccctcttgtc ttacagcggc ttctacgctc 720 cggcactctg agttcatcag caaacgccct ggcgtctgtc ctcaccaagc ttatgaactt 780 tctgctgtct tgggtgcatt ggagccttgc cttgctgctc tacctccacc atgccaagtg 840 gtcccaggct gcacccatgg cagaaggagg ggggcagaat catcacgaag tggtgaagtt 900 catggatgtc tatcagcgca gctactgcca tccaatcgag accctggtgg acatcttcca 960 ggagtaccct gatgagatcg agtacatctt caagccatcc tgtgtgcccc tgatgcgatg 1020 cgggggctgc tgcaatgacg agggcctgga gtgtgtgccc actgaggagt ccaacatcac 1080 catgcagatt atgcggatca aacctcacca aggccagcac ataggagaga tgagcttcct 1140 acagcacaac aaatgtgaat gcagaccaaa gaaagataga gcaagacaag aaaatccctg 1200 tgggccttgc tcagagcgga gaaagcattt gtttgtacaa gatccgcaga cgtgtaaatg 1260 ttcctgcaaa aacacagact cgcgttgcaa ggcgaggcag cttgagttaa acgaacgtac 1320 ttgcagatgt gacaagccga ggcggtgatc tagagtcggg gcggccggcc gcttcgagca 1380 gacatgataa gatacattga tgagtttgga caaaccacaa ctagaatgca gtgaaaaaaa 1440 tgctttattt gtgaaatttg tgatgctatt gctttatttg taaccattat aagctgcaat 1500 aaacaagtta acaacaacaa ttgcattcat tttatgtttc aggttcaggg ggaggtgtgg 1560 gaggtttttt aaagcaagta aaacctctac aaatgtggta aaatcgataa ggatccgtcg 1620 accgatgccc ttgagagcct tcaacccagt cagctccttc cggtgggcgc ggggcatgac 1680 tatcgtcgcc gcacttatga ctgtcttctt tatcatgcaa ctcgtaggac aggtgccggc 1740 agcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 1800 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 1860 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 1920 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 1980 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 2040 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 2100 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2160 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 2220 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 2280 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 2340 ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 2400 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 2460 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 2520 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 2580 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 2640 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 2700 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 2760 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 2820 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 2880 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 2940 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 3000 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 3060 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 3120 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 3180 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 3240 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 3300 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 3360 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 3420 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 3480 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 3540 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 3600 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 3660 cccgaaaagt gccacctgac gcgccctgta gcggcgcatt aagcgcggcg ggtgtggtgg 3720 ttacgcgcag cgtgaccgct acacttgcca gcgccctagc gcccgctcct ttcgctttct 3780 tcccttcctt tctcgccacg ttcgccggct ttccccgtca agctctaaat cgggggctcc 3840 ctttagggtt ccgatttagt gctttacggc acctcgaccc caaaaaactt gattagggtg 3900 atggttcacg tagtgggcca tcgccctgat agacggtttt tcgccctttg acgttggagt 3960 ccacgttctt taatagtgga ctcttgttcc aaactggaac aacactcaac cctatctcgg 4020 tctattcttt tgatttataa gggattttgc cgatttcggc ctattggtta aaaaatgagc 4080 tgatttaaca aaaatttaac gcgaatttta acaaaatatt aacgcttaca atttgccatt 4140 cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac 4200 gccagcccaa gctaccatga taagtaagta atattaaggt acgggaggta cttggagcgg 4260 ccgcaataaa atatctttat tttcattaca tctgtgtgtt ggttttttgt gtgaatcgat 4320 agtactaaca tacgctctcc atcaaaacaa aacgaaacaa aacaaactag caaaataggc 4380 tgtccccagt gcaagtgcag gtgccagaac atttctctat cgata 4425

Claims

SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 1-4425로 구성되는 플라스미드 pRTP801-VEGF.
RTP801 번역 개시 코돈으로부터 상류에 -495 내지 -455 사이의 뉴클레오티드를 포함하는 절두된(truncated) RTP801 프로모터를 포함하는 플라스미드에 있어서, 상기 플라스미드는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 인코딩하는 발현 카세트에 인접하여 작동가능하게 배치되고, 저산소상태에서 조절되어 포유동물 세포에 상기 플라스미드의 전달이후 정상산소상태(normoxia)에서보다 저산소상태에서 혈관 내피 성장 인자의 높은 발현이 달성되는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 1-4425로 구성되는 pRTP801-VEGF 및 제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체의 혼합물을 함유하는 허혈성 질환 치료용 조성물.
SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 1-4425로 구성되는 pRTP801-VEGF 및 제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체의 혼합물을 함유하고, 상기 전달 운반체는 표적 세포에 의해 혈관 내피 성장 인자가 발현되도록 pRTP801-VEGF를 표적 세포 내로 전달하는 허혈성 질환 치료용 조성물.
제 3항 또는 4항에 있어서, 허혈성 질환은 허혈성 심장 질환이고, 표적 세포는 심근 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 조성물.
SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 1-4425로 구성되는 pRTP801-VEGF 및 제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체의 혼합물을 함유하고, 상기 전달 운반체는 심근 세포에 의해 혈관 내피 성장 인자가 발현되도록 pRTP801-VEGF를 심근 세포 내로 전달하는 허혈성 심장 질환 치료용 조성물.
하기 성분의 혼합물을 함유하는 허혈성 질환 치료용 조성물:

(a) RTP801 번역 개시 코돈으로부터 상류에 Sp1 결합 부위가 포함된 -495 내지 -455 사이의 뉴클레오티드를 포함하는 절두된(truncated) RTP801 프로모터를 포함하는 플라스미드에 있어서, 상기 플라스미드는 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 인코딩하는 발현 카세트에 인접하여 작동가능하게 배치되고, 저산소상태에서 조절되어 포유동물 세포에 상기 플라스미드의 전달이후 정상산소상태(normoxia)에서보다 저산소상태에서 혈관 내피 성장 인자의 높은 발현이 달성되고;

(b) 상기 플라스미드가 표적 세포로 전달되고 혈관 내피 성장 인자가 이들 세포에서 발현되도록 하는 제약학적으로 수용가능한 유전자 전달 운반체.
제 7항에 있어서, 플라스미드는 SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 1-4425로 구성되는 pRTP801-VEGF인 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 조성물.
제 7항에 있어서, 허혈성 질환은 허혈성 심장 질환이고, 표적 세포는 심근 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 허혈성 질환 치료용 조성물.
뉴클레오티드 42-244가 SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 42-766으로 치환된 SEQ ID No: 1로 구성되는 pRTP801-725; 뉴클레오티드 42-244가 SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 122-766으로 치환된 SEQ ID No: 1로 구성되는 pRTP801-645; 뉴클레오티드 42-244가 SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 222-766으로 치환된 SEQ ID No: 1로 구성되는 pRTP801-545; 또는 뉴클레오티드 42-244가 SEQ ID No: 13의 뉴클레오티드 272-766으로 치환된 SEQ ID No: 1로 구성되는 pRTP801-495에서 선택되는 플라스미드를 함유하는 조성물.
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