KR102283915B1 - 인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1) 생산 발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류 - Google Patents
인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1) 생산 발현용 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 미세조류 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1) 생산 발현용 벡터 및 상기벡터로 형질전환된 미세조류를 제공한다.
Description
본 명세서는 인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1), 인간섬유아세포성장인자 타입2 (hFGF2), 인간인슐린유사성장인자 타입1 (hIGF1) 생산 발현용 벡터 및 상기벡터로 형질전환된 미세조류에 관한 것이다.
인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1), 인간섬유아세포성장인자 타입2 (hFGF2), 인간인슐린유사성장인자 타입1 (hIGF1) 는 주름개선 화장품의 원료로 사용되는 기능성 단백질이다. 현재 대부분의 상기 성장인자류는 대장균에서 생산되어 사용되고 있다. 그러나 대장균은 내성독소(endotoxin)를 포함하고 있기 때문에 이에 따른 위험성을 내포하고 있다.
따라서, 내성독소에 따른 위험성을 원칙적으로 제거한 기존의 대장균 생산 hFGF1, hFGF2, hIGF1 원료의 대체제가 필요한 실정이다.
상기와 같은 문제점에 착안하여, 본 발명의 발명자들은 내성독성의 가능성을 원천 봉쇄하면서, 효과적으로 hFGF1, hFGF2, hIGF1 단백질을 생산할 수 있는 방법에 관한 연구를 하여 본 발명에 이르게 되었다.
본 발명의 일 측면은, 서열번호 2의 인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1)을 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면은, 서열변호 3의 인간섬유아세포성장인자 타입2 (hFGF2)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면은, 서열번호 4의 인간인슐린유사성장인자 (hIGF1)를 코딩하는 염기서열을 포함하는 벡터를 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 벡터는 서열번호 8-10 으로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은, 상기 벡터로 형질전환된 미세조류를 제공하고자 한다.
본 발명의 또 다른 측면은, 상기 형질전환된 미세조류를 이용하여 FGF1, hFGF2, hIGF1 단백질 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명의 일 측면은, 서열번호 1의 프로모터 및 hFGF1, hFGF2, hIGF1을 코딩하는 유전자를 포함하는 상기 성장인자 발현구역을 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 성장인자 발현구역은 His-tag, GST-tag, GFP, Tobacco etch virus (TEV) cleavage site서열을 더 포함하는, 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 성장인자 발현구역은 서열번호 2-4 로 표시되는 염기서열인, 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 벡터는 서열번호 8-10 으로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 어느 하나에 따른 벡터로 형질전환된 미세조류를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 미세조류는 페오닥틸룸 트리코뉴튬 (Phaeodactylum tricornutum) 인 미세조류일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 생산 방법에 따라 생산된 hFGF1, hFGF2, hIGF1 단백질을 포함하는 화장품원료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면에서, 상기 화장품원료 조정물은 주름개선용 화장품원료 조성물일 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환된 미세조류를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명의 일 측면에 따른 미세균주는 내성독성 없이 hFGF1, hFGF2, hIGF1 단백질을 생산할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따라 생산된 없이 hFGF1, hFGF2, hIGF1 단백질은 기존의 대장균에 의해 생산된 상기 성장인자류 단백질을 대체할 수 있다.
본 발명의 일 측면에 따라 생산된 hFGF1, hFGF2, hIGF1 단백질을 포함하는 화장품원료 조성물은 주름개선 효과가 우수하다.
도 1은 본 발명 실시예에 따른 벡터 구성으로, HSPA1p: HSPA1 promoter, TEV: tobacco etch virus (TEV cleavage site), 3'-UTR: 3 terminal untranslated region, FcpB: fucoxanthin/chlorophyll binding protein B promoter, shble: zeocin resistance gene 이다.
도 2는 유전자 삽입여부를 gDNA-PCR로 확인한 결과이다.
도 3은 GFP 형광측정을 통해 배양 중 목적 단백질 발현 추이를 확인한 결과이다.
도 4는 ELISA를 통해 단백질 발현결과를 확인한 결과이다.
도 5는 목적 단백질 정제 결과이다.
도 6은 서열번호 1의 HASP1 promoter의 염기서열이다.
도 7은 서열번호 2의 His-GST-GFP-TEV-hFGF1 (HGGTF1)의 염기서열이다[노란색 박스: 제한효소위치, 하늘색 박스: hFGF1, 파란색 굵은글씨: kozak sequence, 빨간색 글씨: 시작 코돈 및 스탑 코돈, 보라색 글씨: His-tag, 갈색 글씨: GST-tag, 녹색 글씨: GFP, 파란색 글씨: TEV site]
도 8은 서열번호 3의 His-GST-GFP-TEV-hFGF2 (HGGTF2)의 염기서열이다[노란색 박스: 제한효소위치, 하늘색 박스: hFGF2, 파란색 굵은글씨: kozak sequence, 빨간색 글씨: 시작 코돈 및 스탑 코돈, 보라색 글씨: His-tag, 갈색 글씨: GST-tag, 녹색 글씨: GFP, 파란색 글씨: TEV site]
도 9는 서열번호 4의 His-GST-GFP-TEV-IGF1 (HGGTI1)의 염기서열이다[노란색 박스: 제한효소위치, 하늘색 박스: hIGF1, 파란색 굵은글씨: kozak sequence, 빨간색 글씨: 시작 코돈 및 스탑 코돈, 보라색 글씨: His-tag, 갈색 글씨: GST-tag, 녹색 글씨: GFP, 파란색 글씨: TEV site]
도 10은 서열번호 5의 3'-UTR의 염기서열이다.
도 11은 서열번호 6의 Shble cassete의 염기서열이다.
도 12는 서열번호 7의 pPha-HASP1p vector full sequence의 염기서열이다[녹색: HASP1 promoter, 갈색: 3'-UTR, 자주색: shble cassete, 노란색 박스: multi cloning site]
도 13은 서열번호 8의 pPha-HASP1p-HGGTF1의 염기서열이다.
도 14는 서열번호 9의 pPha-HASP1p-HGGTF2의 염기서열이다.
도 15는 서열번호 10의 pPha-HASP1p-HGGTI1의 염기서열이다.
도 2는 유전자 삽입여부를 gDNA-PCR로 확인한 결과이다.
도 3은 GFP 형광측정을 통해 배양 중 목적 단백질 발현 추이를 확인한 결과이다.
도 4는 ELISA를 통해 단백질 발현결과를 확인한 결과이다.
도 5는 목적 단백질 정제 결과이다.
도 6은 서열번호 1의 HASP1 promoter의 염기서열이다.
도 7은 서열번호 2의 His-GST-GFP-TEV-hFGF1 (HGGTF1)의 염기서열이다[노란색 박스: 제한효소위치, 하늘색 박스: hFGF1, 파란색 굵은글씨: kozak sequence, 빨간색 글씨: 시작 코돈 및 스탑 코돈, 보라색 글씨: His-tag, 갈색 글씨: GST-tag, 녹색 글씨: GFP, 파란색 글씨: TEV site]
도 8은 서열번호 3의 His-GST-GFP-TEV-hFGF2 (HGGTF2)의 염기서열이다[노란색 박스: 제한효소위치, 하늘색 박스: hFGF2, 파란색 굵은글씨: kozak sequence, 빨간색 글씨: 시작 코돈 및 스탑 코돈, 보라색 글씨: His-tag, 갈색 글씨: GST-tag, 녹색 글씨: GFP, 파란색 글씨: TEV site]
도 9는 서열번호 4의 His-GST-GFP-TEV-IGF1 (HGGTI1)의 염기서열이다[노란색 박스: 제한효소위치, 하늘색 박스: hIGF1, 파란색 굵은글씨: kozak sequence, 빨간색 글씨: 시작 코돈 및 스탑 코돈, 보라색 글씨: His-tag, 갈색 글씨: GST-tag, 녹색 글씨: GFP, 파란색 글씨: TEV site]
도 10은 서열번호 5의 3'-UTR의 염기서열이다.
도 11은 서열번호 6의 Shble cassete의 염기서열이다.
도 12는 서열번호 7의 pPha-HASP1p vector full sequence의 염기서열이다[녹색: HASP1 promoter, 갈색: 3'-UTR, 자주색: shble cassete, 노란색 박스: multi cloning site]
도 13은 서열번호 8의 pPha-HASP1p-HGGTF1의 염기서열이다.
도 14는 서열번호 9의 pPha-HASP1p-HGGTF2의 염기서열이다.
도 15는 서열번호 10의 pPha-HASP1p-HGGTI1의 염기서열이다.
본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 방법은 첨부되는 도면과 함께 상세하게 후술되어 있는 실시예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 개시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다.
본 발명의 실시예들을 설명함에 있어서 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 것이다. 그리고 후술되는 용어들은 본 발명의 실시예에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 관례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.
본 발명에서 "인간섬유아세포성장인자 타입1 (human fibroblast growth factor type 1, hFGF1 또는 FGF1, aFGF)"은 155개의 아미노산으로 이루어진 17-18 kDa의 폴리펩타이드로 성장인자 및 신호단백질 역할을 한다.
본 발명에서 "인간섬유아세포성장인자 타입2 (human fibroblast growth factor type 2, hFGF2 또는 FGF2, bFGF)"은 155개의 아미노산으로 이루어진 18 kDa의 폴리펩타이드로 성자인자 및 신호단백질 역할을 한다.
본 발명에서 "인간인슐린유사성장인자 타입1 (human insulin like growth factor type 1, hIGF1 또는 IGF1)"은 70개의 아미노산으로 이루어진 약 8 kDa에 이르는 폴리펩타이드이다.
본 발명의 일측면에 따르면, 미세조류로부터 hFGF1, hFGF2, hIGF1을 생산할 경우 내성독소에 의한 위험성을 원천적으로 제거할 수 있으며, 기존의 대장균 생산 hFGF1, hFGF2, hIGF1 원료의 대체제로 사용할 수 있다. 이러한 미세조류 생산 hFGF1, hFGF2, hIGF1는 최근 화장품 트렌드인 친환경적 및 천연화 추세에 부합하는 화장품 원료로 사용할 수 있다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 일측면은, 서열번호 1의 프로모터; 및 인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1), 인간섬유아세포성장인자 타입2 (hFGF2), 인간인슐린유사성장인자 타입1 (hIGF1)을 코딩하는 유전자를 포함하는 상기 성장인자의 발현구역;을 포함하는, 벡터를 제공한다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 성장인자 발현구역은 His-tag, GST-tag, GFP 및 TEV site 서열을 더 포함하는, 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 성장인자 발현구역은 서열번호 2-4로 표시되는 염기서열인, 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 벡터는 서열번호 8-10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 벡터일 수 있다.
본 발명의 일 측면에서, 상기 벡터는 서열번호 8-10으로 표시되는 염기서열을 포함하는 코딩된, 벡터일 수 있다. 구체적으로 상기 서열번호 8-10은 HASP1 promotor서열, His-tag서열, GFP, TEV 서열, FGF1 또는 FGF2, IGF1 서열, 3'-UTR 서열 및 Shble cassete를 포함한다.
상기 Shble cassete는 FcpB, Shble 및 3'-UTR 포함를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 측면은 상기 어느 하나에 따른 벡터로 형질전환된 미세조류를 제공한다.
본 발명의 다른 측면에서, 상기 미세조류는 페오닥틸룸 트리코뉴튬(Phaeodactylum tricornutum)인, 미세조류일 수 있다. 상기 페오닥틸룸 트리코뉴튬은 국외 미세조류 은행으로부터 용이하게 입수가 가능하다. 구체적으로, 분양기관인 UTEX에서 분양번호 UTEX 646으로 Phaeodactylum tricornutum (Bohlin)을 분양받아 사용할 수 있으며, 분양기관인 CCAP에서 분양번호 CCAP1052/6로 Phaeodactylum tricornutum (Bohlin)을 분양받아 사용할 수 있으며, 분양기관인 CCMP에서 분양번호 CCMP2559로 Phaeodactylum tricornutum을 분양받아 사용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환된 미세조류를 이용하여 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 단백질을 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 생산 방법에 따라 생산된 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 단백질을 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 상기 화장료 조성물은 주름개선용 화장료 조성물일 수 있다.
상기 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 단백질을 포함하는 화장료 제조시에 함유되는 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 단백질의 함량은 조성물 총량에 대하여 건조 중량으로 0.00001 내지 10.0 중량%, 바람직하게는 0.001 내지 1.0 중량%이다. hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 단백질의 함량이 조성물 총량에 대하여 건조 중량으로 0.00001 중량% 미만이면 주름개선의 뚜렷한 효과를 기대할 수 없었고, 10.0 중량%를 초과하면 함유량의 증가에 따라 뚜렷한 효과의 증가를 기대하기 어렵다.
본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서의 상기 성분 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.
본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.
본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 형질전환된 미세조류를 포함하는 키트를 제공한다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실시예 1] 벡터 구성
벡터 구성은 하기와 같은 방법으로 준비하였다.
■ F/2배지 (50%인공해수)에서 배양한 P. tricornutum 배양액 50 mL를 취하여 원심분리 (3500 rpm, 15분, 20℃) cell pellet을 얻은 후, 이로부터 genomic DNA (gDNA)를 추출하였다.
■ 추출한 gDNA를 template로 사용하여 HASP1-F, HASP1-R 프라이머 및 pfu polymerase 로부터 PCR을 통해 HASP1 프로모터 부분의 DNA를 확보하였다. NdeI 및 EcoRI 제한효소를 사용하여 pPha-T1 벡터의 Fcp a 프로모터를 교체하여 pPha-HASP1p 벡터를 구성하였다.
■ 상기 프로모터 부분을 포함하여 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 발현 벡터를 도 1과 같이 구성하여, 목적 단백질인 상기 성장인자류를 생산할 수 있는 벡터를 구성하였다.
■ 상기 벡터를 구성하는 서열을 하기 표 1와 같았다.
| 서열번호 1 | HASP1 promotor |
| 서열번호 2 | His-GST-GFP-TEV-hFGF1 (HGTF1) |
| 서열번호 3 | His-GST-GFP-TEV-hFGF2 (HGTF2) |
| 서열번호 4 | His-GST-GFP-TEV-hIGF1 (HGTI1) |
| 서열번호 5 | 3'-UTR |
| 서열번호 6 | Shble cassete (FcpB, Shble, 3'-UTR을 포함) |
| 서열번호 7 | pPha-HASP1p vector |
| 서열번호 8 | pPha-HASP1p-hGTF1 |
| 서열번호 9 | pPha- HASP1p-hGTF2 |
| 서열번호 10 | pPha- HASP1p-hGTI1 |
| # | Name | Sequence | Restriction enzyme | Annotation |
| 1 | HASP1-F | CATATGCATACAGTGAATGTAACTTTCG | NdeI | pPha-HASP1; PCR and Genomic-DNA PCR |
| 2 | HASP1-R | GAATTCGCTCGCCGTGATGGATCTTTTC | EcoRI | pPha-HASP1p; PCR |
| 3 | pPha-Up-NdeI-F | GTGTCGGGGCTGGCTTAAC | Genomic DNA PCR | |
| 4 | pPha-Down-MCS-R | GCCGCACGTCCCTGGTTG | Genomic DNA PCR |
[실시예 2] 미세조류 형질전환
미세조류 형질전환은 하기와 같은 방법으로 실시하였다.
■ 상기 실시예 1에서 목적 단백질 생산용 벡터들은 E.coli (DH5a (NEBㄾ 5-alpha Competent E.coli) 에 형질전환 후 형질전환된 E.coli를 LB (100 μg/mL ampicillin) 배지에서 배양하였다.
■ 배양한 E.coli로부터 Midiprep 법으로 목적 벡터들을 추출하고, phenol/chloroform 유전자 정제법 및 Ethanol 침전법으로 P. tricornutum 형질전환에 필요한 고순도 벡터 (농도 1.0 μg/μL) 를 확보하였다.
■ 벡터를 금나노입자에 코팅한 후, 유전자총 방법 (Particle bombardment) 를 통해 P. tricornutum 으로 목적 벡터를 전달함으로써 형질전환 시켰다.
■ 상기 형질전환체는 zeocin (100 μg/mL) 이 함유된 F/2 한천배지에서 선별과정을 진행하였다.
상기와 같은 과정에 의해 얻어진 형질전환체는 P. tricornutum (PT-HASP1p-HGGTF1), P. tricornutum (PT-HASP1p-HGGTF2), P. tricornutum (PT-HASP1p-HGGTI1)으로 명명하고, 2019.12.18.자로 각각 한국생명공학 연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Culture; KCTC)에 수탁 번호 KCTC 14080BP, 14081BP, 14082BP로 기탁되었다.
[실험예 1] hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 발현 확인
상기 실시예 3을 통해 선별된 P. tricornutum 형질전환체에 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 코딩유전자의 삽입 여부는 gDNA-PCR 통해 확인하였고, 목적 단백질의 발현여부는 ELISA를 통해 확인하였으며, 구체적으로 하기 실험예 1 내지 2를 통해 확인하였다.
[실험예 2] gDNA-PCR을 통해 유전자 삽입 여부 확인
(1) 실험방법
■ 상기 실시예 2에서 hFGF1, hFGF2, hIGF1발현 형질전환체 콜로니를 확인하였다.
■ P. tricornutum의 genomic DNA 로 삽입여부의 확인은 gDNA-PCR을 통해 확인하였다.
■ 각 형질전환체 콜로니를 F/2 (50% 인공해수) 배지 200 μL 에 접균하여 5일간 배양한 후, 원심분리 (3500 rpm, 15분, 20 ℃) 후 상등액 제거하였다.
■ 10 μL 용해버퍼 (1% Nonidet P-40) 를 첨가한후 10분 후 용액을 PCR에 사용하였다.
■ pPha-Up-NdeI-F 및 pPha-Down-MCS-R 프라이머 및 taq polymerase 사용하여 PCR 진행하여 유전자 삽입을 확인하였다.
(2) 실험결과
■ DNA 전기영동 결과는 도 2에 도시하였다. 도 2a가 hFGF1이며, 도 2b가 hFGF2, 도 2c가 hIGF1의 gDNA-PCR 결과이다. 확인 결과 비슷한 위치에서 목적 유전자 띠를 확인할 수 있었다.
■ 대조군으로는 목적 유전자가 삽입되지 않은 빈 벡터를 삽입한 형질전환체 (Blank)사용하였는데, 여기서는 목적 유전자 띠를 확인하지 못하였다.
[실험예 3] GFP 형광측정을 통한 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 발현 확인
(1) 실험방법
■ 목적 단백질 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 N-terminal 에 결합된 GFP를 통해 미세조류 내 목적 단백질 발현량을 확인하였다.
■ 미세조류 배양액을 96 well plate 에 200 μL 씩 취한 후, microplate reader (Biotek, Synergy HTX)를 통해 측정하였다 (excitation: 485/20, emission: 528/20).
■ 동일한 방법으로 standard curve를 통해 미세조류 내 단백질 발현량 계산을 진행하였다.
(2) 실험결과
■ 형질전환 미세조류에서 목적단백질이 성공적으로 발현되는 것을 확인하였다.
■ hFGF1 및 hFGF2의 발현은 배양 중 5일차에 발현이 나타나기 시작하며, 7일차 이후 발현 농도가 각각 23.0 mg/L 및 7.57 mg/L 로 측정되었다.
■ hIGF1의 경우 배양 5일차에 발현이 나타나며, 5일까지 발현농도 3.01 mg/L 로 측정되었다.
[실험예 4] ELISA를 통한 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 발현 확인
(1) 실험방법
■ hFGF1, hFGF2, hIGF1의 함량은 각각의 효소에 대한 ELISA kit (abchem, ab219636, ab99979, ab211651)에 의해 진행하였다.
■ 각각의 형질전환체는 10일간 F/2 (50% 인공해수) 배양한 후 20 mL를 취하여 원심분리를 통해 cell pellet 얻은 후, 5 mL 용해버퍼 (50 mL Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0.1% Tween 20, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P40)를 첨가하였다.
■ 초음파파쇄기 (sonicator, 10% power, 10 초 초음파 - 50초 휴식 및 냉각, 10회) 로 미세조류 세포의 파쇄를 진행하였다.
■ 원심분리 (10,000 rpm, 20분, 4 ℃)를 통해 찌꺼기 제거 후 상등액을 ELISA 샘플로 사용하였다.
(2) 실험결과
■ hFGF1는 15.4 mg/L의 발현량을 확인하였다.
■ hFGF2는 8.1 mg/L 이상 발현량을 확인하였다.
■ hIGF1는 2.8 mg/L 이상 발현량을 확인하였다.
[실험예 5] hFGF1, hFGF2 및 hIGF1 정제 및 SDS-PAGE 확인
(1) 실험방법
■ 각각의 형질전환체는 10일간 F/2 (50% 인공해수) 배양한 후 2 L를 취하여 원심분리를 통해 cell pellet 얻은 후, 20 mL 용해버퍼 (50 mL Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1 mM PMSF, 0.1% Tween 20, 1 mM EDTA, 1% Nonidet P40)를 첨가하였다.
■ 초음파파쇄기 (sonicator, 30% power, 10 초 초음파 - 50초 휴식 및 냉각, 10회)로 미세조류 세포의 파쇄를 진행하였다.
■ 원심분리 (10,000 rpm, 20분, 4 ℃)를 통해 찌꺼기 제거 후 상등액을 정제에 사용하였다.
■ Ni-resin 5 mL (His-trap 5 mL, GE healthcare)으로 1차 흡착 크로마토그래피를 진행하였다.
■ 12% Tricine-SDS-PAGE 를 통해 결과를 확인하였다.
■ PD10 column (Hi-desalt 5 mL, GE healthcare)을 통해 염 제거 후, TEV protease 5-10 μg/mL 농도로 처리하여 4℃ 에서 9시간 반응시켰다.
■ Ni-resin 5 mL (His-trap 5 mL, GE healthcare)로 2차 흡착 크로마토그래피 진행하여, TEV 제거 및 tag 서열 제거된 목적 단백질을 확보하였다.
■ 15% Tricine-SDS-PAGE를 통해 결과를 확인하였다.
(2) 실험결과
■ HGGTF1 (His-GST-GFP-TEV-FGF1, 71.1 kDa) 단백질 밴드를 확인하였다.
■ HGGTF2 (His-GST-GFP-TEV-FGF1, 72.7 kDa) 단백질 밴드를 확인하였다.
■ HGGTI1 (His-GST-GFP-TEV-IGF1, 62.9 kDa) 단백질 밴드를 확인하였다.
■ 최종 hFGF1 (15.8 kDa) 단백질 밴드를 확인하였다.
■ 최종 hFGF2 (17.4 kDa) 단백질 밴드를 확인하였다.
■ 최종 hIGF1 (7.76 kDa) 단백질 밴드를 확인하였다.
[실험예 6] 주름개선 효과 시험
주름개선효과는 통상 콜라겐 생합성능과 콜라게네이즈 분해 억제능 및 사람에 대한 임상시험으로서 효과를 측정할 수 있다.
사람의 정상 섬유아세포(human normal fibroblast)를 DMEM배지가 들어있는 6-웰 마이크로플레이트에 접종시키고(2ㅧ105세포/웰) 5%농도의 CO2 배양기에 37℃로 24시간 배양하였다. 24시간 후, 각 웰에서 배지를 제거하고 농도별로 시료를 처리한 다음 24시간 동안 다시 배양하였다. 24시간 후, 세포배지를 수집하여 샘플을 제조하였다.
콜라겐 합성량은 콜라겐 측정 키트(Procollagen type I C-peptide EIA kit(MK101), 다카라, 교토, 일본)를 이용하여 세포배지 내에서의 프로콜라겐(procollagen)타입 I C-펩타이드(type I C-peptide : PICP)의 양을 측정하고 분석하였다.
콜라겐을 분해하는 콜라게네이즈의 활성정도를 측정하는 방법으로 콜라게네이즈에 대한 항체를 이용하였다. 콜라게네이즈 활성은 타입 I 콜라게네이즈 어세이 키트(Amersham Biosciences, RPN2629)를 이용하였으며, ELISA 판독기로 흡광도를 측정하였다. 측정된 표준치는 평균 ㅁ표준편차의 형태로 표시하였고 SPSS/PC+프로그램을 이용하여 t-test로 유의성을 검정하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
| 시료 | 콜라겐 합성증가율(%) | 콜라게네이즈 억제율(%) |
| hFGF1(10 ㎍/ml) | 72 | 40 |
| hFGF2(10 ㎍/ml) | 75 | 41 |
| hIGF1(10 ㎍/ml) | 73 | 40 |
표 3에 나타난 바와 같이, 실험예 5에 의해 정제된 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1의 첨가를 통해 콜라겐합성이 증가되었으며, 또한 콜라게네이즈 활성은 억제되었다. 따라서 본 발명에 따른 hFGF1, hFGF2 및 hIGF1은 주름개선 효능을 가지고 있음을 알 수 있다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 다양한 수정 및 변형이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예들은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 보호 범위는 아래의 청구범위에 의하여 해석되어야 하며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 기술사상은 본 발명의 권리범위에 포함되는 것으로 해석되어야 할 것이다.
<110> ALGAEPRONA INC.
<120> The vectors for expressing hFGF1 transformed microalgae for
expression those growth factors
<130> SP1100
<160> 10
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 499
<212> DNA
<213> Phaeodactylum tricornutum
<220>
<221> promoter
<222> (1)..(499)
<223> HASP1 promoter
<400> 1
catacagtga atgtaacttt cgaattgaca gtattagtag tcgtattgac agtgaggcac 60
gcccctcaat gtgcgaggtg gaaaatatac cagcatgaca atgaatcttg gagattcttt 120
tgctgtcatc aagattcacc gccaaatctt caggaaccta tcacgtccac aggcgatgtt 180
aattcttgag tcgtcaaaac aaagtcctgt cctacctgta gaagttgaca gcgagcaatt 240
gtatgcaaac ttctgacttt gttataataa cattaaaggt aattaagtat cttcaattag 300
gcattttgtc actgtcagtc cgttccgaca atataggtag atttggaatg aatcttttct 360
atgctgctgc gaatcttgta cacctttgag gccgtagatt ctgtccgacg aagcgataat 420
tattgcaaaa tacatggact cattattttg attcgatttc tttttggtat ccgactcgaa 480
aagatccatc acggcgagc 499
<210> 2
<211> 1890
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-GST-GFP-TEV-hFGF1 (HGGTF1)
<400> 2
gatatcacca tgcaccacca ccaccaccac gccggaatgt cccccattct cggatactgg 60
aagattaagg gactcgtcca gcccacccgt ctcctcctcg aatacctcga agaaaagtac 120
gaagaacacc tctacgaacg tgacgaagga gacaagtggc gtaacaagaa gttcgaactc 180
ggactcgaat tccccaacct cccctactac attgacggag acgtcaagct cacccagtcc 240
atggccatta ttcgttacat tgccgacaag cacaacatgc tcggaggatg ccccaaggaa 300
cgtgccgaaa tttccatgct cgaaggagcc gtcctcgaca ttcgttacgg agtctcccgt 360
attgcctact ccaaggactt cgaaaccctc aaggtcgact tcctctccaa gctccccgaa 420
atgctcaaga tgttcgaaga ccgtctctgc cacaagacct acctcaacgg agaccacgtc 480
acccaccccg acttcatgct ctacgacgcc ctcgacgtcg tcctctacat ggaccccatg 540
tgcctcgacg ccttccccaa gctcgtctgc ttcaagaagc gtattgaagc cattccccag 600
attgacaagt acctcaagtc ctccaagtac attgcctggc ccctccaggg atggcaggcc 660
accttcggag gaggagacca cccccccaag tccgacggag gacgtgtctc caagggagaa 720
gaactcttca ccggagtcgt ccccattctc gtcgaactcg acggagacgt caacggacac 780
aagttctccg tctccggaga aggagaagga gacgccacct acggaaagct caccctcaag 840
ttcatttgca ccaccggaaa gctccccgtc ccctggccca ccctcgtcac caccctcacc 900
tacggagtcc agtgcttctc ccgttacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 960
tccgccatgc ccgaaggata cgtccaggaa cgtaccattt tcttcaagga cgacggaaac 1020
tacaagaccc gtgccgaagt caagttcgaa ggagacaccc tcgtcaaccg tattgaactc 1080
aagggaattg acttcaagga agacggaaac attctcggac acaagctcga atacaactac 1140
aactcccaca acgtctacat tatggccgac aagcagaaga acggaattaa ggtcaacttc 1200
aagattcgtc acaacattga agacggatcc gtccagctcg ccgaccacta ccagcagaac 1260
acccccattg gagacggacc cgtcctcctc cccgacaacc actacctctc cacccagtcc 1320
gccctctcca aggaccccaa cgaaaagcgt gaccacatgg tcctcctcga attcgtcacc 1380
gccgccggaa ttaccctcgg aatggacgaa ctctacaagt ccgacggagg acgtaccgga 1440
gaaaacctct acttccaggg attcaacctc ccccccggaa actacaagaa gcccaagctc 1500
ctctactgct ccaacggagg acacttcctc cgtattctcc ccgacggaac cgtcgacgga 1560
acccgtgacc gttccgacca gcacattcag ctccagctct ccgccgaatc cgtcggagaa 1620
gtctacatta agtccaccga aaccggacag tacctcgcca tggacaccga cggactcctc 1680
tacggatccc agacccccaa cgaagaatgc ctcttcctcg aacgtctcga agaaaaccac 1740
tacaacacct acatttccaa gaagcacgcc gaaaagaact ggttcgtcgg actcaagaag 1800
aacggatcct gcaagcgtgg accccgtacc cactacggac agaaggccat tctcttcctc 1860
cccctccccg tctcctccga ctaatctaga 1890
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<211> 1941
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> His-GST-GFP-TEV-hFGF2 (HGGTF2)
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ccacaagacc tacctcaacg gagaccacgt cacccacccc gacttcatgc tctacgacgc 1020
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<210> 10
<211> 5694
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> pPha-HASP1p-HGGTI1
<400> 10
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tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca gagcagattg tactgagagt gcac 5694
Claims (8)
- 인간섬유아세포성장인자 타입1 (hFGF1)를 코딩하는 유전자를 포함하는 상기 성장인자 발현구역을 포함하는 벡터에 있어서, 서열번호 8로 표시되는 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제 1항의 벡터로 형질전환된 미세조류.
- 제 5항의 미세조류를 배양하여 hFGF1을 생산하는 방법.
- 제 6항에 의해 생산된 hFGF1을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
- 제 7항에 있어서, 화장료 조성물은 주름개선용인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
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|---|---|---|---|
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Family Applications (1)
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Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2009242247A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-22 | Institute Of Physical & Chemical Research | ヒト免疫不全ウイルス感染阻害剤およびエイズの治療薬または予防薬 |
| JP2013155193A (ja) * | 1998-10-13 | 2013-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostics Inc | Ｆｇｆの脈管形成的に有効な単位用量および投与方法 |
-
2019
- 2019-12-31 KR KR1020190179893A patent/KR102283915B1/ko active IP Right Grant
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2013155193A (ja) * | 1998-10-13 | 2013-08-15 | Novartis Vaccines & Diagnostics Inc | Ｆｇｆの脈管形成的に有効な単位用量および投与方法 |
| JP2009242247A (ja) * | 2008-03-28 | 2009-10-22 | Institute Of Physical & Chemical Research | ヒト免疫不全ウイルス感染阻害剤およびエイズの治療薬または予防薬 |
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