CN113801889B - 细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及细胞筛选模型构建技术领域，具体而言，涉及一种细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和应用。细胞筛选模型的构建方法包括将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；将激素受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中，或将激素受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内。激素受体表达载体包括强组成型启动子和激素受体基因；报告基因表达载体包括激素反应元件和报告基因Lux。本申请的细胞筛选模型的构建方法构建的细胞筛选模型无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，从而准确、可靠、直观地评价物质对激素受体的激动或拮抗活性。

Description

细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及细胞筛选模型构建技术领域，具体而言，涉及一种细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和应用。
背景技术
目前，评价物质对激素受体的激动或拮抗活性的细胞模型稳定性较差，同时需要在长时间反应后加入外源性反应底物和细胞裂解液才能产生响应信号，成本高、有效性和可行性较差。
发明内容
本申请的实施例的目的在于提供一种细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和筛选孕酮受体激动剂或孕酮受体拮抗剂的方法，其旨在改善现有的用于评价物质对激素受体的激动或拮抗活性的细胞模型稳定性较差、成本高以及可行性较差的问题。
本申请第一方面提供一种细胞筛选模型的构建方法，包括：将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；将激素受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中，或将激素受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内。
激素受体表达载体包括强组成型启动子和激素受体基因；报告基因表达载体包括激素反应元件和报告基因Lux。
激素受体选自孕酮受体、雄激素受体、雌激素受体、糖皮质激素受体或者盐皮质激素受体。
将包括激素反应元件和报告基因Lux的报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中，将包括强组成型启动子和激素受体基因的激素受体表达载体转入化至宿主细胞内，构建细胞筛选模型，可以使报告基因Lux在宿主细胞内更稳定的表达，提高响应信号的稳定性。相比现有技术，本申请的细胞筛选模型的构建方法构建的细胞筛选模型无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，从而准确、可靠、直观地评价物质对激素受体的激动或拮抗活性，特异性强、成本低且操作简单。
本申请第二方面提供一种细胞筛选模型的构建方法，包括：将孕酮受体表达载体以及报告基因表达载体转入至宿主细胞内。孕酮受体表达载体包括强组成型启动子和序列如SEQ ID NO.1所示的PR优化基因。报告基因表达载体包括孕酮激素反应元件HRE和报告基因Lux；其中，宿主细胞为酿酒酵母细胞。
可选地，强组成型启动子为TDH3。
将包括强组成型启动子和序列如SEQ ID NO.1所示的PR优化基因的孕酮受体表达载体以及包括孕酮激素反应元件HRE和报告基因Lux的报告基因表达载体转入至宿主细胞内，构建细胞筛选模型。序列如SEQ ID NO.1所示的PR优化基因可以提高孕酮受体在宿主细胞内的表达水平，TDH3可以增强PR优化基因的表达水平，提高响应信号的稳定性。相比现有技术，本申请的细胞筛选模型的构建方法构建的细胞筛选模型无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，可以实现物质对孕酮受体的激动或拮抗活性的动态监测，从而准确、可靠、直观地评价物质对孕酮受体的激动或拮抗活性，特异性强、成本低且操作简单。
本申请的第三方面提供一种细胞筛选模型，细胞筛选模型由如本申请第一方面或第二方面提供的细胞筛选模型的构建方法构建得到。
相比现有技术，本申请的细胞筛选模型无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，从而准确、可靠、直观地评价物质对激素受体的激动或拮抗活性，特异性强、成本低且操作简单。
本申请的第四方面提供一种如本申请第三方面提供的细胞筛选模型在筛选激素受体激动剂或孕酮受体拮抗剂中的应用。
本申请的细胞筛选模型应用于筛选激素受体激动剂或激素受体拮抗剂时，无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，特异性强、准确性强、成本低且操作简单。
本申请的第五方面提供一种酵母菌，酵母菌的命名为BLYrPRS，酵母菌的保藏编号为CGMCC NO.22947。
生物材料：BLYrPRS，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2021年07月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.22947。
本申请提供的酵母菌无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，可以实现物质对孕酮受体的激动或拮抗活性的动态监测，从而准确、可靠、直观地评价物质对孕酮受体的激动或拮抗活性，特异性强、成本低且操作简单。
本申请的第六方面提供一种如本申请第五方面的酵母菌的制备方法，包括：构建孕酮受体表达载体PR/pRS315和报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi；将报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi中的孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中制得HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母；再将孕酮受体表达载体PR/pRS315转化至HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母中。
或，构建孕酮受体表达载体PR/pRS315和报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi；将孕酮受体表达载体PR/pRS315转化至Y1HGold酿酒酵母中制得PR/pRS315/Y1HGold；再将报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi中的孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至PR/pRS315/Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中。
可选地，采用StuI限制性内切酶切割报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi后通过电击转化方式将孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中。
可选地，孕酮受体表达载体PR/pRS315的构建方法包括将序列如SEQ ID NO.1所示的PR优化基因、强组成型启动子TDH3以及线性化的pRS315-TEF-CYC1质粒连接。
可选地，报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi的构建方法包括将孕酮激素反应元件5X HRE、报告基因Lux以及线性化的pAbAi质粒连接。
本申请的酵母菌的制备方法将孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至Y1HGold酿酒酵母细胞本体的基因组中，可以使报告基因Lux在宿主细胞内更稳定的表达，提高响应信号的稳定性。
本申请的第七方面提供一种筛选孕酮受体激动剂或孕酮受体拮抗剂的方法，包括将如本申请第五方面提供的酵母菌的OD600调整为0.1-0.2，加入待筛选药物震荡孵育后检测荧光信号强度。
可选地，孵育的时间为3-24h。
可选地，孵育的温度为28-30℃。
上述检测方法可以使酵母菌具有较高的活性，提高酵母菌中PR优化基因以及报告基因Lux的表达水平，提高响应信号的稳定性，使检测结果更加准确。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在分别加入不同浓度的孕酮进行孵育后产生的自主发光信号的三维图。
图2示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在分别加入已知的对孕酮受体具有激动活性的物质进行孵育4h后的自主发光信号图。
图3示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在分别加入已知的对孕酮受体具有激动活性的物质进行孵育8h后的自主发光信号图。
图4示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在同时加入壬基酚和孕酮进行孵育4h和8h后的自主发光信号图。
图5示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在同时加入不同的双酚类化合物和孕酮进行孵育4h后的自主发光信号图。
图6示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在同时加入不同的双酚类化合物和孕酮进行孵育8h后的自主发光信号图。
图7示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在分别加入睾酮、皮质醇以及醛固酮进行孵育4h后的自主发光信号图。
图8示出了本申请实施例1的酵母菌BLYrPRS在分别加入睾酮、皮质醇以及醛固酮进行孵育8h后的自主发光信号图。
生物材料保藏说明：
生物材料：BLYrPRS，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2021年07月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.22947。
具体实施方式
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
下面对本申请实施例的一种细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和筛选孕酮受体激动剂或孕酮受体拮抗剂的方法进行具体说明。
在本申请中，单位“M”是指mol/L；“μM”是指μmol/L；“nM”是指nmol/L。报告基因Lux是指细菌生物发光基因。PC3细胞是指人前列腺癌细胞；CHO-K1细胞是指仓鼠卵巢细胞亚株；CV1细胞是指非洲绿猴肾细胞。PR是指孕酮受体(Progesterone Receptor)。HRE是指激素反应元件(Hormone Response Element)。nX HRE是指具有n个重复的HRE序列的激素反应元件。5X HRE是指具有5个重复的HRE序列的激素反应元件。TDH3是指甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子。pRS315是指一种非整合型单拷贝酿酒酵母质粒。pAbAi是指一种酵母基因组整合质粒。Y1HGold酿酒酵母是指Y1HGold酵母单倍体菌株。SD/(-Leu-Ura)培养基是指缺少亮氨酸(Leu)以及尿嘧啶(Ura)的SD缺陷酵母培养基。SD/-Ura培养基是指缺少尿嘧啶(Ura)的SD缺陷酵母培养基。表达载体的转入包括转染以及转化，当表达载体的转入对象是酵母细胞时，表达载体的转入为转化；当表达载体的转入对象是哺乳动物细胞时，表达载体的转入为转染。
本申请提供一种细胞筛选模型的构建方法，细胞筛选模型的构建方法包括：将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；将激素受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中。或者，细胞筛选模型的构建方法包括：将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；将激素受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内。其中，激素受体表达载体包括强组成型启动子和激素受体基因；报告基因表达载体包括激素反应元件和报告基因Lux。
在本申请中，步骤“将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中”以及步骤“将激素受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；或，将激素受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内”没有先后关系。例如，可以先执行步骤“将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中”再执行步骤“将激素受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；或，将激素受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内”。或者，在执行过程中也可以先执行步骤“将激素受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；或，将激素受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内”，再执行步骤“将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中”。
本申请将包括激素反应元件和报告基因Lux的报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中，将包括强组成型启动子和激素受体基因的激素受体表达载体转入至宿主细胞内，构建细胞筛选模型。强组成型启动子可以使得激素受体基因在宿主细胞内稳定表达；激素反应元件可以被激素受体与激素结合形成的复合物选择性识别并启动下游基因的转录；将激素反应元件和报告基因Lux的报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中可以使报告基因Lux在宿主细胞内更稳定的表达，提高响应信号的稳定性。相比现有技术，本申请的细胞筛选模型的构建方法构建的细胞筛选模型无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，从而准确、可靠、直观地评价物质对激素受体的激动或拮抗活性，特异性强、成本低且操作简单。
在本申请的一些实施例中，激素受体选自孕酮受体、雄激素受体、雌激素受体、糖皮质激素受体或者盐皮质激素受体。需要说明的是，在本申请的其他实施例中，激素受体也可以不限于上述激素受体。例如，激素受体也可以选自甲状腺激素受体等等。作为示例性地，当激素受体为孕酮受体、雄激素受体、糖皮质激素受体或者盐皮质激素受体时，对应的激素反应元件为HRE；当激素受体为雌激素受体时，对应的激素反应元件是雌激素反应元件ERE；当激素受体为甲状腺激素受体时，对应的激素反应元件是甲状腺激素反应元件TRE。
进一步地，在本申请的实施中，激素受体为孕酮受体。当激素受体为孕酮受体时，激素受体表达载体即为孕酮受体表达载体，孕酮受体表达载体包括强组成型启动子和PR基因。报告基因表达载体包括孕酮激素反应元件HRE和报告基因Lux。作为示例性的，PR基因的来源可以大鼠或人等，本申请不对PR基因的来源进行限定。PR基因可以为经过宿主细胞密码子优化的PR基因，可以提高孕酮受体在宿主细胞内的表达水平，提高响应信号的稳定性。
在本实施例中，PR基因为序列如SEQ ID NO.1所示的PR优化基因。序列如SEQ IDNO.1所示的PR优化基因是通过酿酒酵母细胞密码子优化的大鼠PR基因序列，可以提高孕酮受体在酿酒酵母细胞内的表达水平，提高响应信号的稳定性。
在本申请的一些实施例中，当激素受体为孕酮受体，孕酮受体表达载体中的强组成型启动子为TDH3，可以增强PR基因的表达。
需要说明的是，在本申请的其他实施例中，孕酮激素反应元件也可以为nHRE，n为大于等于1的自然数。作为示例性地，孕酮激素反应元件也可以为2X HRE、3X HRE、5X HRE以及7X HRE等等。当nHRE中n为大于1的自然数时，可以提高细胞筛选模型的灵敏度。进一步地，孕酮激素反应元件为5X HRE。
在本申请的一些实施例中，宿主细胞包括PC3细胞、CHO-KI细胞、CV1细胞或者酵母细胞。
例如，在本实施例中，宿主细胞为酵母细胞。酵母细胞易于培养，无需严格的操作环境且操作简单。进一步地，宿主细胞为酿酒酵母细胞。作为示例性地，酿酒酵母细胞可以为Y1HGold酿酒酵母细胞。
本申请还提供一种细胞筛选模型的构建方法，包括将孕酮受体表达载体以及报告基因表达载体转入至宿主细胞内；孕酮受体表达载体包括强组成型启动子和序列如SEQ IDNO.1所示的PR优化基因；报告基因表达载体包括孕酮激素反应元件HRE和报告基因Lux；其中，宿主细胞为酿酒酵母细胞。
将包括强组成型启动子和序列如SEQ ID NO.1所示的PR优化基因的孕酮受体表达载体以及包括孕酮激素反应元件HRE和报告基因Lux的报告基因表达载体转入至宿主细胞内，构建细胞筛选模型，序列如SEQ ID NO.1所示的宿主密码子优化的PR基因可以提高孕酮受体在宿主细胞内的表达水平，提高响应信号的稳定性。相比现有技术，本申请的细胞筛选模型的构建方法构建的细胞筛选模型无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，可以实现物质对孕酮受体的激动或拮抗活性的动态监测，从而准确、可靠、直观地评价物质对孕酮受体的激动或拮抗活性，特异性强、成本低且操作简单。
在本申请的一些实施例中，强组成型启动子为TDH3，TDH3可以增强PR优化基因的表达水平。
在本申请的实施例中，将报告基因表达载体转入至宿主细胞内包括将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中。将包括激素反应元件和报告基因Lux的报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中，可以使报告基因Lux在宿主细胞内更稳定的表达，提高响应信号的稳定性。
在本申请的实施例中，将孕酮受体表达载体转化至宿主细胞内包括：将孕酮受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；或，将孕酮受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内。换言之，可以采用整合或者以游离形式转化的方式将孕酮受体表达载体转入至宿主细胞内。
需要说明的是，在本申请中，步骤“将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中”以及步骤“将孕酮受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；或，将孕酮受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内”没有先后关系。例如，可以先执行步骤“将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中”再执行步骤“将孕酮受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；或，将孕酮受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内”。或者，在执行过程中也可以先执行步骤“将孕酮受体表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中；或，将孕酮受体表达载体以游离形式转入至宿主细胞内”，再执行步骤“将报告基因表达载体整合至宿主细胞本体的基因组中”。
需要说明的是，在本申请的其他实施例中，孕酮激素反应元件也可以为nHRE，n为大于等于1的自然数。作为示例性地，孕酮激素反应元件也可以为2X HRE、3X HRE、5X HRE以及7X HRE等等。当nHRE中n为大于1的自然数时，可以提高细胞筛选模型的灵敏度。进一步地，孕酮激素反应元件为5X HRE。
本申请还提供一种细胞筛选模型，细胞筛选模型由上述的细胞筛选模型的构建方法构建得到。
本申请还提供一种上述细胞筛模型在筛选激素受体激动剂或激素受体拮抗剂中的应用。本申请的细胞筛选模型应用于筛选激素受体激动剂或激素受体拮抗剂时，无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，特异性强、准确性强、成本低且操作简单。
本申请还提供一种酵母菌，酵母菌的命名为BLYrPRS，酵母菌的保藏编号为CGMCCNO.22947。
生物材料：BLYrPRS，分类命名：酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae，于2021年07月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO.22947。
本申请提供的酵母菌将包括强组成型启动子TDH3和序列如SEQ ID NO.1所示的酿酒酵母密码子优化的大鼠PR基因的孕酮受体表达载体转化至Y1HGold酿酒酵母细胞内，强组成型启动子TDH3和序列如SEQ ID NO.1所示的酿酒酵母密码子优化的大鼠PR基因可以提高孕酮受体在Y1HGold酿酒酵母细胞内的表达水平，提高响应信号的稳定性；将孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux(luxCDABEfrp)整合至宿主细胞本体的基因组中，可以使报告基因Lux(luxCDABEfrp)在宿主细胞内更稳定的表达，提高响应信号的稳定性。无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，可以实现物质对孕酮受体的激动或拮抗活性的动态监测，从而准确、可靠、直观地评价物质对孕酮受体的激动或拮抗活性，特异性强、灵敏度高、成本低且操作简单。
BLYrPRS酵母菌的特征如下：
BLYrPRS酵母菌具有Y1HGold酿酒酵母细胞的基本特征。与Y1HGold酿酒酵母细胞不同的是，BLYrPRS酵母菌中包含Y1HGold酿酒酵母细胞重组基因组以及游离形式的孕酮受体表达载体。其中，Y1HGold酿酒酵母细胞重组基因组包括Y1HGold酿酒酵母细胞本体的基因组、孕酮激素反应元件5X HRE、报告基因Lux(luxCDABEfrp)以及线性化的整合型pAbAi质粒骨架；孕酮受体表达载体包括序列如SEQ ID NO.1所示的酿酒酵母密码子优化的大鼠PR基因、强组成型启动子TDH3、终止子CYC1以及线性化的pRS315质粒骨架。
其中，PR优化基因的序列如SEQ ID NO.1所示；强组成型启动子TDH3的序列如SEQID NO.2所示；孕酮激素反应元件5X HRE的序列如SEQ ID NO.3所示；报告基因Lux(luxCDABEfrp)的序列如SEQ ID NO.4所示；PR/pRS315表达载体的序列如SEQ ID NO.5所示；HRE-Lux/pAbAi表达载体的序列如SEQ ID NO.6所示。
BLYrPRS酵母菌的培养条件为：挑取BLYrPRS酵母菌单菌落菌于SD/(-Leu-Ura)培养基中，于28～30℃、200-220rpm振荡培养。
BLYrPRS酵母菌的保存条件为：将BLYrPRS酵母菌接种于SD/(-Leu-Ura)固体平板培养基，28～30℃培养48-72h后于4-25℃短期保藏。或将培养好的BLYrPRS酵母菌菌液接入20～40％(v/v)无菌甘油冻存管中、-50～-80℃冷冻长期保藏。
本申请还提供一种上述酵母菌的制备方法，即BLYrPRS酵母菌的制备方法，包括：构建孕酮受体表达载体PR/pRS315和报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi；将报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi中的孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中制得HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母；再将孕酮受体表达载体PR/pRS315转化至HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母中。或，BLYrPRS酵母菌的制备方法包括：构建孕酮受体表达载体PR/pRS315和报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi；将孕酮受体表达载体PR/pRS315转化至Y1HGold酿酒酵母中制得PR/pRS315/Y1HGold；再将报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi中的孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至PR/pRS315/Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中。
在本申请的一些实施例中，采用StuI限制性内切酶切割报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi后通过电击转化方式将孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中。在本申请中，报告基因Lux为luxCDABEfrp。由于luxCDABEfrp的序列较长(为6642bp)，将luxCDABEfrp整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中十分困难的，而本申请通过采用StuI限制性内切酶既可以将luxCDABEfrp整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组，大大提高了将报告基因luxCDABEfrp和孕酮激素反应元件5X HRE成功整合到Y1HGold酿酒酵母的基因组中的成功率，操作简单，可以使报告基因Lux(luxCDABEfrp)在宿主细胞内更稳定的表达，提高响应信号的稳定性。
在本申请的一些实施例中，孕酮受体表达载体PR/pRS315的构建方法包括将序列如SEQ ID NO.1所示的宿主密码子优化的PR基因、强组成型启动子TDH3以及线性化的pRS315-TEF-CYC1质粒骨架连接。将如SEQ ID NO.1所示的宿主密码子优化的PR基因、强组成型启动子TDH3以及线性化的pRS315-TEF-CYC1质粒连接可以采用Gibson组装法。
在本申请的一些实施例中，报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi的构建方法包括将孕酮激素反应元件5X HRE、报告基因Lux以及线性化的pAbAi质粒连接。将孕酮激素反应元件5X HRE、报告基因Lux以及线性化的pAbAi质粒连接可以采用Gibson组装法。
本申请还提供一种筛选孕酮受体激动剂或孕酮受体拮抗剂的方法，包括：将BLYrPRS酵母菌的OD600调整为0.1-0.2，加入待筛选药物震荡孵育后检测荧光信号强度。作为示例性地，BLYrPRS酵母菌的OD600可以为0.1、0.13、0.15、0.18以及0.2等等。将BLYrPRS酵母菌的OD600调整为0.1-0.2可以保证酵母菌具有较高的活性，提高酵母菌中PR优化基因以及报告基因Lux相关基因的表达，提高响应信号的稳定性，使检测结果更加准确。
在本申请的一些实施例中，孵育时间为3-24h。作为示例性地，孵育时间可以为3h、4h、6h、7h、8h、12h、16h、20h以及24h等等。孵育时间为3-24h可以保证荧光响应信号的稳定产生，同时也可以保证酵母菌具有较高的活性。可选地，孵育时间为4-9h，可以获得较高的灵敏度和稳定性。
在本申请的一些实施例中，孵育温度为28-30℃。作为示例性地，孵育温度可以为28℃、28.5℃、29℃以及30℃等等。检测温度为28-30℃可以保证酵母菌具有较高的活性。孵育温度过高，BLYrPRS酵母菌会失活；孵育温度过低，BLYrPRS酵母菌的活性会减弱。
在本申请的一些实施例中，震荡孵育的震荡转速为200-250rpm。作为示例性地，震荡孵育的震荡转速可以为200rpm、210rpm、220rpm、230rpm、240rpm以及250rpm等等。
以下结合实施例对本申请的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供一种BLYrPRS酵母菌及其制备方法。
大鼠孕酮受体表达载体PR/pRS315的构建：采用SacI和HindIII双酶(购自美国NEB)切割质粒pRS315-TEF-CYC1(购自北京博澳瑞斯)，切胶回收6191bp的酶切产物，获得线性化的pRS315骨架质粒；以PR/pSMART-LCKan(序列如SEQ ID NO.1所示的酿酒酵母密码子优化的大鼠PR基因与pSMART-LCKan骨架质粒连接转化后获得克隆质粒，由北京天一辉远公司合成并构建)为模板，PCR扩增，切胶回收序列如SEQ ID NO.1所示的大鼠PR优化基因；以pTdh3-HEM1/pSMART-LCKan(购自北京博澳瑞斯)为模板，PCR扩增强组成启动子TDH3；Gibson连接序列如SEQ ID NO.1所示的大鼠PR优化基因、TDH3和线性化的pRS315骨架质粒，连接温度为50℃，连接时间为1h。
报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi的构建：SacI和PuvII双酶(购自美国NEB)切割pAbAi质粒(购自北京淼灵)，切胶回收3101bp的酶切产物，获得线性化的pAbAi骨架质粒；以HRE-Lux/pSMART-LCKan(将序列如SEQ ID NO.3所示的孕酮激素反应元件5X HRE、序列如SEQ ID NO.4所示的报告基因Lux(luxCDABEfrp)以及pSMART-LCKan骨架质粒连接转化后获得克隆质粒，由北京天一辉远公司合成并构建)质粒为模板，PCR扩增，切胶回收如SEQ IDNO.3所示的孕酮激素反应元件5X HRE和序列如SEQ ID NO.4所示的Lux(luxCDABEfrp)基因；Gibson连接5X HRE、Lux(luxCDABEfrp)和线性化的pAbAi骨架质粒，连接温度为50℃，连接时间为1h。
孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux(luxCDABEfrp)与Y1HGold酿酒酵母基因组整合制备HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母：StuI限制性内切酶切割HRE-Lux/pAbAi质粒，切胶回收酶切产物，获得HRE-Lux/pAbAi线性化质粒；将0.2cm规格的电击杯置于冰上预冷；打开电转仪，调节电压至1.5kv，预热仪器；向制备好的100μL的感受态Y1HGold酿酒酵母中加入2μgHRE-Lux/pAbAi线性化质粒，搅拌混匀，冰浴静置3min；将混合物转移至电击杯中，冰浴静置3min；电击转化HRE-Lux/pAbAi线性化质粒进入感受态的Y1HGold酿酒酵母中，电击后迅速在电击杯中加入预冷的1mL山梨醇。将转化后的HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母细胞转移至无菌1.5mL的EP管中，在酵母缺陷培养基SD/-Ura平板上涂布500μL菌液，室温倒置培养72h后备用。
孕酮受体表达载体PR/pRS315以游离形式转化至感受态的HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母细胞内制备BLYrPRS酵母菌：挑取HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母单菌落至50mL的酵母缺陷培养基SD/-Ura，于30℃、250rpm摇菌12～16h，至OD600为0.3(稀释10倍后)；吸取4μL的PR/pRS315质粒至100μL的感受态的HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母中，搅拌混合均匀，冰浴静置3min，转移至提前冰浴过的电击杯中，冰浴静置3min；电击转化PR/pRS315质粒进入HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold感受态中，电击后迅速在电击杯中加入预冷的1mL山梨醇。将转化后的BLYrPRS酵母细胞转移至无菌1.5mL的EP管中，在酵母缺陷培养基SD/-Leu-Ura平板上涂布500μL菌液，室温倒置培养72h后备用。
试验例1
对实施例1提供的BLYrPRS酵母菌进行稳定性以及灵敏度验证。验证方法如下：挑取BLYrPRS酵母菌单菌落于酵母缺陷培养基SD/-Ura-Leu，于30℃、220rpm培养18h，更换新鲜的酵母缺陷培养基SD/-Ura-Leu培养基，调整酵母OD600吸光值为0.15。向白色96孔板加入1μL不同浓度的待测物质，随后加入100μLOD600吸光值为0.15的BLYrPRS酵母菌液混匀，28℃、220rpm震荡培养固定时间后使用酶标仪检测发光信号强度或者立即进行动力学检测，信号采集时间为1s。试验结果如图1所示。并通过四参数对数函数生成的剂量响应曲线计算待测化合物对孕酮受体的EC50(半最大效应浓度)值，试验结果如表1所示。
表1孕酮诱导酵母菌BLYrPRS的EC50值(n＝3次独立重复实验)
Time(h) Mean(M) s.d.(M) CV(％) <![CDATA[R<sup>2</sup>(mean±s.d.)]]>
1 <![CDATA[3.55×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.93×10<sup>-9</sup>]]> 26.3 0.908±0.008
2 <![CDATA[2.67×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.44×10<sup>-9</sup>]]> 16.6 0.993±0.001
3 <![CDATA[2.26×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.31×10<sup>-9</sup>]]> 13.5 0.995±0.002
4 <![CDATA[2.74×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.26×10<sup>-9</sup>]]> 9.3 0.995±0.002
5 <![CDATA[3.30×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.23×10<sup>-9</sup>]]> 6.9 0.997±0.002
6 <![CDATA[3.90×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.02×10<sup>-9</sup>]]> 0.6 0.996±0.002
7 <![CDATA[4.59×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.39×10<sup>-9</sup>]]> 8.5 0.997±0.002
8 <![CDATA[6.13×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.66×10<sup>-9</sup>]]> 10.8 0.996±0.002
9 <![CDATA[7.74×10<sup>-9</sup>]]> <![CDATA[0.80×10<sup>-9</sup>]]> 10.4 0.994±0.001
10 <![CDATA[1.37×10<sup>-8</sup>]]> <![CDATA[0.12×10<sup>-8</sup>]]> 9.0 0.993±0.003
11 <![CDATA[2.70×10<sup>-8</sup>]]> <![CDATA[0.38×10<sup>-8</sup>]]> 13.9 0.994±0.002
12 <![CDATA[4.71×10<sup>-8</sup>]]> <![CDATA[0.37×10<sup>-8</sup>]]> 7.9 0.994±0.002
说明：图1和表1中的Time是指加入待测物质进行反应的时间；Fold of induction是指与溶剂对照(即加入BLYrPRS酵母菌和DMSO(二甲基亚砜)的组别)相比的信号诱导倍数；Progesterone是指孕酮；Mean是指EC50的平均值；s.d.是指EC50的标准差；CV是指变异系数；R2是指相关系数。
从图1可以看出，1nM～1μM的孕酮可以快速诱导BLYrPRS酵母菌产生自主荧光。当孕酮的浓度大于1nM时，加入孕酮后2h即可诱导BLYrPRS酵母菌产生自主荧光。随着加入孕酮后的反应时间和孕酮浓度的增加，BLYrPRS酵母菌产生的自主荧光信号强度逐渐增加，在加入孕酮后的反应6～7h内产生荧光信号最强，反应超过7h后荧光信号强度有减小趋势。
从表1可以看出，孕酮在不同时间点对BLYrPRS报告酵母的EC50值随着反应时间的增加，呈现先降低后增加的趋势，反应时间超过9h后，EC50值明显升高，说明反应初期(9h内)灵敏较高，随着反应时间的延长(超过9h)，灵敏度有下降趋势。变异系数(R2)在0.6％～26.3％范围内，除加入孕酮后反应2h内的变异系数高于15％外，其余时间点的变异系数均低于15％；加入孕酮后反应1h时的R2小于0.99，其余时间点的R2均大于0.99，曲线拟合较好。结果表明BLYrPRS酵母菌用于检测时具有较好的稳定性，动态监测控制在4-9h以内将获得更好的灵敏度和稳定性。
试验例2
对实施例1提供的BLYrPRS酵母菌进行物质对孕酮受体激动或拮抗活性的筛选水平验证。其中，物质对孕酮受体激动活性的验证方法如下：挑取BLYrPRS酵母菌单菌落于酵母缺陷培养基SD/-Ura-Leu，于30℃、220rpm培养12h，更换新鲜的酵母缺陷培养基SD/-Ura-Leu，调整酵母OD600吸光值为0.15。向白色96孔板加入1μL不同浓度的待测物质，随后加入100μLOD600吸光值为0.15的BLYrPRS酵母菌液混匀，28℃、220rpm震荡培养固定时间后使用酶标仪检测发光信号强度或者立即进行动力学检测，连续振荡混匀，信号采集时间为1s。物质对孕酮受体拮抗活性的验证方法如下：挑取BLYrPRS酵母菌单菌落于酵母缺陷培养基SD/-Ura-Leu，于30℃、220rpm培养12h，更换新鲜的酵母缺陷培养基SD/-Ura-Leu,调整酵母OD600吸光值为0.15。向白色96孔板加入1μL不同浓度的待测物质，然后加入1μL10nM的孕酮，最后加入100μLOD600吸光值为0.15的BLYrPRS酵母菌液混匀，28℃、220rpm培养4h和8h后使用酶标仪检测发光信号强度或者立即进行动力学检测，连续振荡混匀，信号采集时间为1s。试验结果如图2、图3、图4、图5、图6、图7以及图8所示。并通过四参数对数函数生成的剂量响应曲线计算待测化合物对孕酮受体的EC50(半最大效应浓度)值和IC50(半抑制浓度)，试验结果如表2和表3所示。
表2酵母菌BLYrPRS测定不同物质加入4h后对孕酮受体激动活性的EC50或拮抗活性的IC50值(n＝3次独立重复实验)
项目 <![CDATA[EC<sub>50</sub>]]> <![CDATA[IC<sub>50</sub>]]> CV(％)
孕酮 2.74±0.26nM n.e 9.3
左炔诺孕酮 1.67±0.11nM n.e. 6.6
炔诺孕酮 3.61±0.28nM n.e. 7.8
地屈孕酮 6.71±0.21nM n.e. 3.1
醋酸甲羟孕酮 19.89±1.93nM n.e. 9.7
17α-羟孕酮 4.65±0.38μM n.e. 8.2
壬基酚 n.e. 8.16±0.27μM 3.3
双酚A n.e. 375.70±5.02μM 1.3
双酚AF n.e 68.48±3.89μM 5.7
双酚B n.e. 119.87±2.87μM 2.4
双酚F n.e. 315.33±9.21μM 2.9
双酚S n.e. n.e. /
双酚芴 n.e. n.e. /
睾酮 3.24±0.19μM n.e. 5.8
醛固酮 n.e. n.e. /
皮质醇 n.e. n.e. /
表3酵母菌BLYrPRS测定不同物质加入8h后对孕酮受体激动活性的EC50或拮抗活性的IC50值(n＝3次独立重复实验)
Figure GDA0003467080620000191
Figure GDA0003467080620000201
说明：表2和表3中n.e.表示未测出相关数据，“/”表示无法计算。图2和图3中Medroxyprogesterone acetate是指醋酸甲羟孕酮，17α-Hydroxy progesterone是指17α-羟孕酮，Dydrogesterone是指地屈孕酮，Levonorgestrel是指左炔诺孕酮，Norgestrel是指炔诺孕酮，Progesterone是指孕酮。图4中Nonyl phenol是指壬基酚。图5和图6中BPA是指双酚A，BHPF是指双酚芴，BPF是指双酚F，BPAF是指双酚AF，BPB是指双酚B，BPS是指双酚S。图7和图8中Hydrocortisone是指皮质醇，Testosterone是指睾酮，Aldosterone是指醛固酮。
从图2和图3可以看出，将不同浓度的已知的对孕酮受体具有激动活性的孕酮、左炔诺孕酮、醋酸甲羟孕酮、地屈孕酮、炔诺孕酮和7α-羟孕酮分别单独作用BLYrPRS酵母菌4h和8h后，结果显示上述已知的孕酮受体激动剂均可以诱导BLYrPRS酵母菌自主产生生物发光信号，表明BLYrPRS酵母菌能够准确验证对孕酮受体具有激动活性的物质。
从图4可以看出，将不同浓度的已知的对孕酮受体具有拮抗活性的壬基酚与孕酮共同作用BLYrPRS酵母菌4h和8h后，相比孕酮(10nM)对BLYrPRS酵母菌单独作用时的生物发光信号强度，壬基酚能显著抑制孕酮诱导BLYrPRS酵母菌自主生物发光的信号强度，即孕酮诱导产生的自主发光信号能被壬基酚拮抗，表明BLYrPRS酵母菌能够准确验证对孕酮受体具有拮抗活性的物质。
结合图2、图3和图4可知，本申请的BLYrPRS酵母菌对已知的对孕酮受体具有激动活性或拮抗活性的物质均能有效验证，因此，本申请的BLYrPRS酵母菌用于验证物质对孕酮受体的激动以及拮抗活性时具有较高的特异性和准确性。
在此基础上，申请人对双酚类化合物(双酚A、双酚AF、双酚B、双酚F、双酚S和双酚芴)对于孕酮受体的激动或者拮抗活性进行验证，从图5和图6可以看出，将双酚A、双酚AF、双酚B、双酚F、双酚S和双酚芴分别单独作用BLYrPRS酵母菌4h和8h后，结果显示上述双酚类化合物均不能诱导BLYrPRS酵母菌自主产生生物发光信号，表明上述双酚类化合物对孕酮受体均不具有激动活性；将双酚A、双酚AF、双酚B、双酚F、双酚S和双酚芴分别和孕酮共同作用BLYrPRS酵母菌4h和8h后，结果显示，相比孕酮(10nM)对BLYrPRS酵母菌单独作用时的生物发光信号强度，双酚A、双酚AF、双酚B和双酚F能显著抑制孕酮诱导BLYrPRS酵母菌自主生物发光的信号强度，而双酚S和双酚芴无明显抑制生物发光信号效应，表明双酚A、双酚AF、双酚B和双酚F对孕酮受体均具有一定的拮抗活性，双酚S和双酚芴对孕酮受体无明显拮抗活性用。
此外，申请人使用其他类固醇激素受体的激动剂如雄激素受体(AR)激动剂睾酮、糖皮质激素受体(GR)激动剂皮质醇以及盐皮质激素受体(MR)激动剂醛固酮单独或与孕酮共同作用BLYrPRS酵母4h和8h后，从图7和图8可以看出，醛固酮和睾酮对PR具有较弱的激动活性而不具有拮抗活性，皮质醇不具有PR的激动和拮抗活性。
从表2和表3可以看出，EC50或IC50值较低且变异系数(CV)均在15％以内，表明本申请的BLYrPRS酵母菌用于验证物质对孕酮受体的激动以及拮抗活性时具有较高的灵敏度以及稳定性。
综上，本申请的BLYrPRS酵母菌无需添加细胞裂解液和外源性底物即能够自主、持续、稳定产生荧光响应信号，可以实现物质对孕酮受体的激动或拮抗活性的动态监测，从而准确、可靠、直观地评价物质对孕酮受体的激动或拮抗活性，特异性强、灵敏度高、成本低且操作简单。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
<120> 细胞筛选模型及其构建方法和应用、酵母菌及其制备方法和应用
<130> 2021.09.13
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2772
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
atgaccgaat tgcaagctaa agatccaaga accttgcata cttctggtgc tgctccatct 60
ccaactcatg ttggttctcc attattggct agattggatc cagatccatt tcaaggttct 120
caacattctg atgcctcttc agttgtttcc ccaattccaa tttctttgga caggttgttg 180
ttctccagat cttgtcaagc tcaagaattg ccagacgaaa agacccaaaa tcaacaatcc 240
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aaagattcat tgccacaagt ttacccacca tacttgaact acttaagacc agattctgaa 1620
gcctcacaat ctccacaata tggtttcgat tctctaccac aaaagatctg cttgatttgc 1680
ggtgatgaag cttctggttg tcattatggt gttttgactt gtggttcttg caaggtgttt 1740
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ggctccgccc ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc 9120
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gctgtgtgca cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc 9360
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gctacactag aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa 9540
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tttgcaagca gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt 9660
ctacggggtc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat 9720
tatcaaaaag gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct 9780
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tctcagcgat ctgtctattt cgttcatcca tagttgcctg actccccgtc gtgtagataa 9900
ctacgatacg ggagggctta ccatctggcc ccagtgctgc aatgataccg cgagacccac 9960
gctcaccggc tccagattta tcagcaataa accagccagc cggaagggcc gagcgcagaa 10020
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taagtagttc gccagttaat agtttgcgca acgttgttgc cattgctaca ggcatcgtgg 10140
tgtcacgctc gtcgtttggt atggcttcat tcagctccgg ttcccaacga tcaaggcgag 10200
ttacatgatc ccccatgttg tgcaaaaaag cggttagctc cttcggtcct ccgatcgttg 10260
tcagaagtaa gttggccgca gtgttatcac tcatggttat ggcagcactg cataattctc 10320
ttactgtcat gccatccgta agatgctttt ctgtgactgg tgagta 10366

Claims (5)

1.一种酵母菌，其特征在于，所述酵母菌的命名为BLYrPRS，所述酵母菌的保藏编号为CGMCC NO.22947。
2.一种如权利要求1所述的酵母菌的制备方法，其特征在于，包括：构建孕酮受体表达载体PR/pRS315和报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi；将所述报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi中的孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中制得中间载体HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母；再将所述孕酮受体表达载体PR/pRS315转化至所述HRE-Lux/pAbAi/Y1HGold酵母中；
或，构建孕酮受体表达载体PR/pRS315和报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi；将所述孕酮受体表达载体PR/pRS315转化至Y1HGold酿酒酵母中制得中间载体PR/pRS315/Y1HGold；再将所述报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi中的孕酮激素反应元件5X HRE和报告基因Lux整合至所述PR/pRS315/Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中；
其中，所述孕酮受体表达载体PR/pRS315的序列如SEQ ID NO.5所示，所述报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi的序列如SEQ ID NO.6所示；
采用StuI限制性内切酶切割所述报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi后通过电击转化方式将所述孕酮激素反应元件5XHRE和所述报告基因Lux整合至Y1HGold酿酒酵母细胞的基因组中；
所述孕酮受体表达载体PR/pRS315的构建方法包括将序列如SEQ ID NO.1所示的PR优化基因、强组成型启动子TDH3以及线性化的pRS315-TEF-CYC1质粒连接；
所述报告基因表达载体HRE-Lux/pAbAi的构建方法包括将孕酮激素反应元件5X HRE、报告基因Lux以及线性化的pAbAi质粒连接。
3.一种筛选孕酮受体激动剂或孕酮受体拮抗剂的方法，其特征在于，包括：将如权利要求1所述的酵母菌的OD600调整为0.1-0.2，加入待筛选药物震荡孵育后检测荧光信号强度。
4.根据权利要求3所述的筛选孕酮受体激动剂或孕酮受体拮抗剂的方法，其特征在于，所述孵育的时间为3-24h。
5.根据权利要求3所述的筛选孕酮受体激动剂或孕酮受体拮抗剂的方法，其特征在于，所述孵育的温度为28-30℃。
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