CN107653240B - 一种DNA-MarkerI分子量标准及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种制备DNA Marker I分子量标准的方法，包括以下步骤：将9个不同长度的DNA片段分配至三个质粒中；限制性内切酶进行酶切，然后混合酶切片段后即得DNA Marker I分子量标准。本发明的方法解决了现有技术酶切DNA片段方法制备DNA Marker各条带之间亮度不均一的问题，即通过增加不同DNA片段的拷贝数以及在质粒酶切产物的混合重量比例，达到DNA片段亮度一致，从而解决批次间质量不稳定的问题。

Description

一种DNA-MarkerI分子量标准及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种DNA Marker I分子量标准及其制备方法与应用。

背景技术

DNA分子量标准又称DNA Marker，是分子生物学电泳实验中经常使用到的一种DNA片段的定性或定量参照物，一般由一系列不同长度的DNA片段组成。在琼脂糖电泳中，通过将DNA Marker与DNA片段一起电泳分析，可以对DNA片段的长度和浓度做出大致估计。

DNA Marker的制备一般有两种方法：DNA片段混合法和质粒限制性酶切法。

DNA片段混合法，一般由不同长度的单一DNA片段混合而成。PCR扩增方法是获得一定长度单一DNA片段的常规方法，只需要利用已知模板DNA序列，使用引物设计软件设计相应引物，可方便的扩增不同长度单一DNA片段。但以PCR扩增获得DNA片段的方法的有明显的不足，一是生产条件要求高，PCR扩增不但需要专业的PCR仪器，而且还需要相关分子生物学和引物设计知识，同时PCR反应体系中的Taq酶、dNTP等PCR反应试剂也需要额外购置。二是DNA片段的产量容易受到限制，一台PCR仪96孔，每个PCR管上样量100微升，PCR扩增反应结束后约获得90微升体积，一次最多也只能获得约8毫升。更多的PCR扩增产物则需要增加PCR仪器或者进行多次扩增。三是PCR所扩增DNA片段单一性不强，经常伴随有非特异性条带或者引物二聚体，为了去除非特异性条带或者引物二聚体又要增加分离纯化步骤，不但增加DNA Marker生产成本，也显得步骤繁琐。

质粒限制性酶切法，一般采用限制性内切酶对质粒载体DNA酶切消化获得，具有制备方便、步骤简单的优点。但由于酶切后DNA片段的亮度与其长度成正比例关系，一个质粒中各酶切DNA片段其亮度会存在较大的差异，大片段比小片段亮度高，会导致制备的DNAMarker各条带之间亮度不均一。

DNA分子量标准是在分子生物学电泳实验中最常用的一种消耗性试剂，市场用量很大。DNA Marker I分子量标准，由2400bp，2000bp，1600bp，1200bp，1000bp，800bp，600bp，400bp，200bp共9个DNA片段组成，其中1000bp为加亮指示条带。DNA Marker I在200bp～1200bp之间为200bp大小间隔的DNA片段，1200bp～2400bp之间为400bp大小间隔的DNA片段，其DNA片段长度参照范围可以满足绝大多数实验室对DNA Marker使用要求，具有广阔的销售市场。许多公司采用DNA片段混合法进行该产品的制备，由于该DNA分子量标准既含有像200bp这种小片段DNA，也含有像2400bp这种大片段DNA。PCR扩增时小片段DNA极易产生引物二聚体，大片段DNA则极易出现非特异性条带，扩增后需要进一步纯化去除引物二聚体或者非特异性条带，定量后再进行配制调整，得到最终DNA Marker I产物。因此，采用DNA片段混合法制备DNA Marker I，不但制备步骤繁琐、耗时费力，生产流程也难于标准化，容易造成DNA Marker I不同批次间的条带亮度差异问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的第一目的在于提供一种制备DNA Marker I分子量标准的方法，包括以下步骤：

步骤1)9个不同长度的DNA片段分配至三个质粒中；

2)将分配后的三个质粒用限制性内切酶进行酶切，然后混合酶切片段后即得DNAMarker I分子量标准；

其中所述9个不同长度的DNA片段分别为2400bp，2000bp，1600bp，1200bp，1000bp，800bp，600bp，400bp，200bpDNA片段；

所述分配后的三个质粒分别为质粒1基因工程质粒载体pBS-7.2kb，核苷酸如序列表中SEQ ID NO:4所示；质粒2为基因工程质粒载体pBS-8kb，核苷酸如序列表中SEQ ID NO:5所示；质粒3为基因工程质粒载体pBS-4.8kb，核苷酸如序列表中SEQ ID NO:6所示。

优选地，本发明所述的制备DNA Marker I分子量标准的方法中，所述步骤1)中9个不同长度的DNA片段分配至三个质粒的拷贝数分别为：质粒1包含2400bp片段、拷贝数1，1200bp片段、拷贝数2，600bp片段、拷贝数4；质粒2包含2000bp片段、拷贝数1，1000bp片段、拷贝数4，200bp片段、拷贝数10；质粒3包含1600bp片段、拷贝数1，800bp片段、拷贝数2，400bp片段、拷贝数4。

优选地，本发明所述的制备DNA Marker I分子量标准的方法中，所述步骤2)的限制性内切酶是EcoR I。

优选地，本发明所述的制备DNA Marker I分子量标准的方法中，所述步骤2)中质粒1～质粒3的酶切产物的混合重量比例为1:1.2:1～1:2:15；更优选地，所述步骤2)中质粒1～质粒3的酶切产物的混合重量比例为1:1.3:1。

优选地，本发明所述的制备DNA Marker I分子量标准的方法中，所述步骤(2)中酶切后，使用乙醇沉淀纯化所述质粒酶切产物后，再将所述质粒的酶切产物混合。

本发明的另一方面为提供上述方法制备的DNA Marker I分子量标准。

本发明的又一方面为提供上述DNA Marker I分子量标准在琼脂糖凝胶电泳中的应用。

本发明的再一方面为提供基因工程质粒载体pBS-7.2k的构建，插入核苷酸序列如表中SEQ ID NO:1所示；一种基因工程质粒载体pBS-8kb的构建，插入核苷酸序列如表中SEQID NO:2所示；一种基因工程质粒载体pBS-4.8kb的构建，插入核苷酸序列如表中SEQ IDNO:3所示。

本发明针对DNA片段混合法制备DNA Marker I步骤繁琐，批次间质量不稳定，难以规模化生产的问题，提供一种新的制备DNA Marker I分子量标准的方法及其生产应用，其制备步骤简单，可规模化生产，各批次间质量稳定，各条带间亮度均一。本发明与现有技术相比，本发明至少具有以下优点：

1、采用质粒限制性酶切法制备DNA Marker I分子量标准，将各条带分配到不同的基因工程质粒进行扩增，并调整各条带拷贝数，使各条带相互之间浓度相近。提取的质粒DNA经限制性内切酶酶切后，就可直接得到每条DNA片段所需要的浓度比例，避免了PCR扩增所得的各条带因浓度差异过大及非特异性条带或引物二聚体，需要分离纯化和浓度调整带来的步骤繁琐，耗时费力的问题。

2、以质粒DNA的提取和酶切操作代替PCR扩增。在实际生产中便于生产流程的标准化和生产规模的扩大化，而PCR扩增受限于每次扩增的体积、各扩增批次之间DNA片段浓度的差异等问题，不容易生产规模化及扩大化。

3、质粒DNA提取及酶切操作均为非常成熟的分子生物学技术，生产中易于熟练掌握和扩大生产规模，并进行标准的质量控制，保证各批次DNA分子量标准之间具有几乎完全一致的质量标准，从而解决批次间质量不稳定的问题。

附图说明

图1为基因工程质粒载体pBS-7.2kb构建流程图；

图2为基因工程质粒载体pBS-8kb构建流程图；

图3为基因工程质粒载体pBS-4.8kb构建流程图；

图4为基因工程质粒载体pBS-7.2kb结构示意图；

图5为基因工程质粒载体pBS-8kb结构示意图；

图6为基因工程质粒载体pBS-4.8kb结构示意图；

图7为本发明DNA Marker I分子量标准在1.5％琼脂糖凝胶电泳图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种制备DNA Marker I分子量标准的方法。将DNA Marker I分子量标准包括的9个不同长度的DNA片段分别构建在三个质粒载体中，三个质粒载体转化大肠杆菌大量复制后，提取其质粒DNA，直接使用限制性内切酶EcoR I酶切，酶切产物回收纯化、混合后，就得到了由9个不同长度DNA片段组成的DNA Marker I分子量标准，并且意外地发明人通过调整三个质粒中分配的DNA片段的组合与混合质量比例，发现最终DNAMarker I分子量标准的9个条带亮度一致，而且指示条带(1000bp)亮度为其余条带的两倍。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

1.三个基因工程质粒载体的构建

1)总述

本发明中三个基因工程质粒载体首先以高产的载体pBluescriptII SK(-)(核苷酸如序列表中SEQ ID NO:7所示)为骨架，自制pBS-T载体。然后采用PCR扩增方法，以lambdaDNA为模板，分别扩增无EcoR I酶切位点的3个插入片段，在T4 DNA连接酶作用下进行TA克隆，构建pBS-7.2kb、pBS-8kb、pBS-4.8kb三个中间载体。最后采用定点突变的方法，对上述三个中间载体进行EcoR I酶切位点突变操作，改造后的质粒载体可用于制备DNA Marker I分子量标准。

2)pBS-T载体的制备

本发明中pBS-T载体的制备方法，根据发明专利《一种基于Taq酶末端转移酶活性构建T载体的方法》(专利号：ZL2014102312328)进行制备。

详细步骤见后续实施例1。

3)插入片段的PCR扩增

以lambda DNA序列为模板，使用Primer Premier 5软件设计3对PCR扩增引物，分别扩增4236bp、5036bp和1836bp三个无EcoR I酶切位点的插入片段。扩增后，将3个插入片段使用PCR产物纯化试剂盒(上海生工)进行纯化，用于下一步插入片段的TA克隆。详细步骤见后续实施例2。

4)插入片段的TA克隆

将自制pBS-T载体分别与纯化后4236bp、5036bp和1836bpPCR片段，在T4 DNA连接酶作用下进行TA克隆连接、转化后，涂布于含有抗生素的显色平板。过夜培养后，分别挑取3个转化平板中的单个白斑菌落，使用M13引物菌落PCR验证为插入片段的菌落，分别命名为pBS-7.2kb中间载体、pBS-8kb中间载体和pBS-4.8kb中间载体，用于下一步EcoR I酶切位点的定点突变。详细步骤见后续实施例3。

5)EcoR I酶切位点的定点突变

采用重叠PCR方法，分别对pBS-7.2kb中间载体、pBS-8kb中间载体和pBS-4.8kb中间载体进行定点突变，逐个引入EcoR I酶切位点，直至所需EcoR I酶切位点全部突变完成。根据最终三个质粒载体片段长度和拷贝数分配情况，三个中间载体需引入EcoR I酶切位点数目如下：

pBS-7.2kb质粒载体，包含2400bp*1，1200bp*2，600bp*4，需引入7个EcoR I酶切位点。

pBS-8kb质粒载体，包含2000bp*1，1000bp*4，200bp*10，需引入15个EcoR I酶切位点。

pBS-4.8kb质粒载体，包含1600bp*1，800bp*2，400bp*4，需引入7个EcoR I酶切位点。

其中*后表示该长度片段在载体中的拷贝数。

每次定点突变引入EcoR I酶切位点，重叠PCR产物需使用Dpn I内切酶去除残留中间载体DNA后，转化大肠杆菌DH5α，涂布于抗性平板。过夜培养后，挑取转化平板中单个菌落，摇菌后送上海生工测序验证EcoR I酶切位点突变结果。详细步骤见实施例4。

2.DNA Marker I生产条件的优化

1)质粒DNA提取

构建好的pBS-7.2kb质粒载体、pBS-8kb质粒载体和pBS-4.8kb质粒载体，采用LB液体培养基在250ml三角瓶中进行基因工程质粒的摇菌培养。三个质粒载体均以高产的质粒载体pBluescriptII SK(-)为骨架，采用离心柱式质粒大提试剂盒(上海生工)提取质粒DNA，平均每升培养菌液可以提取5～10mg的质粒DNA，整个操作过程简单，在1小时内可以完成，所提取的质粒DNA纯度高，可以满足后续酶切工作的要求。

2)酶切

本构建中所采用的EcoR I限制性内切酶为最常用的一种内切酶，价格低廉，可以最大限度降低生产成本。pBS-7.2kb质粒载体和pBS-4.8kb质粒载体含有7个EcoR I酶切位点，优选使用2个单位的EcoR I内切酶酶切1ug质粒DNA。pBS-8kb质粒载体含有15个EcoR I酶切位点，优选使用4个单位的EcoR I内切酶酶切1ug质粒DNA。酶切后，琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否完全。

3)纯化

酶切产物采用乙醇沉淀法进行纯化，所得产物溶于适量TE中，定量后用于DNAMarker I分子量标准的配制。

4)终产品的配制

pBS-7.2kb质粒载体、pBS-8kb质粒载体和pBS-4.8kb质粒载体经EcoR I酶切后，除pBS-8kb质粒载体中1000bp为加亮指示条带，各载体内部不同片段的含量是相同的，在亮度上不存在差异。通过调整不同载体的质量比，就可保证DNA Marker I分子量标准各条带浓度相同，亮度均一。经计算，pBS-7.2kb、pBS-8kb和pBS-4.8kb三个质粒酶切，纯化。然后以质量比1:1.2:1～1:2:1，最佳质量比1:1.3:1进行混合，可保证DNA Marker I分子量标准各条带浓度相同，亮度均一(1000bp为加亮指示条带，亮度为其它条带的2倍)。由于DNA MarkerI分子量标准有9个条带，为了电泳时便于观察将1000bp条带浓度加倍，为加亮指示条带。调整好浓度后，将酶切混合产物溶于1×Loadingbuffer，电泳检测后，分装即为DNA Marker I分子量标准。其中2400bp，2000bp，1600bp，1200bp，800bp，600bp，400bp，200bp的各条带浓度为10ng/μL，1000bp条带浓度为20ng/μL，Loading buffer为1×浓度。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的制备DNA Marker I分子量标准的方法进行详细说明。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照生产厂商所建议的条件进行。

实施例1：pBS-T载体的制备

pBS-T载体的制备，以pBluescriptII SK(-)载体为骨架(以下简称pBS载体)进行制备。包括以下三个步骤：1.pBS载体线性化→2.线性化pBS载体线3′-端加T→3.去除3′-端未加T载体。详细反应体系和反应参数均参照发明专利《一种基于Taq酶末端转移酶活性构建T载体的方法》(专利号：ZL2014102312328)进行制备。

实施例2：插入片段的PCR扩增

引物设计

根据Genbank登录的lambda DNA基因序列(Accession:M17233)，使用PrimerPremier V5.0软件设计3对不同片段大小的扩增引物，分别扩增4236bp、5036bp和1836bp三个无EcoR I酶切位点的插入片段。引物交由上海生工生物工程公司合成。具体引物序列和插入片段信息见表1。

表1插入片段PCR扩增引物

2.扩增

PCR扩增为分子生物学常规技术，对于3个不同长度插入片段的扩增，只需根据引物的退火温度和DNA聚合酶的延伸速度，做相应的调整即可。本实施例中以PCR扩增4236bp片段进行详细说明。

PCR反应体系为：(50μL)

加入灭菌蒸馏水补足体积到50μL，混匀后在PTC-200(Bio-Rad公司)PCR仪上扩增。扩增条件如下：94℃，1min；94℃，15s，55℃，30s，72℃，5mins，25Cycles；72℃，8min。反应结束后，取5.0μLPCR产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分析，其余置4℃保存备用。

本实验中所用的Taq HiFi DNA酶可以达到1kb/min的延伸速度，5036bp插入片段扩增时，延伸时间5min，1836bp插入片段扩增时，延伸时间2min。

3.纯化

使用PCR产物纯化试剂盒(上海生工)对PCR产物进行纯化。具体步骤如下：

a.将PCR反应液移至一干净的1.5mL离心管中，加入5倍体积的Buffer B3，充分混匀；

b.将混合液全部移入吸附柱，8,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

c.向吸附柱中加入500μL Wash Solution，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

d.重复步骤c一次；

e.将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000×g离心1min；

f.在吸附膜中央加入15-40μL Elution Buffer，室温静置1-2min，9,000×g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

实施例3：插入片段的TA克隆

1.连接

使用T4 DNA连接酶(Thermo公司)对实施例2所得4236bp插入片段在PTC-200(Bio-Rad公司)PCR仪上按下列条件进行连接反应。

T4 DNA Ligase连接反应体系为：

加入灭菌蒸馏水补足体积到10μL，混匀后16℃连接过夜。

2.转化

将10μL连接液转入100μL DH5α感受态细胞，轻轻摇匀，冰上放置30min，42℃热激90S后加入900μL LB液体37℃，180rpm摇床上复苏1h后，取100μL复苏连接液涂布于含Amp(100mg/L)、X-Gal(8mg/L)、IPTG(8mg/L)的LB平板上，37℃倒置培养过夜，4℃放置2h，出现蓝、白斑菌落后进行菌落PCR验证。

3.菌落PCR验证

用灭菌牙签随机挑取其中5个白斑部分菌落，使用M13引物菌落PCR验证。PCR反应体系为：

加入灭菌蒸馏水补足体积到25μL，混匀后在PTC-200(Bio-Rad公司)PCR仪上扩增。扩增条件如下：94℃，90s；94℃，30s，55℃，30s，72℃，5min，25Cycles；72℃，8min。反应结束后，取5.0μLPCR产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分析插入片段TA克隆结果。

实施例4：EcoR I酶切位点的定点突变

定点突变为分子生物学成熟的技术方法，有相应的试剂盒可供选择。本发明试验中采用PCR法进行EcoR I酶切位点的定点突变，针对每个待突变的位点合成一对突变引物，进行PCR扩增。PCR产物使用Dpn I内切酶去除残留中间载体DNA后，转化大肠杆菌DH5α，筛选突变克隆，最后通过测序验证EcoR I酶切位点是否突变成功。

而对于3个不同中间载体的EcoR I酶切位点的定点突变，只需根据突变位点序列和质粒载体片段大小，做相应的调整即可。本实施例中以pBS-7.2kb中间载体EcoR I酶切位点的定点突变进行详细说明。

1.突变引物设计

根据pBS-7.2kb中间载体基因序列，采用部分重叠引物设计，引物包含5'端重叠区和3'端延伸区。其中突变位点位于两条引物上，分别位于正向突变引物重叠区下游、紧邻重叠区；反向突变引物5'端。除突变点之外，两条引物的长度大约30个核苷酸，5'端重叠区包含15-20个碱基，3'端延伸区包含至少10个碱基。

pBS-7.2kb中间载体，引入7个EcoR I酶切位点，需设计7对突变引物。具体突变位点及突变顺序，5200：GAAACC→GAATTC，1600：GCCCGG→GAATTC，400：ATGAGC→GAATTC，2800：GCCGGA→GAATTC，3400:TCAGGC→GAATTC，4000：TGATCG→GAATTC，4600：GGCGCA→GAATTC。pBS-7.2kb中间载体7个EcoR I酶切位点依次突变完成后，成为pBS-7.2kb质粒载体。

pBS-8kb中间载体，引入15个EcoR I酶切位点，需设计7对突变引物。具体突变位点及突变顺序，3000：GAAGGG→GAATTC，4400：GAACAG→GAATTC，6000：GAAACC→GAATTC，1000：AGCCGT→GAATTC，2000：ATCTGG→GAATTC，4000:CGGATA→GAATTC，4200：AAGATG→GAATTC，4600：CGCTCG→GAATTC，4800：AGCGGG→GAATTC，5000：GGGGCA→GAATTC，5200：ATCTTG→GAATTC，5400:CTGGAA→GAATTC，5600：CGCCAA→GAATTC，5800：CAGCTT→GAATTC，8000：CCTGAC→GAATTC。pBS-8kb中间载体15个EcoR I酶切位点依次突变完成后，成为pBS-8kb质粒载体。

pBS-4.8kb中间载体，引入7个EcoR I酶切位点，需设计7对突变引物。具体突变位点及突变顺序，2967：GAATCA→GAATTC，1767：GAAAGC→GAATTC，567：GGGTAA→GAATTC，1367：GCTGGA→GAATTC，967：ATGGGC→GAATTC，2167:TTGATC→GAATTC，3767：TTTTAA→GAATTC。pBS-4.8kb中间载体7个EcoR I酶切位点依次突变完成后，成为pBS-4.8kb质粒载体。

下面以pBS-7.2kb中间载体的5200：GAAACC→GAATTC为例来阐述突变引物设计，具体引物序列如下。

Forward:5'----CTGTCGTGCC----3'

Reverse:3'----GCGAGTGACG----5'

正反向突变引物中加粗碱基部分为突变位点，斜体碱基为正反向引物的重叠区域，其余部分为正反向引物3'端延伸区域。突变引物交由上海生工生物工程公司合成。

2.EcoR I突变位点引入

采用PCR扩增的方法，对pBS-7.2kb中间载体引入5199:GAAACC→GAATTC EcoR I突变位点。具体PCR反应体系如下：

PCR反应体系为：

加入灭菌蒸馏水补足体积到25μL，混匀后在PTC-200(Bio-Rad公司)PCR仪上扩增。扩增条件如下：94℃，2min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，4min，25Cycles；72℃，10min。反应结束后，取5.0μL PCR产物于1.0％琼脂糖凝胶上电泳分析，观察目的条带大小是否正确。其余PCR产物，加入1μL DpnI内切酶混匀，置37℃孵育1h。

3.转化

a.取5μL DpnI消化PCR产物，加入到50μL DH5α感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入PCR产物)，轻弹混匀，冰浴30分钟；

b.42℃准确热激45秒，立即置于冰上2min；

c.加500μL平衡至室温的SOC，200rpm，37℃培养1小时；

d.取200μL菌液，涂布于含Amp(100mg/L)的LB平板上，培养过夜获取突变转化子菌落(为得到较多的菌落，4000rpm离心1min，弃掉部分上清，保留100-150μL，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂板，培养过夜)。

4.EcoR I突变位点验证

用灭菌牙签随机挑取5个转化子，分别在含Amp(100mg/L)浓度的5mL LB液体试管中过夜摇菌。5个转化子菌落的EcoR I位点突变是否成功，送上海生工生物工程公司进行测序验证。

实施例5：质粒DNA提取

使用柱式质粒大量抽提试剂盒(上海生工)对pBS-7.2kb质粒载体进行纯化。具体步骤如下：

a.将过夜摇菌100mL的pBS-7.2kb质粒菌液，分装在干净的50mL圆底离心管中，10,000rpm离心3min，收集菌体，倒尽或吸干培养基；

b.在菌体沉淀中加入10mlBufferP1，吸打或振荡至彻底悬浮菌体；

c.加入10mlBufferP2，立即温和颠倒离心管5-10次混匀，室温静置2～4min；

d.加入14ml BufferP3，立即上下颠倒5～10次，室温放置5min；

e.12,000rpm离心15min；

f.将上清全部小心移入吸附柱，室温放置5min，8,000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

g.向吸附柱中加入5mL BufferDW1，8,000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

h.向吸附柱中加入5ml Wash Solution，8,000rpm离心2min。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中；

i.重复步骤10一次；

j.将空吸附柱和收集管放入离心机，10,000rpm离心2min。

k.将吸附柱放入干净的50mL离心管中，在吸附膜中央加入2mL Elution Buffer，室温静置2min，10,000rpm离心2min。将所得到的质粒DNA溶液置于-20℃保存或用于后续试验。

实施例6：酶切

使用EcoR I(Takara公司)内切酶，对pBS-7.2kb质粒载体进行40mL体系大规模酶切。由于pBS-7.2kb质粒载体含有7个EcoR I酶切位点，优选使用2个单位的EcoR I内切酶酶切1ug质粒DNA。具体酶切反应体系如下：EcoR I酶切反应体系为：

10×H buffer 4mL

pBS-7.2kb质粒载体(100ng/μL) 20mL

EcoR V内切酶(10U/μL) 0.4mL

加入灭菌蒸馏水补足体积到40mL。37℃反应2h，酶切产物取3μL，1％琼脂糖凝胶电泳检测是否酶切完全。

实施例7：酶切产物纯化

采用乙醇沉淀法对pBS-7.2kb质粒载体酶切产物进行回收纯化。具体步骤如下：

a.将40mL酶切产物分装在2个50mL的离心管中；

b.加入等体积酚-氯仿-异戊醇，摇晃均匀；

c.12,000rpm离心5min；

d.小心将上层水相转移到另一50mL离心管中；

e.加入2.5倍体积的-20℃预冷无水乙醇，1/10体积3M NaAc(pH5.2)混匀；

f.-20℃沉淀2h以上；

g.12,000rpm离心，6min；

h.倒上清液，用70％乙醇洗涤2次(10mL)；

i.稍离心，倒70％乙醇晾干无酒精味；

j.加入5mL TE溶解；

k.在NanoDrop 2000c仪器上测定回收后DNA浓度，并稀释至500ng/μL，-20℃保存用于后续工作。

实施例8：终产品的配制

以实施例7中所得的浓度为500ng/μL的样品为原材料配制DNA Marker I终产品。以配制100mL终产品为例，具体配制方案如下：

其中5×Loading buffer组成如下：

25mM EDTA，30％甘油，0.05％二甲苯菁，0.05％溴酚蓝。

每批次配制的DNA Marker I成品，先进行电泳检测和室温稳定性检测后，然后以每支0.5mL分装成品DNA Marker I。平均1L菌液所提取的质粒DNA酶切分装后，可得到150mL以上的DNA Marker I成品。

电泳检测：取配制好的不同体积的DNA Marker I样品，以标准样品5μL为对照在1.5％的琼脂糖上电泳，电泳缓冲液为1×TBE，电泳后在凝胶成像仪上进行拍照。电泳检测要求，DNA Marker I成品各条带亮度与标准品相同，且各条带清晰，条带间无杂带，无背景才为合格产品。电泳图见图7。

室温稳定性检测：将每批次配制的DNA Marker I成品，取500μL的量分别在室温放置3天、1周、2周后，与-20℃保存的成品进行电泳检测。室温稳定性检测要求，每批次DNAMarker I成品在室温放置后与-20℃保存的相比较，条带间无明显差异的为合格产品。

序列表

<110> 福建省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所

<120> 一种DNA Marker I分子量标准及其制备方法与应用

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 4236

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ttgtggtggg taaccgtcgt attcccggcg cgtttattca gcaactgaaa aatggccggt 60

ggcatgtcat gcagcgtgtg gctgggaaaa accgttaccc cattgatgtg gtgaaaatcc 120

cgatggcggt gccgctgacc acggcgttta aacaaaatat tgagcggata cggcgtgaac 180

gtcttccgaa agagctgggc tatgcgctgc agcatcaact gaggatggta ataaagcgat 240

gaaacatact gaactccgtg cagccgtact ggatgcactg gagaagcatg acaccggggc 300

gacgtttttt gatggtcgcc ccgctgtttt tgatgaggcg gattttccgg cagttgccgt 360

ttatctcacc ggcgctgaat acacgggcga agagctggac agcgatacct ggcaggcgga 420

gctgcatatc gaagttttcc tgcctgctca ggtgccggat tcagagctgg atgcgtggat 480

ggagtcccgg atttatccgg tgatgagcga tatcccggca ctgtcagatt tgatcaccag 540

tatggtggcc agcggctatg actaccggcg cgacgatgat gcgggcttgt ggagttcagc 600

cgatctgact tatgtcatta cctatgaaat gtgaggacgc tatgcctgta ccaaatccta 660

caatgccggt gaaaggtgcc gggaccaccc tgtgggttta taaggggagc ggtgaccctt 720

acgcgaatcc gctttcagac gttgactggt cgcgtctggc aaaagttaaa gacctgacgc 780

ccggcgaact gaccgctgag tcctatgacg acagctatct cgatgatgaa gatgcagact 840

ggactgcgac cgggcagggg cagaaatctg ccggagatac cagcttcacg ctggcgtgga 900

tgcccggaga gcaggggcag caggcgctgc tggcgtggtt taatgaaggc gatacccgtg 960

cctataaaat ccgcttcccg aacggcacgg tcgatgtgtt ccgtggctgg gtcagcagta 1020

tcggtaaggc ggtgacggcg aaggaagtga tcacccgcac ggtgaaagtc accaatgtgg 1080

gacgtccgtc gatggcagaa gatcgcagca cggtaacagc ggcaaccggc atgaccgtga 1140

cgcctgccag cacctcggtg gtgaaagggc agagcaccac gctgaccgtg gccttccagc 1200

cggagggcgt aaccgacaag agctttcgtg cggtgtctgc ggataaaaca aaagccaccg 1260

tgtcggtcag tggtatgacc atcaccgtga acggcgttgc tgcaggcaag gtcaacattc 1320

cggttgtatc cggtaatggt gagtttgctg cggttgcaga aattaccgtc accgccagtt 1380

aatccggaga gtcagcgatg ttcctgaaaa ccgaatcatt tgaacataac ggtgtgaccg 1440

tcacgctttc tgaactgtca gccctgcagc gcattgagca tctcgccctg atgaaacggc 1500

aggcagaaca ggcggagtca gacagcaacc ggaagtttac tgtggaagac gccatcagaa 1560

ccggcgcgtt tctggtggcg atgtccctgt ggcataacca tccgcagaag acgcagatgc 1620

cgtccatgaa tgaagccgtt aaacagattg agcaggaagt gcttaccacc tggcccacgg 1680

aggcaatttc tcatgctgaa aacgtggtgt accggctgtc tggtatgtat gagtttgtgg 1740

tgaataatgc ccctgaacag acagaggacg ccgggcccgc agagcctgtt tctgcgggaa 1800

agtgttcgac ggtgagctga gttttgccct gaaactggcg cgtgagatgg ggcgacccga 1860

ctggcgtgcc atgcttgccg ggatgtcatc cacggagtat gccgactggc accgctttta 1920

cagtacccat tattttcatg atgttctgct ggatatgcac ttttccgggc tgacgtacac 1980

cgtgctcagc ctgtttttca gcgatccgga tatgcatccg ctggatttca gtctgctgaa 2040

ccggcgcgag gctgacgaag agcctgaaga tgatgtgctg atgcagaaag cggcagggct 2100

tgccggaggt gtccgctttg gcccggacgg gaatgaagtt atccccgctt ccccggatgt 2160

ggcggacatg acggaggatg acgtaatgct gatgacagta tcagaaggga tcgcaggagg 2220

agtccggtat ggctgaaccg gtaggcgatc tggtcgttga tttgagtctg gatgcggcca 2280

gatttgacga gcagatggcc agagtcaggc gtcatttttc tggtacggaa agtgatgcga 2340

aaaaaacagc ggcagtcgtt gaacagtcgc tgagccgaca ggcgctggct gcacagaaag 2400

cggggatttc cgtcgggcag tataaagccg ccatgcgtat gctgcctgca cagttcaccg 2460

acgtggccac gcagcttgca ggcgggcaaa gtccgtggct gatcctgctg caacaggggg 2520

ggcaggtgaa ggactccttc ggcgggatga tccccatgtt cagggggctt gccggtgcga 2580

tcaccctgcc gatggtgggg gccacctcgc tggcggtggc gaccggtgcg ctggcgtatg 2640

cctggtatca gggcaactca accctgtccg atttcaacaa aacgctggtc ctttccggca 2700

atcaggcggg actgacggca gatcgtatgc tggtcctgtc cagagccggg caggcggcag 2760

ggctgacgtt taaccagacc agcgagtcac tcagcgcact ggttaaggcg ggggtaagcg 2820

gtgaggctca gattgcgtcc atcagccaga gtgtggcgcg tttctcctct gcatccggcg 2880

tggaggtgga caaggtcgct gaagccttcg ggaagctgac cacagacccg acgtcggggc 2940

tgacggcgat ggctcgccag ttccataacg tgtcggcgga gcagattgcg tatgttgctc 3000

agttgcagcg ttccggcgat gaagccgggg cattgcaggc ggcgaacgag gccgcaacga 3060

aagggtttga tgaccagacc cgccgcctga aagagaacat gggcacgctg gagacctggg 3120

cagacaggac tgcgcgggca ttcaaatcca tgtgggatgc ggtgctggat attggtcgtc 3180

ctgataccgc gcaggagatg ctgattaagg cagaggctgc gtataagaaa gcagacgaca 3240

tctggaatct gcgcaaggat gattattttg ttaacgatga agcgcgggcg cgttactggg 3300

atgatcgtga aaaggcccgt cttgcgcttg aagccgcccg aaagaaggct gagcagcaga 3360

ctcaacagga caaaaatgcg cagcagcaga gcgataccga agcgtcacgg ctgaaatata 3420

ccgaagaggc gcagaaggct tacgaacggc tgcagacgcc gctggagaaa tataccgccc 3480

gtcaggaaga actgaacaag gcactgaaag acgggaaaat cctgcaggcg gattacaaca 3540

cgctgatggc ggcggcgaaa aaggattatg aagcgacgct gaaaaagccg aaacagtcca 3600

gcgtgaaggt gtctgcgggc gatcgtcagg aagacagtgc tcatgctgcc ctgctgacgc 3660

ttcaggcaga actccggacg ctggagaagc atgccggagc aaatgagaaa atcagccagc 3720

agcgccggga tttgtggaag gcggagagtc agttcgcggt actggaggag gcggcgcaac 3780

gtcgccagct gtctgcacag gagaaatccc tgctggcgca taaagatgag acgctggagt 3840

acaaacgcca gctggctgca cttggcgaca aggttacgta tcaggagcgc ctgaacgcgc 3900

tggcgcagca ggcggataaa ttcgcacagc agcaacgggc aaaacgggcc gccattgatg 3960

cgaaaagccg ggggctgact gaccggcagg cagaacggga agccacggaa cagcgcctga 4020

aggaacagta tggcgataat ccgctggcgc tgaataacgt catgtcagag cagaaaaaga 4080

cctgggcggc tgaagaccag cttcgcggga actggatggc aggcctgaag tccggctgga 4140

gtgagtggga agagagcgcc acggacagta tgtcgcaggt aaaaagtgca gccacgcaga 4200

cctttgatgg tattgcacag aatatggcgg cgatgc 4236

<210> 2

<211> 5035

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

gggctggaaa tcctttctgt ggacgccgcc ttatgagtgg cggcagataa aggtgacctg 60

cgcaaaatgg tcgtcgcggg tcagtatgct gcgtgttgag ttcagcgcag agtttgaaca 120

ggtggtgaac tgatgcagga tatccggcag gaaacactga atgaatgcac ccgtgcggag 180

cagtcggcca gcgtggtgct ctgggaaatc gacctgacag aggtcggtgg agaacgttat 240

tttttctgta atgagcagaa cgaaaaaggt gagccggtca cctggcaggg gcgacagtac 300

agccgtatcc cattcagggg agcggttttg aactgaatgg caaaggcacc agtacgcgcc 360

ccacgctgac ggtttctaac ctgtacggta tggtcaccgg gatggcggaa gatatgcaga 420

gtctggtcgg cggaacggtg gtccggcgta aggtttacgc ccgttttctg gatgcggtga 480

acttcgtcaa cggaaacagt tacgccgatc cggagcagga ggtgatcagc cgctggcgca 540

ttgagcagtg cagcgaactg agcgcggtga gtgcctcctt tgtactgtcc acgccgacgg 600

aaacggatgg cgctgttttt ccgggacgta tcatgctggc caacacctgc acctggacct 660

atcgcggtga cgagtgcggt tatagcggtc cggctgtcgc ggatgaatat gaccagccaa 720

cgtccgatat cacgaaggat aaatgcagca aatgcctgag cggttgtaag ttccgcaata 780

acgtcggcaa ctttggcggc ttcctttcca ttaacaaact ttcgcagtaa atcccatgac 840

acagacagaa tcagcgattc tggcgcacgc ccggcgatgt gcgccagcgg agtcgtgcgg 900

cttcgtggta agcacgccgg agggggaaag atatttcccc tgcgtgaata tctccggtga 960

gccggaggct atttccgtat gtcgccggaa gactggctgc aggcagaaat gcagggtgag 1020

attgtggcgc tggtccacag ccaccccggt ggtctgccct ggctgagtga ggccgaccgg 1080

cggctgcagg tgcagagtga tttgccgtgg tggctggtct gccgggggac gattcataag 1140

ttccgctgtg tgccgcatct caccgggcgg cgctttgagc acggtgtgac ggactgttac 1200

acactgttcc gggatgctta tcatctggcg gggattgaga tgccggactt tcatcgtgag 1260

gatgactggt ggcgtaacgg ccagaatctc tatctggata atctggaggc gacggggctg 1320

tatcaggtgc cgttgtcagc ggcacagccg ggcgatgtgc tgctgtgctg ttttggttca 1380

tcagtgccga atcacgccgc aatttactgc ggcgacggcg agctgctgca ccatattcct 1440

gaacaactga gcaaacgaga gaggtacacc gacaaatggc agcgacgcac acactccctc 1500

tggcgtcacc gggcatggcg cgcatctgcc tttacgggga tttacaacga tttggtcgcc 1560

gcatcgacct tcgtgtgaaa acgggggctg aagccatccg ggcactggcc acacagctcc 1620

cggcgtttcg tcagaaactg agcgacggct ggtatcaggt acggattgcc gggcgggacg 1680

tcagcacgtc cgggttaacg gcgcagttac atgagactct gcctgatggc gctgtaattc 1740

atattgttcc cagagtcgcc ggggccaagt caggtggcgt attccagatt gtcctggggg 1800

ctgccgccat tgccggatca ttctttaccg ccggagccac ccttgcagca tggggggcag 1860

ccattggggc cggtggtatg accggcatcc tgttttctct cggtgccagt atggtgctcg 1920

gtggtgtggc gcagatgctg gcaccgaaag ccagaactcc ccgtatacag acaacggata 1980

acggtaagca gaacacctat ttctcctcac tggataacat ggttgcccag ggcaatgttc 2040

tgcctgttct gtacggggaa atgcgcgtgg ggtcacgcgt ggtttctcag gagatcagca 2100

cggcagacga aggggacggt ggtcaggttg tggtgattgg tcgctgatgc aaaatgtttt 2160

atgtgaaacc gcctgcgggc ggttttgtca tttatggagc gtgaggaatg ggtaaaggaa 2220

gcagtaaggg gcataccccg cgcgaagcga aggacaacct gaagtccacg cagttgctga 2280

gtgtgatcga tgccatcagc gaagggccga ttgaaggtcc ggtggatggc ttaaaaagcg 2340

tgctgctgaa cagtacgccg gtgctggaca ctgaggggaa taccaacata tccggtgtca 2400

cggtggtgtt ccgggctggt gagcaggagc agactccgcc ggagggattt gaatcctccg 2460

gctccgagac ggtgctgggt acggaagtga aatatgacac gccgatcacc cgcaccatta 2520

cgtctgcaaa catcgaccgt ctgcgcttta ccttcggtgt acaggcactg gtggaaacca 2580

cctcaaaggg tgacaggaat ccgtcggaag tccgcctgct ggttcagata caacgtaacg 2640

gtggctgggt gacggaaaaa gacatcacca ttaagggcaa aaccacctcg cagtatctgg 2700

cctcggtggt gatgggtaac ctgccgccgc gcccgtttaa tatccggatg cgcaggatga 2760

cgccggacag caccacagac cagctgcaga acaaaacgct ctggtcgtca tacactgaaa 2820

tcatcgatgt gaaacagtgc tacccgaaca cggcactggt cggcgtgcag gtggactcgg 2880

agcagttcgg cagccagcag gtgagccgta attatcatct gcgcgggcgt attctgcagg 2940

tgccgtcgaa ctataacccg cagacgcggc aatacagcgg tatctgggac ggaacgttta 3000

aaccggcata cagcaacaac atggcctggt gtctgtggga tatgctgacc catccgcgct 3060

acggcatggg gaaacgtctt ggtgcggcgg atgtggataa atgggcgctg tatgtcatcg 3120

gccagtactg cgaccagtca gtgccggacg gctttggcgg cacggagccg cgcatcacct 3180

gtaatgcgta cctgaccaca cagcgtaagg cgtgggatgt gctcagcgat ttctgctcgg 3240

cgatgcgctg tatgccggta tggaacgggc agacgctgac gttcgtgcag gaccgaccgt 3300

cggataagac gtggacctat aaccgcagta atgtggtgat gccggatgat ggcgcgccgt 3360

tccgctacag cttcagcgcc ctgaaggacc gccataatgc cgttgaggtg aactggattg 3420

acccgaacaa cggctgggag acggcgacag agcttgttga agatacgcag gccattgccc 3480

gttacggtcg taatgttacg aagatggatg cctttggctg taccagccgg gggcaggcac 3540

accgcgccgg gctgtggctg attaaaacag aactgctgga aacgcagacc gtggatttca 3600

gcgtcggcgc agaagggctt cgccatgtac cgggcgatgt tattgaaatc tgcgatgatg 3660

actatgccgg tatcagcacc ggtggtcgtg tgctggcggt gaacagccag acccggacgc 3720

tgacgctcga ccgtgaaatc acgctgccat cctccggtac cgcgctgata agcctggttg 3780

acggaagtgg caatccggtc agcgtggagg ttcagtccgt caccgacggc gtgaaggtaa 3840

aagtgagccg tgttcctgac ggtgttgctg aatacagcgt atgggagctg aagctgccga 3900

cgctgcgcca gcgactgttc cgctgcgtga gtatccgtga gaacgacgac ggcacgtatg 3960

ccatcaccgc cgtgcagcat gtgccggaaa aagaggccat cgtggataac ggggcgcact 4020

ttgacggcga acagagtggc acggtgaatg gtgtcacgcc gccagcggtg cagcacctga 4080

ccgcagaagt cactgcagac agcggggaat atcaggtgct ggcgcgatgg gacacaccga 4140

aggtggtgaa gggcgtgagt ttcctgctcc gtctgaccgt aacagcggac gacggcagtg 4200

agcggctggt cagcacggcc cggacgacgg aaaccacata ccgcttcacg caactggcgc 4260

tggggaacta caggctgaca gtccgggcgg taaatgcgtg ggggcagcag ggcgatccgg 4320

cgtcggtatc gttccggatt gccgcaccgg cagcaccgtc gaggattgag ctgacgccgg 4380

gctattttca gataaccgcc acgccgcatc ttgccgttta tgacccgacg gtacagtttg 4440

agttctggtt ctcggaaaag cagattgcgg atatcagaca ggttgaaacc agcacgcgtt 4500

atcttggtac ggcgctgtac tggatagccg ccagtatcaa tatcaaaccg ggccatgatt 4560

attactttta tatccgcagt gtgaacaccg ttggcaaatc ggcattcgtg gaggccgtcg 4620

gtcgggcgag cgatgatgcg gaaggttacc tggatttttt caaaggcaag ataaccgaat 4680

cccatctcgg caaggagctg ctggaaaaag tcgagctgac ggaggataac gccagcagac 4740

tggaggagtt ttcgaaagag tggaaggatg ccagtgataa gtggaatgcc atgtgggctg 4800

tcaaaattga gcagaccaaa gacggcaaac attatgtcgc gggtattggc ctcagcatgg 4860

aggacacgga ggaaggcaaa ctgagccagt ttctggttgc cgccaatcgt atcgcattta 4920

ttgacccggc aaacgggaat gaaacgccga tgtttgtggc gcagggcaac cagatattca 4980

tgaacgacgt gttcctgaag cgcctgacgg cccccaccat taccagcggc ggcaa 5035

<210> 3

<211> 1836

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gcgatgggca gcgactacat ccgtgaggtg aatgtggtga agtctgcccg tgtcggttat 60

tccaaaatgc tgctgggtgt ttatgcctac tttatagagc ataagcagcg caacaccctt 120

atctggttgc cgacggatgg tgatgccgag aactttatga aaacccacgt tgagccgact 180

attcgtgata ttccgtcgct gctggcgctg gccccgtggt atggcaaaaa gcaccgggat 240

aacacgctca ccatgaagcg tttcactaat gggcgtggct tctggtgcct gggcggtaaa 300

gcggcaaaaa actaccgtga aaagtcggtg gatgtggcgg gttatgatga acttgctgct 360

tttgatgatg atattgaaca ggaaggctct ccgacgttcc tgggtgacaa gcgtattgaa 420

ggctcggtct ggccaaagtc catccgtggc tccacgccaa aagtgagagg cacctgtcag 480

attgagcgtg cagccagtga atccccgcat tttatgcgtt ttcatgttgc ctgcccgcat 540

tgcggggagg agcagtatct taaatttggc gacaaagaga cgccgtttgg cctcaaatgg 600

acgccggatg acccctccag cgtgttttat ctctgcgagc ataatgcctg cgtcatccgc 660

cagcaggagc tggactttac tgatgcccgt tatatctgcg aaaagaccgg gatctggacc 720

cgtgatggca ttctctggtt ttcgtcatcc ggtgaagaga ttgagccacc tgacagtgtg 780

acctttcaca tctggacagc gtacagcccg ttcaccacct gggtgcagat tgtcaaagac 840

tggatgaaaa cgaaagggga tacgggaaaa cgtaaaacct tcgtaaacac cacgctcggt 900

gagacgtggg aggcgaaaat tggcgaacgt ccggatgctg aagtgatggc agagcggaaa 960

gagcattatt cagcgcccgt tcctgaccgt gtggcttacc tgaccgccgg tatcgactcc 1020

cagctggacc gctacgaaat gcgcgtatgg ggatgggggc cgggtgagga aagctggctg 1080

attgaccggc agattattat gggccgccac gacgatgaac agacgctgct gcgtgtggat 1140

gaggccatca ataaaaccta tacccgccgg aatggtgcag aaatgtcgat atcccgtatc 1200

tgctgggata ctggcgggat tgacccgacc attgtgtatg aacgctcgaa aaaacatggg 1260

ctgttccggg tgatccccat taaaggggca tccgtctacg gaaagccggt ggccagcatg 1320

ccacgtaagc gaaacaaaaa cggggtttac cttaccgaaa tcggtacgga taccgcgaaa 1380

gagcagattt ataaccgctt cacactgacg ccggaagggg atgaaccgct tcccggtgcc 1440

gttcacttcc cgaataaccc ggatattttt gatctgaccg aagcgcagca gctgactgct 1500

gaagagcagg tcgaaaaatg ggtggatggc aggaaaaaaa tactgtggga cagcaaaaag 1560

cgacgcaatg aggcactcga ctgcttcgtt tatgcgctgg cggcgctgcg catcagtatt 1620

tcccgctggc agctggatct cagtgcgctg ctggcgagcc tgcaggaaga ggatggtgca 1680

gcaaccaaca agaaaacact ggcagattac gcccgtgcct tatccggaga ggatgaatga 1740

cgcgacagga agaacttgcc gctgcccgtg cggcactgca tgacctgatg acaggtaaac 1800

gggtggcaac agtacagaaa gacggacgaa gggtgg 1836

<210> 4

<211> 7200

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaag aattctgatt taacaaaaat 420

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660

gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatttt gtggtgggta accgtcgtat 720

tcccggcgcg tttattcagc aactgaaaaa tggccggtgg catgtcatgc agcgtgtggc 780

tgggaaaaac cgttacccca ttgatgtggt gaaaatcccg atggcggtgc cgctgaccac 840

ggcgtttaaa caaaatattg agcggatacg gcgtgaacgt cttccgaaag agctgggcta 900

tgcgctgcag catcaactga ggatggtaat aaagcgatga aacatactga actccgtgca 960

gccgtactgg atgcactgga gaagcatgac accggggcga cgttttttga tggtcgcccc 1020

gctgtttttg atgaggcgga ttttccggca gttgccgttt atctcaccgg cgctgaatac 1080

acgggcgaag agctggacag cgatacctgg caggcggagc tgcatatcga agttttcctg 1140

cctgctcagg tgccggattc agagctggat gcgtggatgg agtcccggat ttatccggtg 1200

atgagcgata tcccggcact gtcagatttg atcaccagta tggtggccag cggctatgac 1260

taccggcgcg acgatgatgc gggcttgtgg agttcagccg atctgactta tgtcattacc 1320

tatgaaatgt gaggacgcta tgcctgtacc aaatcctaca atgccggtga aaggtgccgg 1380

gaccaccctg tgggtttata aggggagcgg tgacccttac gcgaatccgc tttcagacgt 1440

tgactggtcg cgtctggcaa aagttaaaga cctgacgccc ggcgaactga ccgctgagtc 1500

ctatgacgac agctatctcg atgatgaaga tgcagactgg actgcgaccg ggcaggggca 1560

gaaatctgcc ggagatacca gcttcacgct ggcgtggatg aattcagagc aggggcagca 1620

ggcgctgctg gcgtggttta atgaaggcga tacccgtgcc tataaaatcc gcttcccgaa 1680

cggcacggtc gatgtgttcc gtggctgggt cagcagtatc ggtaaggcgg tgacggcgaa 1740

ggaagtgatc acccgcacgg tgaaagtcac caatgtggga cgtccgtcga tggcagaaga 1800

tcgcagcacg gtaacagcgg caaccggcat gaccgtgacg cctgccagca cctcggtggt 1860

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ggccttcgcc ctgtttgtcg gtttttcgcc ctttgtcgtt ggtgtcctcg ttcttttttt 300

gtggtctctt gttcctttct ggttcttctc tcttcccttt ctcggtcttt tcttttgttt 360

tttttgggtt tttgccgttt tcggcctttt ggtttttttt tgtgctgttt tttctttttt 420

ttttcgcgtt ttttttcttt tttttttcgc tttctttttc ctttcgcctt tctggctgcg 480

cttctgttgg gttgggcgtt cggtgcgggc ctcttcgctt tttcgcctgc tggcgtttgg 540

gggttgtgct gcttggcgtt tttgttgttt tccgcctggg ttttccctgt ctcgtcgttg 600

tttttcgtcg gcctgtgtgc gcgcgttttt cgtctctctt ttgggcgttt tgggttccgg 660

gccccccctc gtggtcgtcg gtttcgtttt gcttgtttgc gatgggcagc gactacatcc 720

gtgaggtgaa tgtggtgaag tctgcccgtg tcggttattc caaaatgctg ctgggtgttt 780

atgcctactt tatagagcat aagcagcgca acacccttat ctggttgccg acggatggtg 840

atgccgagaa ctttatgaaa acccacgttg agccgactat tcgtgatatt ccgtcgctgc 900

tggcgctggc cccgtggtat ggcaaaaagc accgggataa cacgctcacc atgaagcgtt 960

tcactagaat tcgtggcttc tggtgcctgg gcggtaaagc ggcaaaaaac taccgtgaaa 1020

agtcggtgga tgtggcgggt tatgatgaac ttgctgcttt tgatgatgat attgaacagg 1080

aaggctctcc gacgttcctg ggtgacaagc gtattgaagg ctcggtctgg ccaaagtcca 1140

tccgtggctc cacgccaaaa gtgagaggca cctgtcagat tgagcgtgca gccagtgaat 1200

ccccgcattt tatgcgtttt catgttgcct gcccgcattg cggggaggag cagtatctta 1260

aatttggcga caaagagacg ccgtttggcc tcaaatggac gccggatgac ccctccagcg 1320

tgttttatct ctgcgagcat aatgcctgcg tcatccgcca gcaggagaat tcctttactg 1380

atgcccgtta tatctgcgaa aagaccggga tctggacccg tgatggcatt ctctggtttt 1440

cgtcatccgg tgaagagatt gagccacctg acagtgtgac ctttcacatc tggacagcgt 1500

acagcccgtt caccacctgg gtgcagattg tcaaagactg gatgaaaacg aaaggggata 1560

cgggaaaacg taaaaccttc gtaaacacca cgctcggtga gacgtgggag gcgaaaattg 1620

gcgaacgtcc ggatgctgaa gtgatggcag agcggaaaga gcattattca gcgcccgttc 1680

ctgaccgtgt ggcttacctg accgccggta tcgactccca gctggaccgc tacgaaatgc 1740

gcgtatgggg atgggggccg ggtgaggaat tctggctgat tgaccggcag attattatgg 1800

gccgccacga cgatgaacag acgctgctgc gtgtggatga ggccatcaat aaaacctata 1860

cccgccggaa tggtgcagaa atgtcgatat cccgtatctg ctgggatact ggcgggattg 1920

acccgaccat tgtgtatgaa cgctcgaaaa aacatgggct gttccgggtg atccccatta 1980

aaggggcatc cgtctacgga aagccggtgg ccagcatgcc acgtaagcga aacaaaaacg 2040

gggtttacct taccgaaatc ggtacggata ccgcgaaaga gcagatttat aaccgcttca 2100

cactgacgcc ggaaggggat gaaccgcttc ccggtgccgt tcacttcccg aataacccgg 2160

atatttgaat tctgaccgaa gcgcagcagc tgactgctga agagcaggtc gaaaaatggg 2220

tggatggcag gaaaaaaata ctgtgggaca gcaaaaagcg acgcaatgag gcactcgact 2280

gcttcgttta tgcgctggcg gcgctgcgca tcagtatttc ccgctggcag ctggatctca 2340

gtgcgctgct ggcgagcctg caggaagagg atggtgcagc aaccaacaag aaaacactgg 2400

cagattacgc ccgtgcctta tccggagagg atgaatgacg cgacaggaag aacttgccgc 2460

tgcccgtgcg gcactgcatg acctgatgac aggtaaacgg gtggcaacag tacagaaaga 2520

cggacgaagg gtggaattcg ttttcctgct gcccgggggt tcctcttgtt cttgtgcggc 2580

cgcctccgcg gtggtgctcc tgcttttgtt cccttttgtg tgggtttttt gcgcgcttgg 2640

cgttttcttg gtctttgctg tttcctgtgt gtttttgttt tccgctctct tttcctctct 2700

tctttcgtgc cggttgcttt ttgtgttttg cctggggtgc cttttgtgtg tgctttctct 2760

ctttttttgc gttgcgctct ctgcccgctt tcctgtcggg tttcctgtcg tgcctgctgc 2820

ttttttgttt cggccttcgc gcggggtgtg gcggtttgcg ttttgggcgc tcttccgctt 2880

cctcgctctc tgtctcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgtgcggtt tctgctctct 2940

ctttggcggt ttttcggttt tcctctgttt tcggggtttt cgctggtttg ttcttgtgtg 3000

cttttggcct gcttttggcc tggttccgtt ttttggccgc gttgctggcg tttttccttt 3060

ggctccgccc ccctgtcgtg cttctctttt ttcgtcgctc ttgtctgtgg tggcgtttcc 3120

cgtctggtct tttttgtttc ctggcgtttc cccctggttg ctccctcgtg cgctctcctg 3180

ttccgtccct gccgctttcc ggtttcctgt ccgcctttct cccttcgggt tgcgtggcgc 3240

tttctctttg ctctcgctgt tggtttctct gttcggtgtt ggtcgttcgc tccttgctgg 3300

gctgtgtgct cgttcccccc gttctgcccg tccgctgcgc cttttccggt ttctttcgtc 3360

ttgtgtcctt cccggtttgt ctcgtctttt cgcctctggc tgctgcctct ggtttctggt 3420

tttgctgtgc gtggtttgtt ggcggtgctt ctgtgttctt gttgtggtgg cctttcttcg 3480

gcttctcttg ttggtctgtt tttggtttct gcgctctgct gttgcctgtt tccttcggtt 3540

tttgtgttgg ttgctcttgt tccggctttc tttcctccgc tggttgcggt ggtttttttg 3600

tttgcttgct gctgttttcg cgctgttttt ttggttctct tgttgttcct ttgttctttt 3660

cttcggggtc tgtcgctctg tggttcgttt tctctcgttt tgggtttttg gtcttgtgtt 3720

tttctttttg gttcttctcc ttgttccttt tttttttttt ttgttggttt tcttctttct 3780

tttgtttttt tgtgttttct tggtctgtct gtttcctttg ctttttctgt gtggctcctt 3840

tctctgcgtt ctgtcttttt cgttcttcct ttgttgcctg tctccccgtc gtgttgtttt 3900

cttcgtttcg ggtgggcttt ccttctggcc cctgtgctgc tttgtttccg cgtgtccctc 3960

gctctccggc tcctgttttt tctgcttttt tcctgcctgc cggttgggcc gtgcgctgtt 4020

gtggtcctgc ttctttttcc gcctccttcc tgtctttttt ttgttgccgg gttgcttgtg 4080

tttgttgttc gcctgttttt tgtttgcgct tcgttgttgc ctttgcttct ggcttcgtgg 4140

tgtctcgctc gtcgtttggt ttggcttctt tctgctccgg ttcccttcgt tcttggcgtg 4200

tttcttgttc ccccttgttg tgcttttttg cggtttgctc cttcggtcct ccgttcgttg 4260

tctgttgttt gttggccgct gtgttttctc tcttggtttt ggctgctctg cttttttctc 4320

tttctgtctt gccttccgtt tgttgctttt ctgtgtctgg tgtgttctct tccttgtctt 4380

tctgtgtttt gtgtttgcgg cgtccgtgtt gctcttgccc ggcgtctttt cgggtttttt 4440

ccgcgcctct ttgctgttct ttttttgtgc tcttctttgg ttttcgttct tcggggcgtt 4500

ttctctcttg gttctttccg ctgttgtgtt cctgttcgtt gtttccctct cgtgctccct 4560

tctgttcttc tgcttctttt tctttctcct gcgtttctgg gtgtgctttt tctggttggc 4620

tttttgccgc ttttttgggt ttttgggcgt ctcggttttg ttgttttctc tttctcttcc 4680

tttttctttt tttttgttgc ttttttctgg gtttttgtct cttgtgcggt ttcttttttg 4740

tttgtttttt gttttttttt ctttttgggg ttccgcgctc ttttccccgt tttgtgcctc 4800

<210> 7

<211> 2961

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ctgacgcgcc ctgtagcggc gcattaagcg cggcgggtgt ggtggttacg cgcagcgtga 60

ccgctacact tgccagcgcc ctagcgcccg ctcctttcgc tttcttccct tcctttctcg 120

ccacgttcgc cggctttccc cgtcaagctc taaatcgggg gctcccttta gggttccgat 180

ttagtgcttt acggcacctc gaccccaaaa aacttgatta gggtgatggt tcacgtagtg 240

ggccatcgcc ctgatagacg gtttttcgcc ctttgacgtt ggagtccacg ttctttaata 300

gtggactctt gttccaaact ggaacaacac tcaaccctat ctcggtctat tcttttgatt 360

tataagggat tttgccgatt tcggcctatt ggttaaaaaa tgagctgatt taacaaaaat 420

ttaacgcgaa ttttaacaaa atattaacgc ttacaatttc cattcgccat tcaggctgcg 480

caactgttgg gaagggcgat cggtgcgggc ctcttcgcta ttacgccagc tggcgaaagg 540

gggatgtgct gcaaggcgat taagttgggt aacgccaggg ttttcccagt cacgacgttg 600

taaaacgacg gccagtgagc gcgcgtaata cgactcacta tagggcgaat tgggtaccgg 660

gccccccctc gaggtcgacg gtatcgataa gcttgatatc gaattcctgc agcccggggg 720

atccactagt tctagagcgg ccgccaccgc ggtggagctc cagcttttgt tccctttagt 780

gagggttaat tgcgcgcttg gcgtaatcat ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt 840

atccgctcac aattccacac aacatacgag ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg 900

cctaatgagt gagctaactc acattaattg cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg 960

gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc 1020

gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc 1080

ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata 1140

acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg 1200

cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct 1260

caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa 1320

gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc 1380

tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt 1440

aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg 1500

ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg 1560

cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct 1620

tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaaggacagt atttggtatc tgcgctctgc 1680

tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg 1740

ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc 1800

aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt 1860

aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa 1920

aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat 1980

gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct 2040

gactccccgt cgtgtagata actacgatac gggagggctt accatctggc cccagtgctg 2100

caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg ctccagattt atcagcaata aaccagccag 2160

ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg caactttatc cgcctccatc cagtctatta 2220

attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg 2280

ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg 2340

gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct 2400

ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta agttggccgc agtgttatca ctcatggtta 2460

tggcagcact gcataattct cttactgtca tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg 2520

gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc 2580

cggcgtcaat acgggataat accgcgccac atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg 2640

gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga 2700

tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg 2760

ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat 2820

gttgaatact catactcttc ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc 2880

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca 2940

catttccccg aaaagtgcca c 2961

Claims (7)

1.一种制备DNA Marker I分子量标准的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)9个不同长度的DNA片段分配至三个质粒中；

2)将分配后的三个质粒用限制性内切酶进行酶切，然后混合酶切片段后即得DNAMarker I分子量标准；其中所述9个不同长度的DNA片段分别为2400bp，2000bp，1600bp，1200bp，1000bp，800bp，600bp，400bp，200bpDNA片段；

所述分配后的三个质粒分别为质粒1基因工程质粒载体pBS-7.2kb，核苷酸如序列表中SEQ ID NO:4所示；质粒2为基因工程质粒载体pBS-8kb，核苷酸如序列表中SEQ ID NO:5所示；质粒3为基因工程质粒载体pBS-4.8kb，核苷酸如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述步骤1)中9个不同长度的DNA片段分配至三个质粒的拷贝数分别为：质粒1包含2400bp片段、拷贝数1，1200bp片段、拷贝数2，600bp片段、拷贝数4；质粒2包含2000bp片段、拷贝数1，1000bp片段、拷贝数4，200bp片段、拷贝数10；质粒3包含1600bp片段、拷贝数1，800bp片段、拷贝数2，400bp片段、拷贝数4；

所述步骤2)的限制性内切酶是EcoRI；

所述步骤2)中质粒1～质粒3的酶切产物的混合重量比例为1:1.2:1～1:2:1。

2.根据权利要求1所述制备DNA Marker I分子量标准的方法，其特征在于，所述步骤(2)中酶切后，使用乙醇沉淀纯化所述质粒酶切产物后，再将所述质粒的酶切产物混合。

3.根据权利要求1～2任一项所述的方法制备的DNA Marker I分子量标准。

4.根据权利要求3所述的DNA Marker I分子量标准在琼脂糖凝胶电泳中的应用。

5.一种基因工程质粒载体pBS-7.2k的构建，插入核苷酸序列如表中SEQ ID NO:1所示。

6.一种基因工程质粒载体pBS-8kb的构建，插入核苷酸序列如表中SEQ ID NO:2所示。

7.一种基因工程质粒载体pBS-4.8kb的构建，插入核苷酸序列如表中SEQ ID NO:3所示。