CN103667264A - 一种DNA Marker的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种DNA Marker的制备方法，其特征在于：在制备过程中采用DNA序列为SEQ ID NO.1和DNA序列为SEQ ID NO.2的两种质粒中的一种或两种。本发明DNA Marker制备方法稳定性高，可以保证批次之间重复性的生产，从而实现大规模生产；本方法生产过程简单，前期载体构建好后，后期Marker生产成本很低，生产量可大可小，存放非常方便。

Description

一种DNA Marker的制备方法

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程领域，涉及DNA Marker和质粒，尤其是一种DNA Marker的制备方法及两种质粒和质粒的构建方法。 

背景技术

基因工程(genetic engineering)又称基因拼接技术和DNA重组技术，是以分子遗传学为理论基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因按预先设计的蓝图，在体外分子水平上对DNA进行切割、连接、转化等一系列操作的过程，构建杂种DNA分子。基因工程是在分子生物学和分子遗传学的基础上综合发展起来，诞生于20世纪70年代的一门崭新的生物科学技术。尽管该技术是一门年轻的技术，但其在生命科学、生物医学等领域的研究和应用中起到了非常巨大的作用。基因工程技术为基因的结构和功能的研究提供了有力的手段。 

在DNA的体外操作中，涉及到DNA分子的扩增、纯化、切割、连接等许多过程，其中，最基础而且应用非常广泛的一项操作是DNA扩增和电泳。DNA扩增是指通过PCR(聚合酶链式反应)技术强大的扩增能力，在DNA聚合酶的作用下，根据特定的模板设计特定的引物扩增出不同大小的DNA片段。DNA电泳是指利用DNA在中性缓冲液中带负电的性质，在一定的电场作用下，在特定的支持介质中(比如琼脂糖凝胶)，不同大小的DNA片段由于带有的电荷量以及空间位阻等的不同而在支持介质中具有不同的泳动速度从而得以分离的过程。DNA扩增和电泳是基因工程中最基本的技术。 

在凝胶电泳中，在一定的范围内，具有相同构型的DNA在相同的凝胶浓度和电场强度下，其迁移率与DNA分子的大小(通常也就是DNA片段的长度)呈线性关系。因此，可以用一组分子量(长度)已知的DNA片段混合物来指示未知DNA分子的大小。这种由一组分子量已知的，电泳后按其分子量大小和迁移率的不同可以在凝胶上形成一个DNA片段分布梯度，从而可以指示电泳过程中未知DNA样品的分子量的DNA片段混合物就成为DNA分子量标准，简称DNA Marker。DNA Marker的应用非常广泛，是分子生物学实验室的常用试剂。尽管实现DNA Marker的原理非常简单，但要制作低成本高质量的DNA Marker还是有相当的难度。目前，许多生物公司也为此开发了多种针对不同应用的，具有不同分子量范围的DNA Marker产品。 

在DNA Marker的制备上，目前主要有两种方法：酶切法和PCR法。 

酶切法分为以天然来源的基因组DNA的限制性酶切和基于人工构建载体的限制性酶切。天然来源的基因组DNA酶切是指分离某种来源固定、背景信息清晰的基因组DNA分子，用 一种或几种限制性内切酶进行消化。从而产生一系列DNA片段组合。用该方法生产的最经典的DNA Marker是Lambda DNA/Hind III Marker，Lambda噬菌体基因组DNA经过内切酶Hind III消化后，产生125bp至23130bp大小的8条条带。用这种方法生产DNA Marker制作方便，在DNA来源方便的情况下，成本也比较低。但其缺点也是显而易见的：1、条带距离不均匀，由于来自天然的基因组，DNA分子上的酶切位点的位置也是天然的，是不可控的，因此DNA Marker中有的两个条带之间相距很远，不能清晰地指示该区域内的未知DNA分子量情况，有的两个条带之间距离很近，难以清晰地分开；2、基于同样的原因，条带的分子量未能是整数；3、条带亮度严重不均一，由于对应片段在基因组中的拷贝数不可控，分子量大的条带的亮度与分子量较小的条带的亮度相差很远，以Lambda DNA/Hind III Marker为例，最大的条带23130bp与最小的条带125bp在亮度上要相差上百倍，电泳过程中往往导致大条带为实现良好分离而小条带已经严重扩散导致亮度很低甚至不可见。 

PCR法是根据特定的模板设计特定的引物扩增出一系列不同大小的DNA片段，通过纯化、定量和组合即形成了DNA Marker。该方法的优点是操作简单、制作方便，各条带的大小控制方便，不同大小的条带可以灵活的组合成不同的DNA Marker。但其成本较高，长片段扩增困难或效率不高，条带不够锐利，条带之间的亮度难以完全一致，重复性差，稳定性不高，不易长时期保存，且保存环境在-20度，不能保存在室温条件下，不便于使用。 

为此，随着基因工程技术的发展，人们想到用人工构建的DNA分子(比如质粒)进行限制性酶切来制备DNA Marker。通过一次性将所需要的片段以设计好的酶切方式连接到载体中，通过发酵培养和质粒DNA提取，适当酶切后既可获得大量目标DNA片段。这种方法的优势在于可以通过大肠杆菌的培养获得大量廉价的质粒DNA，通过酶切方法获得的片段电泳时条带锐利，生产重复性高，稳定性高，可长期保存在室温状态，一旦质粒构建好，后续生产成本低。 

酶切的方法又分为部分酶切和完全酶切。部分酶切是将具有某种单位长度而且带有设计好的酶切位点的片段顺序连接到载体中，通过控制酶的活性，温度和反应时间等酶切条件，实现载体的部分酶切，酶切产物将是质粒上该单位长度的倍数的片段。该方法是用于以单位长度递增的DNA Marker(比如100bp DNA Ladder，条带为100bp，200bp，300bp等依次递增)的制备，其优点是制备方便，条带分布均匀，但其缺点是部分酶切的程度难以掌握，条带亮度与酶切的完全程度相关。 

完全酶切是将设计好的一组不同大小的DNA片段克隆到特定的载体中，经过大肠杆菌扩增后，将纯化得到的质粒DNA通过完全酶切，获得相应大小的DNA片段。该方法制备的DNA Marker质量较好。 

综上所述，在目前DNA Marker的生产过程中，主要采用的PCR扩增的方式，虽然该方 法简单，但是一种劳动密集型的，难以保证批次之间重复性的生产，从而难以实现大规模生产，总体成本较高的方法。酶切法中的人工构建DNA分子的酶切是将来技术发展的主流。 

通过检索，发现与本发明专利申请相关的如下专利公开文献： 

1、一种用于DNA Marker制备的质粒及其构建方法与用途(CN102337284A)，本发明所述质粒含有组成目标DNA？Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA？Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA？Marker片段之间含有同样的单酶切位点。本发明还提供了低成本快速制备DNA分子量标准的方法，用该方法生产的DNA？Marker具有条带锐利，亮度均一或可随意控制，批次间重复性好等特点。 

2、AMF群落多样性巢式PCR-DGGE检测中DNA Marker的制备方法(CN102146370A)，其技术方案是提取土壤DNA，DGGE分析，克隆转化，验证条带在DGGE胶片上的位置，制作AMF群落多样性巢式PCR-DGGE？Marker，使用NS31-GC和GloI为引物进行PCR扩增，结合序列分析结果并命名使用。本发明在AMF群落结构的Nested？PCR-DGGE研究中有重要的应用价值。可缩短实验时间，尤其适用实验样品量大的实验过程。依照本发明可以开发出一系列研究AMF群落的DNA？Marker，使得巢式PCR-DGGE技术在AMF分子群落研究中更加适用、快捷、准确。 

通过对比，本发明专利申请与上述的专利公开文献存在本质的不同。 

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种可用于生产成本低、质量高的DNA Marker的制备方法及两种质粒和质粒的构建方法，该DNA Marker制备方法稳定性高，可以保证批次之间重复性的生产，从而实现大规模生产；使用该方法可以根据自身需要制备具有不同条带的Marker，针对性强，灵活度高，对于条带大小可控；使用该方法可以大大降低生产成本，克服使用PCR法时的长片段扩增效率不高的困难，且重复性高，稳定性高，可室温保存，便于使用；使用该方法可以克服部分酶切难以掌握程度的困难；使用该方法所获得的DNA Marker产物使用时具有条带均一、锐利、条带间亮度均一性极佳的特点，可以广泛应用于DNA电泳过程中的分子量指示。 

本发明实现目的的技术方案是： 

采用PCR技术扩增出所要Marker各片段条带，并在各条带两端加上不同的酶切位点(同时在各片段的5’端均带有Xmn I(或BamH I)酶切位点)，通过酶切方式将各片段进行连接，然后用首片段5’端引物和尾片段3’端引物以连接产物为模板进行PCR反应，以此类推，最终将所有Marker片段连接成为一条大片段，将其连接进入载体后，获得我们所需要的重组质粒。以Xmn I(或BamH I)对重组质粒进行酶切，最终得到所需要的DNA分子Marker。 

本发明的优点和有益效果为： 

1、本发明DNA Marker制备方法方法稳定性高，可以保证批次之间重复性的生产，从而实现大规模生产；本方法生产过程简单，前期载体构建好后，后期Marker生产成本很低，生产量可大可小，存放非常方便。 

2、本发明DNA Marker制备方法根据现有的DL2000设计出所需要的DNA Marker的片段并加以改动，另外又在其基础上加上了一条3000bp的条带，使得此DNA Marker更具有实用价值。 

3、本发明DNA Marker制备方法所获得的DNA Marker产物使用时具有条带均一、锐利、条带间亮度均一性极佳的特点，可以广泛应用于DNA电泳过程中的分子量指示，而且可长期存放于室温条件下，便于使用。 

4、本发明通过在载体构建过程中合理搭配不同大小的DNA片段及其拷贝数，使得质粒DNA通过完全酶切后，一次性得到DNA Marker中各条带，且各条带之间的亮度基本一致，从而实现DNA Marker在凝胶上的均一性。 

附图说明

图1是本发明pCN1850酶切后DNA Marker组成片段大小与拷贝数的关系示意图； 

图2是本发明pCN1050酶切后DNA Marker组成片段大小与拷贝数的关系示意图； 

图3是本发明pCN1850与pCN1050酶切后DNA Marker组成片段大小与拷贝数总和的关系示意图； 

图4是本发明用于制备DNA Marker的质粒DNA及其中的片段大小与拷贝数关系示意图；其中，a表示质粒pCN1850；b表示质粒pCN1050； 

图5是本发明pCN1850外加各片段之间相连的示意图； 

图6是本发明pCN1050外加各片段之间相连的示意图； 

图7是本发明实施例中所述DNA Marker琼脂糖凝胶电泳效果图。 

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。 

本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为常规方法；本发明中所使用的试剂，如无特殊说明，均为常规试剂。 

下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验指南中所述的条件，或按照制造商所建议的条件。 

本发明根据准备生产的DNA Marker的条带组成一个大片段，与特定载体相连后，使得两种重组质粒可以分别用单一的酶释放组成DNA Marker中的各片段，对载体中各片段的拷贝 数设计使得酶切后得到的各条带的量基本一致。然后，将构建好的质粒扩增后，用完全酶切的方法制备DNA Marker。 

本发明提供了两个DNA Marker制备的质粒，所述质粒符合下列要求： 

含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段(为DNA片段)，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上(包括一个)，且同一质粒上各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点。 

目标DNA Marker的片段大小可以根据需求设计。 

所述单酶切位点可以是II型限制性内切酶酶切位点。所述的酶切位点应该是任意片段内不存在多余的识别位点而且不与载体构建过程中的酶相冲突的II型限制性内切酶酶切位点，且应该选择酶切效果好的酶切位点。且这些单酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部。由于单一的酶释放即能得到组成目标DNA Marker的各片段，因此，质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的碱基数均与目标DNA Marker中某一DNA片段的碱基数相等。满足上述设计要求的质粒能用单一的酶释放得到组成目标DNA Marker的各片段。 

根据现有的DL2000设计出所需要的DNA Marker的片段并加以改动，另外又在其基础上加上了一条3000bp的条带，使得此DNA Marker更具有实用价值。为了构建出这样的质粒，我们在原有的受体质粒上连接上含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA Marker片段，先在体外将设计好的各DNA Marker片段连接成为一条单独的长链DNA片段，再将其与载体相连，随后进行转化。得到所需要的重组质粒。 

本发明进一步公开了符合上述设计要求的用于DNA Marker制备的质粒的制备方法。 

本发明是在体外先进行连接反应，将设计好的带有单酶切位点的DNA Marker的片段进行连接，随后进行PCR反应，得到一整条片段连接到受体载体中。 

该质粒的制备方法具体包括如下的步骤： 

(1)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求：含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上(包括一个)。 

(2)各DNA Marker片段上含有同样的单酶切位点，在各片段的两端含有不同于各片段上的单酶切位点，各片段5’端带有的酶切位点与前一片段3’端带有的酶切位点一样，且各片段两端的酶切位点在各片段上不能够出现。 

(3)将这些DNA Marker片段先进行PCR反应，得到单一的目的条带，回收后进行酶切反应，将这些片段依次进行连接，随后进行PCR反应，最终得到一条1838bp的片段，且在各 片段中都含有单一的酶切位点Xmn I。 

(4)选择高拷贝数质粒作为骨架载体，且该骨架载体上带有唯一的一个Xmn I酶切位点，随后将1838bp片段连接进入骨架载体，构建得到一个含有6个Xmn I酶切位点的重组质粒。 

从图4可以看出，a质粒共有6个条带，受体质粒本身是一个大小为3000bp的质粒，从受体质粒上找到了一个Xmn I单酶切位点，DNA Marker片段中设计时也采用了Xmn I单酶切位点，最终用Xmn I单酶切消化。 

从图4可以看出，b质粒共有6个条带，受体质粒本身是一个大小为3000bp的质粒，DNA Marker片段中设计时采用了BamH I单酶切位点，受体质粒不含有BamH I酶切位点，最终用BamH I单酶切消化。 

b质粒的制备与第一个质粒的制备相似，只有片段种类和单酶切位点不同，且b质粒的单酶切位点不能够存在于骨架载体上。b质粒的制备在PCR反应后最终得到一条1072bp的片段，在各片段中含有的单一酶切位点是BamH I，将这条片段与骨架载体连接后，构建得到一个含有6个BamH I酶切位点的重组质粒。 

步骤(1)中目标质粒的设计还可进一步满足之前所述的各种要求。 

步骤(2)中，各DNA Marker片段两端所含的酶切位点不同于所述单酶切位点，且同一片段的两端酶切位点也不可相同。即每一片段上含有三个不同的单酶切位点，而后一个片段的5’端的酶切位点与前一片段3’端带有的酶切位点相同，且每一片段中间都带有所述单酶切位点，该单酶切位点在每一个片段上都与5’端酶切位点相邻。各片段中间不能带有外加的各酶切位点。 

步骤(3)中，各片段通过PCR及回收后，进行酶切反应，将前一片段的3’端和后一片段的5’端分别进行酶切，回收后进行连接反应，随后用前一片段的上游引物和后一片段的下游引物以连接产物为模板进行PCR，同理，将所有片段连接为一条长为1838bp的片段。 

步骤(4)中，所述高拷贝数质粒是指可以存在于细菌体内的，其复制与细菌基因组DNA的复制不关联的，在单个细菌体内可以达到300个拷贝数以上的质粒。 

本发明专利申请还提供了一种DNA Marker的制备方法，包括下列步骤： 

(1)构建前述用于制备DNA Marker的质粒或者直接采用构建好的用于制备DNA Marker的质粒； 

(2)将步骤(1)所述质粒转入合适的宿主菌后扩增质粒； 

(3)分离质粒并采用所述单酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切质粒获得DNA Marker。 

所述的宿主菌可以是大肠杆菌。 

所述完全酶切法制备DNA Marker是指用一个或多个限制性内切酶对质粒DNA过量消化，使得质粒上的每一个该酶的识别位点均被切开，释放相应大小的片段。 

当采用实施例例举的序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2的质粒制备DNA Marker时，可将其转入大肠杆菌复制，并分别采用Xmn I和BamH I对两种质粒进行完全酶切获得DNA Marker。 

如无特殊说明，以下实施例中的Restriction Enzyme表示限制性内切酶，BSA表示牛血清白蛋白。 

实施例1 

一、构建第一种高效稳定重组质粒 

本实施例讲述一种用于制备DNA Marker的质粒的构建，该质粒包含了D3000 Marker中所含有的6个条带，分别为2000bp，1100bp，750bp，500bp，250bp×2。 

如未特别注明，本实施例中所用的生化试剂以及PCR或核酸提取与纯化试剂盒等均来自沙船(天津)生物科技发展有限公司；所有引物合成均由北京博迈德科技发展有限公司合成；所有限制性内切酶均采用普洛麦格(北京)生物技术有限公司。 

如未特别注明，本实施例中所用的各DNA片段PCR反应体系为： 

反应程序为：1、94℃ for 5min                    预变性 

            2、94℃ for 30s                     变性 

            3、55℃ for 30s                     退火 

            4、72℃ for 30s                     延伸 

(100bp、250bp和500bp延伸时间为30s，750bp延伸时间为1min) 

            5、repeat step2 to step4 30cycles   循环 

            6、72℃ for 10min 

            7、4℃保存 

如未特别注明，本实施例中连接后的DNA片段PCR反应体系为： 

反应程序为：1、94℃ for 5min                        预变性 

            2、94℃ for 30s                         变性 

            3、50℃/57℃/62℃ for 30s               退火 

            4、72℃ for 30s                         延伸 

(不大于500bp的条带延伸时间为30s，不大于1000bp的条带延伸时间为1min，大于1000bp延伸时间为2min) 

            5、repeat step2 to step4 30cycles        循环 

            6、72℃ for 10min 

            7、4℃保存 

如未特别注明，本实施例中所用PCR产物或酶切产物均用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，用DuRed核酸染料染色后于紫外线下观察。用PCR产物回收试剂盒或琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，DNA定量均用尤尼柯公司的紫外风光光度计测定。 

如未特别注明，本实施例中所用的限制性内切酶酶切反应体系为： 

反应条件为：37℃ for 2hours。 

如未特别注明，本实施例中所用的DNA连接反应体系为： 

反应条件为：22℃ for 3hours。 

如未特别注明，本实施例中所用的转化菌株为大肠杆菌DH5α。 

1、载体分子的设计 

根据本发明的方法，本实施例中选择克隆载体pGEM-T为受体载体，带有氨苄青霉素抗性基因；选用Xmn I作为完全酶切法制备DNA Marker的酶；88bp片段5’端不具有酶切位点，以Hind III作为88bp片段3’端酶切位点；选择Hind III和Stu I分别作为250bp片段5’和3’酶切位点；选择Stu I和Nhe I分别作为250bp片段5’和3’酶切位点；选择Nhe I和Stu I为500bp片段5’和3’酶切位点；选择Stu I和Xmn I分别作为750bp片段5’和3’酶切位点。除100bp以外，每个片段5’端酶切位点后均带有Xmn I，两个酶切位点之间相隔0bp。 

2、各目标DNA前体片段的获得 

(1)88bp前体片段 

合成引物88-1(5’-atctataattggcattgtatgtatt-3’)和88-2(5’-ccaagctttcatttggatatcagagctatg-3’)，以λDNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得88bp片段。用Hind III进行单酶切反应，回收备用。该片段序列如SEQ ID NO.3所示。 

(2)250bp前体片段 

合成引物250A-1(5’-ccaagcttgaagcgtttcaagtactaataagcc-3’)，250A-2(5’-gaaggcctaaagctttgtgtgccacccactacg-3’)，250B-1(5’-gaaggcctgaaaattttcctctgtcattacgtc-3’)，250B-2(5’-cggctagccactgtgtattcattccaacgagtg-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得两条250bp片段。250bp-A片段用Hind III进行单酶切，250bp-B片段用Stu I进行单酶切。回收备用。该片段序列如SEQ ID NO.4和SEQ IN NO.5所示。 

(3)500bp前体片段 

合成引物500A-1(5’-cggctagcgaaacatttcttcaggcttaaccat-3’)，500A-2(5’-gaaggcctgagcaaagacgaaaacatgccacac-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得两500bp片段。用Stu I进行单酶切。回收备用。该片段序列如SEQ ID NO.6所示。 

(4)750bp前体片段 

合成引物750-1(5’-gaaggcctgaatgttttcacttaatagtat-3’)，750-2 

(5’-aggaatgttttcgggcaacctcatgtcaac-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得750bp片段。用Stu I进行单酶切。回收备用。该片段序列如SEQ ID NO.7所示。 

3、前体片段的拼装 

将用Hind III酶切好的88bp片段和250bp-A片段进行连接，随后以连接产物为模板，用88bp的上游引物和250bp-A的下游引物进行PCR，得到一条338bp的片段，回收备用。然后用Stu I进行单酶切反应。将酶切好的338bp与250bp-B进行连接，以连接产物为模板，用88bp上游引物和250bp-B下游引物进行PCR，得到一条588bp的片段，回收后用Nhe I对其进行单酶切反应，回收备用。然后将酶切好的500bp与750bp进行连接，以连接产物为模板，用500bp上游引物和750bp下游引物进行PCR，得到一条1250bp的片段，回收备用。然后用Nhe I对1250bp进行单酶切反应，回收后与酶切好的588bp片段进行连接，以连接产物为模板，用88bp上游引物和750bp下游引物进行PCR，得到一条1838bp的片段，回收备用。 

4、终载体的组装 

将步骤3中得到的1838bp片段与pGEM-T载体进行连接，转化后挑取阳性克隆。提取质粒得到重组质粒。终质粒命名为pCN1850。该质粒的完整序列如SEQ ID NO.1所示。 

实施例2 

一、构建第二种高效稳定重组质粒 

本实施例讲述一种用于制备DNA Marker的质粒的构建，该质粒包含了D3000 Marker中所含有的6个条带，分别为3000bp，500bp，250bp，100bp×3。 

如未特别注明，本实施例中所用的生化试剂以及PCR或核酸提取与纯化试剂盒等均来自沙船(天津)生物科技发展有限公司；所有引物合成均由北京博迈德科技发展有限公司合成；所有限制性内切酶均采用普洛麦格(北京)生物技术有限公司。 

如未特别注明，本实施例中所用的各DNA片段PCR反应体系为： 

反应程序为：1、94℃ for 5min        预变性 

2、94℃ for 30s                      变性 

3、55℃ for 30s                      退火 

4、72℃ for 30s                      延伸 

(100bp、250bp和500bp延伸时间为30s) 

5、repeat step2 to step4 30cycles    循环 

6、72℃ for 10min 

7、4℃保存 

如未特别注明，本实施例中连接后的DNA片段PCR反应体系为： 

反应程序为：1、94℃ for 5min                     预变性 

            2、94℃ for 30s                      变性 

            3、50℃/57℃/62℃ for 30s            退火 

            4、72℃ for 30s                      延伸 

(不大于500bp的条带延伸时间为30s，不大于1000bp的条带延伸时间为1min，大于1000bp延伸时间为2min) 

            5、repeat step2 to step4 30cycles    循环 

            6、72℃for10min 

            7、4℃保存 

如未特别注明，本实施例中所用PCR产物或酶切产物均用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，用DuRed核酸染料染色后于紫外线下观察。用PCR产物回收试剂盒或琼脂糖凝胶回收试剂盒进行回收，DNA定量均用尤尼柯公司紫外风光光度计测定。 

如未特别注明，本实施例中所用的限制性内切酶酶切反应体系为： 

反应条件为：37℃ for 2hours。 

如未特别注明，本实施例中所用的DNA连接反应体系为： 

反应条件为：22℃ for 3hours。 

如未特别注明，本实施例中所用的转化菌株为大肠杆菌DH5α。 

1、载体分子的设计 

根据本发明的方法，本实施例中选择克隆载体pGEM-T为受体载体，带有氨苄青霉素抗性基因；选用BamH I作为完全酶切法制备DNA Marker的酶；选择EcoR I作为200bp片段5’端酶切位点，以Hind III作为200bp片段3’端酶切位点，200bp片段中带有两个BamH I酶切位点，其中一个位于100bp处，另一个位于200bp片段5’端，与EcoR I相隔0个碱基；选择Hind III和Kpn I分别作为350bp片段5’和3’酶切位点，350bp片段中带有2个BamH I酶切位点，其中一个位于100bp处，另一个位于350bp片段5’端，与Hind III相隔0个碱基；选择Kpn I和BamH I分别作为500bp片段5’和3’酶切位点，该片段带有1个BamH I酶切位点，位于片段的5’端，与Kpn I相隔0个碱基。 

2、各目标DNA前体片段的获得 

(1)100bp前体片段 

合成引物200-1(5’-cgggatccctttatgactctgccgccgtca-3’)和200-2(5’-ccaagcttctgaaagggcagtgtttcccag-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得1个200bp片段。200bp片段中带有两个BamH I酶切位点，其中一个位于100bp处，另一个位于5’端，与EcoR I相隔0个碱基。200bp片段用Hind III进行单酶切反应，回收备用。该片段序列如SEQ ID NO.8所示。 

(2)100bp和250bp前体片段 

合成引物350-1(5’-ccaagcttggatccctaccgtgaaaagtcg-3’)和350-2(5’-ggggtacctggtaaacgtgcgttttcgctc-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得1个350bp片段。350bp片段中带有两个BamH I酶切位点，其中一个位于100bp处，另一个位于片段5’端，与HindIII相隔0个碱基。350bp用Hind III进行单酶切反应，回收备用。该片段序列如SEQ ID NO.9所示。 

(3)500bp前体片段 

合成引物500B-1(5’-ggggtaccggatccgcagctttcccggaat-3’)，500B-2(5’-cgggatccgagattacgcagctctgctgtc-3’)，以Lambda噬菌体DNA为模板，用taq DNA polymerase进行扩增，获得500bp片段。用Kpn I进行单酶切。回收备用。该片段序列如SEQ ID NO.10所示。 

3、前体片段的拼装 

将用Hind III酶切好的200bp片段和用Hind III酶切好的350bp片段进行连接，随后以连接产物为模板，用200bp的上游引物和350bp的下游引物进行PCR，得到一条550bp的片段，回收备用。然后用Kpn I进行单酶切反应。将酶切好的550bp与用Kpn I酶切好的500bpB进行连接，以连接产物为模板，用200bp上游引物和500bpB下游引物进行PCR，得到一条1072bp的片段，回收备用。 

4、终载体的组装 

将步骤3中得到的1072bp片段与pGEM-T载体进行连接，转化后挑取阳性克隆。提取质粒得到重组质粒。终质粒命名为pCN1050。该质粒的完整序列如SEQ ID NO.2所示。 

实施例3 

DNA Marker的制备 

分别将pCN1850质粒和pCN1050质粒以常规方法转化大肠杆菌，将带有pCN1850质粒和pCN1050的两种大肠杆菌菌株进行大量繁殖，用裂解法结合柱式DNA纯化法抽提质粒。用Xmn I对pCN1850质粒进行单酶切，反应体系如下： 

反应条件为：37℃ for 5hours。 

用BamH I对pCN1050质粒进行单酶切，反应体系如下： 

反应条件为：30℃ for 5hours。 

反应结束后，按照1μl10×DNA Loading Buffer：9μl酶切产物的比例加入10×DNA Loading Buffer，终止两种酶切反应，使它们混合后不会产生相互作用。按照pCN1850与pCN1050比为2Abs∶1Abs的比例配制成DNA Marker。所制备的Marker即可用于琼脂糖凝胶电泳。 

结果如图7所示，三个泳道上样量为3μl、5μl和8μl，可以看到该DNA Marker条带分布均匀，亮度均一，符合本发明的设计要求。 

Claims (10)

1.一种DNA Marker的制备方法，其特征在于：在制备过程中采用DNA序列为SEQ IDNO.1和DNA序列为SEQ ID NO.2的两种质粒中的一种和两种。

2.根据权利要求1所述的DNA Marker的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)在制备过程中采用DNA序列为SEQ ID NO.1和DNA序列为SEQ ID NO.2的两种质粒；

(2)将步骤(1)所述两种质粒转入宿主菌后扩增质粒；

(3)分离质粒并采用单酶切位点对应的限制性内切酶完全酶切获得DNA Marker所需片段，并将两种质粒完全酶切的产物按照2∶1的浓度比例混合，即获得DNA Marker。

3.根据权利要求2所述的DNA Marker的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中宿主菌为大肠杆菌。

4.根据权利要求2所述的DNA Marker的制备方法，其特征在于：所述步骤(3)中限制性内切酶为：DNA序列为SEQ ID NO.1的质粒的限制性内切酶为Xmn I，DNA序列为SEQ IDNO.2的质粒的限制性内切酶BamH I。

5.一种用于DNA Marker制备的质粒，其特征在于：所述质粒的DNA序列为SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

6.一种如权利要求5所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)根据目标DNA Marker的片段组成设计目标质粒，设计的目标质粒满足下列要求：含有组成目标DNA Marker的各大小不同的DNA片段，各大小不同的DNA Marker片段在所述质粒中的拷贝数为一个以上，且各DNA Marker片段之间含有同样的单酶切位点；

(2)制备组成DNA Marker的各个条带的DNA Marker前体片段，在每个DNA Marker片段两端加上一个不同于单酶切位点的酶切位点，且同一片段的两端酶切位点不可相同，后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同；

(3)将DNA Marker片段依次进行连接后采用第一片段的上游引物和最后一个片段的下游引物进行PCR，从而得到所需要的大片段，在大片段中含有所述单酶切位点个数为最终得到片段的个数；

(4)在第一个质粒构建中单酶切位点在骨架载体中存在一个，第二个质粒构建中单酶切位点不存在于骨架载体中；

(5)选择高拷贝数质粒作为骨架载体，将体外连接好的片段与骨架载体进行连接，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

7.根据权利要求6所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)具体步骤为：

分别以步骤(2)获得的各DNA Marker前体片段为起点，反复利用PCR的方式获得含有各DNA Marker前体片段的片段，直至各DNA Marker前体片段连成一条大片段，然后将此片段连接入步骤(5)的骨架载体中，形成可以用于DNA Marker制备的质粒。

8.根据权利要求6所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：所述各片段两端酶切位点及单酶切位点选自II型限制性内切酶酶切位点。

9.根据权利要求8所述的用于DNA Marker制备的质粒的构建方法，其特征在于：所述单酶切位点选自Xmn I、BamH I、Hind III或EcoR I。

10.根据权利要求6-9任一项权利要求所述的用于DNAMarker制备的质粒的构建方法，其特征在于：步骤(1)设计的目标质粒中，所述单酶切位点仅存在于各DNA Marker片段之间，不存在于各DNA Marker片段内部，且质粒中每两个相邻的所述单酶切位点之间的距离均对应等于目标DNA Marker中某一DNA片段的大小；

各DNA Marker片段5’端和3’端带有不同于所述单酶切位点的酶切位点，同一片段的两端的酶切位点不相同，且后一片段的5’端酶切位点与前一片段的3’端酶切位点相同。

Images