CN111549099A - 一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法，所述方法包括以下步骤：(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增；所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和poly dT。本发明在逆转录引物中添加条形码序列对单细胞全长RNA进行逆转录，实现了对不同单细胞来源的序列进行标记，对不同来源的DNA扩增产物混合达到了第三代测序平台对模板量的要求，利用第三代测序平台实现了对全长转录本的精确测序。

Description

一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法

技术领域

本发明属于单细胞测序技术领域，涉及一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法。

背景技术

第二代测序技术(Next-generation sequencing，NGS)的出现将分子生物学研究推向了一个高通量发展的时代，利用NGS产生了大量转录组数据，广泛应用于基础生物学研究和医疗健康领域。传统的测序方法需要大量的起始细胞以获得足够的测序模板，得到的数据也是所有细胞混合的结果，特别是在RNA测序中，细胞间的差异淹没在了平均值中。

单细胞RNA测序技术(scRNA-seq)应运而生，近十年来，基于NGS平台的单细胞转录组测序取得了长足的进步，克服了研究稀有生物材料的挑战，同时揭示了生物样品的异质性，促进了系统发育和癌症异质性等研究领域的发展。Drop-seq(Macosko EZ,etal.Highly Parallel Genome-wide Expression Profiling of Individual Cells UsingNanoliter Droplets.Cell.2015；161(5):1202-1214；Bageritz J,et al.Single-CellRNA Sequencing with Drop-Seq.Methods Mol Biol.2019；1979:73–85；Zheng GX,etal.Massively Parallel Digital Transcriptional Profiling of Single Cells.NatCommun.2017；8:14049.)和Microwell-seq(Codina-Fauteux VA,et al.PHACTR1 SplicingIsoforms and Eqtls in Atherosclerosis-Relevant Human Cells.BMC MedGenet.2018；19(1):97.)等高度并行的scRNA-seq方法使分析人类细胞图谱(HCA)成为可能。然而由于NGS测序平台的技术原因，读长基本不超过500个碱基，对于平均长度为1000个碱基的信使RNA，需要进行测序数据拼接才能推断得到完整的转录本信息，难以获得不同可变剪切的转录本信息。

第三代测序平台(TGS)克服了NGS测序平台读长短的缺点，已经应用于细胞提取总RNA分子的直接测序。然而，TGS测序策略需要大量的原始材料来构建文库，而这些材料无法从单个细胞中直接获得。

发明内容

针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法，所述方法在逆转录阶段对获得的单细胞全长转录本进行条形码标记，并利用第三代测序平台进行测序，可以实现高精度检测单细胞全长转录本的技术效果。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种单细胞转录组的处理方法，所述方法包括以下步骤：

(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；

(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；

或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增。

优选地，所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和polydT。

本发明中，在逆转录引物中添加条形码序列，对不同单细胞来源的RNA进行标记，得到带有条形码的cDNA，将不同来源的产物混合后可以通过条形码序列追溯最初的单细胞来源，利用第三代测序平台实现了对单细胞全长转录本的精确测序，解决了第三代测序平台对原始样本需求量大的技术问题。

根据本发明，所述逆转录引物由三个部分组成：5’端的锚定序列用于向cDNA添加相同的末端序列，有利于后续利用相同的锚定引物进行不同cDNA序列的PCR扩增；中间的与第三代测序平台兼容的条形码序列，为不同来源的单细胞转录本添加不同的标签以进行数据区分；3’端的多个胸腺嘧啶(T)，可以有效结合到mRNA的poly(A)尾上，对转录本进行逆转录。

优选地，所述条形码序列与第三代测序系统兼容，所述第三代测序系统例如可以是单分子即时DNA测序、Heliscope单分子测序、基于荧光共振能量转移的即时DNA测序、纳米孔单分子测序或离子流半导体测序中的任意一种，优选为纳米孔单分子测序。

优选地，所述条形码序列与纳米孔单分子测序系统兼容。

由于第三代测序技术的单碱基准确度略低，本发明设计了较长的条形码序列，所述条形码序列不包含连续三个及以上的相同碱基，并且回避第三代测序偏好的错误模式，不同条形码序列的差异足够大(至少具有10个碱基的错配)；另外，采用第三代测序技术对PCR扩增后的转录本进行测序，相当于对相同单细胞来源的转录本进行多次测序，以条形码序列为标签进行数据分析并纠错，弥补了第三代测序技术单碱基准确度略低的问题(第三代测序的测序错误是随机的，不像第二代测序具有测序偏向性，可以通过多次检测的数据进行有效纠错)，显著提高了测序准确性。

优选地，所述条形码序列的长度为20～40nt，例如可以是20nt、25nt、30nt、35nt或40nt，优选为25nt。

在一种实施方式中，所述方法在将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合之前，还包括对PCR扩增产物进行纯化的步骤。

本发明中，在混合前通过对PCR扩增产物进行纯化，去除了片段较短的产物，提高了全长转录本的比例，利用第三代测序系统进行测序得到全长转录本的序列信息。

优选地，所述纯化采用磁珠进行。

优选地，所述磁珠与所述PCR扩增产物的体积比为(0.3～0.6):1，例如可以是0.3:1、0.4:1、0.5:1或0.6:1，优选为(0.4～0.5):1。

优选地，所述纯化的次数为2～3次。

根据本发明，使用不同比例的磁珠进行纯化可以实现对不同片段范围的扩增产物的筛选，本发明为筛选得到全长的扩增片段，采用的SPRI磁珠比例为样本的0.3～0.6倍体积，纯化的次数为2～3次。

在另一种实施方式中，所述方法在将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合之前，还包括对逆转录体系进行核酸外切酶消化的步骤。

本发明中，在将不同来源的cDNA混合前，为去除逆转录体系中过量的逆转录引物，采用核酸外切酶在35～40℃条件下消化5～15min，避免了过量的逆转录引物中的条形码序列对结果造成的干扰。

第二方面，本发明提供了一种单细胞转录组测序方法，所述方法采用第一方面所述的方法处理单细胞转录组，并对产物进行第三代测序。

优选地，所述第三代测序包括单分子即时DNA测序(SMRT)、Heliscope单分子测序、基于荧光共振能量转移的即时DNA测序、纳米孔单分子测序或离子流半导体测序中的任意一种，优选为纳米孔单分子测序。

本发明中，利用逆转录引物中的条形码序列标记不同单细胞来源的cDNA，进行PCR扩增后将不同来源的PCR扩增产物混合，或将不同来源的cDNA直接混合后进行PCR扩增，满足了第三代测序系统对cDNA起始量的要求，实现了高精度检测单细胞的全长转录本的效果，最后利用条形码序列有效分离不同单细胞的测序信息；同时，采用第三代测序技术对PCR扩增后的转录本进行测序，相当于对相同单细胞来源的一个转录本进行多次测序，以条形码序列为标签进行数据分析并纠错，弥补了第三代测序技术单碱基准确度略低的问题，显著提高了测序准确性。

第三方面，本发明提供了一种单细胞转录组测序试剂盒，所述试剂盒包括逆转录引物；

所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和poly dT；

所述条形码序列与第三代测序系统兼容。

优选地，所述试剂盒还包括模板转换引物、逆转录酶、dNTPs、甜菜碱或Mg²⁺中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，所述模板转换引物从5’端到3’端依次为锚定序列和rGrG+G，所述锚定序列的核酸序列与逆转录引物中的锚定序列相同，有利于在逆转录产物的5’端和3’端添加相同的末端锚定序列，这样在进行PCR扩增时仅需要一种引物；所述rG为核糖鸟苷，+G为锁核酸修饰鸟苷，用于增加核酸双链的稳定性并提高杂交的特异性，促进模板转换引物进行模板转换。

根据本发明，RNA自身形成的发夹结构等二级结构可能对逆转录酶形成空间位阻，为克服上述空间位阻，本发明在逆转录体系中添加甜菜碱，提高了逆转录酶的热稳定性和逆转录效率。

优选地，所述试剂盒还包括锚定引物和/或PCR试剂。

根据本发明，所述锚定引物的序列与逆转录引物中的锚定序列相同。

优选地，所述PCR试剂包括DNA聚合酶、dNTPs或Mg²⁺中的任意一种或至少两种的组合。

根据本发明，所述DNA聚合酶为长片段高保真DNA聚合酶，例如可以是KAPA HiFi热启动DNA聚合酶。

第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的方法在单细胞转录组测序中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明利用逆转录引物中的条形码序列，对不同单细胞来源的RNA进行标记，将不同来源的产物混合后达到了第三代测序平台对样本起始量的要求，利用第三代测序平台实现了对单细胞全长转录本的精确测序，获得不同可变剪切的转录本信息，而样本的最初单细胞来源可以通过条形码序列进行确定；

(2)本发明的方法可以获得单细胞中全长cDNA的准确数量，包括多种新的转录本类型，而第二代测序方法由于需要对获得的转录本信息进行组装拼接，无法识别来自不同转录本的组合产物，而本发明的方法可以直接读出完整的转录本序列，不同的转录本可以被准确检测出来；

(3)本发明在单细胞水平获得了不同转录本的链特异信息，对同一基因的不同转录本可以直接进行区分，获得的测序结果敏感性高、重复性强、准确性好，

(4)本发明的试剂盒和测序方法结合了单细胞全长cDNA扩增和第三代测序的优点，在单细胞转录组分析中显示出独特的优势。

附图说明

图1为基于纳米孔单细胞测序的单细胞转录组测序流程图；

图2为对扩增产物的筛选条件进行优化前和优化后的结果图；

图3为本发明的测序方法(SCAN-seq)与二代测序(NGS-Bulk)获得的基因数量比较；

图4为不同单细胞来源的全转录组的表达水平相关系数。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

试剂和材料：

逆转录引物：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-barcode(25bp)-T25，包括完整的23个碱基长度的锚定序列，25个碱基长度的纳米孔平台兼容的条形码序列，和25个碱基长度的多聚胸腺嘧啶脱氧核糖核酸序列(poly dT)；

模板转换引物：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTACATrGrG+G，包括完整的23个碱基长度的锚定序列，末端携带有两个核糖鸟苷和一个锁核酸修饰鸟苷，rG(riboguanosines)为核糖鸟苷，+G(the LNA-modified guanosine)为锁核酸修饰鸟苷；

锚定引物：AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT(SEQ ID NO:1)，包括23个碱基长度的锚定序列；

RNA酶抑制剂(Takara，Cat.2313B)，Triton X-100(Sigma-Aldrich，Cat.X100)，2.5μM dNTP混合液(Thermo，Cat.R0193)，SuperScript II逆转录酶(Invitrogen，Cat.18064071)，甜菜碱(Sigma-Aldrich，Cat.B0300)，MgCl₂(Sigma-Aldrich，Cat.63020)，2×KAPA HiFi Hot-Start Ready Mix(KAPA，Cat.KK2602)，SPRI磁珠(Beckman，Cat.A63882)；

小鼠胚胎干细胞(mESCs)由小鼠囊胚时期分离内细胞团在体外培养获得。

实施例1单细胞转录组测序原理

本发明的基于纳米孔单细胞测序的单细胞转录组测序流程图如图1所示：

单细胞裂解产物与逆转录体系共孵育，逆转录引物通过poly dT与单细胞mRNA的polyA尾结合，将条形码序列引入单细胞mRNA上，在逆转录酶的作用下将mRNA逆转录为第一链cDNA，条形码序列实现了对第一链cDNA的特异性标记；在末端转移酶的作用下，模板转换引物与第一链cDNA结合并延伸，得到双链DNA；

利用锚定序列进行PCR扩增，得到扩增产物；利用磁珠对扩增产物进行纯化，去除了片段较短的扩增产物，提高了扩增产物中全长转录本的比例；

将纯化样本混合后，在纯化产物上添加测序接头并进行纳米孔单分子测序，得到全长转录本的序列信息。

实施例2单细胞RNA逆转录

(1)单细胞裂解

分离单个小鼠胚胎干细胞(mESCs)，将每个细胞转移至独立的反应管中，并加入一定量的单细胞裂解液，配制表1所示的裂解体系，震荡混合后72℃孵育3min，使细胞充分裂解释放出RNA，样品马上转移至冰上；

表1单细胞裂解体系

成分	体积(μL)
		10％Triton X-100	0.095
RNA酶抑制剂(40U/μL)	0.05
		逆转录引物(5μM)	0.3
dNTPs(10mM)	0.5
		无酶水	1.555

(2)体外逆转录反应

将表2所示的逆转录反应液直接加入到步骤(1)得到的单细胞裂解样品中，充分混匀后，进行体外逆转录，条件为25℃5min，42℃60min，50℃30min，72℃10min，得到与RNA互补的cDNA，所述cDNA上携带有条形码序列(Barcode)。

表2逆转录反应液

成分	体积(μL)
		SuperScript II逆转录酶(200U/μL)	0.2
RNA酶抑制剂(40U/μL)	0.125
		Superscript II第一链合成缓冲液(5×)	1
DTT(0.1M)	0.25
		甜菜碱(Betaine)(5M)	1
MgCl<sub>2</sub>(1M)	0.03
		模板转换引物(100μM)	0.05
无酶水	0.245

实施例3DNA扩增和扩增产物纯化

(1)PCR扩增

对实施例2获得的cDNA进行PCR扩增反应，体系如表3所示，条件为95℃预变性3min；98℃变性20s，65℃退火30s，72℃延伸5min，3～6个循环；98℃变性20s，67℃退火15s，72℃延伸5min，10～20个循环；

表3PCR扩增体系

成分	体积(μL)
		KAPA HiFi HotStart ReadyMix(2×)	6.25
锚定引物(10μM)	0.25
		cDNA模板	5.4
无酶水	1

(2)产物纯化

加入SPRI磁珠对扩增产物进行纯化，磁珠为反应液体积的0.4倍，纯化过程先将磁珠与产物混合，室温孵育5min后置于磁力架上，待磁珠吸附到侧壁上，去除上清；

将磁珠用80％乙醇洗涤2次，晾干，用适量体积的水溶液重悬磁珠，室温静置2min，置于磁力架上，将上清产物合并转移至新的反应管中，重复进行磁珠纯化一次，得到去除了小片段DNA的扩增产物。

如图2所示为对扩增产物的筛选条件进行优化前和优化后的结果图，可以看出，对磁珠的添加量和纯化次数进行优化、将磁珠的添加量限定为反应液体积的0.4倍、纯化次数限定为2次，得到了全长片段，显著提高了全长的扩增片段在体系中的比例。

实施例4逆转录产物纯化和PCR扩增

与实施例3相比，对实施例2获得的cDNA进行核酸外切酶37℃消化10min，将不同单细胞来源的cDNA混合到同一个反应管中，进行PCR扩增反应，其他步骤与条件与实施例3相同。

本实施例对单细胞RNA进行逆转录后，将不同来源的第一链cDNA混合并进行PCR扩增，不仅得到了全长片段，而且简化了实验流程，降低了成本。

实施例5文库构建和单细胞测序

按照纳米孔平台要求对扩增产物进行测序文库构建和单细胞测序，采用LigationSequencing Kit 1D(ONT，Cat.SQK-LSK109)，按照说明书构建纳米孔测序文库；使用UltraII End Prep模块(NEB，Cat.E7546)对cDNA片段进行末端修复并添加dA尾，然后使用快速连接模块(NEB，Cat.E6056)将其连接到1D接头上；之后，将每个cDNA文库加载到一个FLOPRO002通道中，并在PromethION.Beta上测序。

如图2的第二泳道所示，构建的测序文库的长度为500～3000bp，分布在全长cDNA范围内；

如图3所示，本发明的测序方法(SCAN-seq)可以获得与二代测序(NGS-Bulk)相当的基因数量，具有与二代测序相当的敏感性；如图4所示，不同单细胞来源的全转录组的表达水平相关系数高，具有比二代测序更高的可重复性。

综上所述，本发明在逆转录引物中添加条形码序列对单细胞全长RNA进行逆转录，实现了对不同单细胞来源的序列进行标记，对不同来源的DNA扩增产物混合达到了第三代测序平台对模板量的要求，实现了对全长转录本的精确测序。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 广州再生医学与健康广东省实验室

<120> 一种基于第三代测序的单细胞转录组测序方法

<130> 20200421

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 1

aagcagtggt atcaacgcag agt 23

Claims (10)

1.一种单细胞转录组的处理方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)采用逆转录引物对单细胞RNA进行逆转录，得到带有条形码的cDNA；

(2)对带有条形码的cDNA进行PCR扩增，将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合；

或将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合后进行PCR扩增。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和poly dT。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述条形码序列与第三代测序系统兼容；

优选地，所述条形码序列的长度为20～40nt。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在将获得的不同单细胞来源的PCR扩增产物混合之前，还包括对PCR扩增产物进行纯化的步骤。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法在将不同单细胞来源的带有条形码的cDNA混合之前，还包括对逆转录体系进行核酸外切酶消化的步骤。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述纯化采用磁珠进行；

优选地，所述磁珠与所述PCR扩增产物的体积比为(0.3～0.6):1，优选为(0.4～0.5):1；

优选地，所述纯化的次数为2～3次。

7.一种单细胞转录组测序方法，其特征在于，所述方法采用权利要求1-6任一项所述的方法处理单细胞转录组，并对产物进行第三代测序。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第三代测序包括单分子即时DNA测序、Heliscope单分子测序、基于荧光共振能量转移的即时DNA测序、纳米孔单分子测序或离子流半导体测序中的任意一种，优选为纳米孔单分子测序。

9.一种单细胞转录组测序试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括逆转录引物；

所述逆转录引物从5’端到3’端依次为锚定序列、条形码序列和poly dT；

所述条形码序列与第三代测序系统兼容；

优选地，所述试剂盒还包括模板转换引物；

优选地，所述试剂盒还包括锚定引物。

10.一种权利要求1-4任一项所述的方法在单细胞转录组测序中的应用。

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