CN117844808A - 新型内含子、环状rna及其体外制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子的核酸分子,其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。本发明还提供用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子,其截取于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的同一序列,且无重叠区域。本发明还提供了将所述内含子应用于环状RNA的体外制备方法。本发明通过将两条序列SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2任意剪切,获得环化效率较高的所述3’内含子与5’内含子,其能将线性的mRNA高效环化,并具有较少的外源性碱基残留。所获得的内含子可用于制备环状RNA,进一步用于制备mRNA疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,尤其涉及到利用Ⅰ类新型内含子自剪接活性在体外条件下环状RNA的制备方法、以及获得的环状RNA。
背景技术
近年来,得益于mRNA疫苗的良好表现,mRNA技术逐渐走向大众的视野。与传统技术相比,mRNA疫苗具有更高的免疫原性、安全性及低成本规模级制备的显著优势,在基因编辑、细胞治疗与肿瘤新抗原疫苗等领域也具有广阔蓝海。然而,mRNA本身的种种固有缺点也不容忽视。由于mRNA易降解、难储藏的特性,Moderna与BioNTech公司生产的mRNA疫苗需要在-20℃或-70℃条件下进行储藏运输。除此以外,线性mRNA会引发较强的免疫原性,往往需要对核酸进行修饰,例如使用假尿嘧啶取代尿嘧啶,才能够将其引发的免疫反应控制在合理范围内。这些严苛条件极大的限制了mRNA技术的发展和应用。如何进行升级改造,实现mRNA的常温储藏、免疫可控就成为了技术开发的当务之急。
Circular RNA(circRNA)是一种首尾以共价键连接的闭合的环状RNA,在真核细胞中广泛存在。因不具有线性mRNA的Poly A尾及5’末端和3’末端,circRNA对RNA酶消化和水解具有更强的抵抗力。在近年的研究中,越来越多的内源性circRNA已经被发现具有翻译和蛋白表达的功能,为circRNA的实际应用奠定了理论基础,Chuyun Chen等人更是证明在室温条件下储藏15天对circRNA的翻译活性几乎没有影响,此外有研究者证明人工制备的circRNA比线性mRNA在真核细胞内具有更持久的蛋白表达及更低的非特异性免疫刺激。因此,circRNA既继承了线性mRNA的特点,同时拥有稳定、持久、易储藏运输的天然优势。
当前的circRNA体外制备方法主要包括酶连法以及利用具有自剪接功能的I型或Ⅱ型内含子进行环化的PIE技术(Permuted Intron-exon)。酶连法主要是指利用T4 DNA或RNA连接酶在ATP的辅助下将线性mRNA进行首尾连接,其主要优势在于较少的外源性碱基残留,然而这种方法对核酸链的长度有着严格要求,不适用于长链RNA的环化,且无法保证RNA的环化效率,不适用于circRNA的规模级制备。PIE技术最早可追溯到上世纪九十年代,由M.Puttaraju和Michael D.Been共同提出,首次将剪切后的Tetrahymena及Anabaena的Ⅰ型内含子连接在外显子两端,并在Mg2+与GTP的催化下成功将线性mRNA环化。由于当时年代技术的限制,这种环化效率并不理想且无法获得高纯度的circRNA,难以实际应用于疫苗或药物开发等领域。直到2018年,R.Alexander Wesselhoeft等人对PIE法进一步优化实现了以Anabaena内含子为基础的高效率体外环化,然而这一方法会使circRNA残留较多的外源性核酸序列,部分观点认为circRNA的免疫原性与其残留的外源性核酸序列长度相关,可能会引起非特异性免疫。
除了利用Ⅰ型内含子的PIE系统外,Ⅱ型内含子也可被改造用于circRNA的制备,Chuyun Chen等人证明Clostridium tetani的Ⅱ型内含子的不同切割方式对circRNA的环化效率有较大的影响,传统观点认为Ⅱ型内含子的体内外剪接原理可能存在差异,其体外剪接机制仍需明确,对Ⅱ型内含子的改造依然困难,是否具备普适性应用也仍不可知。
发明内容
基于此,本发明的目的是提供了基于PIE系统的高效体外制备circRNA的方法,将IVT(In vitro transcription,体外转录)制备的mRNA高效环化成circRNA,并具有较少的外源性碱基残留。
本发明的第一方面,提供了用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子的核酸分子,其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二方面,提供了任一核酸分子SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2在体外制备环状RNA中的应用。
本发明的第三方面,提供了用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子,其截取于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的同一序列,且无重叠区域。
在其中一些实施例中,所述3’内含子与5’内含子来自于SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2中的任意片段,所述3’内含子大于5bp,或者是大于6bp,或者是大于7bp,或者是大于8bp,或者是大于10bp、或11bp、或12bp、或13bp,或14bp,或是大于15bp,或是大于25bp,5’内含子大于5bp,或者是大于6bp,或者是大于7bp,或者是大于8bp,或者是大于10bp、或11bp、或12bp、或13bp,或14bp,或是大于15bp,或是大于25bp来自与SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2中不重合的序列。
在其中的一些实施例中,针对SEQ ID NO.1,所述3’内含子与5’内含子的组成选自以下中的至少一组:SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;
SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10;
SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12;
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14;
SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18;
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20;
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24;
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26;
SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28;
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30。
在其中的一些实施例中,针对SEQ ID NO.2,所述3’内含子与5’内含子的组成选自以下中的至少一组:SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32;
SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34;
SEQ ID NO.35和AAAU;
SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37;
SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39;
SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43;
SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45;
SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47;
SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49;
SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51;
SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53;
SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57;
SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59;
SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61。
本发明的第四方面,提供了任一上述的3’内含子和5’内含子在体外制备环状RNA中的应用。
本发明的第五方面,提供了一种环状RNA的体外制备方法。
一种环状RNA的体外制备方法,包括下列步骤:
s1质粒构建:将T7启动子,5’同源臂,3’内含子,第二外显子E2,第一外显子E1,5’内含子,3’同源臂,和酶切位点EcoRI的基因片段连接到表达载体上;所述3’内含子和5’内含子的组成来自于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2序列中其一的同一序列;
s2质粒线性化和纯化;
s3体外转录和环化,纯化后得到环状RNA。
在其中一些实施例中,所述3’内含子与5’内含子来自于SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2中的任意片段,所述3’内含子大于5bp,或者是大于10bp,或是大于15bp,或是大于25bp,5’内含子大于5bp,或者是大于10bp,或是大于15bp,或是大于25bp来自与SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.2中不重合的序列。
在其中一些实施例中,所述3’内含子与5’内含子组合成完整的SEQ ID NO.1-SEQID NO.2中任一序列,也可以是SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2中一部分。在其中一些实施例中,s3体外转录和环化,纯化包括:
s3.1体外转录:纯化后的线性化质粒DNA为模板,在转录酶的催化下进行体外转录;然后去除多余未反应的线性化模板;
s3.2进行第一步环化,并对环化的RNA进行柱纯化;
s3.3进行第二步环化,并对环化的RNA进行柱纯化,得到环状RNA。
在其中一些实施例中,s3体外转录和环化,纯化包括:s3.1’:配制一步法环化体系,将一步法反应体系中的各成分混合均匀后,保持恒温使其发生环化;其中所述环化体系中包括RNA聚合酶、RNase抑制剂、焦磷酸酶、环化反应缓冲液和碱基,无酶无菌水、线性化质粒;所述外源性RNA的环化反应缓冲液,包括Tris-HCL缓冲液,亚精胺、TCEP或DTT、Mg2+,pH为6.5~8.5,所述Mg2+的浓度为190mM~400mM,所述亚精胺的浓度为5mM~80mM;所述TCEP的浓度为5mM~35mM,所述DTT的浓度为180~220mM;
s3.2’:线性化模板去除;
s3.3’:RNA纯化和去除线性RNA;纯化后即得环状RNA。
在其中一些实施例中,体外转录步骤中,所述的线性化质粒DNA浓度为350ng/μL-650ng/μL。
在其中一些实施例中,表达载体为pSP64-Poly(A)载体。
在其中一些实施例中,所述第一步环化包括:添加GTP至最终浓度为2±0.2mM,然后将反应体系在55±2℃加热15±2min。
在其中一些实施例中,所述第二步环化包括:RNA变性后在含有GTP的反应体系中,55±2℃反应8±1min。
本发明的第六方面,是提供由上述制备方法得到的环状RNA。
本发明的第七方面,是提供上述环状RNA在制备mRNA疫苗中的应用。
本发明通过将TwortⅠ型内含子进行改造,得到两条序列SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示,通过任意剪切,获得环化效率较高的所述3’内含子与5’内含子,将剪切的内含子序列插入目的片段5’末端及3’末端之间,在金属离子及GTP的催化下将线性的mRNA高效环化,并具有较少的外源性碱基残留。所获得的内含子可用于制备环状RNA,进一步用于制备mRNA疫苗。
附图说明
图1为IVT产物及环化产物的凝胶电泳检测结果示意图。
图2为RNase R消化产物的凝胶电泳检测结果示意图。
图3为Sanger法测序circRNA接头序列结果示意图。
图4为circRNA的体外一步法IVT及环化结果示意图。
图5为一步法制备circRNA的RNase R消化耐受实验结果示意图。
图6为Twort orf142 intron1不同置换位点的内含子一步法制备环状circRNA的结果示意图。
图7为Twort orf142 intron2不同置换位点的内含子一步法制备环状circRNA的结果示意图。
图8为实施例4中RNase R处理后的circRNA-GFP凝胶电泳图。
图9为实施例4中circRNA-GFP转染后的293T荧光图。
图10为实施例4中circRNA-GFP表达持久性验证结果示意图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术
领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
序列1(Twort ORF142 Intron1,325nt)Complete intron:
GAACUUCGUAGCUUCACAUAGUAAUAUGUGUCGAAAAACUUUUCUAAACAGGGAAG
CCUAAGUCUAUUAGAUAUGGUAAUCCUGUGCUAAAUCAGAUUAAUAAUCUGUAAAU
GCCAAACGACUAACUGAAACCUACUUGAUAAUUCAAGGGGAGUAAGUGUAGAGCCA
AGCGGUAGAAGUUUUAAGUAAUUAUUAUGUAAAUCUUCUUUAAAUCGAAAAGAAA
AGAGUCCUUUUUUAGGAUUGUGAUAUAGUCUGAACAUAUAUGGAAACAUAUAGCAGUUCCUAGAGAACGGGCAGUGAGUAGCGACCACUGUUGAACAUAAUG(SEQ ID NO:1)序列2(Twort ORF142 Intron2,252nt)Complete intron:
AAAUAAUUGUGCCUUUAUACAGUAAUGUAUAUCGAAAAAUCCUCUAAUUCAGGGAA
CACCUAAACAAACUAAGAUGUAGGCAAUCCUGAGCUAAGCUCUUAGUAAUAAGAGA
AAGUGCAACGACUAUUCCGAUAGGAAGUAGGGUCAAGUGACUCGAAAUGGGGAUUA
CCCUUCUAGGGUAGUGAUAUAGUCUGAACAUAUAUGGAAACAUAUAGAAGGAUAGGAGUAACGAACCUAUUCGUAACAUAAUUG(SEQ ID NO:2)
*序列1和序列2是高度同源的(参考文献:Landthaler M,Shub DA.Unexpectedabundance of self-splicing introns in the genome of bacteriophage Twort:introns in multiple genes,a single gene with three introns,and exon skippingby group I ribozymes.Proc Natl Acad Sci U S A.1999Jun8;96(12):7005-10.doi:10.1073/pnas.96.12.7005.PMID:10359829;PMCID:PMC22036.)。
根据以上序列,可以根据其组成,任意截取不同长短的5'内含子和3'内含子序列,以下为任意的举例,可参照此,按照以下方式进行选取相应的5'内含子和3'内含子进行mRNA进行环化。
表1 Twort ORF142 Intron1的置换位点3'内含子片段序列和5'内含子片段序列
表2:Twort ORF142 Intron1的置换位点3'内含子片段序列和5'内含子片段序列
以上表格中,在完成环化后,内含子序列被剪切掉,外显子残留碱基(相互连接,形成封闭接头。以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1:基于不同Ⅰ型内含子的PIE法构建的RNA体外环化验证
1.1实验方法与步骤(1)质粒构建
为探究基于新型内含子的PIE法能否促进mRNA的体外环化,首先构建了含有不同内含子的质粒,此处所使用的构建环状RNA的DNA载体,包含T7启动子,5’同源臂,3’内含子,第二外显子E2(Exon2),第一外显子E1(Exon1),5’内含子,3’同源臂,以及可用于质粒线性化的酶切位点EcoRI。所得基因片段连接到pSP64-Poly(A)载体。载体可委托金唯智进行合成。构建环状RNA的DNA载体元件可参考如下文献:
Wesselhoeft RA,Kowalski PS,Anderson DG.Engineering circular RNA forpotent and stable translation in eukaryotic cells.Nat Commun.2018Jul 6;9(1):2629.doi:10.1038/s41467-018-05096-6.PMID:29980667;PMCID:PMC6035260.
其中,Orf142 intron1中:
Exon1:TAATAACTAT(SEQ ID NO:62)
Exon2:GATGAAGCAT(SEQ ID NO:63)
Orf142 intron2中:
Exon1:CTGAAAGCAT(SEQ ID NO:64)
Exon2:AACTTTTAGT(SEQ ID NO:65)。
在本实施例中,所使用的内含子序列除上述表1和表2所示之外,还包括如下表3所示:
/>
阳性对照Circ1.0的Exon外显子序列如下:
E2:ATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCACGCCGGAAACGC(SEQID NO.78)
E1:ATGCGTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTAAA(SEQ ID NO.79)
(2)质粒线性化
将10x Reaction buffer(cut smart)室温解冻并混匀,EcoRI-HF混匀后放于冰盒上。配置酶切体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应1小时。质粒线性化酶切体系:
名称 | 量 |
构建的质粒 | 20μg |
EcoRI-HF | 5μL |
10x Reaction buffer | 10μL |
RNase-free water | to 100μL |
线性化质粒纯化:
在100μL上述酶切体系中加入100μL混匀的AMPureXP磁珠,Vortex混匀,室温静置孵育10分钟。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。加入1mL 70%乙醇清洗磁珠,旋涡重悬磁珠,静置20秒。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。重复一次以上两步清洗步骤。将70%乙醇吸干,磁珠室温干燥10分钟。加入40μL RNase-free水洗脱,孵育5分钟,重复洗脱一次。Nanodrop测浓度后,琼脂糖凝胶电泳进行线性化效率测定。
(3)体外转录
将NTPs和10x Reaction buffer室温解冻并混匀,IVT Enzyme mix(Thermoscientific)放于冰盒上。按照下表配制转录体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应3小时,得RNA solution。
体外转录体系:
线性化模板去除:
将DNase I放于冰盒上。按照下表配制去除质粒模板体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应0.5小时。
去除质粒模板体系:
名称 | 量 |
RNA solution | 60μL |
DNase I,RNase-free | 3μL |
(4)第一步环化
将100mM GTP放于冰盒上。
向完成体外转录的且去除线性化模板的样品中添加额外的GTP至最终浓度为2mM,然后将混合液在55℃加热15min。留样:1μL。
circRNA纯化:使用RNA Cleanup Kit(500μg)试剂盒(NEB)对第一步环化的RNA进行柱纯化。添加2倍反应体系的RNA Cleanup Binding Buffer(RNA纯化结合缓冲液)至RNA反应体系。添加3倍反应体系的无水乙醇到混合液中,用移液枪混匀,勿旋涡。将混合液转移至吸附柱中,吸附柱插入到收集管中,于4℃,16000g离心1min。将吸附柱插入到另一个新的收集管中,添加500μLRNA Cleanup Wash Buffer(使用前确认Cleanup WashBuffer已加入无水乙醇);于4℃,16000g离心1min。弃去收集管中液体,再用RNACleanupWash Buffer清洗一次。将吸附柱转移至新的1.5mL离心管中,加入100μL RNase-free水洗脱RNA,静置2min,于4℃,16000g离心1min,收集洗脱液。并用洗脱液重复洗脱RNA一次。
(5)第二步环化
将100mM GTP放于冰盒;配制2X Recircular Buffer,使体系中含有终浓度100mMTris-HCL、20mM MgCl2、2mM DTT;取50μL上述步骤(4)中的实验产物,置于70℃加热5min后,置于冰上3min,以便其充分变性;按照下表配制RNA第二步环化体系,充分混匀后,于金属浴中55℃反应8min。
名称 | 量 |
第一步环化及纯化产物 | 50μL |
2X Recircular Buffer | 75μL |
100mM GTP | 3μL |
RNase-free water | to 150μL |
留样:1μL,以便后续凝胶电泳检测。circRNA纯化:同步骤(4)中的描述。
(6)线性mRNA去除
将第二步环化并经过纯化的10μg RNA置于65℃加热3min后,置于冰上3min;按照下表配制linear mRNA去除体系,充分混匀后,于金属浴中37℃消化1h,置于冰上。
circRNA纯化:同步骤(4)中的描述。
(7)circRNA的鉴定
A.试剂配制:0.9g琼脂糖粉加入60mL1xTBE溶液中,加热将琼脂塘融化,将凝胶倒入槽中。B.mRNA检测:将mRNA稀释至50ng/μL,取1μL mRNA溶液,加入3μL体积的4×RNAloading buffer混匀,75℃加热5min,上样进行琼脂糖凝胶检测,凝胶电泳条件为165V,20min。待电泳结束后,在凝胶成像仪中进行成像。
1.2实验结果
(1)DNA转录模板制备
线性化模板浓度:pCirc2.1:598.82ng/μL;pCirc2.2:604.55ng/μL;pCirc2.3:600.97ng/μL;pCirc2.4:602.02ng/μL;pCirc2.5:654.37ng/μL;pCirc2.6:629.99ng/μL;pCirc2.7:593.03ng/μL。
(2)mRNA体外转录与环化
①mRNA转录纯化后RNA浓度:Circ2.1:7211.9ng/μL;Circ2.2:7044.8ng/μL;Circ2.3:7623.8ng/μL;Circ2.4:4515.3ng/μL;Circ2.5:8415.1ng/μL;Circ2.6:14079.1ng/μL;Circ2.7:9754.3ng/μL。
②mRNA环化并纯化后RNA浓度:Circ2.1:2401.4ng/μL;Circ2.2:1745.6ng/μL;Circ2.3:1777.3ng/μL;Circ2.4:1705.1ng/μL;Circ2.5:2832ng/μL;Circ2.6:2202.4ng/μL;Circ2.7:2725.8ng/μL。
③RNA变性琼脂糖凝胶电泳。
如图1,本实验采用传统环化方式,即首先对Circ2.1-Circ2.7的线性化模板进行IVT,获得线性mRNA,再在不同缓冲液中进行分步体外环化,以获得环状mRNA。与线性mRNA凝胶电泳结果相比,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6在环化后出现明显条带分布改变,Circ2.4的环化产物在500nt左右出现明亮条带,而Circ2.5、Circ2.6的产物大小也与预期基本相符。由于circRNA的复杂高级结构,在实际实验中可能会出现条带迁移,因此初步认为Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6环化成功。
RNase R消化抵抗测试及Sanger测序验证
①RNase R消化测试:由于circRNA没有裸露的5’及3’末端,相较于线性mRNA具有更强的RNase R消化抗性,因此首先尝试使用RNase R消化前期认为已经环化的Circ2.4-Circ2.6,实验结果如图2所示。circRNA由于缺少裸露的5’及3’末端,具有更强的RNase R消化抗性。在RNase R消化后,Circ2.4主要条带依旧明亮,Circ2.5及Circ2.6的环化产物占比则随RNase R消化时间延长而增加,证明Circ2.4-Circ2.6的目的产物未受到RNase R消化影响,目的条带应为环状RNA。即在相同上样量的情况下,RNase R消化时间越长,则circRNA的条带亮度越是明亮,证明目的条带的确为mRNA环化产物。
②Sanger测序验证:由于Ⅰ型内含子的固有剪接机制,在环化完成后,本实验所设计的内含子序列会被完全切除,环状RNA接头处分别是E2与E1,并以共价键形式连接,因此本实验以特异性引物扩增含有circRNA接头部分的E2与E1序列,通过测序来验证是否环化成功。如图3所示,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6分别为对应E2-E1的连接序列,由于Circ2.5与Circ2.6设计采用相同Ⅰ型内含子的不同剪接位点,因此其接头部分序列相同。这说明Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6环化成功。
本实验使用RNase R消化后的纯化产物为模板,首先进行体外反转录获得cDNA,再使用引物进行体外扩增以获得包含circRNA接头序列的PCR产物。最终Sanger法测序结果及序列比对证明,目的条带确为环状RNA,证明所提供的基于新型内含子的PIE法体外制备circRNA的可行性。
实施例2:一步法RNA环化验证
2.1实验方法与步骤
在上述实施例1的基础上,采用与上述实施例1相同的内含子与外显子元件,尝试进行IVT同步RNA环化,以达到减少过程性损失的目的。
①circRNA的IVT及体外环化
按照如下表格进行溶液配制:
试剂名称 | 投入量 |
模板 | 2μg |
T7 RNA polymerase | 8.5μL |
RNase Inhibitor | 0.1μL |
Pyrophosphatase | 1μL |
10x Reaction Buffer | 4μL |
100mM ATP | 4μL |
100mM CTP | 4μL |
100mM GTP | 4μL |
100mM UTP | 4μL |
RNase free water | To 40μL |
所述环化反应缓冲溶液(Reaction Buffer)的组成为:400mM Tris-HCL,200mMMgCl2,25mM TCEP,20mM spermidine(pH=7.9)。将上述溶液混匀后,在PCR仪中以37℃孵育3.5h,孵育结束后取1μL样品稀释后进行凝胶电泳。
②IVT产物去模板
将2μL DNase I分别加入上述IVT产物中,并在PCR仪中继续37℃孵育30分钟,待反应结束后,取1μL样品稀释进行凝胶电泳。
③RNase R消化及circRNA的纯化
在实施例1的基础上,对本实施例的部分实验产物进行RNase R消化及纯化。
在本实施例实验结果上,通过Image J软件分析circRNA凝胶电泳结果的灰度值占比,并根据以下定义分别计算circRNA的环化效率、RNase R酶消化前纯度及RNase R酶消化后纯度。
circRNA的环化效率计算公式:使用经过IVT、DNase I消化及纯化的circRNA样品进行凝胶电泳,并通过Image J计算circRNA条带占据circRNA条带灰度及线性核酸前体条带灰度值总和的百分比。公式为:凝胶电泳circRNA条带灰度值/(凝胶电泳circRNA条带灰度值+凝胶电泳线性RNA条带灰度值)*100%
RNase R酶消化前纯度:使用经过IVT、DNase I消化及纯化的circRNA样品进行凝胶电泳,并通过Image J计算所得circRNA条带占据所有核酸条带灰度的百分比。公式为:circRNA条带灰度值/全核酸条带灰度值总和*100%
RNase R酶消化后纯度:使用RNA酶消化并纯化后的circRNA样品进行凝胶电泳,并通过Image J计算所得circRNA条带占据所有核酸条带灰度的百分比。公式为:circRNA条带灰度值/全核酸条带灰度值总和*100%。
2.2实验结果
(1)circRNA的一步法IVT及环化
circRNA一步法环化及纯化后浓度:Circ2.4:435.6ng/μL;Circ2.5:336.6ng/μL;Circ2.6:324.9ng/μL。
结果参见图4所示。采用一步法制备circRNA,即通过优化IVT相关缓冲液的成分组成,以达到IVT-环化同步进行的目的。在改变实验参数后,Circ 2.1-Circ2.3及Circ2.7主要产物大小与线性mRNA条带大小相同,证明未能成功环化或只有少量环化,Circ2.4-Circ2.6则出现明显条带大小改变,且与图1中条带分布基本相同,认为环化成功,同时,Circ2.5及Circ2.6各产物占比出现改变,推测是由于实验条件改变造成的差异。
可见,在完成一步法反应后,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6出现明显条带迁移,初步判断环化成功。
(2)circRNA一步法产物的RNase R消化实验
由于本实施例采用IVT-环化一步法,即省略中间相关操作步骤。因此,核酸的浓度只有最终纯化完成后才能获得。选择相应的IVT及环化产物进行RNase R消化实验。如图5所示,在完成RNase R消化后,Circ2.4、Circ2.5、Circ2.6对应条带中杂带明显减少,且目的条带明亮无降解痕迹,且该方法制备的circRNA与传统环化方法制备的circRNA相比,具有更高的纯度,证明环化成功。
实施例3:基于内含子的不同剪接方式构建的环状RNA
3.1实验方法与步骤
在上述实施例1和2的基础上,对内含子的剪接位点进行重新设计,采用一步法进行体外环化,以验证其环化的可行性;在本实施例中,内含子序列除了Circ2.5、Circ2.6还包括如下所示:pCirc2.10、pCirc2.11、pCirc2.18、pCirc2.19、pCirc2.20、pCirc2.21、pCirc2.38、pCirc2.39、pCirc2.40、pCirc2.41、pCirc2.42、pCirc2.43、pCirc2.44、pCirc2.45、pCirc2.46、pCirc2.47、pCirc2.48、pCirc2.49、pCirc2.50、pCirc2.51、pCirc2.52、pCirc2.53、pCirc2.54、pCirc2.55、pCirc2.56、pCirc2.57、pCirc2.65、pCirc2.66。
①质粒线性化
将10x Reaction buffer(cut smart)室温解冻并混匀,EcoRI-HF混匀后放于冰盒上。
配置酶切体系,充分混匀后,于金属浴中37℃反应2小时。
质粒线性化酶切体系:
名称 | 量 |
构建的质粒 | 20μg |
EcoRI-HF | 5μL |
10x Reaction buffer | 10μL |
RNase-free water | to 100μL |
②线性化质粒纯化
在100μL上述酶切体系中加入100μL混匀的AMPureXP磁珠,Vortex混匀,室温静置孵育10分钟。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。加入1mL 70%乙醇清洗磁珠,旋涡重悬磁珠,静置20秒。将反应管置于磁力架上,吸磁5min,弃上清。重复一次以上两步清洗步骤。将70%乙醇吸干,磁珠室温干燥10分钟。加入400μL RNase-free水洗脱,孵育5分钟,重复洗脱一次。Nanodrop测浓度后,琼脂糖凝胶电泳进行线性化效率测定。
③circRNA的IVT及体外环化
按照如下表格进行溶液配制:
试剂名称 | 投入量 |
模板 | 2μg |
T7 RNApolymerase | 8.5μL |
RNase Inhibitor | 0.1μL |
Pyrophosphatase | 1μL |
10x Reaction Buffer | 4μL |
100mM ATP | 4μL |
100mM CTP | 4μL |
100mM GTP | 4μL |
100mM UTP | 4μL |
RNase free water | To 40μL |
将上述溶液混匀后,在PCR仪中以37℃孵育3h,孵育结束后取1μL样品稀释后进行凝胶电泳。
3.2实验结果
(1)DNA转录模板制备
线性化模板浓度为:
pCirc2.10:422.2ng/μL;pCirc2.11:403.3ng/μL;pCirc2.18:422.24ng/μL;pCirc2.19:451.40ng/μL;pCirc2.20:363.54ng/μL;pCirc2.21:419.13ng/μL;pCirc2.38:318.58ng/μL;pCirc2.39:337.59ng/μL;pCirc2.40:378.51ng/μL;pCirc2.41:370.83ng/μL;pCirc2.42:356.90ng/μL;pCirc2.43:326.76ng/μL;pCirc2.44:346.59ng/μL;pCirc2.45:384.23ng/μL;pCirc2.46:311.67ng/μL;pCirc2.47:336.87ng/μL;pCirc2.48:343.87ng/μL;pCirc2.49:336.78ng/μL;pCirc2.50:339.50ng/μL;pCirc2.51:360.49ng/μL;pCirc2.52:358.42ng/μL;pCirc2.53:315.56ng/μL;pCirc2.54:286.37ng/μL;pCirc2.55:261.71ng/μL;pCirc2.56:337.65ng/μL;pCirc2.57:308.82ng/μL;pCirc2.65:314.78ng/μL;pCirc2.66:381.63ng/μL。
(2)mRNA体外转录与环化
CircRNA一步法制备及纯化后浓度:
①Circ2.10:2602.1ng/μL;Circ2.11:5141.8ng/μLCirc2.18:7227.5ng/μL;Circ2.19:3895.7ng/μL;Circ2.20:2897.1ng/μL;Circ2.21:4435.1ng/μL;Circ2.38:2799.7ng/μL;Circ2.39:2654.7ng/μL;Circ2.40:2489.8ng/μL;Circ2.41:2757.9ng/μL;Circ2.42:2620.1ng/μL;Circ2.43:3697.9ng/μL;Circ2.44:2574ng/μL;Circ2.45:2453ng/μL;Circ2.46:1667.2ng/μL;Circ2.47:2033.2ng/μL;Circ2.48:2086.2ng/μL;Circ2.49:2530.4ng/μL;Circ2.50:2220ng/μL;Circ2.51:2601.7ng/μL;Circ2.52:1998.5ng/μL;Circ2.53:2584.8ng/μL;Circ2.54:5138.3ng/μL;Circ2.55:5247.4ng/μL;Circ2.56:5656.2ng/μL;Circ2.57:5414.2ng/μL;Circ2.65:4666.8ng/μL;Circ2.66:4765.4ng/μL。
②RNase R消化及纯化后浓度:
Circ2.10:578.1ng/μL;Circ2.11:474.9ng/μL;Circ2.18:300.8ng/μL;Circ2.19:427.6ng/μL;Circ2.20:412.9ng/μL;Circ2.21:349.8ng/μL;Circ2.38:80.1ng/μL;Circ2.39:222.6ng/μL;Circ2.40:313ng/μL;Circ2.41:86ng/μL;Circ2.42:198.5ng/μL;Circ2.43:173ng/μL;Circ2.44:355.7ng/μL;Circ2.45:375.3g/μL;Circ2.46:395.7ng/μL;Circ2.47:231ng/μL;Circ2.48:429.8ng/μL;Circ2.49:386.3ng/μL;Circ2.50:397.6ng/μL;Circ2.51:338.4ng/μL;Circ2.52:466.2ng/μL;Circ2.53:368.1ng/μL;Circ2.54:546.7ng/μL;Circ2.55:726ng/μL;Circ2.56:773ng/μL;Circ2.57:1061.4ng/μL;Circ2.65:547.2ng/μL;Circ2.66:546.2ng/μL。
此外,还对表1和表中的来自于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2的3’内含子与5’内含子的进行了相关实验,具体结果参见表4和表5,从结果看出可以来自于SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.2的3’内含子与5’内含子能够环化成功,其中的杂带较少,其中,环化效率较好的有Circ2.5、Circ2.6、Circ2.18、Circ2.19、Circ2.39、Circ2.40、Circ2.10、Circ2.11、Circ2.44、Circ2.45、Circ2.46、Circ2.48、Circ2.49、Circ2.50、Circ2.51、Circ2.52、Circ2.53、Circ2.57。
针对Twort orf142 intron1的结果如下表4:
No. | R-纯度 | R+纯度 | R-前环化效率 |
2.5 | 36.60% | 87.29% | 42.73% |
2.6 | 22.03% | 80.46% | 26.23% |
2.18 | 22.71% | 64.76% | 26.34% |
2.19 | 31.41% | 56.38% | 35.66% |
2.20 | 23.22% | 51.26% | 24.63% |
2.21 | 17.76% | 38.89% | 18.93% |
2.38 | 0 | 0 | 0 |
2.39 | 29% | 88% | 36% |
2.40 | 29.94%% | 86% | 36% |
2.41 | 0.00% | 0.00% | 0.00% |
2.42 | 16.74% | 74.70% | 18.44% |
2.43 | 14.69% | 70.62% | 17.99% |
2.65 | 8.59% | 41.83% | 13.29% |
2.66 | 0% | 6.42% | 0% |
针对Twort orf142 intron2的结果如下表5:
从图6-图7中可以看出,对Twort orf142 intron1和Twort orf142 intron2通过分割获得的置换位点:
与线性mRNA凝胶电泳结果相比,针对Twort orf142 intron1,其中Circ2.4在环化后出现明显条带分布改变,Circ2.4的环化产物在500nt左右出现明亮条带,Circ2.5、Circ2.6、Circ2.18、Circ2.19、Circ2.39、Circ2.40的产物大小也与预期基本相符,而Circ2.38和Circ2.66未见到明显条带,环化失败。内含子Circ2.41和Circ2.42的组成,都是属于SEQ ID NO.1中一部分,并非组成完整的SEQ ID NO.1,Circ2.42的结果表示环化成功,而Circ2.41不成功。
与线性mRNA凝胶电泳结果相比,针对Twort orf142 intron2,请见图7。其中Circ2.10、Circ2.11、Circ2.44、Circ2.45、Circ2.46、Circ2.47、Circ2.48、Circ2.49、Circ2.50、Circ2.51、Circ2.52、Circ2.53、Circ2.54、Circ2.55、Circ2.56、Circ2.57在环化后出现明显条带分布改变,在500nt左右出现明亮条带,而Circ2.47、Circ2.54未见到明显条带,未能得到合适的环化产物,属于PIE在体外RNA环化不理想的情况。其中,内含子Circ2.53属于SEQ ID NO.2中一部分,并非组成完整的SEQ ID NO.2,而其环化效率依然高达93.68%。
实施例4:基于新型内含子的circRNA蛋白表达验证
为确保本发明所涉及的内含子序列制备的circRNA能够具有蛋白表达的能力,在上述实施例2-3的基础上,采用与上述实施例2-3相同的内含子切割位点、外显子元件、5’同源臂序列及3’同源臂序列并添加额外的5’间隔区序列和3’间隔区序列,以CVB3 IRES为翻译启动元件,构建编码绿色荧光蛋白(EGFP)的环状mRNA,并委托苏州金唯智生物科技有限公司完成进行质粒合成。
一、质粒线性化、线性circRNA前体制备、模板消化及纯化同上述实施例1所述,环状RNAIVT、RNase R消化、纯化及凝胶电泳同上述实施例2-3所述。
1)线性化模板浓度为:Circ2.5-GFP:384.94ng/μL;Circ2.11-GFP:399.16ng/μL;Circ2.19-GFP:441.28ng/μL。
2)circRNA一步法制备及纯化后浓度:Circ2.5-GFP:5100.5ng/μL;Circ2.11-GFP:4106.7ng/μL;Circ2.19-GFP:7266.4ng/μL。
3)RNase R消化及纯化后浓度:Circ2.5-GFP:600.6ng/μL;Circ2.11-GFP:664.4ng/μL;Circ2.19-GFP:342.5ng/μL。
二、细胞培养与mRNA转染如下所述:
1)细胞培养
293T细胞于37℃,5% CO2条件下进行培养,培养基为含有10%胎牛血清及1%双抗的DMEM高糖培养基,细胞每2-3天进行传代。
2)细胞转染
①转染前12小时将293T细胞按照5*106个/孔接种于12孔板中,并补足DMEM完全培养基至1mL。转染开始时,移除12孔板培养基,并向每个孔加入0.85mL对应的新鲜培养基。
②准备A,B两套各1.5mL离心管,分别标记为对应circRNA编号,向每个离心管中加入75μL OMEM培养基。
③向A套管每管加入1.5μg对应circRNA样品,向B管管分别每管加入3μLLipofectamine MessengerMax(Invitrogen)试剂,随后于室温条件下孵育10min。
④将管B液体加入对应管A中,充分混匀后室温静置5min。
⑤将管A内的混合液分别加入12孔板对应的孔中,轻柔混匀后将细胞放回培养箱中。
3)荧光显微镜拍照
在转染结束后2小时和6小时,分别使用荧光显微镜进行拍照。
4)流式细胞检测
在完成转染及荧光拍照后,每3天更换一次新鲜的DMEM完全培养基,并在14天时将293T细胞转移到流式管中准备进行检测。
流式细胞仪检测参数如下表所述:
/>
4.2实验结果
RNase R处理后的circRNA-GFP凝胶电泳图如图8和下表6所示,从图8中可以看出,其中针对SEQ ID NO.2(Twort orf142 intron2)中的Circ2.11-GFP的纯度最高,达92.62%,稍差的Circ2.48-GFP和Circ2.10-GFP,R+纯度也达72%以上,而其他内含子都达80%以上。通常认为随着插入序列的变长,最终circRNA的产率和纯度会降低。表6中可以看出,即使将CDS更换为更长的IRES+GFP的序列,R+纯度,特别是Circ2.11-GFP、Circ2.45-GFP也能够保持非常高的纯度。
表6:
Sample | Intron | R+纯度 |
Circ2.10-GFP | orf142 intron2 | 76.03% |
Circ2.11-GFP | orf142 intron2 | 92.62% |
Circ2.44-GFP | orf142 intron2 | 88.84% |
Circ2.45-GFP | orf142 intron2 | 91.41% |
Circ2.46-GFP | orf142 intron2 | 83.16% |
Circ2.48-GFP | orf142 intron2 | 72.70% |
Circ2.49-GFP | orf142 intron2 | 80.95% |
Circ2.5-GFP | orf142 intron1 | 89.44% |
Circ2.19-GFP | orf142 intron1 | 86.45% |
Circ2.39-GFP | orf142 intron1 | 88.54% |
circRNA-GFP转染后的293T荧光图如图9所示,图中Circ2.10-GFP,Circ2.11-GFP,Circ2.44-GFP,Circ2.45-GFP,Circ2.46-GFP,Circ2.48-GFP,Circ2.49-GFP,Circ2.5-GFP,Circ2.19-GFP,Circ2.39-GFP转染组均可观测到显著GFP荧光,证明本发明所提供新型内含子制备的环状RNA在插入表达驱动元件后能够促使蛋白在细胞内表达,Circ2.27-GFP具备微弱荧光,其自身制备纯度较差,环化效率较低,说明GFP蛋白是由环状RNA而非线性中间产物表达。如图10所示,从左至右,依次是阴性对照(未转染RNA),阳性对照(转染Circ1.0-GFP,序列见表3),Circ2.5-GFP,Circ2.11-GFP,Circ2.19-GFP在circRNA转染14天后,与阴性对照组相比,仍能观测到转染组有显著的阳性率和GFP表达,证明本发明所涉及的新型内含子制备的circRNA在细胞内具有较好的稳定性和蛋白表达能力。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (13)
1.用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子的核酸分子,其序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示。
2.核酸分子SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2在体外制备环状RNA中的应用。
3.用于体外制备环状RNA的3’内含子和5’内含子,其特征在于,其截取于SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的同一序列,且无重叠区域。
4.根据权利要求3所述的3’内含子和5’内含子,其特征在于,所述3’内含子大于等于4碱基,5’内含子大于等于4碱基。
5.根据权利要求4所述的3’内含子和5’内含子,其特征在于,其组成选自以下中的至少一组:
SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4;
SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6;
SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8;
SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10;
SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12;
SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14;
SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18;
SEQ ID NO.19和SEQ ID NO.20;
SEQ ID NO.23和SEQ ID NO.24;
SEQ ID NO.25和SEQ ID NO.26;
SEQ ID NO.27和SEQ ID NO.28;
SEQ ID NO.29和SEQ ID NO.30。
6.根据权利要求4所述的3’内含子和5’内含子,其特征在于,其组成选自以下中的至少一组:SEQ ID NO.31和SEQ ID NO.32;
SEQ ID NO.33和SEQ ID NO.34;
SEQ ID NO.35和AAAU;
SEQ ID NO.36和SEQ ID NO.37;
SEQ ID NO.38和SEQ ID NO.39;
SEQ ID NO.42和SEQ ID NO.43;
SEQ ID NO.44和SEQ ID NO.45;
SEQ ID NO.46和SEQ ID NO.47;
SEQ ID NO.48和SEQ ID NO.49;
SEQ ID NO.50和SEQ ID NO.51;
SEQ ID NO.52和SEQ ID NO.53;
SEQ ID NO.56和SEQ ID NO.57;
SEQ ID NO.58和SEQ ID NO.59;
SEQ ID NO.60和SEQ ID NO.61。
7.权利要求3-6任一所述的3’内含子和5’内含子在体外制备环状RNA中的应用。
8.一种环状RNA的体外制备方法,其特征在于,包括下列步骤:
s1.质粒构建:将T7启动子,5’同源臂,3’内含子,第二外显子E2,第一外显子E1,5’内含子,3’同源臂,和酶切位点EcoRI的基因片段连接到表达载体上;所述3’内含子和5’内含子的组成来自于SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2序列中其一的同一序列,且无重叠区域;
s2.质粒线性化和纯化;
s3.体外转录和环化,纯化后得到环状RNA。
9.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,所述3’内含子和5’内含子如权利要求4-6任一项所述。
10.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,步骤s3包括以下:
s3.1.体外转录:纯化后的线性化质粒DNA为模板,在转录酶的催化下进行体外转录;然后去除多余未反应的线性化模板;
s3.2.进行第一步环化,并对环化的RNA进行柱纯化;
s3.3.进行第二步环化,并对环化的RNA进行柱纯化,得到环状RNA。
11.根据权利要求8所述的制备方法,其特征在于,步骤s3包括以下:
s3.1’:配制一步法反应体系,将一步法反应体系中的各成分混合均匀后,保持恒温使其发生环化;其中所述一步法反应体系中包括RNA聚合酶、RNase抑制剂、焦磷酸酶、环化反应缓冲液和碱基,无酶无菌水、线性化质粒;所述外源性RNA的环化反应缓冲液,包括Tris-HCL缓冲液,亚精胺、TCEP或DTT、Mg2+,pH为6.5~8.5,所述Mg2+的浓度为190mM~400mM,所述亚精胺的浓度为5mM~80mM;所述TCEP的浓度为5mM~35mM,所述DTT的浓度为180~220mM;
s3.2’:线性化模板去除;
s3.3’:RNA纯化和去除线性RNA;纯化后即得环状RNA。
12.根据权利要求8-11任一项所述制备方法得到的环状RNA。
13.根据权利要求12所述的环状RNA在制备mRNA疫苗中的应用。
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