CN111004813A - 一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用 - Google Patents

一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用，所述试剂盒包括待组装的DNA片段Fn和载体；所述载体包括中间载体和/或组装载体；所述试剂盒还包括λ噬菌体Red重组系统。本发明采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统同时转化入大肠杆菌进行体内组装，构建的试剂盒结合了体外组装和体内组装的优点，并采用λ噬菌体Red重组系统增强大肠杆菌的体内组装能力，加快了超大质粒合成速率，显著提高了超大质粒的合成成功率。

Description

一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用
技术领域
本发明属于合成生物学技术领域，涉及一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用。
背景技术
近年来合成生物学迅速发展，在生物医药、能源和新材料等领域得到广泛的应用。超大质粒可以用于合成基因组的结构单元，服务于基因编辑、蛋白表达和抗体表达等技术，有助于进行代谢通路、基因功能、蛋白质功能和免疫治疗等方面的研究。但是，超大质粒、尤其是40kb以上的质粒的合成存在诸多困难，科学家们虽然提出了多种方法用于超大质粒的合成，但是普遍存在效率低下的问题。这就需要在超大质粒的合成和拼装技术上进行改进和突破。
现阶段，体外大片段组装方法包括Gateway、In-fusion、Cold-fusion、T4DNApolymerase-based Ligase Independent Cloning(LIC)、Golden Gate和Gibson Assembly等。其中，Gateway技术需要构建入门载体，耗时较长，成本较高；Golden Gate技术依赖于II型限制性内切酶和连接酶，不适用于存在上述酶的序列的合成，需要提前分析片段序列再进行组装；而传统的Gibson组装技术在进行多片段组装时效率较低，尤其是对于片段较大的片段，组装成功率很低。
酵母体内组装方法受到酵母生长速度的限制，耗时较长；大肠杆菌生长速度快，但是对大片段DNA的组装能力弱，难以完成超大质粒的体内组装。
因此，需要提出新的高效的超大质粒组装方法。
发明内容
针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种超大质粒构建试剂盒、超大质粒构建方法及其应用，所述试剂盒通过增强大肠杆菌的体内组装能力，并将体外组装和大肠杆菌体内组装相结合，显著提高了超大质粒的合成效率和合成成功率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种超大质粒构建试剂盒，所述试剂盒包括待组装的DNA片段Fn和载体；
所述载体包括中间载体和/或组装载体；
所述DNA片段F1的上游和DNA片段Fn的下游包含中间载体的同源臂，所述DNA片段Fi的上游与DNA片段Fi-1的下游具有一段重叠的反向互补序列，所述DNA片段Fi的下游与DNA片段Fi+1的上游具有一段重叠的反向互补序列；
其中，n≥2且为偶数，1≤i≤n；
所述片段Fn为正向与反向互补相间的长引物；
所述试剂盒还包括λ噬菌体Red重组系统。
本发明中，所述试剂盒采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物与λ噬菌体Red重组系统同时转化入大肠杆菌进行体内组装，所述试剂盒采用λ噬菌体Red重组系统增强了大肠杆菌的体内组装能力，并与体外重组酶体系相结合，提高了超大质粒的合成效率和合成成功率。
本发明中，在进行超大质粒构建的过程中，首先采用一系列较短的DNA片段Fn构建初始片段，依赖不同的DNA片段Fn间的重叠的反向互补序列，采用PCR构建得到长度较大的组装片段，再依赖组装片段构建大片段DNA。
本发明中，组装载体为有利于构建大片段DNA的载体，例如可以是Yac0和/或Yac1。
优选地，所述DNA片段Fn的长度为55～70bp，例如可以是55bp、56bp、57bp、58bp、59bp、60bp、61bp、62bp、63bp、64bp、65bp、66bp、67bp、68bp、69bp或70bp，优选为57～65bp。
优选地，所述重叠的反向互补序列的长度为20～30bp，例如可以是20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp，优选为22～23bp。
优选地，所述中间载体包括PUC57-Amp。
优选地，所述试剂盒还包括限制性内切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶或重组酶中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述限制性内切酶包括EcoRV。
优选地，所述DNA外切酶包括T5DNA外切酶。
优选地，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶。
优选地，所述DNA连接酶包括T4DNA连接酶。
优选地，所述重组酶为T5DNA外切酶和高保真Taq酶混合酶。
优选地，所述试剂盒还包括阿拉伯糖、PCR缓冲液、dNTPs、重组缓冲液、酶切缓冲液或连接缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供了一种超大质粒的构建方法，所述方法采用如第一方面所述的试剂盒进行超大质粒构建。
优选地，所述方法包括以下步骤：
(1)利用PCR将待组装的DNA片段Fn进行拼接，得到拼接产物；
(2)将步骤(1)获得的平末端拼接产物与限制性内切酶酶切后线性化的平末端中间载体进行连接反应或重组反应；
(3)将步骤(2)获得的连接产物采用DNA片段F1和DNA片段Fn作为引物进行PCR扩增，得到用于构建超大质粒的初始片段；
(4)将步骤(3)获得的初始片段与线性化的组装载体进行体外组装；
(5)将步骤(4)获得的体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统同时导入大肠杆菌感受态细胞，进行体内组装。
本发明中，超大质粒的构建采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统同时转化入大肠杆菌进行体内组装，所述方法结合了体外组装和体内组装的优点，解决了单纯采用体外组装或体内组装构建超大质粒成功率低的问题，并采用λ噬菌体Red重组系统增强大肠杆菌的体内组装能力，解决了酵母菌生长缓慢、体内组装效率低的问题。
优选地，步骤(1)所述PCR的条件为96～98℃预变性2～5min；95～98℃变性10～20s，56～58℃退火10～20s，70～72℃延伸1～2min，31～39个循环；70～72℃延伸4～5min；0～4℃保存。
优选地，在步骤(1)后还包括对拼接产物再次进行PCR扩增的过程。
本发明中，如果上一轮PCR扩增的效果不理想，可以以上一轮PCR的产物为模板，以同样的方法进行下一轮PCR，直到扩增出理想的条带。
优选地，步骤(2)所述限制性内切酶包括EcoRV。
优选地，步骤(2)所述中间载体包括PUC57-Amp。
优选地，步骤(3)所述初始片段的上游和/或下游包含同源臂。
本发明中，在进行超大质粒构建的过程中，首先采用一系列较短的DNA片段Fn构建初始片段Ln(2≤n≤20)，其中，初始片段L1的上游和初始片段Ln的下游包含组装载体的同源臂，初始片段Li(2≤i≤n)的上游与初始片段Li-1的下游具有相同的重叠序列，初始片段Li的下游与初始片段Li+1的上游具有相同的重叠序列，再利用重组酶体系将具有相同的重叠序列的初始片段进行体外组装，形成更大的组装片段。
优选地，所述同源臂的长度为45～90bp，例如可以是45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp或90bp，优选为50～70bp。
优选地，所述重叠序列的长度为45～90bp，例如可以是45bp、50bp、55bp、60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp或90bp，优选为50～70bp。
优选地，步骤(3)所述初始片段的长度为1～3kb，例如可以是1kb、1.5kb、2kb、2.5kb或3kb，优选为1.5～2.5kb。
优选地，步骤(3)所述初始片段的数量为2～8个，例如可以是2个、3个、4个、5个、6个、7个或8个，优选为2～4个。
根据本发明中，步骤(4)所述体外组装采用体外多段重组酶系统进行，线性化组装载体和初始片段的浓度为150～500ng/μL，优选为250～300ng/μL，两种的摩尔比为1:1，体系包括5×pre-assembly buffer 38.5～41.5％，T5核酸外切酶0.088～0.112％，高保真Taq酶4.6～5.4％，ddH2O 51～58％，条件为在49.5～50.5℃下反应0.5～4h，优选为在50℃下反应1～1.5h。
优选地，步骤(5)所述导入的方法包括电转化法。
优选地，步骤(5)所述体内组装的条件为将导入有体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统的大肠杆菌进行阿拉伯糖诱导，随后接种于筛选标记平板上，过夜培养。
本发明中，向导入有体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统的大肠杆菌的培养环境中加入阿拉伯糖，诱导Red重组系统中Exo、Beta和Gam三种蛋白的表达，其中，Gam可以抑制大肠杆菌的RecBCD核酸外切酶的活性，使外源线性DNA不会被立即降解，Exo和Bet则引导线性片段与同源区发生重组置换，提高了大肠杆菌的体内重组效率。
优选地，在步骤(5)之后还包括对组装后的重组载体进行酶切，获得的酶切产物作为下一轮体外组装的组装片段的步骤。
本发明中，体内组装一轮后若是达不到目的质粒大小，可以进行下一轮组装直到获得需要的超大质粒。
优选地，所述方法还包括对大肠杆菌进行菌检和测序验证的步骤，得到超大质粒。
第三方面，本发明提供了一种超大质粒，所述超大质粒采用如第一方面所述的试剂盒制备得到。
优选地，所述超大质粒的长度为10～60kb，例如可以是10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、50kb、55kb或60kb。
第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的超大质粒在大型代谢通路和基因组研究中的应用。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统同时转化入大肠杆菌进行体内组装，构建的试剂盒结合了体外组装和体内组装的优点，解决了单纯采用体外组装或体内组装构建超大质粒成功率低的问题，并采用λ噬菌体Red重组系统增强大肠杆菌的体内组装能力，解决了酵母菌生长缓慢、体内组装效率低的问题；
(2)本发明在进行超大质粒构建的过程中，首先采用一系列较短的DNA片段Fn构建初始片段，依赖不同的DNA片段Fn间的重叠的反向互补序列，采用PCR构建得到长度较大的组装片段，再依赖不同的组装片段间的重叠序列，构建大片段DNA；
(3)本发明的方法成功率高，经过1～2轮重组后获得超大质粒，加快了超大质粒合成速率，降低了成本，节省了人力，使企业在合成生物学领域提高了核心竞争力。
附图说明
图1为超大质粒的构建流程示意图；
图2为初始片段电泳图；
图3为组装载体酶切后的线性化载体电泳图，其中，泳道1为DNA分子量，泳道2为线性化酶切产物，泳道3为未被酶切的对照组；
图4为体外组装和体内组装的原理图；
图5为大肠杆菌在选择标记平板上的菌落图；
图6为大肠杆菌菌检图；
图7为酶切验证图；
图8为测序比对验证图。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1超大质粒的体外组装
超大质粒的构建过程如图1所示，本实施例首先进行超大质粒的体外组装。
(1)大片段DNA的拆分
采用序列分析软件对32kb的大片段DNA进行分析，拆分为4个长度为8kb的片段，再继续将8kb的片段拆分为2kb的初始片段，相邻的初始片段之间设计同源臂(同源臂为初始片段最左端60bp序列和最右端60bp序列)，以便后续进行同源重组；
(2)初始片段的拆分
采用序列分析软件将初始片段拆分为待组装的DNA片段Fn，n＝30，Fn为正反向相隔的长引物序列，相邻片段含有一段20bp的重叠的反向互补序列。
(3)PCR合成初始片段
利用PCR将拆分的DNA片段合成为初始片段，PCR反应体系如表1所示，PCR条件如表2所示，将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳验证，对符合预期大小的初始片段进行回收和纯化；
表1合成初始片段的PCR体系
Figure BDA0002342057550000081
Figure BDA0002342057550000091
表2合成初始片段的PCR条件
Figure BDA0002342057550000092
(4)将获得的初始片段连接或重组到EcoRV酶切后平末端中间载体PUC57-Amp上，挑选单克隆菌检测序，将正确克隆采用首位DNA片段进行PCR扩增，得到制备的长度为2kb的初始片段，初始片段的电泳结果如图2所示；
(5)对组装载体进行酶切，体系如表3所示，结果如图3所示，其中，泳道1为DNA分子量，泳道2为线性化酶切产物，泳道3为未被酶切的对照组，对线性化酶切产物进行回收和纯化；
表3酶切体系
Figure BDA0002342057550000093
Figure BDA0002342057550000101
(6)利用体外重组酶系统进行超大质粒的体外组装，原理如图4所示，将10kb线性化组装载体和4条2kb初始片段的混合物加入等体积的重组酶系统(5×pre-assemblybuffer 40％，T5核酸外切酶0.1％，高保真Taq酶5％，ddH2O54.9％)中，混合均匀后置于PCR仪中在50℃下反应1h，组装体系如表4所示。
表4体外组装体系
成分 用量
线性化载体(10kb，100ng/μL) 5μL
4条初始片段(100ng/μL) 1μL/条
重组酶系统 10μL
实施例2线性化λ噬菌体Red重组系统的制备
对λ噬菌体Red重组系统(SEQ ID NO:1)进行酶切，体系如表5所示，对线性化酶切产物进行回收和纯化，得到线性化λ噬菌体Red重组系统。
SEQ ID NO:1：
aagaaaccaattgtccatattgcatcagacattgccgtcactgcgtcttttactggctcttctcgctaaccaaaccggtaaccccgcttattaaaagcattctgtaacaaagcgggaccaaagccatgacaaaaacgcgtaacaaaagtgtctataatcacggcagaaaagtccacattgattatttgcacggcgtcacactttgctatgccatagcatttttatccataagattagcggatcctacctgacgctttttatcgcaactctctactgtttctccatacccgtttttttgggaattcgagctctaaggaggttataaaaaatggatattaatactgaaactgagatcaagcaaaagcattcactaaccccctttcctgttttcctaatcagcccggcatttcgcgggcgatattttcacagctatttcaggagttcagccatgaacgcttattacattcaggatcgtcttgaggctcagagctgggcgcgtcactaccagcagctcgcccgtgaagagaaagaggcagaactggcagacgacatggaaaaaggcctgccccagcacctgtttgaatcgctatgcatcgatcatttgcaacgccacggggccagcaaaaaatccattacccgtgcgtttgatgacgatgttgagtttcaggagcgcatggcagaacacatccggtacatggttgaaaccattgctcaccaccaggttgatattgattcagaggtataaaacgaatgagtactgcactcgcaacgctggctgggaagctggctgaacgtgtcggcatggattctgtcgacccacaggaactgatcaccactcttcgccagacggcatttaaaggtgatgccagcgatgcgcagttcatcgcattactgatcgttgccaaccagtacggccttaatccgtggacgaaagaaatttacgcctttcctgataagcagaatggcatcgttccggtggtgggcgttgatggctggtcccgcatcatcaatgaaaaccagcagtttgatggcatggactttgagcaggacaatgaatcctgtacatgccggatttaccgcaaggaccgtaatcatccgatctgcgttaccgaatggatggatgaatgccgccgcgaaccattcaaaactcgcgaaggcagagaaatcacggggccgtggcagtcgcatcccaaacggatgttacgtcataaagccatgattcagtgtgcccgtctggccttcggatttgctggtatctatgacaaggatgaagccgagcgcattgtcgaaaatactgcatacactgcagaacgtcagccggaacgcgacatcactccggttaacgatgaaaccatgcaggagattaacactctgctgatcgccctggataaaacatgggatgacgacttattgccgctctgttcccagatatttcgccgcgacattcgtgcatcgtcagaactgacacaggccgaagcagtaaaagctcttggattcctgaaacagaaagccgcagagcagaaggtggcagcatgacaccggacattatcctgcagcgtaccgggatcgatgtgagagctgtcgaacagggggatgatgcgtggcacaaattacggctcggcgtcatcaccgcttcagaagttcacaacgtgatagcaaaaccccgctccggaaagaagtggcctgacatgaaaatgtcctacttccacaccctgcttgctgaggtttgcaccggtgtggctccggaagttaacgctaaagcactggcctggggaaaacagtacgagaacgacgccagaaccctgtttgaattcacttccggcgtgaatgttactgaatccccgatcatctatcgcgacgaaagtatgcgtaccgcctgctctcccgatggtttatgcagtgacggcaacggccttgaactgaaatgcccgtttacctcccgggatttcatgaagttccggctcggtggtttcgaggccataaagtcagcttacatggcccaggtgcagtacagcatgtgggtgacgcgaaaaaatgcctggtactttgccaactatgacccgcgtatgaagcgtgaaggcctgcattatgtcgtgattgagcgggatgaaaagtacatggcgagttttgacgagatcgtgccggagttcatcgaaaaaatggacgaggcactggctgaaattggttttgtatttggggagcaatggcgatgacgcatcctcacgataatatccgggtaggcgcaatcactttcgtctactccgttacaaagcgaggctgggtatttcccggcctttctgttatccgaaatccactgaaagcacagcggctggctgaggagataaataataaacgaggggctgtatgcacaaagcatcttctgttgagttaagaacgagtatcgatatggcacatagccttgctcaaattggaatcaggtttgtgccaataccagtag。
表5酶切体系
组分 用量
SEQ ID NO:1 5μg
缓冲液10×FD Buffer 5μL
酶HindIII 5μL
ddH<sub>2</sub>O 补齐至30μL
实施例3大肠杆菌电转感受态细胞的制备
(1)挑取新鲜的EPI300菌落接种到4mL LB培养基中，在通风良好的情况下37℃培养过夜；
(2)稀释1mL过夜培养的细胞到300mL LB培养基中，在通风良好的情况下37℃培养2-3h，至OD600为0.5；
(3)3,500rpm离心10min收集细胞；
(4)采用冰冷的无菌冲洗缓冲液洗涤细胞2遍，3,500rpm离心10min；
(5)细胞悬液于3,500rpm离心10min，离心结束后立即倒出上清液；
(6)采用含有10％超纯甘油和90％超纯双蒸水的溶液洗涤细胞2遍，4,000rpm离心10min；
(7)将细胞重悬于冲洗缓冲液中(大约2mL)，分装，-80℃冻存。
实施例4超大质粒的体内组装
将实施例1获得的体外组装产物过柱纯化，与线性化λ噬菌体Red重组系统一同加入到大肠杆菌电转感受态细胞中，混合均匀，设置电转化程序，将纯化后的体外组装产物和线性化λ噬菌体Red重组系统的混合物经BioRad GenePulser cuvette(电极间距为0.2cm)电穿孔电转入大肠杆菌感受态细胞中，电击时长为4ms；
电穿孔后，将大肠杆菌细胞接种于LB培养基中，37℃下悬浮培养1h；
收集细胞接种于筛选标记平板上，37℃过夜培养，菌落图如图5所示；
用灭菌牙签挑取单菌落于500μL LB筛选培养基中，37℃培养2h，当菌液边混浊至不透明时，取2μL菌液进行PCR菌检，菌检体系如表6所示，条件如表7所示，结果如图6所示，挑取的8个菌落均为阳性克隆；
表6菌检体系
组分 终浓度
1×PCR缓冲液(含Mg<sup>2+</sup>) 1×
上游引物 1.0pmol/μL
下游引物 1.0pmol/μL
菌沉淀或高浓度菌液 200ng/μL
dNTPs 1.0mM
PCR酶 0.2U/μL
去离子水 补齐至25μL
表7菌检条件
Figure BDA0002342057550000131
Figure BDA0002342057550000141
对菌检正确的克隆在37℃摇床扩大培养后提取质粒，将质粒用Pac1酶切验证正确后送样测序。
图7为酶切验证图，其中，第一泳道为未被酶切的超大质粒，第二泳道为被酶切的超大质粒，第三泳道为DNA分子量，图8为测序比对验证图，说明构建的超大质粒正确。
综上所述，本发明采用体外组装和体内组装相结合的方式，首先采用重组酶体系将大片段DNA与组装载体在体外进行组装，再将体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统同时转化入大肠杆菌进行体内组装，构建的试剂盒结合了体外组装和体内组装的优点，解决了单纯采用体外组装或体内组装构建超大质粒成功率低的问题，并采用λ噬菌体Red重组系统增强大肠杆菌的体内组装能力，解决了酵母菌生长缓慢、体内组装效率低的问题，经过1～2轮重组后便可获得超大质粒，加快了超大质粒合成速率，降低了成本，节省了人力。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种超大质粒构建试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括待组装的DNA片段Fn和载体；
所述载体包括中间载体和/或组装载体；
所述DNA片段F1的上游和DNA片段Fn的下游包含中间载体的同源臂；
所述DNA片段Fi的上游与DNA片段Fi-1的下游具有一段重叠的反向互补序列，所述DNA片段Fi的下游与DNA片段Fi+1的上游具有一段重叠的反向互补序列；
其中，n≥2且为偶数，1≤i≤n；
所述片段Fn为正向与反向互补相间的长引物；
所述试剂盒还包括λ噬菌体Red重组系统。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA片段Fn的长度为55～70bp，优选为57～65bp；
优选地，所述重叠的反向互补序列的长度为20～30bp，优选为22～23bp；
优选地，所述中间载体包括PUC57-Amp。
3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括限制性内切酶、DNA外切酶、DNA聚合酶、DNA连接酶或重组酶中的任意一种或至少两种的组合；
优选地，所述限制性内切酶包括EcoRV；
优选地，所述DNA外切酶包括T5 DNA外切酶；
优选地，所述DNA聚合酶包括Taq DNA聚合酶；
优选地，所述DNA连接酶包括T4 DNA连接酶；
优选地，所述重组酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq酶。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阿拉伯糖、PCR缓冲液、dNTPs、重组缓冲液、酶切缓冲液或连接缓冲液中的任意一种或至少两种的组合。
5.一种超大质粒的构建方法，其特征在于，所述方法采用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒进行超大质粒构建。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)利用PCR将待组装的DNA片段Fn进行拼接，得到拼接产物；
(2)将步骤(1)获得的平末端拼接产物与限制性酶切线性化的平末端中间载体进行重组或连接反应；
(3)将步骤(2)获得的连接产物采用DNA片段F1和DNA片段Fn作为引物进行PCR扩增，得到用于构建超大质粒的初始片段；
(4)将步骤(3)获得的初始片段与线性化的组装载体进行体外组装；
(5)将步骤(4)获得的体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统同时导入大肠杆菌感受态细胞，进行体内组装。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述PCR的条件为96～98℃预变性2～5min；95～98℃变性10～20s，56～58℃退火10～20s，70～72℃延伸1～2min，31～39个循环；70～72℃延伸4～5min；0～4℃保存；
优选地，在步骤(1)后还包括对拼接产物再次进行PCR扩增的过程；
优选地，步骤(2)所述限制性内切酶包括EcoRV；
优选地，步骤(2)所述中间载体包括PUC57-Amp；
优选地，步骤(3)所述初始片段的上游和/或下游包含同源臂；
优选地，所述同源臂的长度为45～90bp，优选为50～70bp；
优选地，步骤(3)所述初始片段的长度为1～3kb，优选为1.5～2.5kb；
优选地，步骤(3)所述初始片段的数量为2～8个，优选为2～4个；
优选地，步骤(4)所述体外组装的条件为在49.5～50.5℃下反应0.5～4h；
优选地，步骤(5)所述导入的方法包括电转化法；
优选地，步骤(5)所述体内组装的条件为将导入有体外组装产物和λ噬菌体Red重组系统的大肠杆菌进行阿拉伯糖诱导，随后接种于筛选标记平板上，过夜培养；
优选地，在步骤(5)之后还包括对组装后的重组载体进行酶切，获得的酶切产物作为下一轮体外组装的组装片段的步骤。
8.根据权利要求5-7任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括对大肠杆菌进行菌检和测序验证的步骤，得到超大质粒。
9.一种超大质粒，其特征在于，所述超大质粒采用如权利要求1-4任一项所述的试剂盒制备得到；
优选地，所述超大质粒的长度为10～60kb。
10.一种如权利要求9所述的超大质粒在染色体、多基因代谢通路和基因组研究中的应用。
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