CN114250241A - 一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用。本申请经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和摸索，首次提出了一种一步法BsaI酶切连接组装试剂盒、组装方法，将BsaI限制性内切酶酶切与T4 DNA聚合酶连接合二为一，极大地减少了克隆构建的步骤，可适用于编码sgRNA等短片段的组装，并大幅度降低操作的流程和步骤。与其他组装或构建试剂盒相比，本发明的组装效率高，可用于不同长度和多片段的连接组装，适用于多模块的组装构建。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用。
背景技术
随着本领域中Crispr技术的深入研究和合成生物学的广泛应用，ⅡS型限制性内切酶在向导RNA的表达系统构建、多模块化克隆构建中的应用显著增加。克隆构建的工作流程主要包括：目标片段的扩增或合成及纯化，目标载体和片段的连接。
常见的Ⅱ型限制性内切酶，酶切位点和识别位点在同一位置，使得其在用于克隆构建时，悬垂的4个碱基是固定的，对序列有限制性，且不能用于多片段的连接构建。Gibson连接法补充了常规酶切连接的一些不足，然而，这种方法需要较长的同源片段，这对于本身序列较短的sgRNA等，构建的适用性较差。此外，Gibson方法在连接中，片段与载体的比例约为2：1或者3:1，而在250bp及以下的片段构建中，片段与载体的比例需要增加到5:1或者10:1才能完成低效率连接。同时，因其需要进行酶切、补长、修复的步骤，在连接中容易出现碱基错误的问题，在连接的准确性方面不如酶切连接的方法。
片段组装和克隆构建是基础的序列构建技术，无论是生物合成，蛋白表达，基因功能研究，还是在基因编辑中，都需要应用此技术。ⅡS型限制性内切酶因为识别位点与酶切位点之间间隔1-2个碱基，使得其酶切得到的悬垂碱基随机而不固定，从而不受限于固定酶切位点。其构建的基础原理是酶切连接，在连接的准确率方面有保障。与同源重组片段组装方法相比，其不需要较长的同源序列，使其在sgRNA等短片段的构建中有较大的优势。
同时，常规的酶切连接构建操作，需要先对载体进行酶切、电泳、切胶回收，然后同样地对片段进行扩增或合成后酶切，纯化后再用于连接反应。而载体的酶切、电泳，切胶回收步骤，最少需要1天的时间，时间和人力成本较高。为了提升酶切连接克隆构建的适应性，降低克隆构建的时间和人力成本，急需开发基于ⅡS型限制性内切酶的新的效率高，准确度高，适应性广的克隆构建方法。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用，其整合了酶切和连接体系，可以简化和克隆构建的步骤，节省时间和人力成本，能够解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明是这样实现的，一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，包括：将未经酶切处理的目标片段、载体与Bsa I Assembly Enzyme Mix混合，补水至连接体系总量，按照连接程序进行连接；
所述Bsa I Assembly Enzyme Mix成分包括：2X T4 ligase buffer，100U/μL-500U/μL T4 DNA ligase，200U/mL-2000U/mL BsaI，0.1-0.2mg/mL BSA。
本发明提供了以ⅡS型限制性内切酶BsaI和DNA连接酶T4 Ligase为基础的片段组装方法，以克服现有片段组装技术所存在的缺陷与不足。
进一步地，所述目标片段为单片段或多片段。
进一步地，所述目标片段的长度为20-5K bp。
进一步地，所述多片段为2-4个片段。
进一步地，连接体系中每个目标片段与载体的用量比为2：1。
进一步地，连接体系包括每个目标片段0.1pmol，载体0.05poml，Bsa I AssemblyEnzyme Mix 5μL，体系总量10μL。
进一步地，目标片段为单片段时，连接程序为37℃连接10min，60℃灭活5分钟。
进一步地，目标片段为多片段时，连接程序为37℃连接1min，16℃连接1min为一个循环，重复60个循环，60℃灭活5分钟。
本发明还提供了一种一步法BsaI酶切连接片段组装试剂盒，所述试剂盒包括：T4ligase buffer，T4 DNA ligase，BsaI和BSA。
本发明还提供了如上述的组装方法或试剂盒在一步法BsaI酶切连接片段组装中的应用。
本申请经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和摸索，首次提出了一种一步法BsaI酶切连接组装试剂盒、组装方法，可适用于编码sgRNA等小于100bp内短片段的组装，并大幅度降低操作的流程和步骤。与其他组装或构建试剂盒相比，本发明的组装效率高，可用于不同长度和多片段的连接组装，适用于多模块的组装构建。
具体地，用本发明做片段组装和克隆构建，编码sgRNA短序列的构建中效率可达100％，在4个片段组装中的效率可达60％。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
(1)本发明的试剂盒将T4 DNA连接酶和ⅡS型限制性内切酶BsaI整合成为一步法反应，简化了片段组装和克隆构建的流程，优化了步骤，节省了时间和人力成本。
(2)本发明的试剂盒可以用于以编码sgRNA为例的短片段DNA(20bp左右)的片段组装和克隆构建。本方法与传统方法比较，节省了载体质粒的酶切和纯化步骤，简单快捷。
(3)本发明的方法能够避免同源重组可能存在的接头位置碱基错误的问题，保证了构建的准确度，并且可应用于多达4个片段的多片段组装和克隆构建，同时具有较高的成功率。
附图说明
图1是一步法BsaI酶切连接试剂盒原理模式图；
图2是一步法BsaI酶切连接体系用于编码sgRNA序列组装效率的结果图；
图3是一步法BsaI酶切连接体系用于不同长度单片段组装效率的结果图；
图4是一步法BsaI酶切连接体系用于不同个数片段的组装效率的结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中未特别限定温度时，则均为常温条件。常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明中涉及的基因、蛋白或其片段可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、植物)中产生。
ⅡS型限制性内切酶-BsaI：ⅡS型限制性内切酶是一类识别位点与酶切位点之间有间隔的二型内切酶，识别位点是非对称，也是非间断的，长度为4-7bp，切割位点可能在识别位点一侧的20bp范围内。以BsaI为例，其识别位点为5'-GGTCTC-3'，剪切位点与识别位点间隔1个碱基。在片段组装时，若载体上有相应正确方向的酶切识别位点，酶切后可产生4个相应的悬垂碱基；当DNA片段由退火得来时，需要在退火引物正义链和反义链加上相匹配的悬垂碱基，则可使用DNA连接酶对片段进行连接；当片段由链式扩增法得来时，则需要在正义链和反义链引物的5'端添加相应的前酶切保护碱基，酶切识别序列，后保护碱基。对于BsaI，酶切识别序列为5'-GGTCTC-3'，后保护碱基长度为1bp。若载体上没有相应的酶切位点时，则可通过链式反应的方式对序列进行扩增，在正义链和反义链引物的5'同样需要添加相应的前酶切保护碱基，酶切识别位点，后保护碱基。
T4 DNA连接酶：DNA连接酶被称为“基因针线”，催化两条DNA双链上相邻的5'磷酸基和3'羟基之间形成磷酸二酯键，可用于连接双链DNA的粘性末端。
酶切连接一步法组装体系：酶切连接一步法组装体系省去了常规连接反应中，需要进行片段的酶切反应，然后分别对片段进行回收，繁多的流程。本系统对酶切连接一步法的缓冲液和酶量进行了优化，在此基础上，测试了不同场景中，本体系对片段组装的成功效率。
本发明中的技术原理模式图如图1所示，其中环状代表载体。连接原理是：选择合适的载体(拥有正确方向的BsaI识别位点)，或通过反向扩增的方法，获得线性化的目标质粒片段，同时引入悬垂碱基、间隔碱基、酶切识别位点及酶切保护碱基。载体在BsaI酶的作用下，分别在两端剪切出4个碱基的粘性末端。
插入片段也可通过扩增，引入悬垂碱基、间隔碱基、酶切识别位点及酶切保护碱基，同样地，在BsaI酶的作用下，剪切出悬垂碱基。如图1，片段A和B的正义、反义链的5’端，分别切出悬垂碱基，其中片段A的正义链5’端和目的质粒反义链5’端的悬垂碱基反向互补，片段A尾部的反义链5’端和片段B的正义链5’端反向互补，片段B尾部的反义链5’端和目的质粒正义链5’端悬垂碱基反向互补。最终，连接处在T4连接酶的作用下，按照碱基互补配对原则进行连接，最终形成一个按照设计顺序连接的新质粒。
本发明将BsaI限制性内切酶酶切与T4 DNA聚合酶连接合二为一，极大地减少了克隆构建的步骤。同时，本发明可以组装20bp左右的短片段，不同长度的单片段，多片段，还保有了较高的构建成功率。下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例1酶切连接一步法用于编码sgRNA序列组装
针对编码不同物种靶标的sgRNA的序列，使用一步法酶切连接系统，将片段组装至模式质粒上，通过菌落PCR和测序，探索连接的成功机率。具体的实验流程如下。
1、根据网站设计小鼠Wnt1靶向序列3对，参考文献中靶向植物gRT，OsU6aT，OsU3T位点的3对，序列信息如表1所示：
表1.不同靶标的sgRNA编码序列的引物
2、按照表2配置退火体系。
表2.退火反应体系
按照表3进行退火反应。
表3.退火反应程序
反应完成后，样本放置4℃冰箱保存备用。
3、按照表4配置模式载体与片段的连接体系。
表4.模式载体与片段的连接体系
Bsa I Assembly Enzyme Mix成分包括：2X T4 ligase buffer，400U/μLT4 DNAligase，2000U/mL BsaI，0.1mg/mL BSA。
按照表5设置模式载体与片段的连接程序
表5.模式载体与片段的连接程序
4、连接产物的转化、涂板及挑克隆
从-80℃取出感受态细胞ER2566(100μL)，保证感受态细胞大部分位于底部。
取2μL连接产物，置于感受态细胞中，用手指点管底10次，达到轻柔混匀的目的。然后，在冰上静置25分钟。
42℃热激45s，立即在冰上静置3分钟。
加入800μL不含抗生素的LB培养基，在摇床中37℃，200rpm培养60分钟。
5000rpm离心1min收集菌体，弃700μL培养基。
在相应抗性的培养板底部，用黑色马克笔标记样品的信息或编号。
用量程200μL的移液器，调体积至100μL，将吸头置于液面以下，轻柔吹打，旋起菌体，并吹打均匀，期间尽量不要让枪头吸入液面外空气，而引入气泡。吸取100μL菌液，均匀滴在卡那霉素抗性的培养板上。
将培养皿盖子平放在超净台上，用力将枪头压弯，小心把菌液均匀涂布在板上，精致2-5分钟，待平板表面没有明显的流动液体，倒置放在37℃培养箱中孵育过夜。
将平板置于黑色背景上，观察菌落数目，大小是否均匀，拍摄照片。
准备联排管若干，加入100μL的ddWater，小心挑取单克隆，置于管中，作为模板，备用。
5、连接克隆的菌落PCR和琼脂糖凝胶验证
表6.正向引物
| 引物名称 | 引物序列 | 载体 |
| SP6-1 | AGTGTGTATCGCTCGAGG | pGGA |
将以上准备的克隆作为模板，正向引物为表6中引物，反向引物为表1中相应的反向引物，按照实施例2中的表8和表9进行扩增，扩增结果进行琼脂糖结果验证，判断其连接成功的机率。
实验结果：本实施例中以小鼠Wnt1为靶标设计3对靶向序列，参考文献中植物Crispr序列，选取3对，根据测试目的质粒的悬垂序列，分别在正义链和反义链加上悬垂碱基，采用退火的方式获得连接片段。加入载体0.05poml，片段0.1pmol，37℃连接10min，60℃灭活5分钟。取2-5μL连接液，转化至ER2566感受态细胞中，培养，活化，涂板后，在相应抗性的琼脂板中培养过夜，每个反应挑10个单克隆，使用目标载体的通用引物作为正向引物，使用片段的反向引物作为反向引物，将挑取的单克隆作为模板，进行菌落PCR。琼脂糖凝胶验证是否扩增成功。
结果如图2所示，从图2可以看出，使用一步法BsaI酶切连接的片段组装的试剂盒组装编码sgRNA序列时，在靶向小鼠Wnt1的3个sg序列，和植物蛋白靶标的3个sg序列中，挑取10个单克隆，进行菌落PCR鉴定，结果显示连接效率都为100％，可以高效地完成短片段的组装。
实施例2酶切连接一步法用于不同长度单片段组装
针对编码不同长度的插入片段，使用一步法酶切连接系统，将片段组装至约模式质粒上，通过菌落PCR和测序，探索连接的成功机率。具体的实验流程如下。
1、设计不同长度的插入片段，序列信息如表7所示。
表7.不同长度片段扩增的引物序列
2、按照表8配置扩增体系。
表8.扩增体系
按照表格9设置模式载体的扩增程序。
表格9.扩增程序
3、扩增片段的纯化
准备磁力架，平衡试剂盒至室温，震荡混匀磁珠悬浮液，配70％乙醇溶液。
混匀PCR产物与磁珠悬浮液，吹吸约10次至颜色均一。室温孵育2min(使DNA与磁珠充分结合)重复一次。
将管子与磁力架上静置2min，将枪头朝向与磁珠相对的管壁，缓慢移向管底，小心吸出清液丢弃(枪头勿碰磁珠)。
吸200ul70％乙醇加入，静置1min(与磁力架上)吸出并弃去乙醇，重复一次。
室温静置干燥2min(蒸发残留乙醇)，不可超过3min。
从磁力架上取下管子，加入30ul水，室温静置30s至1min，吹吸15次(混匀)重复一次。
将管子放置磁力架上，静置1min，将上清液移到干净的管中，得到纯化产物。
4、按照表10配置模式载体与片段的连接体系。
表10单片段的连接体系
按照实施例1中的相关操作进行连接、转化、涂板、挑克隆。
5、连接产物克隆的菌落PCR和琼脂糖凝胶验证。
表11正向引物
将上述制备的克隆作为模板，正向引物为表11中引物，反向引物为插入片段的表格7中的反向引物，按照表格8和表格9进行扩增，扩增结果进行琼脂糖凝胶验证，确定其连接成功的机率。
实验结果：本实施例中选取不同长度的片段，分别与不同的目的载体，进行连接，测试一步法BsaI酶切连接体系的效率。在250bp，2Kb的连接体系中，对片段进行扩增和纯化，与目的质粒PGGA进行连接。在1Kb的连接体系中，对目的载体进行反向扩增和纯化，对片段进行扩增和纯化，然后使用一步法BsaI酶切连接体系进行连接。加入载体0.05poml，片段0.1pmol，37℃连接10min，60℃灭活5分钟。取2-5μL连接液，转化至ER2566感受态细胞中，培养，活化，涂板后，在相应抗性的琼脂板中培养过夜，每个反应挑10个单克隆，使用目标载体的通用引物作为正向引物，使用片段的反向引物作为反向引物，将挑取的单克隆作为模板，进行菌落PCR。琼脂糖凝胶验证是否扩增成功。
结果如图3所示。从图3可以看出，使用一步法BsaI酶切连接的片段组装的试剂盒组装250bp、1Kb、2Kb单片段时，连接效率在80％以上，可以高效地完成片段的连接，最长测试片段为2K，连接效率可达80％。
实施例3酶切连接一步法用于不同数目片段组装
针对编码不同长度的插入片段，使用一步法酶切连接系统，将片段组装至约模式质粒上，通过菌落PCR和测序，检测连接的成功机率。具体的实验流程如下。
1、设计不同长度的插入片段，序列信息如表12所示。
表12 2或4片段连接的片段引物信息
2、按照表格9中的程序，进行扩增，按照实施例2中的操作对片段进行纯化。
3、按照表13配置模式载体与片段的连接体系。
表13.多片段的连接体系
按照表14设置模式载体与片段的连接程序。
表14.多片段的连接程序
4、按照实施例1中的操作进行连接产物的转化，涂板，挑克隆
5、连接产物克隆的菌落PCR和琼脂糖凝胶验证
将以上准备的克隆作为模板，进行验证。其中2个片段的连接顺序为2-1及2-2，故检测引物的正向引物为表11中引物SP6，反向引物为表12中的bsaI-lam-2-2-pgga_rev，按照表格8和表格9进行扩增，扩增结果进行琼脂糖凝胶验证，确定其连接成功的机率。其中4个片段的连接顺序为4-1,4-2,4-3及4-4，故检测引物为正向引物为表11中引物SP6，反向引物为表12中的Bsa-lam-4-4-pgga_rev，按照表格8和表格9进行扩增，扩增结果进行琼脂糖凝胶验证，确定其连接成功的机率。
实验结果：本实施例中分别设计2个和4个片段的引物，进行扩增，纯化，然后与目的质粒PGGA进行连接。加入载体0.05poml，每个片段0.1pmol，37℃连接1min，16℃连接1min为一个循环，重复60个循环，60℃灭活5分钟。取2-5μL连接液，转化至ER2566感受态细胞中，培养，活化，涂板后，在相应抗性的琼脂板中培养过夜，每个反应挑10个单克隆，使用目标载体的通用引物作为正向引物，使用片段的反向引物作为反向引物，将挑取的单克隆作为模板，进行菌落PCR。琼脂糖凝胶验证是否扩增成功。
如图4所示。从图4可以看出，使用一步法BsaI酶切连接的片段组装的试剂盒组装2或4个片段时，连接成功的效率在60％以上。最长测试片段为4个，连接成功效率为60％。
本发明各实施例的实验结果表明：一步法BsaI酶切连接的片段组装的试剂盒能够完成从25bp-2K的单片段连接，当应用至编码sg序列的连接时，连接效率为100％。单片段组装中，连接片段的长度最高为2K，连接效率为80％。在多片段的连接中，可成功连接4个片段，成功率可维持在60％以上。可见，一步法BsaI酶切连接的片段组装的试剂盒可解决目前克隆构建领域短片段不易连接的问题，补充了产品形式，尤其在20bp短片段连接和多片段组装方面，有较大的优势。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 上海英基生物科技有限公司
<120> 一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用
<160> 35
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaggcgttc ggttatgtaa ataaa 25
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggtttatt tacataaccg aacgc 25
<210> 3
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggagttgcgg ttcctgatgt attt 24
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atggaaatac atcaggaacc gcaac 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggagtgtgac ctctttgggt attat 25
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atggataata cccaaagagg tcaca 25
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ggaggtttta gagctagaaa t 21
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atggatttct agctctaaaa c 21
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggagcggcag ccaagccagc a 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atggtgctgg cttggctgcc g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggagctgagc ctcagcgcag 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
atggctgcgc tgaggctcag 20
<210> 13
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
agtgtgtatc gctcgagg 18
<210> 14
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ggctacggtc tcaggagata acttaatgtt tttatttaaa ataccc 46
<210> 15
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggctacggtc tcgatggggc agagtcataa agcac 35
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgaagttgcg gttcctgatg tattt 25
<210> 17
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
aagaaagaaa atacatcagg aaccgcaac 29
<210> 18
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggctacggtc tcgatggggc agagtcataa agcac 35
<210> 19
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ggctacggtc tcgatggggc agagtcataa agcac 35
<210> 20
<211> 63
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ggctacggtc tcctcttaaa gttaaacaaa attatttcta gaggggaatt gttatccgct 60
cac 63
<210> 21
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggctacggtc tccttcgttg cggccgcact cgagc 35
<210> 22
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
agtgtgtatc gctcgagg 18
<210> 23
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtggtggtgg tggtggtgct c 21
<210> 24
<211> 46
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
ggctacggtc tctggagata acttaatgtt tttatttaaa ataccc 46
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
ggctacggtc tccagtcata aagcacctca ttac 34
<210> 26
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
ggctacggtc tccgactctg ccactatctc ccgaaagaat cc 42
<210> 27
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
ggctacggtc tctatggggc tcaacgtggg ttttc 35
<210> 28
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
ggctacggtc tcgggagatt tatgaaaatt ttccggttta aggcg 45
<210> 29
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggctacggtc tccgccaccg cctcgcagaa cgggcattcc ctgttcc 47
<210> 30
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
ggctacggtc tcctggcaag ggtaatgagg tg 32
<210> 31
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
ggctacggtc tcaaagtaca gaatgcggtt tccaccactt c 41
<210> 32
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggctacggtc tcaactttcg tgctgtcgcg g 31
<210> 33
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
ggctacggtc tcagaacagt gagcgaagcc cggc 34
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
ggctacggtc tcagttcagg ccggagccac ag 32
<210> 35
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
ggctacggtc tccatgggca accagataag ggtgttgc 38
Claims (10)
1.一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于，包括：将未经酶切处理的目标片段、载体与Bsa I Assembly Enzyme Mix混合，补水至连接体系总量，按照连接程序进行连接；所述Bsa I Assembly Enzyme Mix成分包括：2X T4 ligase buffer，100U/μL-500U/μL T4 DNA ligase，200U/mL-2000U/mL BsaI，0.1mg/mL-0.2mg/mL BSA。
2.根据权利要求1所述的一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于：所述目标片段为单片段或多片段。
3.根据权利要求1所述的一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于：所述目标片段的长度为20-5K bp。
4.根据权利要求2所述的一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于：所述多片段为2-4个片段。
5.根据权利要求2所述的一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于：连接体系中每个目标片段与载体的用量比为2：1。
6.根据权利要求5所述的一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于：连接体系包括每个目标片段0.1pmol，载体0.05poml，Bsa I Assembly Enzyme Mix 5μL，体系总量10μL。
7.根据权利要求2所述的一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于：目标片段为单片段时，连接程序为37℃连接10min，60℃灭活5分钟。
8.根据权利要求2所述的一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法，其特征在于：目标片段为多片段时，连接程序为37℃连接1min，16℃连接1min为一个循环，重复60个循环，60℃灭活5分钟。
9.一种一步法BsaI酶切连接片段组装试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：T4ligase buffer，T4 DNA ligase，BsaI和BSA。
10.如权利要求1-8任一所述的组装方法或权利要求9所述的试剂盒在一步法BsaI酶切连接片段组装中的应用。
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Legal Events
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