CN108893486A - 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用 - Google Patents

一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用 Download PDF

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Abstract

一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用，其载体由以下方法构建：A、以碱基序列为SEQ ID NO：1所示的(5’‑3’)引物与碱基序列为SEQ ID NO：2所示的(5’‑3’)引物，通过超保真DNA聚合酶，对pBHT2载体质粒进行扩增，得到含TrpC‑Hyp基因的核苷酸片段；B、用Hind III限制性内切酶和Pst I限制性内切酶对pGKO2载体进行酶切，得到线性化的pGKO2载体；再将含TrpC‑Hyp基因的核苷酸片段与线性化的pGKO2载体连接，即得。该载体用于丝状真菌基因敲除，可减少同源重组载体构建的步骤，提高阳性转化子的筛选效率，有利于真菌基因的功能研究和开发。

Description

一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用
技术领域
本发明涉及一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用。
背景技术
基因敲除技术是基因功能验证的重要手段。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，通过同源片段替代靶标基因片段，从而达到基因敲除的目的。
基因敲除技术是上世纪80年代末发展起来的一种分子生物学技术。1985年，科学家首次证实了哺乳动物细胞中存在同源重组的现象，为基因敲除提供了理论基础。直至现在，通过同源重组实现对靶标基因的敲除，仍然是最普遍的基因敲除使用方法。基因敲除载体的构建是实现同源重组基因敲除的第一个关键步骤。
丝状真菌的基因敲除的载体的构建是将靶标基因同源的特异DNA片段以及用于替换靶标基因的筛选标记基因按照“上游同源臂-筛选标记基因-下游同源臂”的顺序组装到载体上，完成重组载体的构建，然后通过一定的方式(如电穿孔法或农杆菌介导的遗传转化法)将构建好的重组载体导入到靶标受体细胞中，使重组载体的外源基因与靶标细胞基因组中相应部分发生同源重组，即将重组载体中的筛选标记基因整合到内源基因组中，通过表达筛选标记，在具有相应抗生素的培养基上实现对重组成功的个体进行筛选，最终获得基因敲除丝状真菌突变体。
pGKO2是一个用于真菌基因敲除的载体，该载体携带有一个负向选择标记基因——单纯疱疹病毒胸腺苷激酶基因(HSVtK)，该基因产物可将2'-脱氧-5'-氟尿苷转变成对真菌有毒的化合物。在基因敲除的过程中，如果发生非同源整合，受体真菌基因组中就会插入HSVtK基因，在含有2'-脱氧-5'-氟尿苷的培养基上不能生存。因此，以pGKO2为载体构建的基因敲除重组载体，可以实现潮霉素基因(Hyp)的正向筛选以及HSVtK基因的负向筛选，可大大提高同源重组个体的筛选效率。因此，该载体被广泛用于真菌基因敲除研究工作中(Khang et al.,Fungal Genetics and Biology,42:483-492,2005)。
现有技术的丝状真菌基因敲除的重组载体的构建过程是：首先，上游同源臂片段与载体的连接，获得中间载体A；然后，筛选标记基因与中间载体A的连接，获得中间载体B；最后，下游同源臂片段与中间载体B连接，最终得到组装有“上游同源臂-筛选标记基因-下游同源臂”的重组载体。需要经过3次片段组装才能最终完成靶标基因重组载体的构建，重组载体的构建时间长，操作复杂，构建效率低。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可用于丝状真菌基因敲除的载体，该载体用于丝状真菌基因敲除，可减少同源重组载体构建的步骤，提高阳性转化子的筛选效率，有利于真菌基因的功能研究和开发。
本发明实现其第一目的所采用的技术方案是，一种可用于丝状真菌基因敲除的载体，由以下方法构建得到：
A、含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的制备
以碱基序列为SEQ ID NO：1所示的(5’-3’)引物与碱基序列为SEQ ID NO：2所示的(5’-3’)引物，通过超保真DNA聚合酶对pBHT2载体质粒进行扩增，得到长度为1457bp的碱基序列为SEQ ID NO：3所示的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段；
B、pGKO2-hyp载体的制备
用Hind III限制性内切酶和Pst I限制性内切酶对载体进行酶切，得到线性化的pGKO2载体；再通过一步法定向克隆技术将含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段与线性化的pGKO2载体连接，得到可用于丝状真菌基因敲除的载体，即pGKO2-hyp载体。
本发明的第二目的在于提供所述可用于丝状真菌基因敲除的载体在丝状真菌基因敲除中的应用，该应用的方法更简单、快速的进行丝状真菌基因的敲除，提高阳性转化子的筛选效率，有利于真菌基因的功能研究和开发。
本发明实现其第二目的所采用的技术方案是，一种所述的可用于丝状真菌基因敲除的载体在丝状真菌基因敲除中的应用，其应用方法是：
(1)在丝状真菌的靶标基因上游2000bp范围内取500-1500bp的片段作为上游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行上游同源臂扩增，得到上游同源臂片段；再将上游同源臂片段连接到所述的pGKO2-hyp载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的一侧，得到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体；
(2)在丝状真菌的靶标基因下游2000bp范围内取500-1500bp的片段作为下游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行下游同源臂扩增，得到下游同源臂片段；
对所述的pGKO2-up-hyp上游同源臂载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段另一侧进行线性化，再通过一步法定向克隆技术，将下游同源臂片段连接到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的另一侧，即得到“靶标基因上游同源臂-TrpC-Hyp-靶标基因下游同源臂”的基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down；
(3)将基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down导入到靶标受体细胞中，通过同源重组、表达筛选标记，即实现对丝状真菌的靶标基因的敲除。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的可用于丝状真菌基因敲除的载体pGKO2-hyp载体，在对丝状真菌的靶标基因进行敲除时；只需将上游同源臂片段连接到所述的pGKO2-hyp载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的一侧，得到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体；再将下游同源臂片段连接到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的的另一侧即可。也即本发明由现有技术的3次片段组装减为2次片段组装即可完成靶标基因重组载体的构建，其重组载体的构建时间短，操作简化，构建效率高；提高了阳性转化子的筛选效率，有利于真菌基因的功能研究和开发。
下面结合序列表和具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。
具体实施方式
实施例1
本发明的一种具体实施方式是，一种可用于丝状真菌基因敲除的载体，由以下方法构建得到：
A、含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的制备
以碱基序列为SEQ ID NO：1所示的(5’-3’)引物与碱基序列为SEQ ID NO：2所示的(5’-3’)引物，通过PhusionTM高保真DNA聚合酶对pBHT2载体质粒进行扩增，得到长度为1457bp的碱基序列为SEQ ID NO：3所示的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段；
其中，通过超保真DNA聚合酶对pBHT2载体质粒进行扩增的温度循环条件如下：98℃预变性30秒，98℃5秒、60℃30秒、72℃1分钟，35个循环；72℃5分钟；10℃保存。扩增结束后，利用1％的琼脂糖凝胶进行电泳检测，随后进行胶回收。
所述的pBHT2载体质粒为公开的已知载体质粒，详见Mullins ED,Chen X,RomaineP,et al.Agrobacterium-mediated transformation of Fusariumoxysporum:anefficient tool for insertional mutagenesis and gene transfer.Phytopathology,2000,91(2):173-180。
B、pGKO2-hyp载体的制备
用Hind III限制性内切酶和Pst I限制性内切酶对pGKO2载体进行酶切，得到线性化的pGKO2载体；再通过一步法定向克隆(ClonExpress)技术将含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段与线性化的pGKO2载体连接，得到可用于丝状真菌基因敲除的载体，即pGKO2-hyp载体。
其中，酶切的具体操作是：37℃条件下酶切3小时，随后在0.8％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，再进行胶回收。
所述的pGKO2载体为公开的已知载体，详见：Khang CH,Park SY,Lee YH,et al.Adual selection based,targeted gene replacement tool for Magnaporthe griseaand Fusarium oxysporum.Fungal Genetics and Biology,2005,42:483-492。
所述的Hind III限制性内切酶可以公开购得，如可购买北京百奥莱博科技有限公司生产的编号为SV0401的HindIII限制性内切酶产品；Pst I限制性内切酶也可以公开购得，如可购买福建华灿制药有限公司生产的品牌为FACAN的Pst I限制性内切酶。
本例的可用于丝状真菌基因敲除的载体在丝状真菌基因敲除中的应用，其具体作法是：
(1)在丝状真菌的靶标基因上游2000bp范围内取950bp的片段作为上游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行上游同源臂扩增，得到上游同源臂片段；再将上游同源臂片段连接到所述的pGKO2-hyp载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的一侧，得到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体；
(2)在丝状真菌的靶标基因下游2000bp范围内取1000bp的片段作为下游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行下游同源臂扩增，得到下游同源臂片段；
对所述的pGKO2-up-hyp上游同源臂载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段另一侧进行线性化，再通过一步法定向克隆(ClonExpress)技术，将下游同源臂片段连接到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的另一侧，即得到“靶标基因上游同源臂-TrpC-Hyp-靶标基因下游同源臂”的基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down；
(3)将基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down导入到靶标受体细胞中，通过同源重组、表达筛选标记，即实现对丝状真菌的靶标基因的敲除。
实施例2
本例的可用于丝状真菌基因敲除的载体，其构建方法与实施例1完全相同。
本例的可用于丝状真菌基因敲除的载体在丝状真菌基因敲除中的应用，其应用方法是：
(1)在丝状真菌的靶标基因上游2000bp范围内取840bp的片段作为上游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行上游同源臂扩增，得到上游同源臂片段；再将上游同源臂片段连接到所述的pGKO2-hyp载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的一侧，得到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体；
(2)在丝状真菌的靶标基因下游2000bp范围内取840bp的片段作为下游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行下游同源臂扩增，得到下游同源臂片段；
对所述的pGKO2-up-hyp上游同源臂载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段另一侧进行线性化，再通过一步法定向克隆技术，将下游同源臂片段连接到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的另一侧，即得到“靶标基因上游同源臂-TrpC-Hyp-靶标基因下游同源臂”的基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down；
(3)将基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down导入到靶标受体细胞中，通过同源重组、表达筛选标记，即实现对丝状真菌的靶标基因的敲除。
实施例3
本例的可用于丝状真菌基因敲除的载体，其构建方法与实施例1完全相同。
本例的可用于丝状真菌基因敲除的载体在丝状真菌基因敲除中的应用，其应用方法是：
(1)在丝状真菌的靶标基因上游2000bp范围内取500bp的片段作为上游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行上游同源臂扩增，得到上游同源臂片段；再将上游同源臂片段连接到所述的pGKO2-hyp载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的一侧，得到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体；
(2)在丝状真菌的靶标基因下游2000bp范围内取500bp的片段作为下游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行下游同源臂扩增，得到下游同源臂片段；
对所述的pGKO2-up-hyp上游同源臂载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段另一侧进行线性化，再通过一步法定向克隆技术，将下游同源臂片段连接到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的另一侧，即得到“靶标基因上游同源臂-TrpC-Hyp-靶标基因下游同源臂”的基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down；
(3)将基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down导入到靶标受体细胞中，通过同源重组、表达筛选标记，即实现对丝状真菌的靶标基因的敲除。
实施例4
本例的可用于丝状真菌基因敲除的载体，其构建方法与实施例1完全相同。
本例的可用于丝状真菌基因敲除的载体在丝状真菌基因敲除中的应用，其应用方法是：
(1)在丝状真菌的靶标基因上游2000bp范围内取1500bp的片段作为上游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行上游同源臂扩增，得到上游同源臂片段；再将上游同源臂片段连接到所述的pGKO2-hyp载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的一侧，得到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体；
(2)在丝状真菌的靶标基因下游2000bp范围内取1500bp的片段作为下游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行下游同源臂扩增，得到下游同源臂片段；
对所述的pGKO2-up-hyp上游同源臂载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段另一侧进行线性化，再通过一步法定向克隆技术，将下游同源臂片段连接到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的另一侧，即得到“靶标基因上游同源臂-TrpC-Hyp-靶标基因下游同源臂”的基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down；
(3)将基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down导入到靶标受体细胞中，通过同源重组、表达筛选标记，即实现对丝状真菌的靶标基因的敲除。
序列表
<110> 四川省农业科学院经济作物育种栽培研究所
<120> 一种可用于丝状真菌基因敲除的载体及应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgacggtat cgataagctt gcttgccaaa actggttccc g 41
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtggatcccc cgggctgcag tgggaactac tcacacatta tt 42
<210> 3
<211> 1457
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcttgccaaa actggttccc ggtcggcatc tactctattc ctttgccctc ggacgagtgc 60
tggggcgtcg gtttccacta tcggcgagta cttctacaca gccatcggtc cagacggccg 120
cgcttctgcg ggcgatttgt gtacgcccga cagtcccggc tccggatcgg acgattgcgt 180
cgcatcgacc ctgcgcccaa gctgcatcat cgaaattgcc gtcaaccaag ctctgataga 240
gttggtcaag accaatgcgg agcatatacg cccggaggcg cggcgatcct gcaagctccg 300
gatgcctccg ctcgaagtag cgcgtctgct gctccataca agccaaccac ggcctccaga 360
agaggatgtt ggcgacctcg tattgggaat ccccgaacat cgcctcgctc cagtcaatga 420
ccgctgttat gcggccattg tccgtcagga cattgttgga gccgaaatcc gcatgcacga 480
ggtgccggac ttcggggcag tcctcggccc aaagcatcag ctcatcgaga gcctgcgcga 540
cggacgcact gacggtgtcg tccatcacag tttgccagtg atacacatgg ggatcagcaa 600
tcgcgcatat gaaatcacgc catgtagtgt attgaccgat tccttgcggt ccgaatgggc 660
cgaacccgct cgtctggcta agatcggccg cagcgatcgc atccatggcc tccgcgaccg 720
gctggagaac agcgggcagt tcggtttcag gcaggtcttg caacgtgaca ccctgtgcac 780
ggcgggagat gcaataggtc aggctctcgc tgaactcccc aatgtcaagc acttccggaa 840
tcgggagcgc ggccgatgca aagtgccgat taacataacg atctttgtag aaaccatcgg 900
cgcagctatt tacccgcagg acatatccac gccctcctac atcgaagctg aaagcacgag 960
attcttcgcc ctccgagagc tgcatcaggt cggagacgct gtcgaacttt tcgatcagaa 1020
acttctcgac agacgtcgcg gtgagttcag gctttttcat ttggatgctt gggtagaata 1080
ggtaagtcag attgaatctg aaataaaggg aggaagggcg aacttaagaa ggtatgaccg 1140
ggtcgtccac ttaccttgct tgacaaacgc accaagttat cgtgcaccaa gcagcagatg 1200
ataataatgt cctcgttcct gtctgctaat aagagtcaca cttcgagcgc cgccgctact 1260
gctacaagtg gggctgatct gaccagttgc ctaaatgaac catcttgtca aacgacacaa 1320
attttgtgct caccgcctgg acgactaaac caaaataggc attcattgtt gacctccact 1380
agctccagcc aagcccaaaa aatgctcctt caatatcagt ttcgagtttc tccataataa 1440
tgtgtgagta gttccca 1457

Claims (2)

1.一种可用于丝状真菌基因敲除的载体，由以下方法构建得到：
A、含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的制备
以碱基序列为SEQ ID NO：1所示的(5’-3’)引物与碱基序列为SEQ ID NO：2所示的(5’-3’)引物，通过超保真DNA聚合酶对pBHT2载体质粒进行扩增，得到长度为1457bp的碱基序列为SEQ ID NO：3所示的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段；
B、pGKO2-hyp载体的制备
用Hind III限制性内切酶和Pst I限制性内切酶对载体进行酶切，得到线性化的pGKO2载体；再通过一步法定向克隆技术将含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段与线性化的pGKO2载体连接，得到可用于丝状真菌基因敲除的载体，即pGKO2-hyp载体。
2.一种权利要求1所述的可用于丝状真菌基因敲除的载体在丝状真菌基因敲除中的应用，其具体作法是：
(1)在丝状真菌的靶标基因上游2000bp范围内取500-1500bp的片段作为上游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行上游同源臂扩增，得到上游同源臂片段；再将上游同源臂片段连接到所述的pGKO2-hyp载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的一侧，得到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体；
(2)在丝状真菌的靶标基因下游2000bp范围内取500-1500bp的片段作为下游同源臂，以丝状真菌的总DNA为模板，通过超保真DNA聚合酶进行下游同源臂扩增，得到下游同源臂片段；
对所述的pGKO2-up-hyp上游同源臂载体中含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段另一侧进行线性化，再通过一步法定向克隆技术，将下游同源臂片段连接到pGKO2-up-hyp上游同源臂载体的含TrpC-Hyp基因的核苷酸片段的另一侧，即得到“靶标基因上游同源臂-TrpC-Hyp-靶标基因下游同源臂”的基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down；
(3)将基因敲除重组载体pGKO2-up-hyp-down导入到靶标受体细胞中，通过同源重组、表达筛选标记，即实现对丝状真菌的靶标基因的敲除。
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