CN111748540A - 一种用于合成生物学部件高效组装的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于合成生物学部件高效组装的试剂盒及其使用方法，涉及合成生物学领域。试剂盒包括缓冲液、ATP、ⅡS核酸内切酶和T4DNA连接酶。本发明还提供该试剂盒的使用方法，即利用缓冲液、ATP和超纯水构建缓冲体系；加入T4DNA连接酶和ⅡS核酸内切酶，形成酶切连接体系；加入待组装部件和目标空载体，添加超纯水调整反应体系的体积；在PCR仪上进行热循环；PCR产物直接用于大肠杆菌转化，在筛选平板上选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。本发明从反应缓冲体系、ⅡS核酸内切酶活力以及部件与空载体的加入比例三方面入手进行优化，大幅度降低了合成生物学复杂通路的构建难度和成本。
Description
技术领域
本发明涉及合成生物学领域，尤其涉及一种用于合成生物学部件高效组装的试剂盒及其使用方法。
背景技术
合成生物学是将现代工程学原理和方法应用到生物学形成的新研究领域，采用自下而上的方法构建人工生物体系，其目标是人造生命和高附加值产物的生物制造，已经在农作物改良、药物合成和个性化医疗等多个领域得到广泛应用。
元件是合成生物学的基本单位，是一段具有特定功能的DNA序列，常见元件有启动子元件、蛋白CDS元件和终止子元件等。这些元件可以组装形成表达单元，表达单元进一步组装形成通路，不同通路可以组装形成复杂的合成生物学系统。元件、表达单元、通路和系统统称为部件，分层模块化的部件设计和标准化的部件组装方法是合成生物学的两个基石。
先限制性酶切，分离目标序列后进一步连接的传统DNA重组方法操作复杂，过程冗长，难以实现标准化，组装后残留附加酶切位点等疤痕序列，难以适应合成生物学部件的高通量、并行和标准化组装要求。Gibson法可以高效实现任何序列的无痕组装，但难以实现标准化。基于ⅡS核酸内切酶的部件组装无需分离操作，通过一步反应实现部件定向组装，具有并行、高通量、标准化和无痕组装等众多优点，成为合成生物学部件装的主流方向，Golden Gate是其中最典型的代表。Golden Gate标准反应由一种ⅡS核酸内切酶(Fermentas BsmBI/NEB BsaI)和T4DNA连接酶共同催化，等质量的待连接部件和目标空载体(75ng)在10微升的反应体系中，通过37℃/16℃变温PCR循环，实现酶切连接反应，一步实现合成生物学部件的组装。由于Golden Gate组装部件的高通用性，促进了合成生物学部件的重复使用和实验室间合成生物学部件的交换，极大地推动了合成生物学的发展。
在采用Golden Gate方法进行部件组装时，我们发现该方法的组装效率有待提高，表现为连接产物转化大肠杆菌后，获得的抗性菌斑数量较少，其中含有目标连接部件重组载体的白色菌斑所占比例较低，显示反应体系中酶切效率不高。
因此，针对上述问题，本领域的技术人员致力于开发一种合成生物学部件高效组装的试剂盒及其操作方法。本发明从反应缓冲体系、ⅡS核酸内切酶活力以及部件与空载体的加入比例三方面入手进行优化，将合成生物学部件组装效率较现有技术提高了2倍以上，大幅度降低了合成生物学复杂通路的构建难度和成本。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的技术问题是开发一种高效的、低成本的合成生物学部件组装的试剂盒及其操作方法。
为实现上述目的，本发明提供了一种高效的用于合成生物学部件组装的试剂盒及其使用方法，将合成生物学部件组装效率较现有技术的组装效率提高了2倍以上，从而极大的降低了合成生物学部件组装的成本。
一方面，本发明提供一种合成生物学部件组装试剂盒，包括缓冲液、ATP、ⅡS核酸内切酶和T4DNA连接酶。
进一步地，缓冲液是10×FastDigest缓冲液。
进一步地，ⅡS核酸内切酶包括FastDigest系列ⅡS核酸内切酶Esp3I和Eco31I。
进一步地，试剂盒中包括两种FastDigest系列ⅡS核酸内切酶Esp3I和Eco31I，一管Promega T4DNA连接酶，一管10×FastDigest缓冲液和一管ATP。
另一方面，本发明还提供一种合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，方法包括以下步骤：
步骤(1)利用缓冲液、ATP和超纯水在PCR管中构建缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管加入T4DNA连接酶和ⅡS核酸内切酶，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入待组装部件和目标空载体，添加超纯水调整反应体系的体积；在PCR仪上进行热循环，得到PCR产物；
步骤(4)将步骤(3)获得的PCR产物直接用于大肠杆菌转化，在筛选平板上选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。
进一步地，步骤(1)中，缓冲液为10×FastDigest缓冲液；ATP母液的浓度为10～20mM。
进一步地，步骤(2)中，ⅡS核酸内切酶根据部件两侧的内切酶识别位点选择FastDigest系列ⅡS核酸内切酶Esp3I或Eco31I；FastDigest系列ⅡS核酸内切酶Esp3I或Eco31I的浓度为1～2U/μL。
进一步地，步骤(2)中，T4DNA连接酶的浓度为1～2U/μL。
进一步地，步骤(3)中，每个待组装部件摩尔浓度为20～80fmol，各待组装部件按照等摩尔比加入；目标空载体的摩尔浓度为10fmol～20fmol；各待组装部件和目标空载体的摩尔比在2～4之间；目标空载体和待组装部件载体的抗性不同。
进一步地，步骤(3)中，热循环的反应条件是：每个热循环分两个阶段，第一阶段，温度为37℃，反应时间为2～5分钟；之后进行第二阶段，温度为16℃，反应时间为5分钟；热循环的数量是20～30个。
优选地，步骤(3)中，热循环的反应条件是：第一阶段，温度为37℃，反应时间为2～4分钟；第二阶段，温度为16℃，反应时间为5分钟；热循环的数量是20～25个。
进一步地，步骤(1)中，缓冲液体积为1～2μL；ATP体积为1μL；步骤(2)中，T4DNA连接酶体积为1μL，ⅡS核酸内切酶的体积为1μL；其中T4DNA连接酶、ⅡS核酸内切酶和目标空载体也可以等比例降低加入量以降低成本；步骤(3)的反应体系的体积为10～20μL。
进一步地，步骤(4)取1μLPCR产物进行大肠杆菌转化，按照目标空载体抗体进行筛选。
在本发明的较佳实施方式实施例1中，采用本发明的试剂盒及其使用方法进行紫杉二烯5位羟基化酶(T5)CDS元件构建，对照例1采用Golden Gate标准化组装方案进行紫杉二烯5位羟基化酶(T5)CDS元件构建，实施例1的组装效率是对照例1组装效率的10.7倍。
在本发明的另一较佳实施方式实施例2中，采用本发明的试剂盒及其使用方法进行组装构建P2×35s：Cas9:T35s表达单元，对照例2采用Golden Gate标准化组装方案进行组装构建P2×35s：Cas9:T35s表达单元，实施例2的组装效率是对照例2组装效率的3.1倍。
在本发明的另一较佳实施方式实施例3中，采用本发明的试剂盒及其使用方法组装构建针对木糖转移酶启动子区域基因编辑Target RNA表达单元：PU6：guide_RNA:sg_RNA，对照例3采用Golden Gate标准化组装方案针对木糖转移酶启动子区域基因编辑的Target RNA表达单元：PU6：guide_RNA:sg_RNA，实施例3的组装效率是对照例3组装效率的44.8倍。
在本发明的另一较佳实施方式实施例4中，采用本发明的试剂盒及其使用方法组装实施例2、3中构建的CAS9表达单元和Target RNA表达单元，构建木糖转移酶启动子基因编辑通路，对照例4采用Golden Gate标准化组装方案,组装对照例2、3中构建的CAS9表达单元和Target RNA表达单元，构建木糖转移酶启动子基因编辑通路，实施例4的组装效率是对照例4组装效率的3.1倍。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
(1)本发明合成生物学部件组装方法的组装效率高达98％，比Golden Gate标准化组装效率高2～44倍；
(2)本发明方法的部件组装效率具有高度稳定性，重复性强，批次间波动在1％以内；
(3)由于本发明提供的合成生物学部件高效组装试剂盒及其方法的稳定高效特性，在实际应用中可以通过等比例降低酶、待组装部件、目标空载体的加入量，实现组装成本的大幅度下降。
以下将对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
具体实施方式
以下介绍本发明的多个优选实施例，使其技术内容更加清楚和便于理解。本发明可以通过许多不同形式的实施例来得以体现，本发明的保护范围并非仅限于文中提到的实施例。
实施例1
本实施例采用本发明提供的合成生物学部件组装试剂盒及其使用方法进行紫杉二烯5位羟基化酶(T5)CDS元件构建。
T5 CDS元件的设计和前期准备：
利用GOLDENBRAID网站针对蔓地亚红豆杉紫杉二烯5位羟基化酶编码区序列设计CDS元件，以蔓地亚红豆杉cDNA为模板，通过PCR获得构成CDS元件的两个片段，称为T5_1和T5_2，T5_1具体序列如SEQ ID NO：1所示，T5_2具体序列如SEQ ID NO：2所示。
T5 CDS元件构建：
步骤(1)利用1μL 10×FastDigest缓冲液、1μL ATP和适量超纯水在PCR管中构建FastDigest缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μLFastDigest Esp3Ⅰ(FD0454)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入T5_1和T5_2两个PCR片段以及目标空载体pUD2(Addgene#68161)各1μL,对应物质的量分为30fmol:30fmol:10fmol,部件和目标空载体的摩尔比为3。添加超纯水将反应体系的体积调整到10μL。在PCR仪上进行25个热循环(37℃2分钟，16℃5min)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(25mg/L Chloramphenicol,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装元件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为1124±20，白色克隆数为1116±17，目标白色克隆占比为99.3％。
对照例1
本实施例采用Golden Gate标准化组装方案进行紫杉二烯5位羟基化酶(T5)CDS元件构建。
T5_1和T5_2两个cDNA片段和实施例1相同。
T5 CDS元件构建：
步骤(1)利用1μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和适量超纯水在PCR管中构建T4连接酶缓冲体系，；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μLFermentas BsmBI(ER0451)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入T5_1和T5_2两个PCR片段以及目标空载体pUD2(Addgene#68161)各1μL,对应质量都为75ng。添加超纯水将反应体系的体积调整到10μL。在PCR仪上进行25个热循环(37℃2分钟，16℃5min)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(25mg/L Chloramphenicol,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装元件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为860±20，白色克隆数为8±2，目标白色克隆占比为9.3％。
实施例1的组装效率是对照例1组装效率的10.7倍。
实施例2
本实施例采用本发明提供的合成生物学部件组装试剂盒及其使用方法进行组装构建P2×35s：Cas9:T35s表达单元。
步骤(1)利用1μL 10×FastDigest缓冲液、1μL ATP和适量超纯水在PCR管中构建FastDigest缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μLFastDigest Eco31Ⅰ(FD0293)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入待连接元件P2×35s启动子元件GB0222(Addgene#68173)、Cas9 CDS元件GB0575(Addgene#68206)、T35s终止子元件GB0036(Addgene#68187)，和目标空载体pDGB3α1(Addgene#68228)各1μL,对应物质的量分为40fmol:40fmol:40fmol:10fmol，部件和目标空载体的摩尔比为4。添加超纯水将反应体系的体积调整到20μL。在PCR仪上进行20个热循环(37℃4分钟，16℃5分钟)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(50mg/L Kanamycin,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为1442±35，白色克隆数为1416±31，目标白色克隆占比为98.2％。
对照例2
本实施例采用Golden Gate标准化组装方案进行组装构建P2×35s：Cas9:T35s表达单元。
步骤(1)利用1μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和适量超纯水在PCR管中构建T4连接酶缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μL NEBBsaI(R0535S)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入待连接元件P2×35s启动子元件GB0222(Addgene#68173)、Cas9 CDS元件GB0575(Addgene#68206)、T35s终止子元件GB0036(Addgene#68187)，和目标空载体pDGB3α1(Addgene#68228)各1μL,对应质量都为75ng。添加超纯水将反应体系的体积调整到10μL。在PCR仪上进行25个热循环(37℃2分钟，16℃5分钟)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(50mg/L Kanamycin,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为875±30，白色克隆数为276±9，目标白色克隆占比为31.5％。
实施例2的组装效率是对照例2组装效率的3.1倍。
实施例3
本实施例采用本发明提供的合成生物学部件组装试剂盒及其使用方法进行组装构建针对木糖转移酶启动子区域基因编辑Target RNA表达单元：PU6：guide_RNA:sg_RNA。
木糖转移酶启动子区域基因编辑Target RNA表达单元前期准备：
利用GOLDENBRAID网站针对木糖转移酶启动子序列设计guide_RNA元件，合成两个单链DNA片段：
Forward primer的序列如SEQ ID NO：3所示，Reverse primer的序列如SEQ IDNO：4所示。
其他两个元件为U6启动子元件PU6 GB1001(Addgene#68208)和sg_RNA元件(Addgene#68208).sgRNA GB0645(Plasmid#68210)
木糖转移酶启动子区域基因编辑Target RNA表达单元组装：
步骤(1)利用1μL 10×FastDigest缓冲液、1μL ATP和适量超纯水在PCR管中构建FastDigest缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μLFastDigest Eco31Ⅰ(FD0293)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入U6启动子元件GB1001、guide_RNA元件、sgRNA元件和目标空载体pDGB3α2(Addgene#68229)各1μL,对应物质的量分为20fmol:20fmol:20fmol:10fmol，待组装部件和目标空载体的摩尔比为2。添加超纯水将反应体系的体积调整到10μL。在PCR仪上进行20个热循环(37℃4分钟，16℃5分钟)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(50mg/L Kanamycin,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为1023±30，白色克隆数为1009±29，目标白色克隆占比为98.7％。
对照例3
本实施例采用Golden Gate标准化组装方案针对木糖转移酶启动子区域基因编辑的Target RNA表达单元：PU6：guide_RNA:sg_RNA。
木糖转移酶启动子区域基因编辑guide_RNA元件和实施例3相同，
将两个DNA片段稀释到1uM,各取5ul等量混合，在室温下煺火30分钟，获得双链guide_RNA元件。
其他两个元件为U6启动子元件PU6 GB1001(Addgene#68208)和sg_RNA元件(Addgene#68208).sgRNA GB0645(Plasmid#68210)
木糖转移酶启动子区域基因编辑Target RNA表达单元组装：
步骤(1)利用1μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和适量超纯水在PCR管中构建T4连接酶缓冲体系，；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μL NEBBsaI(R0535S)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入U6启动子元件GB1001、guide_RNA元件、sgRNA元件和目标空载体pDGB3α2(Addgene#68229)各1μL,对应质量都为75ng。添加超纯水将反应体系的体积调整到10μL。在PCR仪上进行25个热循环(37℃2分钟，16℃5分钟)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(50mg/L Kanamycin,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为45±4，白色克隆数为1±1，目标白色克隆占比为2.2％。
实施例3的组装效率是对照例3组装效率的44.8倍。
实施例4
本实施例采用本发明提供的合成生物学部件组装试剂盒及其使用方法组装实施例2、3中构建的CAS9表达单元和Target RNA表达单元，构建木糖转移酶启动子基因编辑通路。
步骤(1)利用1μL 10×FastDigest缓冲液、1μL ATP和适量超纯水在PCR管中构建FastDigest缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μLFastDigest Esp3Ⅰ(FD0454)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入P2×35s：Cas9:T35s表达单元和PU6：guide_RNA:sg_RNA表达单元以及目标空载体pDGB3Ω1(Addgene#68234)各1μL,对应物质的量分为45fmol:45fmol:15fmol，部件和目标空载体的摩尔比为3。。添加超纯水将反应体系的体积调整到20μL。在PCR仪上进行30个热循环(37℃2分钟，16℃5分钟)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(25mg/L Spectinomycin,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为1321±34，白色克隆数为1308±28，目标白色克隆占比为99.0％。
对照例4
本实施例采用Golden Gate标准化组装方案,组装对照例2、3中构建的CAS9表达单元和Target RNA表达单元，构建木糖转移酶启动子基因编辑通路。
步骤(1)利用1μL 10×T4DNA连接酶缓冲液和适量超纯水在PCR管中构建T4连接酶缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的PCR管中加入1μL Promega T4 DNA ligase(M180B),1μLFermentas BsmBI(ER0451)，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的PCR管中加入P2×35s：Cas9:T35s表达单元和PU6：guide_RNA:sg_RNA表达单元以及目标空载体pDGB3Ω1(Addgene#68234)各1μL,对应质量都为75ng。添加超纯水将反应体系的体积调整到10μL。在PCR仪上进行25个热循环(37℃2分钟，16℃5分钟)；
步骤(4)从步骤(3)获得的PCR产物中取1μL直接转化大肠杆菌DH5α，在筛选平板(25mg/L Spectinomycin,0.5mM IPTG,40mg/L Xgal)上过夜培养。选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含组装部件的目标重组载体。
实验设置三个重复组，发现每筛选平板上平均克隆数为902±35，白色克隆数为285±14，目标白色克隆占比为31.6％。
实施例4的组装效率是对照例4组装效率的3.1倍。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种用于合成生物学部件高效组装的试剂盒及其使用方法
<130> 2020
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1117
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcgccgtctc gctcgaatgg acgccatgga tctcacagtt gcaaagttta aggaattcac 60
gcagctacag tcctctgcta ttcttctcac tgttgtttct ggaatcatcg tcatcgtaat 120
cctgctcctc cgttctaaac gccgctcctc tctcaaactt cctccgggga aattaggcct 180
ccctctcatt ggggaatcgt tatcattcct gtgggctctt cgatcaaaca cactcgaaca 240
gtttgtggac aaaagagtga agaaatacgg caatgtcttc aagacatcgt tacttgggca 300
acccacagta gtactgtgtg gcgcagccgg aaaccgccta attctgtcga accaggagaa 360
gctgttgagc cgaacggtgt cggatcgagt agcgaaactg acgggtgata cttctatttc 420
ggttatagcg ggagacagtc atcgcatcat acgcgcagca gttgcagggt ttttggggcc 480
agcaggactc aagattcaca ttggcgaaat gagcgcacat atccgaaatc atatcaacca 540
agtatggaag ggaaaagatg aagtgaacgt acttagtttg gcaagagagc tggtcttcgc 600
catctcggcc agtttgtttt taaatataaa tgatagagag gaacagcacc aattgcataa 660
gactctcgaa actattcttc ccggatattt ttctgttcct ataaacttcc ccggatttgc 720
ctttcgcaag gcactggagg gaaactcgaa gcgtaggaaa catttctctg ttttacaaga 780
aaagagaaga agggatctga gcgtagggtt agcatcccgc actcaggatc tgctttctgt 840
tttgctcgcc tacgaagatg acaaagggaa tccactcacc gatgaggagg tcctcgacaa 900
catttctgcg ctcattgatg gctcctacga gagcacctct tcacaaatgg ccatgctttt 960
aaagctgttg tctgaccatc cagaatgcta tgaaaaagta gttcaagagc aattggagat 1020
agcttcacat aaaaaggaag gagaagaaat cacatggaag gatgtgaaag ccatgagata 1080
cacatggcaa gtaatgcagg agacaccgag acggcgc 1117
<210> 2
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gcgccgtctc gacactgcgg atgtttgccc ctgtttttgg acctcgtggg aaagctataa 60
ctgacattca ttatgacggt tacaccattc caaaaggatg gcaactttca tgggcaactt 120
attcgaccca tcagaatgat acatatttca atgagccgga caaattcatg ccgtccagat 180
tcgacgagga aggagggcgt ttggctcctt acacattcgt gccatttgga ggagggagaa 240
ggaaatgccc aggatgggaa ttcgcaaaga ctgagatatt actgttcgtc catcattttg 300
ttaaaacatt cagtgcctac acgccaatcg accctcacga aagtatttgg gggcgtccac 360
tccctcctgt ccctgccaat ggatttccta ttaaacttat ttctcgatcc taagctttga 420
gcgagacggc gc 432
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
attggaggtg gtcagatctg gaa 23
<210> 4
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aaacttccag atctgaccac ctc 23
Claims (10)
1.一种合成生物学部件组装试剂盒，其特征在于，包括缓冲液、ATP、ⅡS核酸内切酶和T4DNA连接酶。
2.如权利要求1所述的一种合成生物学部件组装试剂盒，其特征在于，所述缓冲液是10×FastDigest缓冲液。
3.如权利要求1所述的一种合成生物学部件组装试剂盒，其特征在于，所述ⅡS核酸内切酶包括FastDigest系列ⅡS核酸内切酶Esp3I和Eco31I。
4.一种如权利要求1、2或3所述的合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，所述使用方法包括以下步骤：
步骤(1)利用缓冲液、ATP和超纯水在PCR管中构建缓冲体系；
步骤(2)向步骤(1)的所述PCR管加入T4DNA连接酶和ⅡS核酸内切酶，形成酶切连接体系；
步骤(3)向步骤(2)的所述PCR管中加入待组装部件和目标空载体，添加所述超纯水调整反应体系的体积；在PCR仪上进行热循环，得到PCR产物；
步骤(4)将步骤(3)获得的所述PCR产物直接用于大肠杆菌转化，在筛选平板上选择白色抗性克隆，纯化质粒即可获得包含所述组装部件的目标重组载体。
5.如权利要求4所述的合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述缓冲液为10×FastDigest缓冲液；所述ATP母液的浓度为10～20mM。
6.如权利要求4所述的合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述ⅡS核酸内切酶根据所述待组装部件两侧的内切酶识别位点选择对应的FastDigest系列ⅡS核酸内切酶Esp3I或Eco31I；所述FastDigest系列ⅡS核酸内切酶Esp3I或Eco31I的浓度为1～2U/μL。
7.如权利要求4所述的合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述T4DNA连接酶的浓度为1～2U/μL。
8.如权利要求4所述的合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中，每个所述待组装部件摩尔浓度为20～80fmol，各所述待组装部件按照等摩尔比加入；所述目标空载体的摩尔浓度为10fmol～20fmol；各所述待组装部件和所述目标空载体的摩尔比在2～4之间；所述目标空载体和所述待组装部件载体的抗性不同。
9.如权利要求4所述的合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(3)中，所述热循环的反应条件是：每个所述热循环分两个阶段，第一阶段，温度为37℃，反应时间持续2～5分钟；之后进行第一阶段，温度为16℃，时间持续5分钟；所述热循环的数量是20～30个。
10.如权利要求4所述的合成生物学部件组装试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(1)中，所述缓冲液体积为1～2μL；所述ATP体积为1μL；所述步骤(2)中，所述T4DNA连接酶体积为1μL，所述ⅡS核酸内切酶的体积为1μL；其中所述T4DNA连接酶、所述ⅡS核酸内切酶和所述目标空载体也可以等比例降低加入量以降低成本；所述步骤(3)的反应体系的体积为10～20μL。
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