CN108103089A - 一种无缝多片段克隆的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无缝多片段克隆的构建方法，载体依次包括启动子序列、核糖体结合位点、Golden Gate反应位点、自杀基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子。该方案具有如下优点：载体质粒无需预先经过线性化等处理，且质粒用量少，可降低质粒抽提成本；可以在同一体系中进行限制性内切酶消化反应和连接反应；每次反应均只需要一种限制性内切酶，无需考虑反应条件冲突等问题；反应中，酶切位点会被切除，无需考虑有多余片段引入是否会对目的基因产生不良影响；通过人为控制粘性末端，可避免克隆载体自连产生背景；可进行高达9个片段的无缝连接。
Description
技术领域
本发明涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种无缝多片段克隆的构建方法。
背景技术
基因克隆又称分子克隆，是指在大肠杆菌中将目的DNA分子片段与特定载体的DNA分子连接而产生重组质粒的方法。传统意义上，质粒重组是基于碱基互补配对的原理，一般做法为：通过引物在目的片段两端引入酶切位点；用相同的限制性内切酶分别对目的片段和质粒载体进行酶切处理；目的片段和质粒载体的酶切产物在体外连接；连接产物转化大肠杆菌；筛选重组子。后来，为满足不同的实验需求，在传统的质粒重组技术的基础上，研究者们又提出多种不同的分子克隆技术：如LIC技术、SLIC技术、Gibson组装，Gateway技术等。
LIC技术，最早由Aslanidis(Aslanicis C et al.,1990)提出，这种方法依赖于T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性。具体做法为：设计PCR扩增引物，其中目的DNA分子引物5’端12个碱基不含有dCMP，线性载体末端的5’端12个碱基不含有dGMP；利用T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性分别处理待插入的目的DNA片段和线性化载体，使其5’端分别产生粘性末端；目的DNA分子和线性化载体退火反应；转化大肠杆菌；重组子筛选。同传统质粒重组方法一样，LIC技术也是基于碱基互补配对的原理，“酶切”(外切酶反应)和“连接”反应同样是分步进行。
SLIC技术是后续研究者在LIC技术的基础上，摒弃碱基互补配对的原则而建立的不依赖于序列和连接的克隆方法(Li M Z et al.,2007)。具体做法是：设计目的DNA分子的PCR扩增引物，引物两端加上与载体同源的20～30bp的DNA片段；载体质粒线性化处理暴露出同源序列；转化大肠杆菌；重组子筛选。同传统质粒重组方法一样，该技术的“酶切”(限制性内切酶反应)和“连接”(同源重组)过程也是分步进行。
Gibson组装最早由Daniel及其同事于2009年提出，该技术适于拼接多个线性DNA片段以及进行载体组装，具体做法是：通过PCR引物在DNA分子末端加上同源片段；将DNA片段以及线性化载体在master mix(混合酶体系)作用下孵育1h；转化大肠杆菌；重组子筛选。这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；一种聚合酶，用于修补碱基的缺口；一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。从作用原理上来看，Gibson组装同样延续了传统质粒重组的碱基互补配对原则，只不过是互补序列进一步加长；该反应既需要限制性内切酶也需要限制性外切酶作用，且“酶切”(外切酶)和“连接”反应在同一个体系中完成，反应时间更短，效率更高。
Walhout最先提出Gateway技术，后经Invitrogen公司进一步趋于成熟。该技术是利用λ噬菌体的位点特异性重组原理(λ噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶源途径之间的相互转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时还保持正确的ORF(open reading fragment，开放阅读框，即基因表达序列)和插入方向。在Gateway技术中起到重组作用的是重组位点：attB，attP，attL和attR，包含两个反应，分别为BP反应和LR反应。BP反应是利用一个attB DNA片段和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。几种质粒重组技术的对比如表1所示:
表1.几种常规质粒重组方法对比
表2.几种常规质粒重组方法缺陷
在传统的质粒重组方案中，限制性内切酶消化反应和连接分步进行，耗时较长；多个限制性内切酶反应还需考虑缓冲液和反应温度冲突的问题；为获得较多的酶切产物，一般所需的质粒量较多；普遍存在载体大量自连背景克隆数目较多的问题。LIC技术为了保证连接效率，需要先对质粒载体进行改造，以产生较长的粘性末端；SLIC技术和Gibson组装则依赖于同源片段，同源片段不理想则容易产生二级结构等，影响重组效率；且Gibson反应中，限制性外切酶产生的用于碱基互补配对的粘性末端较长，混合酶中聚合酶的保真性不足容易产生碱基突变或者缺失；此外Gateway技术的反应产物会在重组质粒中引入多余片段(即同源重组序列)，可能会对目的基因的表达产生影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效的无缝多克隆片段的构建方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于多片段插入的载体，依次包括启动子序列、核糖体结合位点、GoldenGate反应位点、负筛选基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子。
作为上述载体的进一步改进，Golden Gate反应位点选自内切酶BsaI、AarI、BpiI、Esp3I、LguI识别位点中的至少一个。
作为上述载体的进一步改进，Golden Gate反应位点的内切酶识别位点后补充有待剪切的多余序列。
作为上述载体的进一步改进，编码抑制子为LacⅠ。
作为上述载体的进一步改进，筛选基因为抗性筛选基因。
作为上述载体的进一步改进，负筛选基因为ccdB。
一种无缝片段克隆的构建方法，包括如下步骤：
1)设计目的DNA分子PCR引物：用于Golden Gate反应的目的DNA分子PCR引物的结构为：
正向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端1互补序列-引物特异性序列F-3’；
反向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端2互补序列-引物特异性序列R-3’；
2)使用目的DNA分子PCR引物扩增目的基因，得到PCR产物；
3)将PCR产物与上述的载体混合，加入Golden Gate反应试剂，进行Golden Gate反应；
4)反应结束后，转化普通感受态细菌；
5)筛选得到无缝多片段克隆。
作为上述构建方法的进一步改进，目的基因的数量为1～9个。
本发明的有益效果是：
本发明的载体，主要利用II型限制性内切酶识别位点与切割位点不同，且切割位点位于识别位点外面的特点，从而达到多片段无缝连接的目的。反应时，只需在反应管中加入带有相应II型限制性内切酶位点的插入片段(通过PCR引物引入)、设计好的克隆载体及连接酶、II型限制性内切酶，然后进行反应，后期筛选即可得到有效的克隆。该方案具有如下优点：
1)载体质粒无需预先经过线性化等处理，且质粒用量少，可降低质粒抽提成本；
2)可以在同一体系中进行限制性内切酶消化反应和连接反应；
3)每次反应均只需要一种限制性内切酶，无需考虑反应条件冲突等问题；
4)反应中，酶切位点会被切除，无需考虑有多余片段引入是否会对目的基因产生不良影响；
5)通过人为控制粘性末端，可避免克隆载体自连产生背景；
6)可进行高达9个片段的无缝连接。
附图说明
图1是本发明的一种载体结构示意图；
图2是Golden Gate反应酶切位点的反应方向示意图；
图3是菌落PCR鉴定阳性克隆的结果。
具体实施方式
下面结合图1，示例性说明本发明的技术方案。
图1为本发明一种载体的结构示意图，载体主要功能元件及其作用如下表所示：
载体需要特别注意：
1、Golden Gate反应酶切位点的方向。限制性内切酶识别位点5’端远离需保留的区域，如图2所示，箭头表示AarI限制性酶识别位点5’-3’方向。
2、Golden Gate反应内切酶的切割位点在识别位点之外。如图2所示，AarI识别“5’CACCTGC 3’(SEQ ID NO：1)”序列，并在5’端后第11个和第12个碱基之间开始切割(即切割位点在5’CACCTGC NNNN-3’后(SEQ ID NO：2))，暴露出有4个碱基的粘性末端，如粘性末端1和粘性末端2。因此，为保证骨架序列的完整，在设计骨架时，需在限制性内切酶识别位点后补充待剪切的多余序列，以免骨架序列被切割而不完整。酶切位点3’端需要补充的碱基数目由限制性酶的切割位点决定，如AarI为4，BsaI为1等。
3、在骨架载体设计时，为避免载体自连产生背景克隆，可将粘性末端1和2设计成不同的粘性末端。
目的DNA分子PCR引物设计
正向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端1互补序列-引物特异性序列F-3’；
反向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端2互补序列-引物特异性序列R-3’。
Golden Gate因含有ccdB自杀基因，不能在普通感受态细胞中正常生长。将GoldenGate反应产物转化Stbl3等非抗ccdB普通感受态细胞，只有重组质粒能生长，避免了反应体系中未反应完全的骨架载体产生大量背景克隆。
如将A、B两个目的片段通过Goldengate方式重组到目的表达载体，设计重组后A、B基因的结构为
A表示前面一个基因，B表示后面一个基因，选定加粗倾斜区域ATGT作为连接的粘性末端(粘性末端通常选在两个基因连接处，例如A基因的TAA区，或者B基因的ATG区)。以BsaI为内切酶为例，则扩增A的后端引物为：
BsaI-A-R:atcgGGTCTCGACATTTAAAGTTTGGCCTGAGCTAGTTTG(SEQ ID NO：5)；
扩增B的前端引物为：
BsaI-B-F:atcgGGTCTCGATGTGGGTGACCAAACTCCTG(SEQ ID NO：6)
A片段正向引物和B片段的反向引物设计同理，粘性末端互补序列与载体互补即可。
实施例：
骨架载体pRP-BsaI-ccdB-Chl-BsaI，目的片段BsaI-IRES-BsaI和BsaI-EGFP-BsaI，利用Goldengate方法构建pRP-IRES-EGFP重组载体：
引物设计:
反应体系：
反应程序：
| 37℃ | 5min |
| 20℃ | 5min |
| 80℃ | 10min |
| 12℃ | 5min |
转化及结果：
| 宿主类型 | 实验组长菌个数 | 对照组长菌个数 |
| Stbl3 | 840 | 3 |
| DB3.1 | 855 | 0 |
按标准转化流程，取上述2μl反应产物转化100μl Stbl3和DB3.1感受态，将转化产物取相同的量涂在氨苄(Amp)板板上，第二天氨苄板上长出上百个克隆，对照组长出的克隆很少或没有，证明酶切非常充分，且载体自连概率低。在实验组板上挑8个克隆进行菌落鉴定，目的条带大小为1.5kb,阳性率100％，如图3所示。
参考文献：
Aslanidis C,De Jong P J.Ligation-independent clonging of PCR products(LIC-PCR)[J].Nucleic Acids Res,1990,18(20):6069-6074.
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序列表
<110> 赛业（广州）生物科技有限公司
<120> 一种无缝多片段克隆及其构建方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctgc 7
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacctgcnnn n 11
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaactagct caggccaaac tttaaatgtg ggtgaccaaa ctcctgccag 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggcaggag tttggtcacc cacatttaaa gtttggcctg agctagtttg 50
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcgggtctc gacatttaaa gtttggcctg agctagtttg 40
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcgggtctc gatgtgggtg accaaactcc tg 32
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcgggtctc gggctgcccc tctccctccc ccc 33
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgggtctc gccatggttg tggccatatt atcatcgtg 39
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcgggtctc gatggtgagc aagggcgagg ag 32
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcgggtctc ggggtttact tgtacagctc gtccatgc 38
Claims (9)
1.一种用于多片段插入的载体，依次包括启动子序列、核糖体结合位点、Golden Gate反应位点、负筛选基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：Golden Gate反应位点选自内切酶BsaI、AarI、BpiI、Esp3I、LguI识别位点中的至少一个。
3.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：Golden Gate反应位点的内切酶识别位点后补充有待剪切的多余序列。
4.根据权利要求1或2所述的载体，其特征在于：Golden Gate反应位点被剪切后得到的粘性末端不互补。
5.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：编码抑制子为Lac Ⅰ。
6.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：负筛选基因为ccdB。
7.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：筛选基因为抗性筛选基因。
8.一种无缝片段克隆的构建方法，包括如下步骤：
1)设计目的DNA分子PCR引物：用于Golden Gate反应的目的DNA分子PCR引物的结构为：
正向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端1互补序列-引物特异性序F-3’；
反向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端2互补序列-引物特异性序R-3’；
2)使用目的DNA分子PCR引物扩增目的基因，得到PCR产物；
3)将PCR产物与权利要求1～7任一项所述的载体混合，加入Golden Gate反应试剂，进行Golden Gate反应；
4)反应结束后，转化普通感受态细菌；
5)筛选得到无缝多片段克隆。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：目的基因的数量为1～9个。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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