CN108103089B - 一种无缝多片段克隆的构建方法 - Google Patents
一种无缝多片段克隆的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108103089B CN108103089B CN201711221166.6A CN201711221166A CN108103089B CN 108103089 B CN108103089 B CN 108103089B CN 201711221166 A CN201711221166 A CN 201711221166A CN 108103089 B CN108103089 B CN 108103089B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- reaction
- golden gate
- site
- gene
- vector
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
Landscapes
- Genetics & Genomics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种无缝多片段克隆的构建方法，载体依次包括启动子序列、核糖体结合位点、Golden Gate反应位点、自杀基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子。该方案具有如下优点：载体质粒无需预先经过线性化等处理，且质粒用量少，可降低质粒抽提成本；可以在同一体系中进行限制性内切酶消化反应和连接反应；每次反应均只需要一种限制性内切酶，无需考虑反应条件冲突等问题；反应中，酶切位点会被切除，无需考虑有多余片段引入是否会对目的基因产生不良影响；通过人为控制粘性末端，可避免克隆载体自连产生背景；可进行高达9个片段的无缝连接。
Description
技术领域
本发明涉及一种载体的构建方法，特别涉及一种无缝多片段克隆的构建方法。
背景技术
基因克隆又称分子克隆，是指在大肠杆菌中将目的DNA分子片段与特定载体的DNA分子连接而产生重组质粒的方法。传统意义上，质粒重组是基于碱基互补配对的原理，一般做法为：通过引物在目的片段两端引入酶切位点；用相同的限制性内切酶分别对目的片段和质粒载体进行酶切处理；目的片段和质粒载体的酶切产物在体外连接；连接产物转化大肠杆菌；筛选重组子。后来，为满足不同的实验需求，在传统的质粒重组技术的基础上，研究者们又提出多种不同的分子克隆技术：如LIC技术、SLIC技术、Gibson组装，Gateway技术等。
LIC技术，最早由Aslanidis(Aslanicis C et al.,1990)提出，这种方法依赖于T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性。具体做法为：设计PCR扩增引物，其中目的DNA分子引物5’端12个碱基不含有dCMP，线性载体末端的5’端12个碱基不含有dGMP；利用T4DNA聚合酶的3’-5’外切酶活性分别处理待插入的目的DNA片段和线性化载体，使其5’端分别产生粘性末端；目的DNA分子和线性化载体退火反应；转化大肠杆菌；重组子筛选。同传统质粒重组方法一样，LIC技术也是基于碱基互补配对的原理，“酶切”(外切酶反应)和“连接”反应同样是分步进行。
SLIC技术是后续研究者在LIC技术的基础上，摒弃碱基互补配对的原则而建立的不依赖于序列和连接的克隆方法(Li M Z et al.,2007)。具体做法是：设计目的DNA分子的PCR扩增引物，引物两端加上与载体同源的20～30bp的DNA片段；载体质粒线性化处理暴露出同源序列；转化大肠杆菌；重组子筛选。同传统质粒重组方法一样，该技术的“酶切”(限制性内切酶反应)和“连接”(同源重组)过程也是分步进行。
Gibson组装最早由Daniel及其同事于2009年提出，该技术适于拼接多个线性DNA片段以及进行载体组装，具体做法是：通过PCR引物在DNA分子末端加上同源片段；将DNA片段以及线性化载体在master mix(混合酶体系)作用下孵育1h；转化大肠杆菌；重组子筛选。这种master mix含有三种不同类型的酶：一种外切酶，从5’端开始对DNA进行消化，产生长的黏性末端，这样便于与另外的同源末端进行配对结合；一种聚合酶，用于修补碱基的缺口；一种DNA连接酶，实现无痕拼接，形成完整的DNA分子。从作用原理上来看，Gibson组装同样延续了传统质粒重组的碱基互补配对原则，只不过是互补序列进一步加长；该反应既需要限制性内切酶也需要限制性外切酶作用，且“酶切”(外切酶)和“连接”反应在同一个体系中完成，反应时间更短，效率更高。
Walhout最先提出Gateway技术，后经Invitrogen公司进一步趋于成熟。该技术是利用λ噬菌体的位点特异性重组原理(λ噬菌体用此重组系统进行裂解途径和溶源途径之间的相互转换)，实现了不需要传统酶切连接过程的基因快速克隆和载体间平行转移，同时还保持正确的ORF(open reading fragment，开放阅读框，即基因表达序列)和插入方向。在Gateway技术中起到重组作用的是重组位点：attB，attP，attL和attR，包含两个反应，分别为BP反应和LR反应。BP反应是利用一个attB DNA片段和一个attP供体载体之间的重组反应，创建一个入门克隆。LR反应是一个attL入门克隆和一个attR目的载体之间的重组反应。几种质粒重组技术的对比如表1所示:
表1.几种常规质粒重组方法对比
表2.几种常规质粒重组方法缺陷
在传统的质粒重组方案中，限制性内切酶消化反应和连接分步进行，耗时较长；多个限制性内切酶反应还需考虑缓冲液和反应温度冲突的问题；为获得较多的酶切产物，一般所需的质粒量较多；普遍存在载体大量自连背景克隆数目较多的问题。LIC技术为了保证连接效率，需要先对质粒载体进行改造，以产生较长的粘性末端；SLIC技术和Gibson组装则依赖于同源片段，同源片段不理想则容易产生二级结构等，影响重组效率；且Gibson反应中，限制性外切酶产生的用于碱基互补配对的粘性末端较长，混合酶中聚合酶的保真性不足容易产生碱基突变或者缺失；此外Gateway技术的反应产物会在重组质粒中引入多余片段(即同源重组序列)，可能会对目的基因的表达产生影响。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种高效的无缝多克隆片段的构建方法。
本发明所采取的技术方案是：
一种用于多片段插入的载体，依次包括启动子序列、核糖体结合位点、GoldenGate反应位点、负筛选基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子。
作为上述载体的进一步改进，Golden Gate反应位点选自内切酶BsaI、AarI、BpiI、Esp3I、LguI识别位点中的至少一个。
作为上述载体的进一步改进，Golden Gate反应位点的内切酶识别位点后补充有待剪切的多余序列。
作为上述载体的进一步改进，编码抑制子为LacⅠ。
作为上述载体的进一步改进，筛选基因为抗性筛选基因。
作为上述载体的进一步改进，负筛选基因为ccdB。
一种无缝片段克隆的构建方法，包括如下步骤：
1)设计目的DNA分子PCR引物：用于Golden Gate反应的目的DNA分子PCR引物的结构为：
正向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端1互补序列-引物特异性序列F-3’；
反向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端2互补序列-引物特异性序列R-3’；
2)使用目的DNA分子PCR引物扩增目的基因，得到PCR产物；
3)将PCR产物与上述的载体混合，加入Golden Gate反应试剂，进行Golden Gate反应；
4)反应结束后，转化普通感受态细菌；
5)筛选得到无缝多片段克隆。
作为上述构建方法的进一步改进，目的基因的数量为1～9个。
本发明的有益效果是：
本发明的载体，主要利用II型限制性内切酶识别位点与切割位点不同，且切割位点位于识别位点外面的特点，从而达到多片段无缝连接的目的。反应时，只需在反应管中加入带有相应II型限制性内切酶位点的插入片段(通过PCR引物引入)、设计好的克隆载体及连接酶、II型限制性内切酶，然后进行反应，后期筛选即可得到有效的克隆。该方案具有如下优点：
1)载体质粒无需预先经过线性化等处理，且质粒用量少，可降低质粒抽提成本；
2)可以在同一体系中进行限制性内切酶消化反应和连接反应；
3)每次反应均只需要一种限制性内切酶，无需考虑反应条件冲突等问题；
4)反应中，酶切位点会被切除，无需考虑有多余片段引入是否会对目的基因产生不良影响；
5)通过人为控制粘性末端，可避免克隆载体自连产生背景；
6)可进行高达9个片段的无缝连接。
附图说明
图1是本发明的一种载体结构示意图；
图2是Golden Gate反应酶切位点的反应方向示意图；
图3是菌落PCR鉴定阳性克隆的结果。
具体实施方式
下面结合图1，示例性说明本发明的技术方案。
图1为本发明一种载体的结构示意图，载体主要功能元件及其作用如下表所示：
载体需要特别注意：
1、Golden Gate反应酶切位点的方向。限制性内切酶识别位点5’端远离需保留的区域，如图2所示，箭头表示AarI限制性酶识别位点5’-3’方向。
2、Golden Gate反应内切酶的切割位点在识别位点之外。如图2所示，AarI识别“5’CACCTGC 3’(SEQ ID NO：1)”序列，并在5’端后第11个和第12个碱基之间开始切割(即切割位点在5’CACCTGC NNNN-3’后(SEQ ID NO：2))，暴露出有4个碱基的粘性末端，如粘性末端1和粘性末端2。因此，为保证骨架序列的完整，在设计骨架时，需在限制性内切酶识别位点后补充待剪切的多余序列，以免骨架序列被切割而不完整。酶切位点3’端需要补充的碱基数目由限制性酶的切割位点决定，如AarI为4，BsaI为1等。
3、在骨架载体设计时，为避免载体自连产生背景克隆，可将粘性末端1和2设计成不同的粘性末端。
目的DNA分子PCR引物设计
正向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端1互补序列-引物特异性序列F-3’；
反向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端2互补序列-引物特异性序列R-3’。
Golden Gate因含有ccdB自杀基因，不能在普通感受态细胞中正常生长。将GoldenGate反应产物转化Stbl3等非抗ccdB普通感受态细胞，只有重组质粒能生长，避免了反应体系中未反应完全的骨架载体产生大量背景克隆。
如将A、B两个目的片段通过Goldengate方式重组到目的表达载体，设计重组后A、B基因的结构为
A表示前面一个基因，B表示后面一个基因，选定加粗倾斜区域ATGT作为连接的粘性末端(粘性末端通常选在两个基因连接处，例如A基因的TAA区，或者B基因的ATG区)。以BsaI为内切酶为例，则扩增A的后端引物为：
BsaI-A-R:atcgGGTCTCGACATTTAAAGTTTGGCCTGAGCTAGTTTG(SEQ ID NO：5)；
扩增B的前端引物为：
BsaI-B-F:atcgGGTCTCGATGTGGGTGACCAAACTCCTG(SEQ ID NO：6)
A片段正向引物和B片段的反向引物设计同理，粘性末端互补序列与载体互补即可。
实施例：
骨架载体pRP-BsaI-ccdB-Chl-BsaI，目的片段BsaI-IRES-BsaI和BsaI-EGFP-BsaI，利用Goldengate方法构建pRP-IRES-EGFP重组载体：
引物设计:
反应体系：
反应程序：
| 37℃ | 5min |
| 20℃ | 5min |
| 80℃ | 10min |
| 12℃ | 5min |
转化及结果：
| 宿主类型 | 实验组长菌个数 | 对照组长菌个数 |
| Stbl3 | 840 | 3 |
| DB3.1 | 855 | 0 |
按标准转化流程，取上述2μl反应产物转化100μl Stbl3和DB3.1感受态，将转化产物取相同的量涂在氨苄(Amp)板板上，第二天氨苄板上长出上百个克隆，对照组长出的克隆很少或没有，证明酶切非常充分，且载体自连概率低。在实验组板上挑8个克隆进行菌落鉴定，目的条带大小为1.5kb,阳性率100％，如图3所示。
参考文献：
Aslanidis C,De Jong P J.Ligation-independent clonging of PCR products(LIC-PCR)[J].Nucleic Acids Res,1990,18(20):6069-6074.
Daniel G Gibson et al.,Enzymatic assembly of DNA molecules up toseveral hundred kilobases.Nature Methods 6,2009,343-345.
Li M Z et al.,Harnessing homologous recombination in vitro togenerate recombinant DNA via SLIC[J].Nat Methods,2007,4:251-256.
Walhout A J.Gateway recombination cloning:application to the cloningof large numbers of open reading frames of Feomes[J].Methods Enzymol,2000,328:578-592.
序列表
<110> 赛业（广州）生物科技有限公司
<120> 一种无缝多片段克隆及其构建方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacctgc 7
<210> 2
<211> 11
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacctgcnnn n 11
<210> 3
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
caaactagct caggccaaac tttaaatgtg ggtgaccaaa ctcctgccag 50
<210> 4
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggcaggag tttggtcacc cacatttaaa gtttggcctg agctagtttg 50
<210> 5
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atcgggtctc gacatttaaa gtttggcctg agctagtttg 40
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcgggtctc gatgtgggtg accaaactcc tg 32
<210> 7
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atcgggtctc gggctgcccc tctccctccc ccc 33
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
atcgggtctc gccatggttg tggccatatt atcatcgtg 39
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
atcgggtctc gatggtgagc aagggcgagg ag 32
<210> 10
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
atcgggtctc ggggtttact tgtacagctc gtccatgc 38
Claims (6)
1.一种用于多片段插入的载体，依次包括启动子序列、核糖体结合位点、Golden Gate反应位点、负筛选基因、Golden Gate反应位点、终止子、筛选基因、大肠杆菌复制子和编码抑制子；Golden Gate反应位点的内切酶识别位点后补充有待剪切的多余序列，GoldenGate反应位点被剪切后得到的粘性末端不互补；Golden Gate反应位点选自内切酶BsaI、AarI、BpiI、Esp3I、LguI识别位点中的至少一个。
2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：编码抑制子为Lac Ⅰ。
3.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：负筛选基因为ccdB。
4.根据权利要求1所述的载体，其特征在于：筛选基因为抗性筛选基因。
5.一种无缝片段克隆的构建方法，包括如下步骤：
1)设计目的DNA分子PCR引物：用于Golden Gate反应的目的DNA分子PCR引物的结构为：
正向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端1互补序列-引物特异性序F-3’；
反向引物：5’-保护碱基-限制性酶识别位点-补充碱基-粘性末端2互补序列-引物特异性序R-3’；
2)使用目的DNA分子PCR引物扩增目的基因，得到PCR产物；
3)将PCR产物与权利要求1～4任一项所述的载体混合，加入Golden Gate反应试剂，进行Golden Gate反应；
4)反应结束后，转化普通感受态细菌；
5)筛选得到无缝多片段克隆。
6.根据权利要求5所述的构建方法，其特征在于：目的基因的数量为1～9个。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711221166.6A CN108103089B (zh) | 2017-11-29 | 2017-11-29 | 一种无缝多片段克隆的构建方法 |
| PCT/CN2017/116921 WO2019104770A1 (zh) | 2017-11-29 | 2017-12-18 | 一种无缝多片段克隆的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711221166.6A CN108103089B (zh) | 2017-11-29 | 2017-11-29 | 一种无缝多片段克隆的构建方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108103089A CN108103089A (zh) | 2018-06-01 |
| CN108103089B true CN108103089B (zh) | 2022-08-05 |
Family
ID=62208605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711221166.6A Active CN108103089B (zh) | 2017-11-29 | 2017-11-29 | 一种无缝多片段克隆的构建方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108103089B (zh) |
| WO (1) | WO2019104770A1 (zh) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109102369A (zh) * | 2018-08-15 | 2018-12-28 | 云舟生物科技（广州）有限公司 | 一种载体线上构建和交易的方法、系统、平台及存储介质 |
| CA3160450A1 (en) * | 2019-12-03 | 2021-06-10 | Michael C. Jewett | Modular, cell-free protein expression vectors to accelerate biological design in cells |
| CN112852849B (zh) * | 2019-12-31 | 2023-03-14 | 湖北伯远合成生物科技有限公司 | 一种用于大片段dna无缝组装的系统及组装方法 |
| CN111748540A (zh) * | 2020-06-22 | 2020-10-09 | 上海交通大学 | 一种用于合成生物学部件高效组装的试剂盒及其使用方法 |
| CN114250242A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-29 | 上海英基生物科技有限公司 | 一种一步法BbsI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用 |
| CN114250241A (zh) * | 2021-12-29 | 2022-03-29 | 上海英基生物科技有限公司 | 一种一步法BsaI酶切连接片段组装方法、组装试剂盒及应用 |
| CN115927546A (zh) * | 2022-12-29 | 2023-04-07 | 北京海创科业生物科技有限责任公司 | 一种基于无缝克隆技术的全新质粒定点突变方法 |
| CN116355931A (zh) * | 2023-05-29 | 2023-06-30 | 北京因诺惟康医药科技有限公司 | 一种快速分子克隆方法 |
| CN117683807A (zh) * | 2023-12-16 | 2024-03-12 | 韶关学院 | 一种高效的片段组装与快速的植物细胞原生质体瞬时表达方法、系统及应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106282157B (zh) * | 2015-05-22 | 2019-11-12 | 南京金斯瑞生物科技有限公司 | 一种由短链核苷酸介导的dna组装方法及其应用 |
| CN106222186B (zh) * | 2016-08-22 | 2019-03-19 | 河北省农林科学院粮油作物研究所 | 入门载体pAmpGate和pGentGate的构建及使用方法 |
| CN106906232B (zh) * | 2017-04-07 | 2023-10-13 | 中国热带农业科学院热带生物技术研究所 | 一种dna分子克隆方法及其应用 |
-
2017
- 2017-11-29 CN CN201711221166.6A patent/CN108103089B/zh active Active
- 2017-12-18 WO PCT/CN2017/116921 patent/WO2019104770A1/zh active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2019104770A1 (zh) | 2019-06-06 |
| CN108103089A (zh) | 2018-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108103089B (zh) | 一种无缝多片段克隆的构建方法 | |
| Gibson | Enzymatic assembly of overlapping DNA fragments | |
| CN108138189B (zh) | 一种dna片段体外组装方法和试剂盒 | |
| CN101368188B (zh) | 一种快速高效的植物人工微rna表达载体构建方法 | |
| US7696335B2 (en) | Kits for multiple non-cross reacting recombination reactions utilizing loxP sequences | |
| CN113481194A (zh) | 一种dna的合成方法 | |
| CN102628057B (zh) | 一种无背景定向克隆pcr产物的载体及制备方法和应用 | |
| WO2023230991A1 (zh) | 新型闭合线性双链dna的体外制备技术 | |
| Li et al. | Evolution of plasmid-construction | |
| CN117247959A (zh) | 一种基于基因编辑技术的dna克隆技术 | |
| CN111850050B (zh) | 一种基因编辑工具及其制备方法与多轮基因编辑的方法 | |
| CN104212827A (zh) | 不依赖生物工程酶的快速分子克隆方法 | |
| CN112746075B (zh) | 诱导型内源CRISPR-Cas系统的构建方法及其在多基因同时编辑中的应用 | |
| Green et al. | A guide to cloning the products of polymerase chain reactions | |
| CN104357438B (zh) | 一种dna组装和克隆的方法 | |
| CN115747242B (zh) | 消除质粒、质粒组合、基因编辑试剂盒、制备方法及应用 | |
| CN103205449B (zh) | 一种使用通用缓冲液快速克隆基因的方法 | |
| WO2024067644A1 (zh) | 一种无细胞制备mRNA转录模板的方法 | |
| US20080286871A1 (en) | Modular genomes for synthetic biology and metabolic engineering | |
| CN106995814B (zh) | 一种lr酶可识别和作用的位点对和引物对及质粒构建方法 | |
| CN106868004B (zh) | 一种lr酶可识别和作用的位点对和引物对及质粒构建方法 | |
| CN106811459A (zh) | 一种利用短链引物阻遏提高dna克隆及组装效率的方法 | |
| CN115058451A (zh) | 一种用于同源重组和单碱基编辑的双报告质粒及其构建方法和应用 | |
| CN113249400A (zh) | 一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法 | |
| WO2014201394A2 (en) | Methods and compositions for the construction of prokaryotic organisms having multiple chromosomes |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |