CN113249400A

CN113249400A - 一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法

Info

Publication number: CN113249400A
Application number: CN202010083919.7A
Authority: CN
Inventors: 杨晟; 张译文; 杨俊杰; 蒋宇
Original assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Current assignee: Center for Excellence in Molecular Plant Sciences of CAS
Priority date: 2020-02-10
Filing date: 2020-02-10
Publication date: 2021-08-13

Abstract

本发明公开了一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法，包括：对于CRISPR‑Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统，改造其crRNA表达质粒中靶向基因组单一位点的crRNA序列，使改造后的crRNA或crRNA阵列靶向基因组中多拷贝序列或者多个位点，引导目的基因插入这些位点，实现目的基因在细菌染色体上多拷贝插入。该方法可以无残留抗性标记、快速、可编辑的将目的基因插入基因组预期位点，实现细菌染色体上的目的基因多拷贝插入，具有广阔工业应用前景。

Description

一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法、以及一种用于在细菌染色体中多拷贝插入目的基因的基因编辑系统。

背景技术

优化目的基因表达盒的表达剂量是构建高性能生物催化剂的重要环节，但常用的质粒在遗传上容易不稳定，并且由于可用的质粒复制子种类有限，且拷贝数受多种因素影响，导致基因表达盒的表达剂量难以被精确地控制(Tyo,et al.,Stabilized geneduplication enables long-term selection-free heterologous pathwayexpression.Nature Biotechnology,2009,27(8):760-U115.)。重要的工业底盘细胞大肠杆菌的基因编辑技术虽然较为成熟，但将基因表达盒迭代整合到染色体上时，每轮操作也至少需要2天，难以快速获得含一系列基因表达盒拷贝数的工程菌(Jiang,Y.,et al.,Multigene editing in the Escherichia coli genome using the CRISPR-Cas9system.Appl Environ Microbiol,2015)。美国Gregory实验室曾报道过染色体基因盒高拷贝的方法CIChE(Tyo,et al.,ibid.)，基于同源重组原理，用提升氯霉素浓度筛选高拷贝串联重复基因表达盒，但是缺点是在大肠杆菌染色体上留有氯霉素抗性标记从而影响其工业应用。Mu复制型转座技术理论上可以不使用抗生素标记实现基因表达盒高拷贝，但是基因表达盒的转座位置是随机的(Akhverdyan,V.Z.,et al.,Application of thebacteriophage Mu-driven system for the integration/amplification of targetgenes in the chromosomes of engineered Gram-negative bacteria-mini review."Applied Microbiology and Biotechnology，2011,91(4):857-871.)。

CRISPR-Cas虽然可以同时切割基因组多拷贝序列或以crRNA array同时靶向多个不同序列，但受限于同源重组的修复效率较低，难以一次性插入3个拷贝以上的基因表达盒(Jiang,Y.,et al.,ibid.)。因此迫切需要一种可编辑的、快速、无标记残留、定点的染色体多拷贝整合系统成为代谢工程与合成生物学的有力工具。

2019年，Science和Nature分别公布了Broad研究所张锋研究组(JonathanStrecker et al.,RNA-guided DNA insertion with CRISPR-associatedtransposases.Science,2019,365,48-53)和哥伦比亚大学Sam Sternberg研究组(SanneE.Klompe1,et al.,Transposon-encoded CRISPR–Cas systems direct RNA-guided DNAintegration.Nature,2019,Vol.571,https://doi.org/10.1038/s41586-019-1323-z.)两项相似的研究成果：利用细菌转座基因，将DNA序列精确地插入基因组而不切割DNA。张锋研究组从蓝藻中抽提了一种转座酶，他们将其命名为CAST，即CRISPR相关转座酶(CRISPR-associated transposase)。Sternberg研究组在霍乱弧菌中发现了一个独特的“转座基因”(转座子)后，开发了一种名为INTEGRATE(Insertion of transposable elements byguide RNA-assisted targeting，引导RNA辅助靶向的转座元件插入)的基因编辑工具，可以在基因组中插入大片段基因而不引入DNA断裂。该新技术INTEGRATE利用转座基因将DNA序列插入基因组而不切割DNA。这两项研究分别报道了CRISPR–Cas相关转座系统CAST系统和INTEGRATE系统可不依赖于同源重组将DNA片段通过转座整合到大肠杆菌染色体预设的位点，无抗性标记残留，无双链DNA断口。但上述方法均局限于基因组单一位点的插入，尚无法实现在染色体中多拷贝插入目的基因盒。

发明内容

为克服现有基因组多拷贝编辑技术的上述缺陷，我们对CAST系统和INTEGRATE系统的深入研究，推测通过设计靶向染色体多位点的crRNA序列或crRNA阵列，有可能利用CRISPR-Cas相关转座系统实现染色体目的基因盒多拷贝插入。于是基于这两种CRISPR相关转座系统的比较和组合，我们开发了一种可编辑、无遗留标记、定点、快速高效的细菌染色体目的基因多拷贝方法(简称MUCICAT)，通过如下策略进行了验证：1.将INTEGRATE系统或CAST系统中只能靶向单一位点的单一crRNA替换为靶向基因组多拷贝序列(即，基因组中多拷贝的DNA序列，简称“多拷贝序列”)的crRNA或由不同crRNA组成的crRNA阵列(crRNAarray)；2.通过固体平板划线传代的方式延长转座时间，插入拷贝数随转座时间增加而增加，可以获得染色体上含一系列拷贝数目的基因的菌株文库；3.构建含Cas9和靶向INTEGRATE与CAST系统工具质粒共同序列的sgRNA的质粒pCutamp，将其转化至上述文库菌株中，鼠李糖诱导转录sgRNA，消除转座工具质粒。pCutamp质粒含有sacB基因，通过在蔗糖平板反筛消除质粒pCutamp，可获得无质粒的基因组目的基因多拷贝的工程菌株。

因此，本发明的第一个目的在于提供一种细菌染色体中整合多拷贝目的基因的方法，包括如下技术方案：

一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法，包括下述步骤：对于CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统，改造其crRNA表达质粒中靶向基因组单一位点的crRNA序列，使改造后的crRNA靶向细菌染色体中多个位点，引导目的基因插入这些位点，实现目的基因在细菌染色体上多拷贝插入。

上述改造后crRNA可以靶向基因组中多拷贝序列，即，改造后crRNA序列为细菌基因组上多拷贝序列的部分序列；或者形成两种以上分别靶向细菌染色体中不同位点的crRNA array，该crRNA阵列由两种以上crRNA组成，即，改造后crRNA序列为基因组中多个不同位点的部分序列所组成的crRNA阵列。

上述改造后crRNA或crRNA array可以克隆在INTEGRATE系统中的V型CRISPR核酸酶表达质粒pQCascade_entry(简写为pQCascade)上、或者克隆在CAST系统中的pHelper_ShCAST_sgRNA(简写为pHelper)上进行表达；也可以由单独的载体表达。

当改造后crRNA由INTEGRATE系统中的pQCascade或者CAST系统中的pHelper表达时，将质粒pQCascade或pHelper、INTEGRATE系统或者CAST系统中的目的基因(cargo)表达载体pDonor、INTEGRATE系统中的转座酶表达载体pTnsABC被转入细菌感受态细胞，并进行筛选。上述改造后质粒pHelper和pDonor构成了两质粒系统用于本发明的MUCICAT；或者改造后质粒pQCascade、pDonor和pTnsABC构成了三质粒系统用于本发明的MUCICAT。

优选地，上述细菌包括但不限于大肠杆菌，可以是K-12系、B系及W系大肠杆菌，例如大肠杆菌BL21(DE3)或MG1655(DE3)。

在MUCICAT的一种实施方式中，先将INTEGRATE系统中pDonor和pTnsABC转化至细菌中，在含抗生素比如氨苄青霉素和/或卡那霉素的LB固体平板上进行筛选；然后挑选阳性克隆子，制备成电转感受态细胞，将pQCascade质粒转化至感受态细胞中，再在含抗生素比如氨苄青霉素和/或卡那霉素和/或链霉素的LB固体平板上进行筛选；通过菌落PCR，筛选出的克隆进行拷贝数验证，获得染色体上含不同拷贝数目的基因的基因编辑菌株。

进一步地，可以对上述克隆进行质粒消除，例如利用本发明构建的质粒pCutamp对上述克隆进行质粒消除，获得无质粒的基因编辑菌株，包括如下步骤：

1)将上述筛选出的克隆制备成电转感受态细胞，电转化质粒pCutamp在含安普霉素和鼠李糖的LB固体平板上培养过夜，其中鼠李糖诱导转录sgRNA，消除转座工具质粒；

2)将步骤1)平板上所获的阳性克隆分别点平板至氨苄青霉素、卡那霉素或链霉素的单一抗生素LB固体平板上，同时点平板至含10g/L蔗糖的LB固体平板上反筛消除质粒pCutamp自身(因pCutamp质粒含有sacB基因，通过在蔗糖平板反筛消除自身。)；

3)选取步骤2)中氨苄青霉素、卡那霉素或链霉素的单一抗生素LB固体平板上不能生长，在蔗糖平板上生长的克隆，点平板于安普霉素平板，验证pCutamp质粒消除，得到消除所有质粒的编辑菌株。

其中，上述pCutamp质粒包含靶向质粒pQCascade或pHelper、INTEGRATE系统pDonor和pTnsABC这三种质粒骨架上AmpR启动子的共有序列的sgRNA基因。

本发明的第二个目的在于提供一种新的基因编辑系统，该基因编辑系统可称为“多拷贝插入系统”，在本文中可简称为MUCICAT系统，其包括：INTEGRATE系统中的V型CRISPR核酸酶表达质粒pQCascade、或者CAST系统中的pHelper，该pQCascade或pHelper上克隆有上述改造后crRNA或crRNA array；INTEGRATE系统或CAST系统中的质粒pDonor，其包含目的基因cargo；INTEGRATE系统中的转座酶表达载体pTnsABC。上述质粒pQCascade或pHelper、质粒pDonor和质粒pTnsABC构成了三质粒系统，用于目的基因(cargo)在细菌染色体中的多拷贝插入。

上述pQCascade包含霍乱弧菌来源的cas5678核酸酶基因和tniQ基因、crRNA阵列、CloDF13复制子、T7启动子、lacI阻遏蛋白基因、链霉素抗性基因。

上述pHelper质粒包含霍氏双岐藻来源cas12k核酸酶基因、tnsBC、tniQ转座酶基因、crRNA阵列、pBR322复制子、J23119组成型启动子、氨苄青霉素抗性基因。

在一种实施方式中，上述crRNA阵列中的一个crRNA靶向细菌比如大肠杆菌染色体中IS186序列，spacer序列可以为：5’-TGGATGCTTTGCGTGCAAAGGAACCTGAACTC-3’(SEQ IDNO:1)。这种情况下，可以将pQCascade质粒表示为pQCascade-IS186。

在另一种实施方式中，上述crRNA阵列中的一个crRNA靶向细菌比如大肠杆菌染色体中IS1序列，spacer序列可以为：5’-TGGCACGGCTGGGACGGAAGTCGCTGTCGTTC-3’(SEQ IDNO:2)。这种情况下，可以将pQCascade质粒表示为pQCascade-IS1。

在一种实施方式中，上述crRNA阵列的序列可以为SEQ ID NO:3：

CCATGGGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACGCCTGGCTTGGCGATGCTCGCCTGATCGACAAGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACGAGAATATTGTGGCAAAAGCGCATAAGGTGCTGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACGTCAGAGTGGCGTATCCGATGAATCACCACAGGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACGCAGAAGTGCACGGCGTGTGCGGCGGCGAGCAGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACTCGATCCGTGGGTGTTTATGTTCTCAGCAGGAGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACTTACTTACGGCGTTGCGCATTCTCATTGCACCGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACGCATTACTAAGCTGGCGCGTGAAGCTGTAGAAGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACGGGGCGTAAAAAGAAGGGGCGCTGATTAACGCGTGAACTGCCGAGTAGGTAGCTGATAACGGATCC(SEQID NO:3)。

上述质粒pDonor包含转座用的LE和RE序列、目的基因(cargo)和pMB1*复制子。

上述pTnsABC包含霍乱弧菌来源的转座酶编码基因tnsABC、T7启动子和ColA复制子。

本发明用于表达crRNA阵列的质粒pQCascade或pHelper可以包括pQCascade-IS1、pQCascade-IS186、pQCascade-array1、pT7-Helper-IS1和pHelper-array2，其中pQCascade-IS1质粒包含靶向BL21(DE3)基因组28拷贝IS1序列的spacer序列；pQCascade-IS186质粒包含靶向BL21(DE3)基因组5拷贝的IS186序列的spacer序列；pQCascade-array1包含由9个正向重复序列与8个靶向BL21(DE3)基因组不同位点的spacer组成的array1序列；pT7-Helper-IS1质粒包含靶向BL21(DE3)基因组29拷贝的IS1序列的spacer序列；pHelper-array2包含由9个正向重复序列与8个靶向BL21(DE3)基因组不同位点的spacer组成的array2序列。

在一种优选的实施方式中，上述基因编辑系统还包含用于消除质粒pQCascade或pHelper、pDonor和pTnsABC的质粒pCutamp，从而使MUCICAT系统成为四质粒系统。

上述质粒pCutamp含有cas9基因、sacB基因和sgRNA。优选改造后sgRNA是靶向三个质粒骨架上AmpR启动子的共有序列的sgRNA基因。

在一种实施方式中，上述crRNA可以靶向细菌比如大肠杆菌染色体中IS1序列，spacer序列可以为：5’-TTTTATGTTCAGATAATGCCCGAT-3’(SEQ ID NO:4)。这种情况下，pHelper质粒可以是衍生质粒pT7-Helper，表示为pT7-Helper-IS1。

优选地，与pHelper系列质粒配合使用时，辅助质粒pDonor可以是CAST系统中的质粒pDonor-kanR或是衍生质粒pSC101-Donor。

在一种实施方式中，上述基因编辑系统可以呈试剂盒形式提供，其包含质粒pQCascade或pHelper、pDonor、pTnsABC、pCutamp、用于实施基因组编辑的各种PCR引物。

作为本发明的基因编辑系统的具体应用实施例，其例如可用于构建葡萄糖脱氢酶(GDH)生产菌株等。

本发明的MUCICAT系统能够可编辑地快速将目的基因多拷贝插入细菌基因组中预期位点，实现无遗留标记、定点、稳定高效的基因编辑。应用该系统，可以快速生成包含不同拷贝目的基因的细菌文库，具有广阔工业应用前景。

附图说明

图1是检测靶向大肠杆菌BL21(DE3)基因组IS186位点的基因插入拷贝量的凝胶电泳图。其中条带编号1-5分别指插入序列IS186在基因组上的1-5位点，M是Mark。

图2是实施例1中转座传代过程中各菌株被插入的IS1位点数目变化的柱形图。

图3是实施例1中菌株IS1Cm-16A的IS1位点基因插入情况示意图。

图4是检测靶向大肠杆菌BL21(DE3)基因组8个不同位点的传代过程菌株8位点插入拷贝量的凝胶电泳图。其中条带编号1-8分别指基因组上的1-8位点，M是Mark。。

图5是实施例2中传代过程中的基因组8位点被插入位点的数目变化的柱形图。

图6是本发明构建的质粒pCutamp的结构示意图。

图7是本发明构建的基因组不同拷贝菌株T7-GDH与质粒版菌株(pET24a-GDH)的GDH酶活比较图。

图8是实施例4中大肠杆菌BL21(DE3)基因组29个IS1位点的插入目的基因的凝胶电泳图。其中条带编号1-30分别指基因组上的1-29位点，M是Mark。

具体实施方式

本发明是通过对现有技术的CAST系统和INTEGRATE系统这两种CRISPR相关转座系统进行改造和组合后形成的一种新的CRISPR-Cas相关转座系统，以便实现目的基因(cargo)在细菌染色体中的多拷贝插入。

现有的INTEGRATE系统包括pQCascade、pDonor和pTnsABC三种质粒，其中pQCascade包含cas678核酸酶基因、tniQ基因。

现有的CAST系统包括pHelper(含cas和转座酶)和pDonor两种质粒。其中pHelper包含tnsBC、tniQ、Cas12k、tracrRNA、spacer基因。

现有的INTEGRATE系统中的pDonor包含RE、LE、目的基因cargo。

现有的CAST系统中的pDonor包含RE、LE、目的基因cargo、卡那霉素抗性基因kanR。

本发明重点改造了INTEGRATE系统和CAST系统中原来的crRNA，增加了其可靶向的基因组位点，从而形成一种新的基因组编辑工具MUCICAT。为了体现本发明与现有技术的INTEGRATE系统和CAST系统中原来的crRNA序列之间的区别，可以将本发明的MUCICAT系统中使用的crRNA称为“改造后(的)crRNA”。改造后crRNA同样是根据基因组上预期进行定向编辑的靶序列设计的碱基配对序列，作为crRNA阵列，引导目的基因插入基因组中多拷贝序列、或者插入基因组中多个不同的位点。

改造后crRNA可以是靶向基因组中多拷贝序列的一种crRNA序列，其为细菌基因组上多拷贝序列的部分序列；也可以是由两种以上crRNA组成的crRNA阵列(crRNA array)，分别靶向细菌染色体中不同位点。

术语“多拷贝序列”也可称为“重复序列(repeated sequence)”，该序列在基因组中是多拷贝存在的。

在本文中，为了描述简便，有时会将某种蛋白比如核酸酶Cas与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如，对于Cas，用于描述核酸酶功能或类别时，指的是蛋白质；在作为一种基因描述时，指的是编码该Cas的基因。类似地，有时会将RNA比如sgRNA或crRNA与其编码基因(DNA)名称混用，本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。

使用本发明的MUCICAT系统对细菌进行基因编辑时，以大肠杆菌BL21(DE3)为例，可以包括下述步骤：

1)电转化pDonor与pTnsABC至BL21(DE3)，37℃条件下在含氨苄青霉素与卡那霉素的LB固体平板上进行筛选。

2)挑选阳性克隆子，制备成电转感受态细胞后，电转化pQCascade-array1至上述菌中，37℃条件下在含氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的LB固体平板上进行筛选。

3)将步骤2)的平板上的克隆刮取一部分重悬于液体LB培养基中，重新涂布于添加了终浓度0.1mM IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的LB固体平板上。IPTG负责诱导转座相关酶的表达。37℃条件下培养16h。

4)将步骤3)的平板上的克隆刮取一部分重悬于液体LB培养基中，调整OD₆₀₀至约0.5后，稀释50倍后，吸取100μL涂布于添加了终浓度1mM IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的LB固体平板上。IPTG负责诱导转座相关酶的表达。37℃条件下培养24h。

5)为了提高插入拷贝数，可以选择传代延长转座时间。用10μL枪头蘸取步骤4)平板上生长的阳性克隆，点在新的含1mM IPTG与上述三种抗生素的LB固体平板上，换用200μL枪头从点处起始进行划线，分离出单菌。

6)通过菌落PCR，将步骤4)与步骤5)平板上的克隆进行拷贝数验证，获得染色体上含不同拷贝数目的基因的大肠杆菌编辑菌株。

优选地，上述目的克隆还可利用pCutamp进行质粒消除，获得无质粒的大肠杆菌编辑菌株，包括如下步骤：

1)将上述目的克隆制备成电转感受态细胞，电转化质粒pCutamp，37℃复苏40min后，将复苏菌液转移至含3mL LB液体培养基的试管中，其中加入安普霉素与10mM鼠李糖，37℃继续培养3h后，收集0.5mL菌液涂布至含安普霉素与10mM鼠李糖的LB固体平板，37℃继续培养过夜。

2)将步骤1)平板上所获的阳性克隆分别点平板至氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的单一抗生素LB固体平板上，同时点平板至含10g/L蔗糖的LB固体平板上反筛消除质粒pCutamp自身。

3)选取步骤2)中氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的单一抗生素LB固体平板上不能生长，在蔗糖平板上生长的克隆，点平板于安普霉素平板，验证pCutamp质粒消除，得到消除所有质粒的编辑菌株。

考虑到实验操作方便目的，本发明的MUCICAT系统可以为试剂盒，将所需的材料集中在一个试剂盒中。在优选的实施方式中，上述试剂盒除了包含质粒、用于实施基因组编辑的各种PCR引物等外，还可分别包括下述物品中的至少之一：携带工具，其空间划分为可以收容一种或多种容器、96孔板或板条的限定空间，该容器例如是试剂盒、药瓶、试管、和类似物，每样容器都含有一个单独的用于本发明方法的组分；说明书，其可以写在瓶子、试管和类似物上，或者写在一张单独的纸上，或者在容器的外部或内部，例如是带有操作演示视频APP下载窗口比如二维码的纸件，说明书也可以是多媒体的形式，比如CD、U盘、网盘等。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于举例说明目的，而不是对本发明的限制。此外应理解，在阅读了本发明的构思之后，本领域技术人员对其作出的各种改变或调整，均应落入本发明的保护范围内，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书限定的范围。

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

实施例

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。

本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

实施例1靶向大肠杆菌染色体IS1或IS186序列实现目的基因多拷贝整合

构建pQCascade-IS1和pQCascade-IS186质粒及PCR验证所需的引物参见表1。

表1、PCR引物序列

注：表中引物名称后缀F代表正向引物，R代表反向引物。

1.1酶切获得pQCascade骨架片段

BsaI限制性内切酶酶切pQCascade_entry(根据Addgene#130635的序列，由南京金斯瑞公司合成)质粒，获得pQCascade_entry骨架片段。

酶切反应条件：37℃，1h。通过凝胶电泳分离酶切后质粒片段并胶回收。

限制性内切酶试剂盒购自Fermentas公司，DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。

1.2引物退火自搭

表1中的引物对通过退火自搭，可获得含有4bp粘性末端的spacer片段，该粘性末端与pQCascade质粒骨架BsaI酶切后的粘性末端互补。

95℃保温5min，每分钟减低5-10℃，16℃保温10min，用ddH₂O稀释20倍，备用。

1.3连接构建质粒pQCascade-IS1或pQCascade-IS186

16℃连接1h。T4连接酶试剂盒购自TAKARA公司。

将上述连接产物全部转化至DH5α感受态细胞中(购自深圳康体生命科技有限公司)，在含有链霉素的LB固体平板上进行筛选，获得质粒pQCascade-IS1或pQCascade-IS186。用QCas750R引物测序验证正确。

1.4转化转座工具质粒与诱导转座

电转化pDonor(根据Addgene#130634的序列，由南京金斯瑞公司合成)与pTnsABC(根据Addgene#130633的序列，由南京金斯瑞公司合成)至大肠杆菌BL21(DE3)，37℃条件下在含氨苄青霉素与卡那霉素的LB固体平板上进行筛选。挑选阳性克隆子，制备成电转感受态细胞后，电转化pQCascade-IS1或pQCascade-IS186至上述菌中，37℃条件下在含氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的LB固体平板上进行筛选，获得含有pDonor、pTnsABC和pQCascade-IS1或pQCascade-IS186三种质粒的大肠杆菌BL21(DE3)菌株。将上述平板上的克隆刮取一部分重悬于液体LB培养基中，重新涂布于含有终浓度0.1mM IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的LB固体平板上，IPTG负责诱导转座相关酶的表达。37℃条件下培养16h，可能会形成一层菌膜，属正常情况。将上述含有0.1mM IPTG平板上的克隆刮取一部分重悬于液体LB培养基中，调整OD₆₀₀至约0.5后，用液体LB培养基稀释50倍，吸取100μL涂布于添加了终浓度1mM IPTG、氨苄青霉素、卡那霉素与链霉素的LB固体平板上，37℃条件下培养24h。

为了提高插入拷贝数，可以选择传代延长转座时间。随机选取上述含1mM IPTG诱导剂的平板上的克隆，用10μL枪头蘸取克隆，点在新的含1mM IPTG和上述三种抗生素的LB固体平板上，换用200μL枪头从点处起始进行划线，分离出单菌，37℃条件下培养24h，平板上新生长的菌落即为第2代菌落。以新生长的菌落为出发菌落，重复上述操作，可获得第3、4……n代菌落。

1.5菌落PCR鉴定靶向IS186的拷贝数

使用表1中位于插入位点上下游约300bp的引物对IS186-F/1R～IS186-F/5R，通过菌落PCR，验证靶向IS186的第1代平板上克隆的基因组5个IS186位点的插入情况。

PCR Mix购自诺维赞公司。

PCR反应条件：

质粒pDonor上的供体插入片段包括LE(Left End)、RE(Right End)和CmR片段(无启动子的氯霉素抗性基因片段)，共983bp，阳性条带约1600bp，阴性条带约600bp。经统计，14个克隆中有11个基因组5个IS186位点均有插入，即插入了5拷贝，1个克隆插入4拷贝，2个克隆插入3拷贝。部分凝胶电泳图如图1所示。

上述结果显示，利用MUCICAT系统靶向基因组5拷贝的IS186位点，一次转座即可实现基因组5拷贝的插入，总插入率100％，5拷贝插入率78.57％。利用MUCICAT系统在基因组插入5拷贝目的基因只需5天，具有操作简易、用时短、效率高等优势。

1.6荧光定量PCR鉴定靶向IS1的拷贝数

由于大肠杆菌BL21(DE3)基因组上插入序列IS1位点一共有28拷贝，使用菌落PCR进行位点验证费时费力，因此通过荧光定量PCR(qPCR)进行拷贝数验证。随机选取11个1mMIPTG平板上的克隆接种于3mL液体LB培养基中，37℃、200rpm过夜培养。离心收集0.5mL菌体，提取基因组，细菌基因组试剂盒购自Axygen公司，实验操作按说明书进行。

将IS1位点以RE-CmR-LE方向插入目的基因的序列作为参考，设计一内一外的特异性的qPCR引物对qIS1-F/R(见表1)，同时选取gapA为内参基因并设计内参引物对gapA-F/R(表1)，以提取好的基因组为模板，进行qPCR验证。qPCR体系(20μL)：

qPCR反应条件：

qPCR试剂盒SYBR Green Supermix购自BioRad公司。

为减少误差带来的影响，每个样品设3个平行组。获得的qPCR数据通过Pfaffl法进行处理，计算出不同克隆的相应拷贝数。

通过检测转座传代过程中各菌株的插入拷贝数情况，得到如图2所示的柱形图曲线，由图2可以看出，随着传代过程转座时间的延长，菌株基因组插入的拷贝数呈现整体上升的趋势。

在28个插入位点上游约300bp处分别设计28个正向引物，分别以RE-CmR-LE方向与LE-CmR-RE方向设计反向引物，构成56个引物对，可以通过菌落PCR特异性鉴定IS1位点真实插入情况。选取第8代插入拷贝数最高的菌株IS1Cm-16A，划线于含10g/L葡萄糖的LB固体平板，以生长出的单菌为模板，进行菌落PCR鉴定。鉴定结果如图3所示。

上述结果表明，大肠杆菌BL21(DE3)靶向含28拷贝的IS1位点进行转座，经过传代8次后，可获得基因组插入16拷贝目的基因的菌株。

实施例2利用array靶向大肠杆菌染色体8个不同位点实现目的基因多拷贝整合

2.1质粒pQCascade-array1的构建

将靶向大肠杆菌BL21(DE3)基因组8个不同位点的crRNA组合，形成由9个固定正向重复序列和8个靶向不同位点的spacer间隔排列的array序列，插入至pQCascade_entry质粒的两个BsaI位点之间，构建质粒pQCascade-array1。array序列合成以及上述质粒构建由南京金斯瑞公司完成。

2.2转化转座工具质粒与诱导转座

电转化质粒pDonor、pTnsABC和pQCascade-array1三种质粒至大肠杆菌BL21(DE3)，转化操作同步骤1.5。平板菌落诱导转座与传代操作同步骤1.5。

2.3菌落PCR鉴定基因组8位点插入情况

在基因组8个位点的上下游300bp左右处分别设计正向与反向引物，即验证所需的引物，序列见表2。

表2、8位点验证引物序列

引物	序列(5'→3')
		cr1-UF	CAACTGGTCACGCTGATCG
cr1-DR	CTGTTCAACCTGGTCCAGCC
		cr2-UF	GCCATGCTAACTCGTCCAAAC
cr2-DR	GCGTATGAAGAGCGGTGAGC
		cr3UF	GTGGAATTACTGGCAGCGAC
cr3DR	CGGTGGTATATTCCCTTCTGATG
		cr4UF	CTGCATGTACGTGCCTTCC
cr4DR	GCTACCGAAGGGACTATTCCTC
		cr5-UF	CAGAGATGGAAATTACCCTGCAAG
cr5-DR	CGTTTGCCGTTCAACAACG
		cr6UF	GGTGCAAGTATCATCACCACTTC
cr6DR	GTCGATTACGAGACGTTGATGAAG
		cr7UF	CTGGTATCGTAAAATGGTTCAACG
cr7DR	CCATGTCCTGACCTGGGTTC
		cr8UF	TCTTCCGCATTACCCTGGTG
cr8DR	TACACTGAACTCTCTGGCTCAC

注：表中引物名称后缀F代表正向引物，R代表反向引物。

PCR体系与反应条件同步骤1.6。

通过菌落PCR与核酸凝胶电泳验证各克隆基因组8位点的插入情况，如图4所示，目的菌落随着传代，8位点的插入数目迭代增加。

通过对传代过程中各菌落的基因组8位点的插入拷贝数进行统计，得到如图5所示的传代过程中基因组8位点被插入位点的数目变化的柱形图。随着传代时间的增长，基因组中目的基因的插入拷贝数整体明显增加，高拷贝菌株占比也呈增加的趋势。

实施例3靶向BL21(DE3)基因组8个不同位点构建GDH生产菌株

葡萄糖脱氢酶(GDH)(EC:1.1.1.47)是用于NAD(P)H再生的重要生物催化酶，目前在中国是以pET系统进行生产。我们将pDonor上的目的基因cargo替换为T7-GDH表达盒，以获得整合系列拷贝数的工程菌，并与pET24a的表达效果进行比较，探索是否能通过MUCICAT系统改造出比pET24a表达更优良的GDH工业菌株。

表3、pDonor-GDH质粒构建与验证所需引物

引物	序列(5'→3')
		GDH-F	TTTCATGAAGAGGTCATTTCCGGGGATCCGGCGTAGAGGATCGAGATC
GDH-R	AGCAAAACTACTGCAGTAAGGACTCTAGAATCCGGATATAGTTCCTCCT
		Donor-350F	CAGCAACTTAACCACAAAACAAC
Donor-200R	CCAATATGGACAACTTCTTCGC

注：表中引物名称后缀F代表正向引物，R代表反向引物。

3.1酶切质粒pDonor

将质粒pDonor进行BamHI与XbaI限制性内切酶双酶切，酶切反应体系(50μL)：

酶切反应条件：37℃，1h。通过凝胶电泳分离酶切后质粒片段并胶回收，获得pDonor骨架片段。

3.2PCR T7-GDH片段

使用表3的引物对GDH-F/R，以pET-GDH为模板，PCR获得与酶切后pDonor骨架连接的T7-GDH片段。

Prime Star Mix试剂盒购自TAKARA公司。

PCR反应条件：

PCR产物通过凝胶电泳分离酶切后质粒片段并胶回收，获得T7-GDH片段。

将酶切后pDonor骨架与T7-GDH片段进行连接。

3.3连接构建质粒pDonor-GDH

在50℃温育30min后，将连接产物全部转化至DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB固体平板上进行筛选，获得质粒pDonor-GDH。用Donor350R与Donor200F引物测序验证质粒正确。重组连接试剂盒购自诺维赞公司。

3.4转化转座工具质粒与诱导转座

转化pDonor-GDH、pTnsABC与pQCascade-array1至大肠杆菌BL21(DE3)，IPTG诱导转座相关酶表达，步骤同1.4。为增加基因组目的基因的插入拷贝数，进行适当传代以延长转座时间，步骤同1.4。

3.5菌落PCR鉴定目的基因插入情况

选取含1mM IPTG诱导剂的平板上的克隆进行菌落PCR鉴定，确定T7-GDH基因表达盒的插入拷贝数。菌落PCR使用验证引物见表2，反应体系与条件同步骤1.6。

3.6质粒消除

为了获得表达量及酶活最优的菌株，即获得T7-GDH基因表达盒的最优拷贝数，我们需要将不同拷贝数T7-GDH基因表达盒的菌株进行质粒丢除，以排除pDonor质粒上T7-GDH基因表达盒的干扰与停止转座、维持菌株稳定。我们将本实验室构建的质粒pEcCas(参见中国专利申请CN201911291240.0，其包含cas9核酸酶基因、λ-RED重组酶基因、araC蛋白基因、sacB基因、复制子pSC101、鼠李糖调节蛋白RhaS/RhaR基因、用于将Cas9导向辅助质粒DNA序列的sgRNA序列。)的sgRNA替换为靶向pDonor、pTnsABC与pQCascade质粒骨架上AmpR启动子的共有序列，该共有序列参见序列5(5’-TATTATTGAAGCATTTATCAGGG-3’，SEQ ID NO:5)，构建出质粒pCutamp用以消除转座工具质粒，质粒pCutamp图谱见图6。质粒pCutamp含有cas9基因、sacB基因、sgRNA。

具体消质粒步骤：

2)将步骤1)平板上所获的阳性克隆分别点平板至氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素的单一抗生素LB固体平板上，同时点平板至含10g/L蔗糖的LB固体平板上反筛消除质粒pCutamp自身。

3)选取步骤2)中氨苄青霉素、卡那霉素和链霉素的单一抗生素LB固体平板上不能生长、但在蔗糖平板上生长的克隆，点平板于安普霉素平板，验证pCutamp质粒消除，得到消除所有质粒的GDH生产菌株。

按以上步骤，将GDH表达盒靶向基因组8个不同位点并诱导传代3次的菌株消除质粒后，获得了最高拷贝数为8的含系列T7-GDH表达盒拷贝数的酶表达菌株库。

3.7GDH生产菌株的酶活测试

GDH的生产目前常用策略是用pET系列质粒表达，因此酶活测试时添加含有pET24a-GDH质粒的菌株作为对照。摇瓶发酵步骤如下：将整合有多拷贝T7-GDH基因表达盒或带有pET24a-GDH的大肠杆菌BL21(DE3)在3mL LB液体培养基中于37℃过夜培养。然后，将上述300μL培养物分别接种到250mL摇瓶中的30mL Terrific Broth(TB)培养基中。将细胞在37℃下培养至OD₆₀₀＝2-4，此时加入IPTG至终浓度为0.3mM，并在28℃下继续发酵40小时。

为测定GDH的酶活，4℃下1,500×g离心10min，收集1mL的发酵培养物。弃去上清培养液，用1mL的100mM Tris-HCl(pH 7.5)重悬细胞。在冰上超声处理获得细胞裂解液，即粗酶液，超声条件：200W，工作3s，间隔5s，40次。酶活测试的反应混合物包含100mM葡萄糖，100mM Tris-HCl(pH 7.5)，2mM NAD和稀释8000倍的粗酶液，于25℃下进行反应。GDH会将NAD⁺转化为NADH，使OD₃₄₀吸光度增加。通过记录OD₃₄₀吸光度的变化，可由下式计算GDH酶活：U/mL＝[ΔA/min]×[1/ε]×8000(ε＝A/cL＝6.402mL/(/mol*cm))。

如图7所示，利用MUCICAT系统得到的基因组含不同拷贝数的T7-GDH基因表达盒的菌株，与传统pET24a表达的菌株在摇瓶水平进行酶活比较。结果显示基因组3至6个位点插入T7-GDH基因表达盒插入的菌株，其GDH酶活均明显超出工业pET24a表达菌株。摇瓶发酵40h，工业pET24a表达菌株中表现最好的菌株的酶活位160.95U/mL，但此时MUCICAT系统的6位点插入的GDH生产菌株酶活已达到460.76U/mL，是pET24a表达菌株的2.86倍。

实施例4改造CAST系统靶向大肠杆菌染色体IS1序列实现目的基因多拷贝整合

表4、pSC101-Donor与pT7-Helper质粒构建与验证所需引物

注：表中引物名称后缀F代表正向引物，R代表反向引物。

4.1PCR质粒pDonor_ShCAST_kanR骨架与pSC101复制子

使用表4中的引物对101-DonorF/R与pSC101-F/R，分别以pDonor_ShCAST_kanR(购自Addgene#127924)与pKD46质粒(参见Datsenko KA,Wanner BL.One-step inactivationof chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products.Proc NatlAcad Sci U S A.2000,97(12):6640-5.)为模板进行PCR。

Prime Star Mix试剂盒购自TAKARA公司。

PCR反应条件：

PCR产物通过凝胶电泳分离酶切后质粒片段并胶回收，获得带有约20bp重叠序列的DNA片段：无复制子的pDonor_ShCAST_kanR质粒片段与pSC101复制子片段。

4.2连接构建质粒pSC101_Donor

将无复制子的pDonor_ShCAST_kanR片段(片段1)与pSC101复制子片段(片段2)进行连接。重组连接试剂盒购自诺维赞公司。

连接体系(10μL)：

连接Mix 5μL

片段1 2.5μL

片段2 2.5μL

在50℃温育30min后，将连接产物全部转化至DH5α感受态细胞中，在含有卡那霉素的LB固体平板上进行筛选，获得质粒pSC101_Donor。用DonorRE-F引物测序验证质粒复制子正确替换为pSC101。

4.3构建质粒pT7_Helper

使用表4中的引物对T7-HelperF/R和Helper-T7F/R，分别以pHelper-ShCAST-sgRNA(简写为pHelper，购自Addgene#127921)与pQCascade_entry质粒为模板进行PCR，获得pHelper质粒片段(片段1)与T7-lacI片段(片段2)。PCR反应体系与反应条件同4.1。

将两片段进行连接，连接体系同4.2，在50℃温育30min后，将连接产物全部转化至DH5α感受态细胞中，在含有氨苄青霉素的LB固体平板上进行筛选，获得质粒pT7_Helper。用pBR322ori-F引物测序验证质粒正确。

4.4酶切获得pT7_Helper质粒片段

LguI限制性内切酶酶切pT7_Helper质粒，获得pT7_Helper质粒片段。

酶切反应条件：37℃，1h。通过凝胶电泳分离酶切后质粒片段并胶回收。限制性内切酶试剂盒购自Fermentas公司，DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司。

4.5引物退火自搭

表4中的引物对CASTIS1-F/R通过退火自搭，可获得含有4bp粘性末端的spacer片段，该粘性末端与pT7_Helper质粒骨架LguI酶切后的粘性末端互补。

4.6连接构建质粒pT7_Helper_IS1

16℃连接1h。T4连接酶试剂盒购自TAKARA公司。

将上述连接产物全部转化至DH5α感受态细胞中(购自深圳康体生命科技有限公司)，在含有氨苄青霉素的LB固体平板上进行筛选，获得质粒pT7_Helper_IS1。用Amp-R引物测序验证正确。

4.7转化转座工具质粒与诱导转座

电转化pSC101-Donor与pT7-Helper_IS1至大肠杆菌BL21(DE3)，30℃条件下在含氨苄青霉素与卡那霉素的LB固体平板上进行筛选，过夜生长。将上述平板上的克隆刮取一部分重悬于液体LB培养基中，重新涂布于含有终浓度0.1mM IPTG、氨苄青霉素与卡那霉素的LB固体平板上，IPTG诱导转座相关酶的表达。30℃条件下培养16h，可能会形成一层菌膜，属正常情况。将上述含有0.1mM IPTG平板上的克隆刮取一部分重悬于液体LB培养基中，调整OD₆₀₀至约0.5后，用液体LB培养基稀释50倍，吸取100μL涂布于添加了终浓度1mM IPTG、氨苄青霉素与卡那霉素的LB固体平板上，30℃条件下培养24h。

为了提高插入拷贝数，可以选择传代延长转座时间。随机选取上述含1mM IPTG诱导剂的平板上的克隆，用10μL枪头蘸取克隆，点在新的含1mM IPTG和上述三种抗生素的LB固体平板上，换用200μL枪头从点处起始进行划线，分离出单菌，30℃条件下培养24h，平板上新生长的菌落即为第2代菌落。以新生长的菌落为出发菌落，重复上述操作，可获得第3、4……n代菌落。

4.8菌落PCR鉴定靶向IS1的拷贝数

将IS1位点以LE-KanR-RE方向插入目的基因的序列作为参考，设计特异性的29个PCR引物对insBF/IS1-1R～insBF/IS1-30R与IS1-25F/R(见表4)，通过菌落PCR，验证E.coliBL21(DE3)中29个IS1位点插入情况。

质粒pSC101-Donor上的供体插入片段包括LE(Left End)、RE(Right End)和KanR片段，共2210bp，阳性条带约3000bp，阴性条带约800bp。在第3代平板上选取部分菌落进行37℃培养并转入pCutamp质粒，消除转座质粒，分离单菌后进行菌落PCR验证，成功筛选到两个菌株(即3号与6号菌株)实现了双拷贝插入。凝胶电泳图如图8所示。

以上结果验证了本发明的MUCICAT系统可用于细菌的基因多拷贝整合，快速高效地生成包含不同拷贝目的基因的菌株文库。

还需说明的是，本说明书中对先前公开的文献的列举和论述不应视为承认该文献是现有技术或者是公知常识。

序列表

<110> 中国科学院上海生命科学研究院

<120> 一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法

<130> SHPI2010020

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 1

tggatgcttt gcgtgcaaag gaacctgaac tc 32

<210> 2

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

tggcacggct gggacggaag tcgctgtcgt tc 32

<210> 3

<211> 520

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

ccatgggtga actgccgagt aggtagctga taacgcctgg cttggcgatg ctcgcctgat 60

cgacaagtga actgccgagt aggtagctga taacgagaat attgtggcaa aagcgcataa 120

ggtgctgtga actgccgagt aggtagctga taacgtcaga gtggcgtatc cgatgaatca 180

ccacaggtga actgccgagt aggtagctga taacgcagaa gtgcacggcg tgtgcggcgg 240

cgagcagtga actgccgagt aggtagctga taactcgatc cgtgggtgtt tatgttctca 300

gcaggagtga actgccgagt aggtagctga taacttactt acggcgttgc gcattctcat 360

tgcaccgtga actgccgagt aggtagctga taacgcatta ctaagctggc gcgtgaagct 420

gtagaagtga actgccgagt aggtagctga taacggggcg taaaaagaag gggcgctgat 480

taacgcgtga actgccgagt aggtagctga taacggatcc 520

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

ttttatgttc agataatgcc cgat 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

tattattgaa gcatttatca ggg 23

Claims

1.一种在细菌染色体中快速多拷贝整合目的基因的方法，包括下述步骤：对于CRISPR-Cas相关的转座系统INTEGRATE系统或者CAST系统，改造其crRNA表达质粒中靶向基因组单一位点的crRNA序列，使改造后的crRNA靶向细菌染色体中多拷贝序列或者多个位点，引导目的基因插入这些位点，实现目的基因在细菌染色体上多拷贝插入。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造后的crRNA靶向基因组中多拷贝序列；或者形成两种以上分别靶向细菌染色体中不同位点的crRNA阵列。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述改造后的crRNA或crRNA阵列克隆在INTEGRATE系统中的V型CRISPR核酸酶表达质粒pQCascade上、或者CAST系统中的pHelper上进行表达；或者可选地由单独的载体表达。

4.如权利要求3述的方法，其特征在于，当改造后的crRNA由INTEGRATE系统中的pQCascade或者CAST系统中的pHelper表达时，质粒pQCascade或pHelper、INTEGRATE系统或者CAST系统中的目的基因表达载体pDonor、以及INTEGRATE系统中的转座酶表达载体pTnsABC转入细菌感受态细胞，并进行筛选。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，进一步对筛选的菌株进行质粒消除，获得无质粒的基因编辑菌株。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌。

7.一种用于实施如权利要求1-6中任一项所述方法的基因编辑系统，其包括：INTEGRATE系统中的V型CRISPR核酸酶表达质粒pQCascade、或者CAST系统中的pHelper，该pQCascade或pHelper上克隆有分别靶向细菌染色体中多个位点的crRNA阵列(crRNAarray)；INTEGRATE系统或CAST系统中的质粒pDonor，其包含目的基因；INTEGRATE系统中的转座酶表达载体pTnsABC，从而构成三质粒系统。

8.如权利要求7所述的基因编辑系统，其特征在于，还包含用于消除质粒pQCascade或pHelper、pDonor和pTnsABC的质粒pCutamp，从而使基因编辑系统成为四质粒系统，所述质粒pCutamp含有cas9基因、sacB基因、靶向所述三质粒的crRNA。

9.如权利要求8所述的基因编辑系统，其特征在于，所述pQCascade包含霍乱弧菌来源的cas5678核酸酶基因、tniQ基因、crRNA阵列、CloDF13复制子、T7启动子、lacI阻遏蛋白基因、链霉素抗性基因；所述pHelper质粒包含霍氏双岐藻来源cas12k核酸酶基因、tnsBC、tniQ转座酶基因、crRNA阵列、pBR322复制子、J23119组成型启动子、氨苄青霉素抗性基因。

10.如权利要求8所述的基因编辑系统，其特征在于，呈试剂盒形式，其包含质粒pQCascade或pHelper、pDonor、pTnsABC。