CN111893130A - 一种pcci-2u质粒及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PCCI‑2U质粒及其构建方法和应用，所述的质粒命名为PCCI‑2U，质粒包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、oriV复制子、原核转录终止子T3te和tonB终止子、trp基因和yeast 2μ复制子基因。本发明的提供的一种PCCI‑2U质粒及其构建方法和应用，在大肠杆菌中具有拷贝数低、容量大、稳定性高等特点，在酵母中依赖高拷贝的2μ复制子能稳定复制，具有编码色氨酸的TRP基因，可以利用SC‑rtp半合成培养基进行筛选。本发明的PCCI‑2U可用长基因的酵母内组装，用于长片段基因、结构复杂基因的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工程领域。
Description
技术领域
本发明属于生物技术及基因工程领域，具体涉及一种能够在单拷贝和中拷贝之间切换、大容量、高稳 定性的酵母-大肠穿梭载体PCCI-2U质粒的构建方法和应用。
背景技术
现代生物学建立以来，从解码一个人的基因组计划的人类基因组计划，到分析人群差异性的HapMap， 再到利用基因组围剿疾病的GWAS以及现在的精准医疗，在基因组巨大的宝藏之中，人类的探索从未停止。 现在科学家已经有能力从头建构或者重编程大肠杆菌或者酵母的基因组。
基因组组装技术基于大规模基因组数据分析,发现新型的或隐藏的生物活性物质合成基因簇。利用基因组 装技术,可提高或激活沉默的生物合成基因簇在微生物中的表达,从而合成潜在的、有价值的生物活性物 质。
TAR(转化重组技术)是利用酿酒酵母体内高效的同源重组系统实现多个具有末端重叠序列的DNA片 段的一步组装方法，它不仅能够方便地将较短的DNA片段组装成较长的DNA片段，甚至还能够实现整个基 因组的组装。2016年3月，测序和合成生物学先驱CraigVenter及其同事们宣布，他们重编码了支原体 细菌的基因组，将其基因组大小从约一百万碱基减少到五十万碱基，使用TAR技术创建了“最小”基因组 ——这是目前维持生命所需的最小基因组。
酵母菌也有质粒存在，这种2pm长的质粒称为2um质粒，约6300bp。这种质粒至少有一段时间存在 于细胞核内染色体以外，利用2um质粒和大肠杆菌中的质粒可以构建成能穿梭于细菌与酵母菌细胞之间的 穿梭质粒。酵母克隆载体都是在这个基础上构建的。应用TAR克隆方法需要将DNA克隆到大肠-酵母穿梭 载体。
人们为了克隆大片段DNA，创造了很多人工染色体载体，例如酵母人工染色体YAC，大肠杆菌人工染 色体BAC。
酵母人工染色体YAC能够用于克隆100-1000kb的基因组，容量远远大于大肠人工染色体BAC载体， YAC载体的主要元件包括端粒序列CEN和自主复制序列ARS，能够确保载体能随着酵母的有丝分裂稳定复 制。YAC载体的主要元件也包括筛选标记基因，例如合成亮氨酸的leu基因，当转化leu基因突变的酵母 菌株，涂布于缺少亮氨酸的培养基SC-LEU时，只有含YAC载体的酵母克隆才能在平板上生长。
大片段DNA的克隆伴随的问题有：常规载体克隆大片段DNA有容量限制，克隆20k以上的基因时往往 出现序列缺失，克隆失败等问题。克隆的DNA基因转录对大肠杆菌有毒性的RNA或编码毒性蛋白时，会导 致大肠杆菌死亡，最终无法获得阳性克隆的质粒。大片段DNA基因存在毒性基因及不稳定基因的概率大于 小片段DNA，因此更难于克隆。常规克隆载体DNA序列包括复制子、抗性基因、多克隆位点序列，载体序 列上的启动子可能会对插入序列进行通读和转录，或插入序列中的启动子可能会发生序列通读，影响载体 元件的基因表达，这也会导致基因的克隆失败。
序列通读会导致外源基因的转录翻译，可能导致外源DNA的克隆失败。序列通读指的是RNA聚合酶结 合启动子序列，持续转录RNA，在终止子位置从DNA上脱落，如果没有终止子序列，RNA聚合酶会在转录 当前基因后继续转录，一直到从DNA上脱落为止。
利用BAC载体进行大片的DNA的克隆，相比常规克隆载体，例如PUC57，因为该载体在大肠中以单拷 贝的形式存在，随大肠杆菌染色体一起复制，能够容纳更多的DNA片段，能够保持DNA的稳定性，能克隆 不稳定的序列(发卡结构、重复序列、Z-DNA等)，包括克隆毒性基因(病毒基因组)。
大肠杆菌基因工程载体的拷贝数由载体的复制子决定。质粒的复制子与细菌用来复制基因组的复制起 点是分开的，受到不同的调控。例如，大肠杆菌质粒pBR322使用一种叫做Rop/Rom的蛋白质(来源于pMB1 质粒)来调节每个细菌细胞内质粒的数量。这限制了每个细胞的质粒数量即拷贝数到30-40。
更为常用的质粒包括pUC19在内的pUC系列质粒。与pBR322相比，它的ori存在点突变，并且删除 了Rop/Rom基因。通过这些改变，每个细胞可以产生多达500个拷贝，这使得可以生产大量用于研究目的 的DNA。质粒复制的其他来源包括pSC101(来自沙门氏菌，每个细胞约5份)、15A来源(来自p15A，每个 细胞10-20份)和细菌人工染色体(每个细胞1份)。
常规的细菌人工染色体BAC载体利用大肠杆菌F’因子的复制系统，包括repE、sopA、sopB、sopC基 因，在大肠杆菌中保持一份拷贝。因此，相较常规克隆载体，BAC载体的质粒提取相对更加困难，因为质 粒拷贝数是常规的几十分之一。要提取足够进行下游质粒酶切、测序等实验用的BAC质粒对实验室是个难 题。
Epicentre的PCCI-BAC载体具有可被诱导的oriⅤ复制起点，当BAC质粒转化可诱导表达TrfA的菌 株后，在诱导剂存在的情况下，TrfA可激活oriⅤ复制起点，并使质粒拷贝数由每个细胞1个拷贝提高到 每个细胞10-20个拷贝，从而提高质粒抽提量。
发明内容
针对现有技术中的上述不足，本发明提供了一种PCCI-2U质粒及其构建方法和应用，质粒是一种大肠 -酵母穿梭载体，在大肠杆菌中具有拷贝数低、容量大、稳定性高的特点。
为了达到上述发明目的，本发明采用的技术方案为：
一种PCCI-2U质粒，所述PCCI-2U质粒包括trp基因和yeast 2μ复制子基因、repE基因、sopA基因、 sopB基因、sopC基因、ori2复制子、可经诱导使质粒拷贝数提高至约10个拷贝的oriV复制子、抗生素 抗性基因以及原核转录终止子T3te和tonB，原核转录终止子位于克隆位点两端。
优选的，所述抗生素抗性基为编码氯霉素乙酰转移酶的Cm基因，抗生素抗性基因可以为氨苄青霉素 抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kanr)、四环素抗性基因(Tetr)、链霉素抗性基因(Strr)和 氯霉素抗性基因(Cmlr)、壮观霉素抗性基因(Sper)或庆大霉素基因(Gmr)。
优选的，所述酵母中筛选标记基因为编码色氨酸的TRP基因，筛选标记基因可以为编码尿嘧啶的ura 基因、编码亮氨酸的leu基因、编码组氨酸的His基因。
优选的，所述酵母复制子基因为端粒序列和自主复制位点CEN-ARS，为酵母2μ复制子。本方案中选 择的2μ复制子为高拷贝
优选地，原核转录终止子为不依赖Rho因子的终止子，可以为噬菌体T7终止子、rrnB终止子以及T0 终止子，噬菌体T3早期转录终止子T3Te，大肠杆菌tonB-P14转录终止子tonB。
优选的，所述质粒具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述质粒中，自5’端第1bp～30bp为终 止子T3Te，58bp～135bp为多克隆位点区域，155bp～186bp为终止子tonB，200bp～1156bp为Trp基因， 1901bp～3243bp为2μ复制子基因，3388bp～4047bp为氯霉素基因，5008bp～5622bp为oriV基因，6008bp～ 6763bp为repE基因，7342bp～8517bp为sopA基因，8517bp～9488bp为sopB基因，9561bp～10034bp 为sopC基因。
一种构建PCCI-2U质粒的方法，包括以下步骤：
步骤一：分别设计并人工合成如SEQ ID NO.1所示序列结构的trp-酵母，SEQ IDNO.3所示序列复制 子2μ基因序列、如SEQ ID NO.2所示序列结构的CmR-ori2基因序列、、如SEQ ID NO.4所示序列结构 的repE–sopA-sopB-sopC基因序列、如SEQ ID NO.4所示的原核转录终止子和多克隆位点T3t-MCS-TonB 基因序列。
步骤二:运用Gibson重组方法将所述的4个基因序列连接环化，最终得到环形质粒。
所述PCCI-2U质粒在基因克隆、基因组组装和测序领域中的应用。
本发明的有益效果为：
本发明的PCCI-2U质粒具有拷贝数低、容量大、稳定性高、操作难度低等特点，可用于结构复杂基因、 包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因在酵母或大肠中的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工 程领域。
附图说明
图1为PCCI-2U质粒的物理图谱；
图2为PCCI-2U质粒构建流程模式图；
图3为PCCI-2U载体构建腺病基因组毒DNA序列重组质粒的构建流程模式图；
图4为PCCI-2U载体构建腺病基因组毒DNA序列重组质粒的酶切验证图，其中1为重组质粒用限制性内切 酶MluI和EcoRI酶切结果；2为重组质粒对照；3为1KB DNA Marker。
具体实施方式
下面结合附图来进一步说明本发明的具体实施方式。其中相同的零部件用相同的附图标记表示。
需要说明的是，下面描述中使用的词语“前”、“后”、“左”、“右”、“上”和“下”指的是附图中 的方向，词语“内”和“外”分别指的是朝向或远离特定部件几何中心的方向。
为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的 技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例
质粒PCCI-2U的构建：
质粒PCCI-2U的结构如图1所示，其构建流程模式图如图2所示，具体方法如下：
(1)设计并合成Trp-2μ基因基因序列如序列表中的序列1、序列3所示，序列1长度957bp，为trp 基因，编码色氨酸合成酶，序列3长度1343bp，为2μ复制子。序列和上下游序列带有同源序列30bp。
(2)设计并合成Cm-oriⅤ-ori2基因，基因序列如序列表中的序列2所示，序列全长2530bp，其中1-763 为氯霉素抗性基因，编码氯霉素乙酰转移酶，1620-2235bp为oriⅤ复制子基因，2310-2530bp为ori2复制 子基因；
(3)设计并合成repE-SopA-SopB-SopC基因，基因序列如序列表中的序列5所示，序列全长4027bp， 其中1-756bp为repE基因，编码repE蛋白，1334bp-2510bp为SopA基因，2511-3480bp为SopB基因， 3553bp-4027bp为SopC基因；
(4)设计并合成T3t-MCS-TonB基因，基因序列如序列表中序列6所示，序列全长186bp。其中1-30bp 为终止子T3t序列，74-106bp为多克隆位点，包含EcoRI和NotI位点，两端为M13-47，M13-48引物序列， 用于插入序列的测序，154-186bp为TonB终止子序列。
(5)分别合成以上四个基因片段，由于四个片段之间具有30bp重叠互补区，因此使用2*GenRec重 组试剂盒(通用生物系统有限公司)将它们组装起来最终得到环形的质粒，记为PCCI-2U。
质粒酶切和测序结果表明构建出的质粒与预期相符。
质粒PCCI-2U稳定性检测：
(1)将质粒PCCI-2U转化到大肠杆菌EPI300感受态细胞中，挑取单克隆菌落在含有氯霉素抗生素 (15-50μg/μl)的LB培养基中过夜培养16小时，对培养的菌液在含有氯霉素抗生素(15-50μg/μl)的平板上 划线培养，对划线得到的单克隆重新在含有氯霉素抗生素(15-50μg/μl)的平板上再进行一次划线培养，由 此得到纯的阳性转化克隆。
(2)将得到的纯的阳性转化克隆接种到不含有抗生素的LB培养基中，37℃培养20代(约7h)后，从 中取100μl接种至新的不含有抗生素的培养基LB中，37℃继续培养20代，如此重复6次。最后分别得 到40代、60代、80代、100代和120代的细菌，取上述各代菌液100μl，稀释100倍后分别接种至不含 有抗生素的LB平板上和含有氯霉素抗生素(15-50μg/μl)的LB平板上，37℃培养过夜。
(3)无抗生素条件下质粒的保持率＝含有氯霉素抗生素(15-50μg/μl)的LB平板上的存活菌落数/不 含有抗生素的LB平板上的存活菌落数。
(4)无选择压力的情况下，质粒PCCI-2U连续培养120代，保持率为100％。
利用质粒PCCI-2U转化酵母克隆腺病毒基因组：
所构建的序列为猴腺病毒基因组的完整基因序列，NCBI序列编号AF394196.1，最终构建大小33594bp。 图3所示为基因组构建到PCCI-2U的整个实验流程。
(1)大片段的基因合成
首先将整个基因组序列平均分为8个大片段，每个大片段4000bp-4200bp，8个大片段的基因序列两端 各带有80bp同源序列，便于在转化酵母后互相重组。
设计基因合成的引物，引物合成于通用生物系统(安徽)有限公司，分别基因合成500bp-700bp的小 片段DNA克隆到puc57载体。
PCR扩增500bp-700bp的小片段，拼接4000bp左右的全长序列，两端带有40bp PCCI载体的重组臂， 用2*GenRec重组试剂盒(通用生物系统有限公司)克隆到PCCI载体。由于所克隆的基因为病毒基因组，其 中有部分基因的表达产物对大肠杆菌有毒性，例如病毒衣壳蛋白，病毒的反转录酶，整合酶等，所以需要 克隆到单拷贝载体PCCI。
8个大片段正确后，PCR扩增每一个大片段，胶回收PCR产物。为了确保大片段扩增的质量，保证序 列的保真性，所用PCR聚合酶为通用生物系统(安徽)有限公司的高保真酶GPV8 HF DNA聚合酶。
用EcoRI和NotI酶切PCCI-2U质粒作为载体，PCR柱纯化酶切产物。对纯化后的DNA进行电泳检 测，用ONE DROP对DNA浓度进行测定。
(2)酵母转化组装多个DNA片段
使用的酵母菌株为MaV203菌株。
取原始菌株划线于YPD平板，30度培养2天，挑取单克隆于10ml YPD培养基提取酵母质粒。扩大 培养至50ml YPD培养基至OD＝0.6。5000rpm离心5min，弃上清，加入0.1MLiOAC洗涤，重复上述离心 步骤，再次加入LiOAC重悬细胞。加入PEG-LiOAC-DMSO转化液，加入纯化后的8个DNA大片段和酶 切后的线性化载体DNA以及ssDNA，每个片段各加50ng，载体添加量190ng。37度培养30min，42度培 养10min，涂布于SC-trp平板上，30度培养3天至酵母克隆长至1-2mm大小。
挑取单克隆于SC-TRP液体培养基中培养18-20小时，提取酵母质粒。将提取的酵母质粒转化大肠杆 菌stable，30度。
挑取单克隆提取质粒，酶切验证，测序。酶切结果显示猴腺病毒基因组成功的克隆到PCCI-2U载体中， 见说明书附图4。测序结果显示序列正确，证明基因组的成功构建。
本发明利用人工合成的方法，合成一种单拷贝PCCI-2U质粒，主要技术手段是利用低拷贝致育因子的 复制元件，在大肠杆菌中保持一个拷贝，该质粒转化可经诱导表达的TrfA菌株后，在诱导剂如阿拉伯糖 存在的情况下，TrfA可激活oriⅤ复制起点，并使质粒拷贝数由每个细胞1-10拷贝提高到每个细胞30-50 拷贝，从而提高质粒抽提量。
常规克隆载体，例如puc57，pBluescript系列载体，带有pMB1复制子，为高拷贝质粒，具有蓝白斑 筛选功能，这给外源基因的克隆带来方便，但是驱动LACZ基因表达的载体启动子同时也会驱动外源基因 的转录和翻译，当外源基因表达的产物对细胞存在毒害作用时，例如克隆基因为限制性内切酶基因，其表 达会导致细胞内的DNA序列被切断。外源基因难以克隆到该类型载体。即使克隆的基因对细胞无毒害作 用，额外表达对细胞生存本身无用的过量产物(基因、RNA、蛋白)对细胞本身造成了负担，当外源DNA 片段过大时，细胞本身的能量、物质供给无法满足，负担过重对细胞也是一种另类的毒性。
PET系列载体由于携带ROP元件，其拷贝数较低，可降低至10-30个拷贝。由于其载体携带LacI抑 制子基因，能够严格控制蛋白的泄露表达，只有当添加IPTG诱导后才能表达。能够克隆一些对细胞呈毒 性的蛋白基因。但PET系列载体由于拷贝数限制，仍然不能够克隆基因组。克隆基因组序列仍然需要依靠 BAC载体或YAC载体。
PCCI-2U质粒时一种综合BAC和YAC的穿梭载体，能够在大肠中克隆同时其多克隆位点上下游无强 启动子，并且两端添加了即不依赖ρ因子的原核生物转录终止子，一能避免载体序列的启动子的通读效应 对外源基因的转录和翻译，二能够避免外源基因的启动子序列对载体元件序列的转录和翻译。因此能够有 效遏制外源基因的转录、翻译，从而使该质粒能够克隆因外源基因表达对宿主细胞有毒害的基因。
使质粒拷贝数由每个细胞1-10拷贝提高到每个细胞30-50拷贝从而提高质粒抽提量。
本发明所述PCCI-2U质粒可以克隆0.1kb-150kb的基因片段，容量较大：具有在酵母中可供转化子选 择的氨基酸筛选标记；并且具有在大肠杆菌中可供转化子选择的标记抗生素抗性基因；同时具有两个大肠 杆菌复制子，在不能表达trfA的菌株中以低拷贝形式复制以提高质粒的稳定性；在能够表达trfA的菌株中 oriⅤ可以启动质粒的高拷贝复制，方便后续质粒制备等实验操作；所述质粒在没有选择压力的情况下，连 续培养120代，质粒的保持率均为100％，具有较高的稳定性，且能够克隆高拷贝、低拷贝所不能克隆的 外源基因。
本发明的PCCI-2U质粒具有拷贝数低、容量大、稳定性高、操作难度低等特点，可用于结构复杂基因、 包括重复序列、不稳定基因以及长片段基因在酵母或大肠中的克隆、筛选、测序和基因组的构建等基因工 程领域。
以上所述仅为本发明专利的较佳实施例而已，并不用以限制本发明专利，凡在本发明专利的精神和原 则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明专利的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种pCCI-2U质粒，其特征在于，包括repE基因、sopA基因、sopB基因、sopC基因、ori2复制子、可经诱导使质粒拷贝数提高至10个拷贝的oriV复制子、抗生素抗性基因以及原核转录终止子T3te和tonB，所述原核转录终止子T3te和tonB位于克隆位点两端；
所述pCCI-2U质粒中，自5’端第1bp～30bp为终原核转录终止子T3Te，58bp～135bp为多克隆位点区域，155bp～186bp为原核转录终止子tonB，200bp～1156bp为Trp基因，1901bp～3243bp为2μ复制子基因，3388bp～4047bp为氯霉素基因，5008bp～5622bp为oriV基因，6008bp～6763bp为repE基因，7342bp～8517bp为sopA基因，8517bp～9488bp为sopB基因，9561bp～10034bp为sopC基因。
2.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其特征在于：所述PCCI-2U质粒包括trp基因和yeast 2μ复制子基因，所述PCCI-2U质粒在酵母中以高拷贝的特点维持，所述PCCI-2U质粒具有编码色氨酸的TRP基因。
3.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其特征在于：所述抗生素抗性基因编码氯霉素乙酰转移酶的Cm基因。
4.如权利要求1所述的一种PCCI-2U质粒，其特征在于：所述PCCI-2U质粒在大肠杆菌中的拷贝数维持在一个拷贝，转换具有trfA gene的大肠杆菌，通过诱导剂诱导提高拷贝数至10个以上拷贝。
5.一种构建权利要求1～4任一所述PCCI-2U质粒的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一：分别设计并人工合成SEQ ID NO.1所示序列结构的trp-酵母复制子2μ基因序列、SEQ ID NO.2所示序列结构的CmR-ori2基因序列、SEQ ID NO.3所示序列结构的repE-sopC基因序列、SEQ ID NO.4所示的原核转录终止子和多克隆位点基因序列；
步骤二:运用Gibson重组方法将步骤一中的4个基因序列连接环化，最终得到环形质粒。
6.如权利要求4所述PCCI-2U质粒的方法，其特征在于，所述trp-酵母复制子2μ基因序列、CmR-ori2基因序列、repE-opC基因序列、原核转录终止子和多克隆位点基因序列之间具有30bp-40bp的重叠互补区。
7.如要求1～4所述的PCCI-2U质粒在基因克隆、基因合成、测序领域中的应用。
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