CN102051374A - 一种食品级酿酒酵母重组质粒的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基因工程技术领域，提供了一种食品级酿酒酵母重组质粒的制备方法：首先，构建含有酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子和酵母终止子的穿梭质粒酵母载体部分；同时，构建含有酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因的外源基因表达盒；然后，将穿梭质粒酵母载体部分与外源基因表达盒共转化相应营养缺陷型酿酒酵母菌株，在营养缺陷选择性培养基上筛选培养转化子；最后，分离纯化获得目的酿酒酵母重组质粒。该表达质粒只能够在酿酒酵母细胞内生存，不会转移，可以安全、高效的广泛的用于表达各种外源基因。

Description

一种食品级酿酒酵母重组质粒的制备方法

技术领域

本发明属于生物基因工程技术领域，具体涉及一种食品级酿酒酵母重组质粒的制备方法及其应用。

背景技术

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统是最早建立的酵母表达系统，自1981年Hitzeman等首次在酿酒酵母中表达了人α干扰素(Hitzeman，R.Aet al.，Expression of a human gene for interferon in yeast.Nature293：717-722，1981)，陆续有上百个外源基因在酿酒酵母中成功表达，其中数十个已作为基因工程药物上市。虽然总体表达水平相对毕赤酵母低，但酿酒酵母表达某些外源基因也可达到克级/升的水平(如酿酒酵母表达黑曲霉葡萄糖氧化酶达到9g/L，Park EH et al.，Expression of glucose oxidase by usingrecombinant yeast.J Biotechnol 81：35-44，2000)，远高于哺乳动物细胞表达系统。酿酒酵母易生长，可以实现高密度发酵(菌体干重可达80-200g/L)，使重组蛋白浓度提高，便于后续纯化(Schmidt F.R.，Recombinant expressionsystems in the pharmaceutical industry，Appl MicrobiolBiotechnol，65：363-372，2004)。而且酿酒酵母具有其独特优势：首先酿酒酵母是一种食品级酵母，培养过程中无内毒素，安全性好，已被美国药品与食品管理局(FDA)认定为安全型微生物，而毕赤酵母发酵过程需添加有毒的甲醇，大规模发酵需要特殊的防爆(explosion-proof)装置；其次酿酒酵母存在高效同源重组机制，且全基因组序列早在1996年就测定完毕，遗传背景清楚，遗传操作十分方便。因此酿酒酵母表达系统是一种理想的安全型表达系统。

目前已建立了多种酿酒酵母表达载体，其中整合型(YIp)和附加体型(YEp)载体使用最多。整合型载体没有自主复制序列(ARS)，而是被整合到酵母细胞基因组上，这类载体的优点是稳定性好，基因不易丢失，但拷贝数较低，有可能影响基因表达量。附加体型载体具有来自酿酒酵母天然质粒2μ复制子(Ori)序列，能够在酵母细胞内自主复制，附加体型载体具有很高的转化效率和拷贝数，但在非选择性培养条件下不稳定，传代时质粒易丢失(Malissard M.et al.，Theyeast expression system for recombinant glycosyltransferases.Glycoconjugate Journal 16：125-139，1999)。载体稳定性、拷贝数、启动子、信号肽等因素都会影响酿酒酵母表达系统的效率。研究者通过对各影响因素的调整优化，增强酿酒酵母系统表达外源重组蛋白能力，取得了不错的效果，如Sleep D.等研究发现一种编码E2泛素连接酶的基因UBC4突变后，明显促进酿酒酵母细胞内2μ质粒拷贝数提高并促进重组人血清白蛋白(rHA)分泌表达(SleepD.et al.，Yeast 2microm plasmid copy number is elevated by a mutationin the nuclear gene UBC4.Yeast 18(5)：403-21，2001)，而一种天冬氨酸蛋白酶基因YAP3敲除后能够减少分泌的rHA蛋白降解，从而提高产量(Kerry-Williams SM et al.，Disruption of the Saccharomyces cerevisiaeYAP3gene reduces the proteolyt ic degradat ion of secreted recombinanthuman albumin.Yeast 14(2)：161-9，1998)。

现有的酿酒酵母表达载体(如Invitrogen公司的pYES2系列载体和Stratagene公司的pESC系列载体)一般为穿梭质粒，即具有大肠杆菌质粒的复制子序列和抗药性基因，能够在细菌细胞内增殖，所需表达的外源基因通过酶切、连接方式克隆于上述穿梭型的表达载体上，然后转化酿酒酵母细胞。这样存在于酵母细胞内的外源基因表达质粒或者整合于染色体上的外源基因表达单元均包含了大肠杆菌质粒序列和抗药基因序列，导致整个发酵系统存在一定的污染隐患。

发明内容

本发明的目的在于提供一种制备安全、高效的酿酒酵母重组质粒的方法。

酿酒酵母细胞内存在着较其他生物更为高效的同源重组机制，两个DNA分子间只要有30-50bp长的同源区段就可以准确、有效地进行同源重组(Bhatia PKet al.，DNA repair and transcription.Curr Opin Genet.Dev.6：146-150，1996)。本发明利用酿酒酵母这一特点，构建了两种载体，一是克隆载体Px-RH，该载体多克隆位点前后分别为酵母启动子和终止子元件，外源基因通过多克隆位点克隆于该载体，形成有酵母启动子-外源基因开放阅读框-酵母终止子组成的外源基因表达盒；二是酵母-大肠杆菌穿梭载体pHR-Px，该载体由酿酒酵母2μ质粒完整序列、酿酒酵母营养缺陷筛选基因、与克隆载体相同的酵母启动子Px、终止子元件以及在大肠杆菌中繁殖所需的大肠杆菌质粒复制子、氨苄青霉素抗性基因序列构成。克隆载体和酵母穿梭载体经限制性内切酶作用，可以分别将各自的大肠杆菌质粒序列和抗药性基因序列去除，所得到外源基因表达盒与酵母载体片段共转化宿主酿酒酵母，在酿酒酵母细胞内通过同源重组机制形成外源基因的酵母表达质粒，该表达质粒完全没有大肠杆菌质粒序列和抗药性基因序列，只能够在酿酒酵母细胞内生存，不会转移。

本发明提供了一种食品级酿酒酵母重组质粒的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)构建含有酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子和酵母终止子的穿梭质粒酵母载体部分；

(2)构建含有酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因的外源基因表达盒；

(3)将(1)获得的穿梭质粒酵母载体部分与(2)获得的外源基因表达盒共转化相应营养缺陷型酿酒酵母菌株，在营养缺陷选择性培养基上筛选培养转化子；

(4)分离纯化获得包含酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因的酿酒酵母重组质粒。

酿酒酵母天然质粒2μ复制子(Ori)序列，能够在酵母细胞内自主复制。

酵母营养缺陷筛选基因与营养缺陷型酿酒酵母菌株相对应，主要为了筛选转化子。

所述的酵母启动子是酵母菊粉酶基因启动子、TEF1基因启动子、ADH1基因启动子、ADH2基因启动子、GAPDH基因启动子、GAL1基因启动子、GAL10基因启动子中的任意一种，或者其中两种及两种以上启动子的融合启动子。

所述的酵母终止子是菊粉酶基因终止子、CYC1基因终止子、TEF1基因终止子、ADH1基因终止子中的一种或者几种。

所述的酵母营养缺陷筛选基因是LEU2、ADE2、URA3、TRP1或者HIS3中的一种或者几种。

所述的目标外源基因可以是各种蛋白的编码基因，例如菊粉酶基因、TEF1基因、ADH1基因或者ADH2基因，等等。

步骤(1)中所述的穿梭质粒含有大肠杆菌质粒复制子、抗生素抗性基因、酿酒酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子和酵母终止子的序列，切除大肠杆菌质粒复制子和抗生素抗性基因，获得穿梭质粒酵母载体部分。

可以利用克隆载体构建外源基因表达盒。克隆载体含有酵母启动子、多克隆位点区和酵母终止子。例如，以pAG61质粒为基础，构建含有酵母启动子、多克隆位点区和酵母终止子的克隆载体Px-RH(图1)。外源基因通过多克隆位点区克隆于Px-RH载体，限制性内切酶酶切获得由酵母启动子Px、外源基因开发阅读框和酵母终止子组成的外源基因表达盒。

酵母-大肠杆菌穿梭载体构建：以完整的酵母2μ质粒序列为基础，构建含有酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子Px和酵母终止子元件的穿梭质粒pHR-Px(图2)，酵母启动子Px与终止子元件间为大肠杆菌质粒复制子(Ori)和氨苄青霉素抗性基因(Ap^r)序列，大肠杆菌质粒复制子和氨苄青霉素抗性基因序列通过酶切可与穿梭载体上的酵母基因序列分离。

去除了大肠杆菌质粒复制子和氨苄青霉素抗性基因序列的穿梭载体pHR-Px片段与外源基因表达盒共转化营养缺陷型酿酒酵母菌株，在营养缺陷选择性培养基上筛选获得外源基因表达工程菌。工程菌中外源基因表达盒与穿梭载体pHR-Px片段通过同源重组形成外源基因表达质粒，该表达质粒没有非酵母基因序列和抗药性基因序列(除需表达的外源基因序列外)。

本发明提供了一种酿酒酵母重组质粒，该重组质粒含有酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因。

该酿酒酵母重组质粒可以通过以下方法制备：分别构建酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、目标外源基因和酵母终止子的DNA片段，然后将其依次连接。

本发明提供了一种酵母-大肠杆菌穿梭质粒，该穿梭质粒含有酵母终止子、酿酒酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、大肠杆菌质粒复制子和抗生素抗性基因的序列，上述各部分依次连接，大肠杆菌质粒复制子和抗生素抗性基因两侧均有酶切位点。

本发明还提供了一种食品级的酿酒酵母菌株，该菌株含有上述酿酒酵母重组质粒。

制备酿酒酵母菌株的步骤如下：

克隆载体构建：

以pAG61质粒为基础，构建含有酵母启动子、多克隆位点区和酵母终止子的克隆载体Px-RH(图1)

外源基因表达盒构建：

外源基因通过多克隆位点区克隆于Px-RH载体，限制性内切酶酶切获得由酵母启动子Px、外源基因开发阅读框和酵母终止子组成的外源基因表达盒。

酵母-大肠杆菌穿梭载体构建：

以完整的酵母2μ质粒序列为基础，构建含有酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子Px和酵母终止子元件的穿梭质粒pHR-Px(图2)，酵母启动子Px与终止子元件间为大肠杆菌质粒复制子(Ori)和氨苄青霉素抗性基因(Ap^r)序列，大肠杆菌质粒复制子和氨苄青霉素抗性基因序列通过酶切可与穿梭载体上的酵母基因序列分离。

工程菌构建：

去除了大肠杆菌质粒复制子和氨苄青霉素抗性基因序列的穿梭载体pHR-Px片段与外源基因表达盒共转化营养缺陷型酿酒酵母菌株，在营养缺陷选择性培养基上筛选获得外源基因表达工程菌，工程菌中外源基因表达盒与穿梭载体pHR-Px片段通过同源重组形成外源基因表达质粒，该表达质粒没有非酵母基因序列和抗药性基因序列(除需表达的外源基因序列外)。

具体说明如下：

1、克隆载体Px-RH构建

(1)pAG61质粒经Not1酶切，电泳回收含有大肠杆菌质粒复制子Ori和氨苄青霉素抗性基因Ap^r序列的DNA片段；

(2)以两端含有限制性内切酶位点的引物分别PCR扩增酵母启动子Px及终止子序列，限制性内切酶分别酶切酵母启动子、终止子PCR产物；

(3)分别合成多克隆位点区的正反链单链，变性退火形成多克隆位点双链序列，两端分别含有与酵母启动子Px序列3’粘端、酵母终止子序列5’粘端互补的粘端；

(4)大肠杆菌质粒复制子和氨苄青霉素抗性基因序列与酶切后的酵母启动子、酵母终止子以及多克隆位点双链连接，转化大肠杆菌DH5α，对形成的转化子进行PCR筛选鉴定，PCR阳性转化子抽取质粒，测序鉴定，获得克隆载体Px-RH。Px-RH载体具有大肠杆菌质粒复制子、氨苄青霉素抗性基因筛选标记、酵母启动子、多克隆位点区和酵母终止子元件。

2、外源基因表达盒构建

需表达的外源基因开发阅读框(ORF)经PCR特异扩增、限制性内切酶酶切，与经过同样限制性内切酶酶切处理的Px-RH载体连接，外源基因插入Px-RH载体多克隆位点区，形成的质粒具有酵母启动子Px-外源基因ORF-酵母终止子组成的外源基因表达盒，然后转化大肠杆菌DH5α，对转化子中的重组质粒进行PCR、测序鉴定。重组质粒经Not1酶切，电泳回收与大肠杆菌质粒复制子、氨苄青霉素抗性基因序列分离的外源基因表达盒。

3、酵母-大肠杆菌穿梭载体pHR-Px构建

pHC11载体(刘轶婷等，在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控，复旦学报，37(4)：399-444，1998)酶切，电泳回收包括酵母2μ质粒完整序列和酵母营养缺陷筛选基因Leu2的8.7kb片段、与中间插入了大肠杆菌复制子Ori和氨苄青霉素抗性基因Apr序列的酵母启动子Px和酵母终止子连接，转化大肠杆菌DH5α，对转化子中的重组质粒进行PCR、测序鉴定，得到pHR-Px穿梭载体。

4、工程菌构建

酵母-大肠杆菌穿梭载体pHR-Px经Sac1、Sal1双酶切，电泳，回收去除了大肠杆菌质粒复制子Ori和氨苄青霉素抗性基因Ap^r序列的载体片段，该载体片段均为酵母基因序列，与外源基因表达盒一起利用醋酸锂法共转化LEU2基因突变的酿酒酵母菌株，在缺少亮氨酸(leucine)的SD选择性培养基(SD-Leu)上筛选转化子，PCR鉴定转化子中克隆于表达质粒的外源基因，选择PCR阳性转化子作为工程菌进行外源基因表达试验。

本发明还提供了上述制备方法的应用，其中所述的目标外源基因是菊粉酶基因，利用含有菊粉酶基因的酿酒酵母重组质粒发酵培养，表达获得菊粉酶。

本发明的载体均为市售或者根据文献报道。如非特别指出，均可采用本领域常规的操作方法。例如，按照冷泉港实验室的《分子克隆》、《抗体》、《细胞》，以及《冷泉港实验室实验方案》等通用的实验手册。

本发明利用酿酒酵母的高效同源重组机制，制备了一种含有酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因酿酒酵母重组质粒。该表达质粒中，除需表达的外源基因序列外，没有非酵母基因序列，只能够在酿酒酵母细胞内生存，不会转移。本发明所产生的酿酒酵母表达质粒充分发挥了酿酒酵母食品级微生物的优势，安全、高效，可以广泛的用于表达各种外源基因。

附图说明

图1：克隆载体Px-RH。

图2：酵母-大肠杆菌穿梭载体pHR-Px。

图3：重组菊粉酶基因表达酵母质粒pHR-INU。

图4：酿酒酵母工程菌发酵液中重组菊粉酶酶活测定结果。

具体实施方式

实施例1：克隆载体P_inu-RH构建

(1)pAG61质粒Not1酶切，电泳回收大肠杆菌质粒复制子(Ori)-氨苄青霉素抗性基因(Ap^r)部分，碱性磷酸酶处理去磷。

(2)以克鲁维酵母Kluyveromyces cicerisporus CBS4857基因组DNA为模板，以P1和P2为引物PCR扩增菊粉酶基因(GenBank登入号AF178979，序列如SEQ.ID.NO 13，Wen T.Q.，Cloning and analysis of the inulinase gene fromKluyveromyces cicerisporus CBS4857，World Journal of Microbiology &Biotechnology 19：423-426，2003)，GenBank登入号为AF17897。)启动子Pinu片段。以酿酒酵母S288c基因组DNA为模板，以P3和P4为引物PCR扩增CYC1基因(SGD登入号YJR048W)终止子Tcyc片段。按照各个片段设计的酶切位点进行相应的限制性内切酶酶切处理。

所用的4条引物的核苷酸序列如下：

克隆菊粉酶基因启动子Pinu两条引物序列是：

P1：5’AG GCGGCGC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA3’(SEQ NO 1)Not1

P2：5’ACAAGCTT ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT3’(SEQ NO 2)HindIII

克隆CYC1终止子Tcyc两条引物序列是：

P3：5’ATACTAGTGTCATGTAATTAGTTATGTCACGC(SEQ NO 3)    Spe1

P4：5’AGCGGCCGCGGTACCGGCCGCAAATTAAA  (SEQ NO 4)     Not1

(3)构建多克隆位点区(MCS)

分别合成MCS正反链P5、P6，经T4磷酸激酶作用磷酸化，变性退火形成MCS双链，两端分别为HindIII、Spe1粘性末端。

MCS正反链序列是：

P5：5’AGCTTGATATCGAGCTCCCGGGATCCAGCTGGGCCCGTCGACA    (SEQ NO 5)

P6：5’CTAGTGTCGACGGGCCCAGCTGGATCCCGGGAGCTCGATATCA    (SEQ NO 6)

(4)pAG61质粒Ori-Ap^r片段、菊粉酶基因启动子Pinu酶切产物、CYC1基因终止子Tcyc和MCS双链进行多片段连接、转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定转化子，阳性转化子抽取质粒，测序鉴定，得到克隆载体Pinu-RH。

实施例2：穿梭载体pHR-P_inu构建

(1)pHC11载体Bgl I、Sal双酶切，回收8.7kb大片段(包含完整2μ质粒序列和Leu2基因序列)，Klenow酶处理补平。

(2)引物P7和P8PCR扩增菊粉酶基因启动子Pinu，引物P9和P10PCR扩增CYC1基因终止子Tcyc。Pinu PCR产物经EcoR1、BamH1双酶切处理，Tcyc PCR产物经BamH1、HindIII双酶切处理，Pinu、Tcyc酶切片段与经过HindIII、EcoR1双酶切处理的质粒pSP72连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR和测序鉴定，得到pSP72-Pinu-Tcyc质粒。

(3)pSP72-Pinu-Tcyc质粒BamH1单酶切线性化，Klenow酶补平，与(1)中pHC11酶切片段(8.7kb)连接，转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定阳性转化子，抽提质粒，测序确证，得到酵母-大肠杆菌穿梭载体pHR-Pinu。

所用的4条引物核苷酸序列如下：

克隆菊粉酶基因启动子Pinu两条引物序列：

P7：5’ATGGATCCGCGGCCGC AAAACGACAAGAGAAGCAAACACA    (SEQ NO 7)

BamH1

P8：5’ACGAATTCGTCGAC ATCTAACAAAAAAAAAATTAAATGTGT(SEQ NO 8)

EcoR1 Sal1

克隆CYC1终止子Tcyc两条引物序列：

P9：5’TG AAGCTTGAGCTC TCATGTAATTAGTTATGTCACGCTT    (SEQ NO 9)

HindIII Sac1

P10：5’ATGGATCCGCATGCGGTACCGGCCGCAAATTAAAG    (SEQ NO 10)

BamH1

实施例3：菊粉酶基因表达盒构建

以克鲁维酵母Kluyveromyces cicerisporus CBS4857基因组DNA为模板，引物P11和P12PCR扩增菊粉酶基因开放阅读框ORF，PCR产物经HindIII、Sal1双酶切后，与同样经过HindIII、Sal1双酶切的Pinu-RH载体连接转化大肠杆菌DH5α，PCR鉴定转化子，抽提阳性转化子重组质粒，测序鉴定，得到菊粉酶基因克隆于Pinu-RH载体MCS区的重组质粒，该重组质粒具有Pinu启动子-菊粉酶基因-Tcyc终止子组成的菊粉酶基因表达盒(Pin-Inu-Tcyc)，重组质粒经Not1酶切，电泳分离、回收菊粉酶基因表达盒(Pin-Inu-Tcyc)。

菊粉酶基因开放阅读框ORF克隆引物：

P11：5’TGAAGCTTATGAAGTTAGCATACTCCCTCTTG(SEQ NO 11)  HindIII

P12：5’CAGTCGACTTGTTCGTTAGTAAAGTAAGCCCA(SEQ NO 12)  Sal1

实施例4：分泌表达菊粉酶酿酒酵母工程菌构建及菊粉酶活性测定

(1)酵母-大肠杆菌穿梭载体pHR-Pinu经限制性内切酶Sac1、Sal1双酶切，去除pSP72载体片段(大肠杆菌复制子Ori和氨苄青霉素抗性基因Ap^r序列)，回收酵母载体部分，与菊粉酶基因表达盒(Pin-INU-Tcyc)一起采用醋酸锂法共转化酿酒酵母菌株Y16(刘轶婷等，在杂合启动子控制下乙肝病毒表面抗原SA-28融合基因在酵母中的表达及调控，复旦学报，37(4)：399-444，1998)，转化子涂布SD-Leu选择性培养基，穿梭载体pHR-Pi nu的酵母载体部分与菊粉酶基因表达盒在酵母细胞内发生同源重组，形成菊粉酶基因酵母表达质粒pHR-Inu(图3)。挑选转化子进行菊粉酶基因PCR鉴定，PCR阳性转化子即为表达菊粉酶的重组酿酒酵母工程菌。

(2)工程菌接种于SD-Leu液体培养基中，30℃250rpm培养22小时后，按照5％(v/v)比例接种与30ml YEPD培养基中，30℃250rpm培养120小时，每隔24小时取样测定发酵液中菊粉酶酶活。

具体结果如图4所示，可见菊粉酶能达到约56U/ml。这说明，本发明获得的重组表达质粒系统能较高效表达外源基因。

序列表

<210>1

<211>33

<212>DNA

<213>Artificial

<400>1

aggcggcgca aaacgacaag agaagcaaac aca                33

<210>2

<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<400>2

acaagcttat ctaacaaaaa aaaaattaaa tgtgt              35

<210>3

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<212>DNA

<213>Artificial

<400>3

atactagtgt catgtaatta gttatgtcac gc                 32

<210>4

<211>29

<212>DNA

<213>Artificial

<400>4

agcggccgcg gtaccggccg caaattaaa                                29

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<212>DNA

<213>Artificial

<400>5

agcttgatat cgagctcccg ggatccagct gggcccgtcg aca                43

<210>6

<211>43

<212>DNA

<213>Artificial

<400>6

ctagtgtcga cgggcccagc tggatcccgg gagctcgata tca                43

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<212>DNA

<213>Artificial

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atggatccgc ggccgcaaaa cgacaagaga agcaaacaca                40

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<212>DNA

<213>Artificial

<400>8

acgaattcgt cgacatctaa caaaaaaaaa attaaatgtg t              41

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<212>DNA

<213>Artificial

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tgaagcttga gctctcatgt aattagttat gtcacgctt                 39

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<211>35

<212>DNA

<213>Artificial

<400>10

atggatccgc atgcggtacc ggcc gcaaat taaag                    35

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<400>11

tgaagcttat gaagttagca tactccctct tg                        32

<210>12

<211>32

<212>DNA

<213>Artificial

<400>12

cagtcgactt gttcgttagt aaagtaagcc ca                        32

<210>13

<211>3325

<212>DNA

<213>Artificial

<400>13

gaattctcaa accgaaatgg ggcgttgttt taccccaggt atccggttgt agttggcact     60

ggggatggaa aaaaatgatg ttgatgttga gttagttggg ttgagtcaat tagtgcgtga    120

aagtatcacc acttttgtca tccggcgttt ctgtgcgaat cacacacaca cacacagttt    180

attggagcac ttgtttctgg cgtattcgta attgttctgc ggtgcggttc tgtgtgcatt    240

tttcctgggg tgtctgccgc acctactcat cacccacgcc gtgggtttga gccatggcgg    300

aggtacgact gactggctgc ctgcctgcct gactgactgc ctgactgcag gaaaagaggg    360

tttcgaagga aaaacttttc ctgtgttaat ccggccgtgc gccgctgctc caaaatccac    420

cttcatgaga aggagtttga aaaaacaaaa aaattcacat ataaaaagcg tatctcgaga    480

tctcaaagtc tcccttgaat cgtgtttgcc agttgtaact catcctttat tcttctattc    540

tatctctctc tttccttccc ctaatcagca attaaatccg gggtaaggaa gaattactac    600

tgtgtgtaac ggttatattt cgttttttat tttttttttc cattgccata gagaaagaaa    660

aaaaaaaaaa gagagtttgt gaagatcttc cattcgaatc ccataagtga cacatttaat    720

tttttttttg ttagatatga agttagcata ctccctcttg cttccattgg caggagtcag    780

tgcttcagtt atcaattaca agagagatgg tgacagcaag gccatcacta acaccacttt    840

cagtttgaac agaccttctg tgcatttcac tccatcccat ggttggatga acgatccaaa    900

tggtttgtgg tacgatgcca aggaagaaga ctggcatttg tactaccagt acaacccagc    960

agccacgatc tggggtactc cattgtactg gggtcacgct gtttccaagg atttgacttc   1020

ttggacagat tacggtgctt ctttgggccc aggttccgac gacgctggtg cgttcagtgg   1080

tagtatggtt atcgattata acaatacttc tggtttcttc aacagctctg tggacccaag   1140

acaaagagca gttgcagtct ggaccttgtc taagggccca agccaagccc agcacatcag    1200

ttactcgttg gacggtggtt acaccttcca acactattcc gacaacgccg tgttggacat    1260

caacagctcc aacttcagag accctaaggt gttctggcac gagggcgaga acggcgaaga    1320

tggtcgttgg atcatggccg ttgctgaatc gcaagtgttc tctgtgttgt tctactcttc    1380

tccaaacttg aaaaactgga ccttggaatc caacttcacc atcacggtct ggactggtac    1440

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tttcacggcg acaccatcat atgccatatt cctcaacaaa ccgaattctt caacaaattg    3060

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ccttcaagct accacgttac gatcatgaat tgctgccacg aacacgatcg ttctgagggc    3180

cactggccca aaggtaatcg atccggacac aagcatgctg cggtgtacat ctacatctga    3240

ccaacattct aacgtccgag aatgcggcca ctgcgggctc tgctgattcc gaactcgaat    3300

tacaggtgta tcacagccct gccta                                          3325

Claims (10)

1.一种食品级酿酒酵母重组质粒的制备方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：

(1)构建含有酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子和酵母终止子的穿梭质粒酵母载体部分；

(2)构建含有酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因的外源基因表达盒；

(3)将(1)获得的穿梭质粒酵母载体部分与(2)获得的外源基因表达盒共转化相应营养缺陷型酿酒酵母菌株，在营养缺陷选择性培养基上筛选培养转化子；

(4)分离纯化获得包含酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因的酿酒酵母重组质粒。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的穿梭质粒含有大肠杆菌质粒复制子、抗生素抗性基因、酿酒酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子和酵母终止子的序列，切除大肠杆菌质粒复制子和抗生素抗性基因，获得穿梭质粒酵母载体部分。

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母启动子是酵母菊粉酶基因启动子、TEF1基因启动子、ADH1基因启动子、ADH2基因启动子、GAPDH基因启动子、GAL1基因启动子、GAL10基因启动子中的任意一种，或者其中两种及两种以上启动子的融合启动子。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母终止子是菊粉酶基因终止子、CYC1基因终止子、TEF1基因终止子、ADH1基因终止子中的一种或者几种。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的酵母营养缺陷筛选基因是LEU2、ADE2、URA3、TRP1或者HIS3中的一种或者几种。

6.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的目标外源基因是菊粉酶基因、TEF1基因、ADH1基因或者ADH2基因中的任意一种。

7.一种酿酒酵母重组质粒，其特征在于，该重组质粒含有酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、酵母终止子和目标外源基因。

8.一种酵母-大肠杆菌穿梭质粒，其特征在于，该穿梭质粒含有酵母终止子、酿酒酵母2μ质粒完整序列、酵母营养缺陷筛选基因、酵母启动子、大肠杆菌质粒复制子和抗生素抗性基因的序列，上述各部分依次连接，大肠杆菌质粒复制子和抗生素抗性基因两侧均有酶切位点。

9.一种食品级的酿酒酵母菌株，其特征在于，该菌株含有权利要求7所述的重组质粒。

10.权利要求1所述制备方法的应用，其特征在于，所述的目标外源基因是菊粉酶基因，利用含有菊粉酶基因的酿酒酵母重组质粒发酵培养，表达获得菊粉酶。

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