CN102363788B

CN102363788B - 一种在黑曲霉中同源表达木聚糖酶基因xynB的表达载体、基因工程菌株及其应用

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Publication number: CN102363788B
Application number: CN 201110333966
Authority: CN
Inventors: 白爱枝; 梁运章; 李前忠; 闫祖威
Original assignee: Inner Mongolia University
Current assignee: Inner Mongolia University
Priority date: 2011-10-28
Filing date: 2011-10-28
Publication date: 2013-03-13
Anticipated expiration: 2031-10-28
Also published as: CN102363788A

Abstract

本发明涉及一种在黑曲霉中同源表达木聚糖酶基因xynB的表达载体。本发明提供了一种在黑曲霉中同源表达木聚糖酶基因xynB的表达载体，其通过将木聚糖酶基因xynB及包括部分启动子序列在内的非编码序列插入载体pBS-T构建获得，其中，所述非编码序列位于基因xynB的5′端，所述木聚糖酶基因xynB及包括部分启动子序列在内的非编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供了一种产木聚糖酶的基因工程菌株，其通过将上述表达载体转化黑曲霉A₃₂₇获得。本发明还提供了一种高产木聚糖酶的基因工程菌株，产酶活力达到11000IU/mL(以燕麦木聚糖为底物)。本发明基因工程菌所产木聚糖酶的最适pH值和最适温度分别为pH 5.2和55℃，适合于饲料工业和食品工业等众多领域。

Description

一种在黑曲霉中同源表达木聚糖酶基因xynB的表达载体、基因工程菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地涉及一种在黑曲霉(Aspergillus niger)中同源表达木聚糖酶基因xynB的表达载体、高产木聚糖酶的基因工程菌株及其应用。

背景技术

黑曲霉(Aspergillus niger)木聚糖酶基因xynB的同源表达研究的甚少，2005年Anthony等利用RT-PCR从Aspergillus niger BRFM281mRNA扩增的带有6个hi s标签的xynB基因克隆到有gpd强启动子的表达盒，将该表达盒在蛋白酶阴性突变株Aspergillus niger D15#26中进行表达，获得的一株转化子中xynB的产量达到900mg/L；国内的郑瑞娟将从Aspergullus nigerTS1中利用同样方法克隆得到xynB基因，通过构建与葡萄糖淀粉酶的融合表达质粒，在尿嘧啶缺陷型Aspergullus nigerM54中表达，获得的重组菌的酶活力最高达507IU/mL，分别是原出发菌和宿主菌的6.7倍和3.89倍。

丝状真菌黑曲霉(Aspergillus niger)的同源表达系统在基础研究和应用研究中都是极有价值的。在基础研究中，同源表达系统的建立是从分子水平上研究该菌株中酶表达调控的先决条件；由于只有同源系统表达的酶才会有与自然酶同样的结构特征，因此，同源表达系统又是研究酶的结构功能关系，以定向改造酶的结构，达到改进酶催化活性和催化特性的重要基础。在应用研究上，因多拷贝整合是丝状真菌转化的特点，因此，通过转化引入多拷贝内源基因后，利用菌株中现成的酶形成机制，可较大幅度地提高酶产量，早年的研究已充分证明了这一点。同源表达较之异源表达，可有效避免异源表达中难以解决的问题，如分泌过程中蛋白的错误折叠和被内源蛋白酶降解的可能以及物种密码子的偏好性、基因结构的复杂性等，多种蛋白酶同源表达的成功表明该策略具有广泛的应用价值(Verdoes，1995)。

需要解决的技术难题：

1.试验确定适用于黑曲霉A₃₂₇木聚糖酶基因xynB转化的载体、选择标记基因，构建表达质粒；

2.通过黑曲霉菌株前培养方法，菌丝裂解条件等试验，建立能获得足够数量并且高质量的原生质球的方法；

3.建立表达分泌载体转化黑曲霉的转化技术，提高转化频率。

发明内容

本发明的目的是提供一种在黑曲霉中同源表达木聚糖酶基因xynB的表达载体。

本发明的另一目的是提供一种产木聚糖酶的基因工程菌株。

本发明的另一目的是提供一种高产木聚糖酶的基因工程菌株。

本发明的另一目的是提供一种生产木聚糖酶的方法。

本发明的另一目的是提供上述高产木聚糖酶的基因工程菌株在饲料和食品工业中的应用。

本发明提供的一种在黑曲霉中同源表达木聚糖酶基因xynB的表达载体，其通过将基因xynB及包括部分启动子序列在内的非编码序列插入表达载体pBS-T构建获得，其中，所述非编码序列位于基因xynB的5′端。具体构建方法为：

1)以黑曲霉A₃₂₇的总DNA为模板，设计特异引物，扩增木聚糖酶基因xynB及包括部分启动子序列在内的非编码序列；

2)将基因xynB及包括部分启动子序列在内的非编码序列与载体pBS-T连接，并连入构巢曲霉的终止子和选择标记基因amds，得到表达质粒pBS-XTP。

其中，所述木聚糖酶基因xynB及包括部分启动子序列在内的非编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：

gggcagttac ctgagcaatc ggatcttctt gagccacagg ctaatatcaa aacaccttgt 60

ggcgtctagc cttgttttta tttgaccgtc gggaagccgg atctgcacgg tcttttccct 120

cgcgttctac tttccaatta cgtttcatgc gaaggatctc aattggcacc ttccttaata 180

agtagtgata gtattatcct caaatataac gcggcggtgg cactctgcta agtcactaac 240

ggcaggagac actcccttaa gttagcgcac gctagcattt tccttcctga ctagatacag 300

gcagtacgtc tccgtctaga ttccagtagg cttataatca ttgctaaagt agtatacagt 360

gtcgtaaatg gttttatatg ccatccatga aatgatgaga gccaaccaat gggtcttacg 420

taatgaacaa tgaagcattc gagccaggac gcattaaaca cagcaataga gtcaggctac 480

acaagcggat atcgatgttc acaaccggga atctagaccc ttgaagctcc actgcctatt 540

cgaacaggca ttatgatttc aggatgtctg caggacccta gaaggcgatt taggctgttt 600

cgggagatca attcggcttt ccaaatcgcc cacggatgct ccaccgacta ggctaaaccc 660

catcacagcg gacgtttcag gtacggcagg gtctcacatt tagggcctcg gcagggtctc 720

ggcaggtacc cttcttaata aaggctaaat agcttctgca gaatcatggg tatatcagga 780

acgtctcctc cgtcgctgca gaccttctct tcttactccc agccccattg aatcaactcc 840

tcaagccaag tctctttcaa catgcttacc aagaaccttc tcctctgctt cgccgcagct 900

aaggctgctc tggccgttcc ccacgactct gtcgtcgagc gttcggatgc cttgcacaag 960

ctctctgagc gttcgacccc gagctcgacc ggcgagaaca acggcttcta ctactccttc 1020

tggaccgacg gcggtggtga tgtgacctac accaacggtg acgctggctc gtacaccgtc 1080

gagtggtcca atgttggcaa ctttgttggt ggaaagggct ggaaccctgg aagtgcgcag 1140

taagttaatc tccctccaac tgtctctcta ggtatccaat ggaacaattg ctcacatacc 1200

tccagggaca tcacctacag cggcaccttc acccctagcg gcaacggcta cctctccgtc 1260

tatggctgga ccactgaccc cctgatcgag tactacatcg tcgagtccta cggcgactac 1320

aaccccggca gtggaggcac gtacaagggc accgtcacct ccgatggatc cgtctacgat 1380

atctacacag ctacccgcac caacgccgct tctatccaag gaaccgctac cttcacccag 1440

tactggtccg ttcgccagaa caagagagtt ggaggaactg ttaccacttc caaccacttc 1500

aacgcttggg ctaagctggg catgaacctg ggtactcaca actaccagat cgtggctacc 1560

gagggctacc agagcagcgg atcttcctcc atcactgttc agtaactgca g 1611

其大小为1611bp；其中结构基因长744bp，核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

atgcttacca agaaccttct cctctgcttc gccgcagcta aggctgctct ggccgttccc 60

cacgactctg tcgtcgagcg ttcggatgcc ttgcacaagc tctctgagcg ttcgaccccg 120

agctcgaccg gcgagaacaa cggcttctac tactccttct ggaccgacgg cggtggtgat 180

gtgacctaca ccaacggtga cgctggctcg tacaccgtcg agtggtccaa tgttggcaac 240

tttgttggtg gaaagggctg gaaccctgga agtgcgcagt aagttaatct ccctccaact 300

gtctctctag gtatccaatg gaacaattgc tcacatacct ccagggacat cacctacagc 360

ggcaccttca cccctagcgg caacggctac ctctccgtct atggctggac cactgacccc 420

ctgatcgagt actacatcgt cgagtcctac ggcgactaca accccggcag tggaggcacg 480

tacaagggca ccgtcacctc cgatggatcc gtctacgata tctacacagc tacccgcacc 540

aacgccgctt ctatccaagg aaccgctacc ttcacccagt actggtccgt tcgccagaac 600

aagagagttg gaggaactgt taccacttcc aaccacttca acgcttgggc taagctgggc 660

atgaacctgg gtactcacaa ctaccagatc gtggctaccg agggctacca gagcagcgga 720

tcttcctcca tcactgttca gtaa 744

其含一个长66bp的内含子，因此，其CDS序列如SEQ ID NO.3所示：

atgcttacca agaaccttct cctctgcttc gccgcagcta aggctgctct ggccgttccc 60

cacgactctg tcgtcgagcg ttcggatgcc ttgcacaagc tctctgagcg ttcgaccccg 120

agctcgaccg gcgagaacaa cggcttctac tactccttct ggaccgacgg cggtggtgat 180

gtgacctaca ccaacggtga cgctggctcg tacaccgtcg agtggtccaa tgttggcaac 240

tttgttggtg gaaagggctg gaaccctgga agtgcgcagg acatcaccta cagcggcacc 300

ttcaccccta gcggcaacgg ctacctctcc gtctatggct ggaccactga ccccctgatc 360

gagtactaca tcgtcgagtc ctacggcgac tacaaccccg gcagtggagg cacgtacaag 420

ggcaccgtca cctccgatgg atccgtctac gatatctaca cagctacccg caccaacgcc 480

gcttctatcc aaggaaccgc taccttcacc cagtactggt ccgttcgcca gaacaagaga 540

gttggaggaa ctgttaccac ttccaaccac ttcaacgctt gggctaagct gggcatgaac 600

ctgggtactc acaactacca gatcgtggct accgagggct accagagcag cggatcttcc 660

tccatcactg ttcagtaa 678

编码225个氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示：

MLTKNLLLCF AAAKAALAVP HDSVVERSDA LHKLSERSTP SSTGENNGFY

YSFWTDGGGD 60

VTYTNGDAGS YTVEWSNVGN FVGGKGWNPG SAQDITYSGT

FTPSGNGYLS VYGWTTDPLI 120

EYYIVESYGD YNPGSGGTYK GTVTSDGSVY DIYTATRTNA ASIQGTATFT

QYWSVRQNKR 180

VGGTVTTSNH FNAWAKLGMN LGTHNYQIVA TEGYQSSGSS

SITVQ 225

本发明提供的一种产木聚糖酶的基因工程菌株，其是通过将上述表达载体转化黑曲霉A₃₂₇获得。

本发明还提供了一种高产木聚糖酶的基因工程菌株，为黑曲霉An.g28(Aspergillus niger)，于2011年8月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5204。

本发明还提供了一种生产木聚糖酶的方法，其中，包括培养上述基因工程菌株及纯化木聚糖酶的步骤。

根据本发明的生产木聚糖酶的方法，其中，培养上述基因工程菌株的培养基以廉价的工农业下脚料为主，配方为：玉米芯80g/L、麸皮18g/L、糖蜜14g/L、NaNO₃8g/L，发酵温度28～31℃，接种量为5％，装液量30mL/250mL三角瓶，发酵96h，摇床转速230rpm。

本发明还提供了上述高产木聚糖酶的基因工程菌在饲料和食品工业中的应用。

本发明以产酸性木聚糖酶的黑曲霉A₃₂₇为研究对象，通过同源表达策略利用菌株自身的木聚糖酶蛋白形成机制获得了黑曲霉同源表达高产木聚糖酶基因工程菌株，该菌株产酶活力高，较现有菌株活力高约30倍，降低了木聚糖酶的生产成本。

该基因工程菌所产木聚糖酶的最适pH值和最适温度分别为pH 5.2和55℃，在4～10的pH范围内能保持90％以上的酶活，在35℃～45℃温浴40min酶活力保持在100％以上，该酶对燕麦木聚糖的底物特异性较桦木木聚糖高1.6倍，较适合于饲料工业和食品工业等众多领域。

附图说明

图1为表达质粒pBS-XTP构建过程示意图。

图2为重组质粒pBS-xynB的限制性酶切分析凝胶图，Lane1：marker，λDNA/HindIII；lane2.：Marker，100bp DNA ladder；lane3：BamHI酶切(3.2+1.4)kb；lane4：EcoRV酶切(3.7+0.9)kb；lane5：SacI酶切(3.6+1.0)kb；lane6：EcoRI与HindIII双酶切(3.0+1.6)kb；lane7：质粒pBS-xynB。

图3为重组质粒pBS-XT的限制性酶切分析凝胶图，lane1：EcoRV与SalI双酶切(3.5kb+890bp+780bp+233bp)；lane2：EcoRI与SalI双酶切(3.0kb+1639bp+780bp)；lane3：EcoRV与MluI双酶切(4.1kb+890bp+415)；lane4：BamHI酶切(3.8kb+1.4kb+246bp)；lane5：marker，100bp DNAladder；lane6：marker，λ/HindIII；lane7：SalI酶切(5.4kb)；lane8：质粒pBS-XT。

图4为表达质粒pBS-XTP的限制性酶切分析凝胶图，Lane1：marker，λDNA/HindIII；lane2：Marker，100bp DNA ladder；lane3：SacI酶切(4.3kb+2.1kb+1.7kb)；lane4：EcoRV酶切(5.3kb+1.3kb+0.9kb+0.6kb)kb；lane5：SacI酶切(3.6+1.0)kb。

图5为木糖标准曲线，k：标准木糖浓度/OD；t：酶反应时间，本实验为10min；n：酶液稀释倍数；1000：由mmol转化为μmol的系数；M：还原糖分子量，木糖为150.06，葡萄糖为180.16；OD：还原糖的光密度值。

图6木聚糖酶的热稳定性

图7pH值对酶活的影响

图8木聚糖酶的热稳定性

图9木聚糖酶的pH稳定性

本发明的基因工程菌黑曲霉An.g28(Aspergillus niger)于2011年8月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5204。

具体实施方式

实验材料及一般实验方法：

试验材料：

黑曲霉(Aspergillus niger)A₃₂₇：出发菌株，由内蒙古大学离子束生物工程实验室保藏。

Escherichia coli DH5α：用于质粒构建，由上述实验室保藏。

IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)、X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)，各种限制性内切酶，Klenow Fragment，Alkaline Phosphatase，T₄DNA polymerase及T₄DNAligase为TaKaRa公司产品；

溶菌酶为华美生物工程公司产品；

普通抗生素购自华美生物工程公司；

beta-D-Glucanase G裂解酶：为IneterSpex产品；

凝胶回收试剂盒，long amp superTaq DNA polymerase：为申能博彩科技有限公司产品；

ABTS：为Sigma公司产品；

pB S-T vector，Taq DNA polymerase，100bp ladder marker，200bp ladder marker及λ/HindIII marker，DNA回收试剂盒：为天为时代科技有限公司产品；

引物由赛百盛生物公司合成，测序由上海博亚生物技术有限公司完成；

蛋白酶K，潮霉素B(HgyB)为Merck公司产品；

RNaseA为Promega公司产品；

蛋白分子标准marker TaKaRa公司产品；

燕麦木聚糖和桦木木聚糖：为Sigma公司产品；

其它试剂均为分析纯或化学纯。

分子实验方法：标准的分子操作技术如DNA提取、RNA提取、反转录、凝胶电泳、大肠杆菌转化、原生质体/PEG转化均使用标准技术(Sambrook等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual第3版2001；Kriegler，Gene Transfer and Expression：ALaboratory Manual 1990)进行。

木聚糖酶的活性测定方法：取适当稀释的粗酶液0.1mL，加到1mL、1％的木聚糖悬浮液中(pH5.0，0.2mol/L醋酸缓冲液配制)于50℃水浴反应10min，用DNS(3，5-二硝基水杨酸)法，测定产生的还原糖。以木糖为标准绘制标准曲线(图5)，在本实验条件下，每分钟产生1μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位(IU/mL)。酶活力计算公式为：酶活力(IU/mL)＝(k×OD×n×1000)/(M×t)，其中，k：标准木糖浓度/OD；t：酶反应时间，本实验为10min；n：酶液稀释倍数；1000：由mmol转化为μmol的系数；M：还原糖分子量，木糖为150.06，OD：还原糖的光密度值。

实施例1黑曲霉木聚糖酶基因xynB及包括部分启动子序列在内的非编码序列的扩增

以黑曲霉A327(由内蒙古大学离子束生物工程实验室保藏，从草料场分离筛选获得)总DNA为模板，根据GenBank中xynB基因全序列设计引物：

X1：5′GGGCAGTTACCTGAGCAATCG_3′；

X2：5′CTGCAGTTACTGAACAGTGAT GG_3′，

有效扩增了木聚糖酶的结构基因及包括部分启动子序列在内的非编码序列片段，其中，所述非编码序列位于木聚糖基因xynB的5′端，并进行TA克隆和DNA序列测定。测定的目的片段大小为1611bp(SEQ ID NO.1)，其中结构基因长744bp(SEQ ID NO.2)，含一个长66bp的内含子，编码的225个氨基酸(SEQ ID NO.4)。登录NCBI网站，利用BLAST对xynB基因氨基酸序列进行比对，发现与黑曲霉(登录号：AY126481.1)的同源性最高，为99.56％。

实施例2重组质粒pBS-XTP的构建

通过基因克隆技术，利用pBS-T载体、黑曲霉A₃₂₇自身的木聚糖酶结构基因及其5′端序列片段(含部分启动子序列)、构巢曲霉的终止子和选择标记基因amds，构建表达质粒pBS-XTP。具体方法如下：

(1)将PCR扩增的黑曲霉的xynB基因及其5′端非编码序列1611bp与载体pBS-T连接，并转化大肠杆菌DH5α，得到了质粒pBS-xynB(图1)，通过测序表明，xynB基因已经整合到质粒中，并且没有出现氨基酸移码。

(2)质粒pBS-xynB经HindIII酶切，经琼脂糖凝胶电泳，回收线性片段，KlenowFragment补平，酚仿抽提、沉淀，再用SalI酶切后经琼脂糖凝胶电泳，回收线性片段，溶于ddH₂O备用；质粒VHb用HindIII酶切，酚仿抽提、沉淀，Klenow Fragment补平，酚仿抽提、沉淀，再用SalI酶切，琼脂糖凝胶电泳得到终止子TtrpC约0.8kb的线性片段，回收；将上述两个片段进行连接，转化，得到质粒pBS-XT(图1)，通过PCR验证，表明质粒pBS-XT中包含了TtrpC的线性片段。

(3)将质粒pBS-XT经MluI酶切，经5′末端脱磷后，琼脂糖凝胶电泳，回收线性片段，溶于ddH₂O备用；将质粒p3SR2经SspI-SspI酶切，琼脂糖凝胶电泳，回收2.7kb的amdS基因线性片段，溶于ddH₂O备用；将上述2个片段连接，转化，得到质粒pBS-XTP(图1)。通过PCR验证，pST-XTP质粒中包含了amdS基因序列。

实施例3同源表达质粒构建过程中的酶切鉴定结果

根据同源性，参照NCBI上公布的Aspergillus niger基因序列(GenBankNo.D38071)设计一对引物以黑曲霉A₃₂₇染色体DNA为模板，由PCR扩增出约1.6kb的木聚糖酶基因包括部分启动子序列在内的非编码序列，其中，所述非编码序列位于木聚糖基因xynB的5′端，克隆到载体pBS-T上，通过蓝白斑筛选，选取较蓝斑滞后的质粒进一步进行酶切鉴定(见图2)：BamHI酶切，得到3.2kb和1.4kb两条带(图2，Lane3)；EcoRV酶切，得到3.7kb和0.9kb两条带(图2，Lane4)；SacI酶切，得到3.6kb和1.0kb两条带(图2，Lane5)；EcoRI与HindIII酶切，得到3.0kb和1.6kb两条带(图2，Lane6)。以上结果与预期相符，证明为目的亚克隆，且xynB基因连入载体的方向为T3方向连入，得到质粒pBS-xynB。

对所构建的质粒pBS-XT菌株首先作菌落PCR初步鉴定，引物Px3为xynB结构基因5′端引物，Ptrpc为终止子TtrpC3’端引物，如果Ptrpc片段连入质粒pBS-xynB正确，则产生约1.5kb大小的PCR产物，将PCR鉴定正确的质粒菌株pBS-XT进一步进行酶切鉴定(图3)：EcoRV与SalI双酶切，得到3.5kb、890bp、780bp和233bp四条带(图3，Lane1)；EcoRI与SalI双酶切，得到3.0kb、1639bp、780bp三条带(图3，Lane2)；EcoRV与MluI双酶切，得到4.1kb、890bp、415bp三条带(图3，Lane3)；BamHI酶切，得到3.8kb、1.4kb、246bp三条带(图3，Lane6)；SalI单酶切，得到5.4kb一条带(图3，Lane7)。以上结果与预期相符，证明质粒构建正确。

对所构建的质粒pBS-XTP菌株首先作菌落PCR初步鉴定，引物Pamds为amds基因5’端引物，Px4为xynB基因3’端引物，如果amds片段连入质粒pBS-XP正确，则产生约1.5kb大小的PCR产物，将PCR鉴定正确的质粒菌株pBS-XTP进一步进行酶切鉴定(图4)：SacI酶切，得到4.3kb、2.1kb和1.7kb三条带(图4Lane3)；EcoRV酶切，得到5.3kb、1.3kb、0.9kb和0.6kb四条带(图4，Lane4)；EcoRI与DraI双酶切，得到3.4kb、2.5kb、1.5kb和0.7kb四条带(图4，Lane5)。以上结果与预期相符，证明质粒构建正确。

实施例4高产木聚糖酶基因工程菌株的构建及产木聚糖酶的纯化

将构建得到的表达质粒pBS-XTP，利用原生质体/PEG方法转化黑曲霉A₃₂₇后，获得上百个转化子，摇瓶筛选了其中的96个，初筛发现87.5％的转化子产酶活力较对照高(见表1-5)。通过PCR扩增鉴定部分转化子，均检测到了表达载体上的选择标记基因amds上长度为1.8kb的片段，证明为阳性表达；将酶活较高的8个转化子平板分离后摇瓶发酵验证产酶水平，发现An.g28菌株产酶活力最高，在基础培养基中的产酶活力为(6234IU/mL)，其于2011年8月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为：CGMCC No.5204。

表1转化株1-18#的木聚糖酶活力(活力单位：IU/mL)

表2转化株19-37#的木聚糖酶活力(活力单位：IU/mL)

表3转化株38-59#的木聚糖酶活力(活力单位：IU/mL)

表4转化株60-78#的木聚糖酶活力(活力单位：IU/mL)

表5转化株79-96#的木聚糖酶活力(活力单位：IU/mL)

(注：表1-5中各个对照的酶活力不同是因为不同批次的发酵造成，发酵培养基为基础培养基)

以廉价易得的农作物下脚料和制糖工业下脚料为碳源，通过L⁹(4³)的正交实验和发酵条件的研究，得到了转化株An.g28产木聚糖酶的优化培养基配方和产酶适宜条件：玉米芯80g/L、麸皮18g/L、糖蜜14g/L、NaNO₃ 8g/L，发酵温度28～31℃，接种量为5％，装液量30mL/250mL三角瓶、摇床转速230rpm。在上述优化的培养基和发酵条件下研究转化株An.g28的发酵特性，发酵96h，产酶达到高峰期，酶活力达11000IU/mL(以燕麦木聚糖为底物)，较对照菌株提高近30倍。

将上述所得粗酶液经硫酸铵分级沉淀、透析和DEAE Sepharose阴离子交换层析得到一种电泳纯的单一组分木聚糖酶，相对分子质量约为21KDa。

实施例5转化株An.g28产木聚糖酶的酶学性质分析

1、木聚糖酶的最适温度

底物pH4.6、反应10min的条件下，测定木聚糖酶分别在35℃-65℃，间隔5℃水浴条件下的酶活，以最适温度下测得的酶活性定为100％，其余条件下测定的酶活与最高酶活的比值为该温度下的相对酶活，作温度--相对酶活曲线。结果如下(图6)：在40～65℃范围内相对酶活力都能达到80％以上，其中55℃为最适酶促反应温度。

2、木聚糖酶的最适pH

在最适温度下，分别用不同pH值的木聚糖底物进行酶解反应，按上述酶活测定方法测定酶活，以最适pH值下测得的酶活定为100％，其余pH条件下测定的酶活性与最高酶活性的比值为该pH下的相对酶活，作pH--相对酶活曲线。结果如下(图7)：最适作用pH值为5.2，在pH值为3.4～5.8范围内，相对酶活均在80％以上，说明此酶在酸性条件下酶活较高。

3、木聚糖酶对温度的稳定性

将酶液与用最适pH值缓冲液所配制的底物分别在35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃水浴中保温10min、20min、30min、40min后，立即置冰浴中冷却，在最适温度水浴条件下测定酶活，与没处理过的酶的活力比较，计算出剩余酶活。结果如下(图8)：显示木聚糖酶在35℃～45℃下较稳定，处理40min，残留酶活性均在100％以上。

4、木聚糖酶对pH值的稳定性

将用不同pH值的缓冲液(pH2--pH8用磷酸氢二钠--柠檬酸缓冲体系，pH9.0--pH10用磷酸氢二钠-氢氧化钠缓冲体系)适当稀释的酶液在35℃水浴条件下处理60min，立即冷却到室温，在最适pH底物和最适温度水浴条件下测定酶活，与没处理的酶的活力相比对，计算出剩余酶活。结果如下(图9)：木聚糖酶在pH值为3～10的范围内能维持较高的酶活，除pH值在3和2时相对酶活分别为80％和63％左右，其它pH值下相对酶活均能达到90％以上，表现出比较稳定的高活性。

5、金属离子对酶反应的影响

将不同金属离子溶液与酶液混合，使各种金属离子最终浓度分别为4mmol/L、8mmol/L、12mmol/L，35℃保温60min，立即冷却到室温，然后测定酶活，以不加入金属离子的酶液的相对酶活性为100％，加入不同浓度金属离子后的残余酶活与其的比值为相对酶活，结果如下(表6)：Mg²⁺、Cu²⁺、Mn²⁺、Fe³⁺Co²⁺和K⁺对木聚糖酶的活性有抑制作用，Mn²⁺的抑制作用表现为随离子浓度的增加，抑制作用增强；Cu²⁺在各个浓度下对酶活的抑制效果相同，Mg²⁺和K⁺只在高浓度时对酶活有抑制作用，Fe³⁺在低浓度时的抑制作用强于高难度；Zn²⁺和Na⁺对酶活有促进作用，并且随着离子浓度的增大促进作用增强；Ca²⁺和Fe²⁺在各个浓度下对酶活的作用表现不明显。

表6金属离子对木聚糖酶活力的影响

6、木聚糖酶动力学参数米氏常数和最大反应速度的测定

用pH值为5.2的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液配制不同浓度的桦木木聚糖底物溶液，在其它条件相同情况下测定酶活性，按照Lineweaver-Burk的双倒数作图法求出酶的米氏常数Km值和最大反应速度Vmax值分别为6.17mg/mL和3020μmol/(min·mg)。

7、木聚糖酶的底物特异性

以桦木木聚糖和燕麦木聚糖为底物，木聚糖酶的活力测定方法测定酶活，考察木聚糖酶对这两种底物水解的特异性，以桦木木聚糖为底物时测定的酶活为100％，计算燕麦木聚糖的相对酶活，结果如下(表7)：无论是出发菌株还是基因工程菌An.g28其粗酶液对燕麦木聚糖的水解能力较桦木木聚糖高约1.6倍，表明该木聚糖酶对燕麦木聚糖具有很强的底物专一性。

表7木聚糖酶酶解的底物特异性

Claims

1.一种高产木聚糖酶的基因工程菌株，其特征在于，所述基因工程菌株为黑曲霉（Aspergillus niger）An.g28，保藏编号：CGMCC No.5204。

2.一种生产木聚糖酶的方法，其特征在于，包括培养权利要求1所述基因工程菌株及纯化木聚糖酶的步骤。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，培养所述基因工程菌株的培养基配方为：玉米芯80g/L、麸皮18g/L、糖蜜14g/L、NaNO₃ 8g/L。

4.权利要求1所述高产木聚糖酶的基因工程菌株在制备木聚糖酶中的应用。