CN103374570B - 一种丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)的启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，具体的说是一种丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)的启动子及其应用。丝状真菌启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。本发明通过克隆不同长度的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因5’端核苷酸序列，使其驱动sgfp基因在土曲霉中进行表达，通过检测荧光判断sgfp的表达情况，进而确定该长度的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的5’端核苷酸序列是否具有启动子活性。本发明启动子核苷酸序列能在丝状真菌中有效驱动外源基因的表达，为丝状真菌的代谢工程改造提供了重要工具，具有重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体的说是一种丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)的启动子及其应用。
背景技术
丝状真菌不仅是研究真核生物生命规律的重要模式菌株，也是抗生素、酶制剂和有机酸的主要生产者。与细菌及酵母相比，丝状真菌在营养需求、细胞生长、翻译后修饰、蛋白分泌能力等方面具有显著的优势。
丝状真菌的遗传转化方法已经很成熟，这为外源基因在丝状真菌中的表达提供了前提条件。在丝状真菌中，不论是研究代谢调控路径还是提高代谢产物的含量，通常都需要过量表达相关基因。甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)是许多真菌中表达丰度很高的基因，构巢曲霉、卷枝毛霉、假丝酵母等真菌的gpd启动子因具有很高的活性而被用来构建表达载体(Punt，P.J.，Zegers，N.D.，Busscher，M.，Pouwels，P.H.，van den Hondel，C.A.M.J.J.，Intracellular and extracellular production of proteinsin Aspergillus under the control of expression signals of the highlyexpressed Aspergillus nidulans gpdA gene，1991，17，19-33；Wolff，A.M.，Arnau，J.，Cloning of glyceraldehyde-3-pho sphatedehydrogenase-encoding genes in Mucor circinelloides(Syn.racemosus)and use of the gpd1 promoter for recombinant proteinproduction，Fungal Genet.Biol.，2002，35，21-29；Van Bogaert，I.N.A.，De Maeseneire，S.L.，Develter，D.，Soetaert，W.，Vandamme，E.J.，Cloning and characterisation of the glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase gene of Candida bombicola and use of its promoter，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.，2008，35，1085 1092)。
不同真菌gpd启动子的活性有很大差异(Cao，Y.，Jiao，R.，Xia，Y.，Astrong promoter，PMagpd，provides a tool for high gene expressionin entomopathogenic fungus，Metarhizium acridum，Biotechnol.Lett.，2012，34，557562；Liao，X.，Fang，W.，Zhang，Y.，Fan，Y.，Wu，X.，Zhou，Q.，Pei，Y.，Characterization of a highly active promoter，PBbgpd，in Beauveria bassiana，Curr.Microbiol.，2008，57，121126)，因此对于特定真菌最好选择活性比较高的gpd启动子。可供选择的丝状真菌强启动子并不多，当需要在真菌宿主中同时过量表达多种不同的基因时，知道多种功能性启动子是有益的，为防止压制特定转录因子的滴定(titration)，优选使用多种不同的启动子，对每种待表达基因使用一种特定的启动子。
发明内容
本发明目的在于提供一种丝状真菌启动子及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)的启动子，丝状真菌启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的互补序列。
所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示具有60％或60％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列；或
所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示具有60％或60％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列的互补序列。
所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示具有90％或90％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列；或
所述丝状真菌启动子为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示具有90％或90％以上的同一性或具有相同功能的核苷酸序列的互补序列。
本领域普通技术人员均知晓不同启动子之间核苷酸相似性非常低，通常只是其中的一些顺式作用元件具有保守性，改变启动子中某些非重要核苷酸并不会影响启动子的活性，但改变一些核苷酸或增减一些序列会导致同一性低于100％、大于60％，因此与SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示序列或其互补序列具有60％或60％以上同一性，具有相同功能的DNA序列也属于本发明的保护范围。
丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因(gpd)的启动子的应用，所述丝状真菌启动子在调控丝状真菌基因表达中的应用。
所述丝状真菌启动子调控外源目的基因进行转录、表达。所述外源目的基因为编码绿色荧光蛋白基因sgfp。
利用所述丝状真菌启动子提供丝状真菌表达盒，其由启动子、目的基因和终止子组成，外源目的基因在启动子的调控下进行转录、表达，其中启动子为上述的核苷酸序列。所述外源目的基因为编码绿色荧光蛋白基因sgfp。
利用所述丝状真菌启动子提供表达载体，其表达载体包含上述的丝状真菌表达盒。所述表达载体为pJJL-4、pJJL-5、pJJL-6。
利用所述丝状真菌启动子提供重组菌株：
1)将目的基因与上述具有启动子可操作地连接，构建其在丝状真菌中的表达载体。所述外源目的基因为sgfp，表达载体为pJJL-4、pJJL-5、pJJL-6；
2)将上述表达载体转化丝状真菌，得到基因工程菌株。
其重组菌株包含上述的丝状真菌表达载体和合适的丝状真菌宿主菌。所述宿主菌株为土曲霉、黑曲霉、红曲霉、里氏木霉等丝状真菌，优选宿主菌株为土曲霉。
本发明所具有的优点：本发明通过克隆不同长度的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因5’端核苷酸序列，使其驱动sgfp基因在土曲霉中进行表达，通过检测荧光判断sgfp的表达情况，进而确定该长度的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的5’端核苷酸序列是否具有启动子活性。
附图说明
图1为本发明实施例提供的载体pSGF957的基本结构。其中hph-casette为潮霉素抗性基因表达盒；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；Pmgpd为红曲霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；GFP-F、TrpC-R1为一对引物。
图2为本发明实施例提供的载体pJJL-4的基本结构。Pgpd1为长度为2145 bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶启动子；hph-casette为潮霉素抗性基因表达盒；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；M13-47、GFP-R为PCR验证转化子时的一对引物。
图3为本发明实施例提供的载体pJJL-5的基本结构。Pgpd2为长度为1081 bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶。启动子；hph-casette为潮霉素抗性基因表达盒；sgfp为绿色荧光蛋白基因；TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；M13-47、GFP-R为PCR验证转化子时的一对引物。
图4为本发明实施例提供的载体pJJL-6的基本结构。Pgpd3为长度为630 bp的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子；hph-casette为潮霉素抗性基因表达盒；sgfp为绿色荧光蛋白基因。，TtrpC为构巢曲霉色氨酸合成酶终止子；M13-47、GFP-R为PCR验证转化子时的一对引物。
图5为本发明实施例提供的PCR验证转化子的琼脂糖凝胶电泳图。分别以各转化子和土曲霉NRRL1960的基因组分别为模板，以M13-47(5’-CGCCGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和GFP-R(5’-CCCGGCCGCTTTACTTGTAC-3’)为引物对进行PCR，扩增转化载体中的PgpdX元件，验证转化子。M，1kb DNAladder(Fermentas，Catalog No.：#SM0311)；1，pJJL-4的土曲霉转化菌株；2，pJJL-5的土曲霉转化菌株；3，pJJL-6的土曲霉转化菌株；4，阴性对照(土曲霉NRRL 1960)。
图6为本发明实施例提供的出发菌株土曲霉NRRL 1960在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。
图7为本发明实施例提供的pJJL-4转化菌株在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。
图8为本发明实施例提供的pJJL-5转化菌株在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。
图9为本发明实施例提供的pJJL-6转化菌株在不同生长阶段的荧光检测。左列为孢子时期，中列为幼嫩菌丝时期，右列为成熟菌丝时期。
具体实施方式
所述丝状真菌(filamentous fungi)即霉菌，是一类菌丝体发达而又不产生大型子实体的真菌的统称。
甘油醛-3-磷酸脱氢酶是糖酵解过程中的一种氧化酶，该酶将甘油醛-3-磷酸氧化成1，3-二磷酸甘油酸。
启动子(promoter)定义为一种结合RNA聚合酶并指导聚合酶到达编码序列的正确的转录起始位点从而起始转录的DNA序列。RNA聚合酶能有效的催化与编码区适当DNA链互补的信息RNA的装配。启动子还可以理解为包括用于转录mRNA后用于翻译5’非编码区(介于启动子和转录起始位点之间)，cis-作用转录调控元件，如增强子和能与转录因子相互作用的其他核酸序列。
载体(vector)是指能够将DNA片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状DNA分子。
“同一性”或“同一性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同一性百分数，以最佳比较目的对序列进行比对。两个序列之间的同一性百分比是由这些序列共有的相同位置的数目的函数(即，同一性百分数＝相同位置的数目/位置的总数(例如，重叠位置)×100)。例如，“同一性百分比”通过下列方式来计算：在比较窗中比较两个经最佳比对的序列，测定在两个序列中出现相同核苷酸碱基或相同氨基酸残基的位置的数目以产生匹配位置的数目，将匹配位置的数目除以比较窗中位置的总数目(即，窗的大小)，并且将结果乘以100从而产生序列同一性百分比。用于比较的序列的最佳比对可以通过下述来进行：例如，Smith和Waterman(Smith，T.F.andWaterman，M.S.，Comparison of biosequences，Adv.Appl.Math.，1981，2，482-489)的局部同源性算法；Needleman和Wunsch(Needleman S.B.andWunsch C.D.，A general method applicable to the search forsimilarities in the amino acid sequence of two proteins，J.Mol.Biol.，1970，48，443-453.)的同源性比对算法；Pearson和Lipman(Pearson W.R.，Lipman D.J.，Improved tools for biological sequence comparison，Proc.Natl.Acad.Sci.，1988，85，2444-2452.)的相似性搜索方法；这些算法的计算机化实施(例如，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575 Science Dr.，Madison，Wis.中的GAP、BESTFIT、FASTA、BLAST P、BLAST N和TFASTA)；或手工比对和目测检查(参见，例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology(1995增刊)。
本发明中质粒提取采用OMEGA公司Plasmid Mini Kit I试剂盒(D6942-01)，DNA片段回收是采用OMEGA公司Cycle-Pure Kit试剂盒(D6492-01)，凝胶回收是采用OMEGA公司Gel Extraction Kit试剂盒(D2500-01)。
实施例1
构建含有gpd启动子1的载体：
根据土曲霉NIH2624基因组数据库公布的序列信息设计引物Pgpd-F1(5’-GACCTCGAGATATGGCCTACGAACGAATTGC-3’)和Pgpd-R(5’-AGCCTCTAGAAGCACATGTTGTGATGATTGATGAGTTGTTGG-3’)以土曲霉菌株NRRL1960(ATCC 10020，CICC40205，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)的基因组为模板，采用pfu DNA聚合酶(Fermentas，Catalog No.：EP0501)进行PCR，经1.0％琼脂糖凝胶电泳检测长度约为2145bp的条带为目的产物，产物TA克隆至pMD18-T载体(Takara，Catalog No.：D101A)中，测序验证后得到质粒pJJL-1。
经测序证实土曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶启动子Pgpd1的NDA序列为SEQID NO.1所示。SEQ ID NO.1：atatggcctacgaacgaattgcgcacgacgccatgtgcaggggatttgtttgctgtattatcatgaccgcggtgttaagtgggttggtcggccatacgtctagttttggtcaccatgatctttggatgggtttgattacggcctcttgctaggagaattagactcgattttgccttctatattgtcaatattactgataatgctttcataaactgttcttgcatgaatgatgagtggcgagatacatgacaagggtttcgggagagctggccgataatccaggccgttgccactgcatagccaccgatgatggcgacagtgcgccacgccgtagctatgtacgtagtatgaagggagcaagtcaacatgagcttagtcgggagctacggacgtgacattgacgacatcattgcattgtgagatacgttatgttgatgtagatccataactaggattcttagagattagaatggctgataccctggttttataaccaatactgcctgtggaacagtcaaaacatggcgaatgagatcaaagtaaaccagaacaagacatcagtagaaagttaaagcctgcatttatcatcgaagtgactcatgtctggagccgccgtcatgcaaccgtggtctgactgcaggggtctaccgaaggaacttataacattttatgctatctttatgacagcgctattccggtagcagcatggagagagcgatctccacagataccattaatgaagaccacgtggggaaagccaatgatgttgtggctctgtctcggtagatacgtacgtagtaggatggtctcttcataatgggtgtagcacctagtccattgataggtctgtcttttctgccctctttctgatccgactattctccgtctcacaccgggaggggagatatagtcatatgtcccttgcaggaagctgggaggccctaagtcatacgagacccatgtgtggtgtgcatggctgcagtggcgttggcctaatggatatggaatggtacagagagcctgtaggggttgacggcaaggtgtactcgtactagaactgtactccgtagggatggccataatggagatggtatccactgcgaaagaaaaaaaaagtgttgcgaaaaaaatagattgaagaagattacaaatagaccaatctttaattacctactaatgggtcagatgaaaaataaacccagcgcgtgatcgaagagcatggcgacaggctgtccggtgaaggtttctggagtccggagaagaccctccatgcatggaaagggagttccagccctttgaagaggccggacacatattgttccatcccgacgtatgggccgaaagcggcatggccggacgtgcccctccttgtagggtgatggatggtgggatgttgatggcgttacactctgggaggatccaggtacttccattcttactaggaagtatttcggcctagactaatacaacgaaagaaactgttcgattctacgggaaaagtactccaattccattacatcatcgcattctccctctcgtaaggtacctaccacaaacccccactatcgttcatccgtccccggttacaacgggaagaaaaagcccggggagagggggaagaagaaaatcccaagggacgggaatagccgtgcggaagagaagacgattagcctaggtagaagcctcatggccgaccatttgattccgaaaagctggcaaaacattcacgagatagacacagtgaggacccggacgatgccctatgcggcgcgctgattggccaggccgggcagtgccgaagcagcaaatatcgtgagtctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaagggttgctggggagctggtcagcggcgcaagccgggagggcgactgagctctgtagcttttgccccgtctgtccgtccggtgtagagtggcagaccaccgcctgctgcgcctcccattgggtcttccccaacgtgactgggtcgttgcgtcagtccatgtcgctgcctttttcttcctccccctcccccgctgtccttcttcttcttcttcttctctctttctcccatcatcctctcatcctctgcctttcccatcgaactcacttcttctaccaacaactcatcaatcatcaca
(a)序列特征：
●长度：2145 bp
●类型：碱基序列
●链型：双链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：土曲霉(Aspergillus terreus)
(f)特异性名称：misc-feature
实施例2
构建gpd启动子1控制的表达载体：
以mtpMD18-F(5’-GGATAACGCAGGAAAGAAGATGTGAGCAAAAGGC CAG-3’)和mtpMD18-R(5’-CTGGCCTTTTGCTCACATCTTCTTTCCTGCGTTAT CC-3’)为引物、pJJL-1为模板进行PCR，对pJJL-1进行定点突变，除去pMD18-T-simple上的PciI酶切位点，得到质粒pJJL-2。具体过程如下：用pfu DNA聚合酶进行PCR(94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸6min，16个循环；72℃延伸10min)，PCR产物用Dpn I(NEB，CatalogNo.：R0176V)消化模板质粒pJJL-1，取2μL消化产物转化大肠杆菌DH5α，测序验证。
以GFP-F(5’-AGCCACATGTTGAGCAAGGGCGAGGAGC-3’)和TrpC-R(5’-GTCGTGCCAGTCGACTCTAGA-3’)为引物对，以质粒pSGF957(质粒参见Jeong-Gu Kim，Yang Do Choi，Yung-Jin Chang，Soo-Un Kim，Genetictransformation of Monascus purpureus DSM1379，Biotechnology Letters，2003，25：1509-1514进行构建)(参见图1)为模板进行PCR，产物经Pci I(Fermentas，Catalog No.：#ER1871)和Xba I(Fermentas，Catalog No.：#FD0684)酶切并纯化，将纯化产物与经相同酶切并回收的质粒pJJL-2(4.8kb)经T4连接酶(Fermentas，Catalog No.：#EL0011)连接得到质粒pJJL-3。
用XbaI酶切质粒pSGF957，纯化大小约为3.2kb的抗性基因片段(由色氨酸启动子、终止子和潮霉素磷酸转移酶基因组成)。将质粒pJJL-3经XbaI酶切，经碱性磷酸酶(TaKaRa，Catalog No.：D2250)去磷酸化后回收，与纯化的抗性基因片段经T4连接酶(Fermentas，Catalog No.：EL0011)连接得到表达载体pJJL-4(参见图2)。
实施例3
构建gpd启动子2控制的表达载体：
以Pgpd-F2(5’-GACCTCGAGCCGTAGGGATGGCCATAATGG-3’)和Pgpd-R为引物对，以pJJL-1为模板，扩增得到Pgpd2的DNA片段(1081 bp)，用XhoI和PciI酶切并回收。用XhoI(Fermentas，Catalog No.：#ER0691)和PciI酶切质粒pJJL-4，回收7.3kb的片段并与纯化后的Pgpd 2片段经T4连接酶(Fermentas，Catalog No.：EL0011)连接得到表达载体pJJL-5(参见图3)。SEQ ID NO.2：ccgtagggatggccataatggagatggtatccactgcgaaagaaaaaaaaagtgttgcgaaaaaaatagattgaagaagattacaaatagaccaatctttaattacctactaatgggtcagatgaaaaataaacccagcgcgtgatcgaagagcatggcgacaggctgtccggtgaaggtttctggagtccggagaagaccctccatgcatggaaagggagttccagccctttgaagaggccggacacatattgttccatcccgacgtatgggccgaaagcggcatggccggacgtgcccctccttgtagggtgatggatggtgggatgttgatggcgttacactctgggaggatccaggtacttccattcttactaggaagtatttcggcctagactaatacaacgaaagaaactgttcgattctacgggaaaagtactccaattccattacatcatcgcattctccctctcgtaaggtacctaccacaaacccccactatcgttcatccgtccccggttacaacgggaagaaaaagcccggggagagggggaagaagaaaatcccaagggacgggaatagccgtgcggaagagaagacgattagcctaggtagaagcctcatggccgaccatttgattccgaaaagctggcaaaacattcacgagatagacacagtgaggacccggacgatgccctatgcggcgcgctgattggccaggccgggcagtgccgaagcagcaaatatcgtgagtctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaagggttgctggggagctggtcagcggcgcaagccgggagggcgactgagctctgtagcttttgccccgtctgtccgtccggtgtagagtggcagaccaccgcctgctgcgcctcccattgggtcttccccaacgtgactgggtcgttgcgtcagtccatgtcgctgcctttttcttcctccccctcccccgctgtccttcttcttcttcttcttctctctttctcccatcatcctctcatcctctgcctttcccatcgaactcacttcttctaccaacaactcatcaatcatcaca
(a)序列特征：
●长度：1081 bp
●类型：碱基序列
●链型：双链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：土曲霉(Aspergillus terreus)
(f)特异性名称：misc-feature
实施例4
构建gpd启动子3控制的表达载体
以Pgpd-F3(5’-GACCTCGAGACATCATCGCATTCTCCCTCTCG-3’)和Pgpd-R为引物对，以pJJL-1为模板，扩增得到Pgpd 3的DNA片段(630bp)，用XhoI和PciI酶切并回收。用XhoI和PciI酶切质粒pJJL-4，回收7.3kb的片段并与纯化后的Pgpd 3片段经T4连接酶(Fermentas，Catalog No.：#EL0011)连接得到表达载体pJJL-6(参见图4)。SEQ ID NO.3：acatcatcgcattctccctctcgtaaggtacctaccacaaacccccactatcgttcatccgtccccggttacaacgggaagaaaaagcccggggagagggggaagaagaaaatcccaagggacgggaatagccgtgcggaagagaagacgattagcctaggtagaagcctcatggccgaccatttgattccgaaaagctggcaaaacattcacgagatagacacagtgaggacccggacgatgccctatgcggcgcgctgattggccaggccgggcagtgccgaagcagcaaatatcgtgagtctcctgctttgcccggtgtatgaaaccggaaagggttgctggggagctggtcagcggcgcaagccgggagggcgactgagctctgtagcttttgccccgtctgtccgtccggtgtagagtggcagaccaccgcctgctgcgcctcccattgggtcttccccaacgtgactgggtcgttgcgtcagtccatgtcgctgcctttttcttcctccccctcccccgctgtccttcttcttcttcttcttctctctttctcccatcatcctctcatcctctgcctttcccatcgaactcacttcttctaccaacaactcatcaatcatcaca
(a)序列特征：
●长度：630 bp
●类型：碱基序列
●链型：双链
●拓扑结构：线性
(b)分子类型：DNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：土曲霉(Aspergillus terreus)
(f)特异性名称：misc-feature
将pJJL-4、pJJL-5、pJJL-6用DraI(Fermentas，Catalog No.：FD0224)进行线性化，割胶回收目的片段。
实施例5
土曲霉的转化以及转化菌株的筛选
1)将产衣康酸的土曲霉菌株NRRL 1960孢子悬液接种至50mL液体培养基ME中(20g L-1葡萄糖，2g L-1 NH4NO3，20mg L-1 NH4HPO4，20mg L-1FeSO4，0.4g L-1 MgSO4，4.4mg L-1 ZnSO4，浓硫酸调节pH 至3.5)，将孢子浓度调至107个/mL，200rmp、33℃培养12-18h。
2.用无菌单层500目尼龙布过滤收集菌丝，并用灭菌的0.6M MgSO4溶液清洗三次，压干后放入无菌的50ml三角瓶中；按10mL酶解液/g菌丝加入酶解液，30℃、60rpm培养1-3h，待用。
酶解液成分为0.8％纤维素酶(Sigma，Catalog No.：C1184)、0.8％裂解酶(Sigma，Catalog NO.：L1412)、0.4％蜗牛酶(上海生工，Catalog No.：SB0870)、0.6M MgSO4，经由0.22μm的无菌过滤器过滤除菌.
3.将上述所得原生质体混合液先用2层无菌的擦镜纸过滤，再用5层擦镜纸过滤，收集滤液。4℃离心收集原生质体，用预冷1.0M山梨醇溶液洗涤一次，再用预冷的STC(STC为1.0M山梨醇，50mM Tris·HCl-pH8.0，50mM CaCl2)洗涤一次，最后将原生质体重悬于150μl预冷的STC中，并用STC将原生质体浓度调整为5×107个/mL，待用。
4.向140μL上述原生质体悬液中加入约5μg线性化的DNA片段(线性化的DNA片段为已线性化的pJJL-4、pJJL-5、pJJL-6质粒中的一种)和50μL PTC(PTC为40％PEG4000，50mM Tris-HCl-pH8.0，50mM CaCl2)，轻轻混匀，冰浴30min。加入1mL PTC，混匀后室温放置20min；然后与上层琼脂混合后覆盖于再生筛选培养基平板PDA-SH上(称取4gDifcoTMPotato Dextrose Agar(BD，LOT：1165825)和22g Sorbitol(Sigma，LOT：071M00271V)，用蒸馏水溶解至100ml，灭菌，冷却至约55℃时加入潮霉素(Solarbio，Catalog No.：M419099)至终浓度为100μg/mL，制备平板)，在30℃、黑暗条件下培养3-4天。
5.从再生筛选培养基平板上将转化子转接至筛选平板PDA-H(称取4gDifcoTMPotato Dextrose Agar(BD，LOT：1165825)溶解于100ml蒸馏水中，灭菌，冷却至约55℃时加入潮霉素至终浓度为100μg/mL，制备平板)，在30℃培养3-5天，挑取转化子在PDA-H筛选平板上传6代。
6.刮取抗性菌株的孢子于ME液体培养基中进行培养，收集菌丝，提取基因组，以M13-47(5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’)和GFP-R(5’-CCCGGCCGCTTTACTTGTAC-3’)为引物对进行PCR，扩增转化子中gpd启动子与sgfp基因的融合片段，以验证目标载体是否整合至土曲霉基因组中。扩增转化载体中的PcsX元件，用1％的琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物，验证转化子。M13-47引物位于Pgpd启动子上游约90bp处，GFP-seqR引物设计在sgfp基因上，位于Pgpd启动子下游约330bp处，因此PCR扩增产物比相应的Pgpd启动子约大420bp，图5为0.8％的琼脂糖凝胶电泳分析结果，与预期相符，由此可见各转化株均有目的片段，而出发菌株NRRL 1960没有扩增出相应片段，说明gpd启动子与sgfp基因的融合片段已成功整合到土曲霉NRRL 1960的基因组上。
实施例6
各不同长度gpd启动子的阳性土曲霉转化子的荧光分析，分别观察各阳性土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝和成熟菌丝的荧光。
孢子分别取自各土曲霉转化子的产孢平板上；幼嫩菌丝为孢子接种于ME液体培养基中，在32℃培养12h；成熟菌丝为孢子接种于ME液体培养基中，在32℃培养60h。荧光分析结果显示pJJL-4的土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝均有荧光，如图7；荧光分析结果显示pJJL-5的土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝均有荧光，如图8；荧光分析结果显示pJJL-6的土曲霉转化子的孢子、幼嫩菌丝、成熟菌丝均有荧光，如图9；而出发菌株NRRL1960的孢子和菌丝均无荧光，如图6。这表明不同长度的gpd启动子在土曲霉生长的不同时期都能有效启动荧光蛋白基因的表达，可见上述构建的载体能在土曲霉中有效表达外源基因。
Claims (4)
1.一种丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子，其特征在于：丝状真菌启动子核苷酸序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示。
2.一种权利要求1所述的丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子的应用，其特征在于：所述丝状真菌启动子在调控土曲霉基因表达中的应用。
3.权利要求2所述的丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子的应用，其特征在于：所述丝状真菌启动子调控外源目的基因进行转录、表达。
4.权利要求3所述的丝状真菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子的应用，其特征在于：所述外源目的基因为编码绿色荧光蛋白基因sgfp。
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