CN103409458A - Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体及其应用 - Google Patents

Abstract

Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体及其应用，属于分子生物学技术领域。其T-DNA区域元件排列次序如下：黑曲霉靶基因启动子、多克隆位点、黑曲霉靶基因终止子、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA、黑曲霉筛选标记基因、黑曲霉靶基因终止子。本发明通过目的基因同源重组整合在黑曲霉靶基因位点，目的基因由高表达的靶基因启动子调控，消除转基因的位置效应，提高表达水平。

Description

Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体及其应用

技术领域

本发明涉及Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体及其应用，属于分子生物学技术领域。

背景技术

自1973年Mishra和Tatum首次报道粗糙脉孢霉的DNA转化以来，真菌遗传转化研究得到了迅速的发展，建立了PEG-CaCl₂介导的遗传转化、电激介导的遗传转化、农杆菌介导的遗传转化等多种方法。

丝状真菌生产异源蛋白遇到的问题主要是大多数哺乳动物、植物和细菌来源的蛋白远低于真菌内源蛋白表达水平，通常仅达到每升发酵液几十毫克。而表达蛋白的产量至少在每升几克的水平，才能适应或达到工业发酵规模的需求。过量表达的异源蛋白超出细胞承受能力，多肽链不能及时正确折叠，从而在内质网内形成错误折叠或未折叠的蛋白质积累，严重影响蛋白的转运和分泌，这是影响异源蛋白产量低的重要因素。

尽管在丝状真菌表达系统的研究方面已经取得了一些进展，但是尚缺乏像大肠杆菌表达系统、酵母表达系统那样成熟的、商业化的表达系统。其关键是缺少简便有效的核心技术和关键技术，如高效转化技术、高效基因置换技术、筛选标记基因删除技术、纯合转化子筛选和鉴定技术，以及这些技术的系统集成。本发明将提供一种基于农杆菌介导转化法获得基因定点整合重组菌株的成熟的食品级黑曲霉高效表达系统。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体，其T-DNA区域元件排列次序如下：黑曲霉靶基因启动子、多克隆位点、黑曲霉靶基因终止子、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA、黑曲霉筛选标记基因、黑曲霉靶基因终止子。

所述黑曲霉靶基因启动子还包括带有信号肽编码序列的黑曲霉靶基因启动子或带有融合蛋白编码序列的黑曲霉靶基因启动子。

所述黑曲霉靶基因为黑曲霉糖化酶基因glaA，所述黑曲霉筛选标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPH。

所述载体命名为pSZHG，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述黑曲霉糖化酶基因启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.16784-7845bp位置所示，多克隆位点核苷酸序列如SEQ ID NO.17846-7875bp位置所示，黑曲霉糖化酶基因终止子核苷酸序列如SEQ ID NO.17876-9074bp位置与11344-12542bp位置所示，构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA核苷酸序列如SEQ ID NO.19081-10128bp位置所示，黑曲霉筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因HPH核苷酸序列如SEQID NO.110301-11320bp位置所示。

为了进一步拓宽所述载体，在黑曲霉糖化酶基因启动子下游加入黑曲霉糖化酶基因分泌信号肽编码序列sig，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，新载体命名为pSZHGS。

为了进一步拓宽所述载体，在黑曲霉糖化酶基因启动子下游带有黑曲霉糖化酶基因glaA的N端498个氨基酸的编码序列和切割位点kex2的编码序列，所述glaA的N端498个氨基酸核苷酸序列如SEQ IDNO.31-1743bp位置所示，所述kex2核苷酸序列如SEQ ID NO.31744-1752bp位置所示。

本发明还提供了一种用上述载体构建黑曲霉工程菌方法。

为解决上述技术问题，提供技术方案如下：将目的基因克隆到所述载体的多克隆位点，获得目的基因表达载体，通过农杆菌介导法将目的基因转化黑曲霉，获得目的基因在靶位点整合的不含有筛选标记的食品级黑曲霉工程菌。

所述目的基因为黑曲霉内切木聚糖酶基因XynB、黑曲霉甘露糖酶基因MAN、和牛凝乳酶基因cym。

进一步地，所述构建方法是将黑曲霉内切木聚糖酶基因XynB克隆到载体pSZHG的多克隆位点，获得目的基因表达载体pSZHG-xynB；通过农杆菌介导法将XynB基因转化黑曲霉，获得XynB基因在黑曲霉糖化酶位点整合的不含有筛选标记基因的食品级黑曲霉工程菌。

进一步地，所述构建方法是将黑曲霉甘露糖酶基因MAN克隆到载体pSZHG的多克隆位点，获得目的基因表达载体pSZHG-MAN；通过农杆菌介导法将MAN基因转化黑曲霉，获得MAN基因在黑曲霉糖化酶位点整合的不含有筛选标记基因的食品级黑曲霉工程菌。

进一步地，所述构建方法是将牛凝乳酶基因cym克隆到载体pSZHGS或pSZHGF的多克隆位点，获得目的基因表达载体pSZHGS-CYM和pSZHGF-CYM；通过农杆菌介导法将cym基因转化黑曲霉，获得cym基因在黑曲霉糖化酶位点整合的不含有筛选标记基因的食品级黑曲霉工程菌。

所述Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体的具体构建方法：

在Ti质粒植物表达载体pBI121（图1）的基础上，切除T-DNA区域的植物筛选标记基因NPTII和gus基因表达框，在T-DNA区域引入如下元件：黑曲霉糖化酶基因启动子GLA5、多克隆位点、黑曲霉糖化酶基因终止子、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA、黑曲霉筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因HPH、黑曲霉糖化酶基因终止子GLA3，构建Ti质粒黑曲霉基因置换系列表达载体（图2A-C）。在该系列载体结构中，NPTII为细菌筛选标记新霉素磷酸转移酶基因；LB、RB分别是Ti质粒的左边界、右边界；GLA5用于调控目的基因的表达，同时也是5’-同源臂；PgpdA用于调控HPH基因的表达；GLA3用于终止目的基因和HPH基因的转录，同时HPH之后的GLA3是3’-同源臂，两个GLA3之间的DNA片段可通过体内同源重组被删除；sig是黑曲霉糖化酶基因glaA的分泌信号肽编码序列；glaA498是黑曲霉糖化酶基因glaA的N端498个氨基酸的编码序列（含内含子）；kex2是切割位点glu lys arg的编码序列；克隆位点ApaI、StuI、ClaI用于目的基因的克隆。

目的基因表达载体的构建方法：利用常规的分子克隆方法，通过PCR引物设计在待表达的目的基因两侧引入合适的酶切位点（ApaI、NheI、StuI、ClaI、HindIII或它们的同尾酶），将目的基因连接在载体pSZHG/pSZHGS/pSZHGF的克隆位点（ApaI、NheI、StuI、ClaI、HindIII）。

黑曲霉工程菌的构建方法：采用农杆菌介导法将上述表达载体转化黑曲霉，通过潮霉素筛选和PCR鉴定，获得在糖化酶基因位点整合的不含有筛选标记基因HPH的转化子；通过SDS-PAGE和蛋白活性检测等方法测定重组蛋白的表达量，获得安全高效表达重组蛋白的工程菌。

本发明提供的系列载体有以下3个优点：（1）目的基因可通过同源重组整合在黑曲霉糖化酶基因位点，消除转基因的位置效应和糖化酶基因表达的竞争效应，提高表达水平；（2）可通过两个GLA3之间的同源重组删除筛选标记基因HPH，成为食品级表达系统，并可实现重复转化；（3）目的基因由高表达的黑曲霉糖化酶基因启动子调控，表达水平高，发酵条件易于控制。

附图说明：

图1：载体pBI121的质粒图谱。

图2：本发明的Ti质粒系列表达载体的质粒图谱。

图3：pSZH载体的构建示意图。

图4：PCR扩增GLA3电泳图（M，分子量标记DL2000；1，PCR扩增结果）

图5：pAN-Gla3载体的构建示意图。

图6：pSZH-hph载体的构建示意图。

图7：PCR扩增GLA3、GLA5F、GLA5S、GLA5电泳图（M，分子量标记DL2000；1，GLA3PCR扩增结果；2，GLA5F PCR扩增结果；3，GLA5S PCR扩增结果；4，GLA5PCR扩增结果）。

图8：pSZHG、pSZHGS、pSZHGF载体的构建示意图。

图9：xynB基因的PCR扩增电泳图（M，分子量标记DL2000；1，xynB扩增结果）。

图10：pSZHG-xynB载体导入农杆菌的PCR电泳图（M，分子量标记DL5000；1，水阴性对照；2，质粒pSZHG-xynB阳性对照；3，4，5为pSZHG-xynB转化子）。

图11：pSZHG-xynB黑曲霉转化子的PCR电泳图（M，分子量标记DL5000；1，水阴性对照；2，质粒pSZHG-xynB阳性对照；3，CICC2462基因组DNA对照；4-13为潮霉素抗性转化子）。

图12：同源重组转化子的PCR电泳图（M，分子量标记DL2000；1，水阴性对照；2，CICC2462基因组DNA对照；3，质粒pSZHG-xynB对照；泳道4-15为pSZHG-xynB转化子，其中5、9、15为非同源重组转化子，其它为同源重组转化子）。

图13：纯合的同源重组菌株的PCR电泳图（M，分子量标记DL5000；1，水阴性对照；2，质粒pSZHG-xynB阳性对照；3，CICC2462基因组DNA对照；4-17为纯合的同源重组菌株）。

图14：GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE引物鉴定HPH基因消除的PCR扩增结果（M表示分子量标记DL5000；1为水阴性对照；2为CICC2462基因组DNA阳性对照；3为质粒pSZHG-xynB阳性对照；4-5为不抗潮霉素的菌落）。

图15：同源重组引物鉴定HPH基因消除的PCR扩增结果（M表示分子量标记DL5000；1为阴性对照；2-4为抗潮霉素菌落；5、6为不抗潮霉素的菌落）。

图16：重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析（M为小分子量蛋白Marker；1为出发菌株CICC2462；2为B10-5-100；3为B10-5-111；4为B10-5-100：CICC2462=10：1；5为B10-5-100：CICC2462=5：5；6为B10）。

图17：重组木聚糖酶的SDS-PAGE分析（M为小分子量蛋白Marker；1为样品100-5；2为样品100-7.5；3为样品100-10；4为样品111-5；5为样品111-7.5；6为样品111-10；7为出发菌株CICC2462）。

图18：MAN基因的PCR扩增结果（M表示分子量标记DL2000；1为MAN基因）。

图19：pSZHG-MAN转化农杆菌AGL1PCR鉴定结果（M表示分子量标记DL2000；1为水阴性对照；2为pSZHG-MAN质粒对照；3-7为pSZHG-MAN转化子）。

图20：pSZHG-MAN黑曲霉转化子PCR验证结果（M表示分子量标记DL5000；1为阴性对照；2为pSZHG-MAN质粒对照；3为出发菌株CICC2462；4-8为非阳性转化子；9-11为阳性转化子）。

图21：pSZHG-MAN黑曲霉同源重组转化子PCR验证结果（M表示分子量标记DL2000；1为出发菌株CICC2462；2为pSZHG-MAN质粒对照；3为非同源重组转化子；4、5为同源重组转化子）。

图22：重组甘露聚糖酶的SDS-PAGE分析（M为小分子量蛋白Marker；1、2为同源重组转化子；3为出发菌株CICC2462）。

图23：Cym基因PCR扩增结果（M表示分子量标记DL2000；1为Cym基因PCR扩增结果）。

图24：pSZHGS-CYM转化农杆菌AGL1PCR鉴定结果（M表示分子量标记DL2000；1为pSZHGS-CYM质粒对照；2为水阴性对照；3-8为pSZHGS-CYM转化子）。

图25：pSZHGF-CYM转化农杆菌AGL1PCR鉴定结果（M表示分子量标记DL5000；1为水阴性对照；2为pSZHGF-CYM质粒对照；3-6为pSZHGF-CYM转化子）。

图26：pSZHGS-CYM黑曲霉转化子PCR验证结果（M表示分子量标记DL5000；1为水阴性对照；2为出发菌株CICC2462基因组DNA对照；3为pSZHGS-CYM质粒对照；4-8为阳性转化子）。

图27：pSZHGF-CYM黑曲霉转化子PCR验证结果（M表示分子量标记DL5000；1为出发菌株CICC2462基因组DNA对照；2为pSZHGF-CYM质粒对照；3、4为阳性转化子）。

图28：pSZHGS-CYM黑曲霉同源重组转化子PCR检测结果（M表示分子量标记DL2000；1为出发菌株CICC2462；2为pSZHGF-CYM质粒对照；3-6为非同源重组转化子；7、8为同源重组转化子）。

图29：pSZHGF-CYM黑曲霉同源重组转化子PCR检测结果（M表示分子量标记DL2000；1为出发菌株CICC2462；2为同源重组转化子）。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述。本领域的普通技术人员可以理解本发明并不限于所述实施例，应以权利要求书保护范围为准，在实施例中所用材料均可商品化购买。

实施例1：pSZHG、pSZHGS、pSZHGF载体的构建

①载体pSZH的构建

用NheI、EcoRI双酶切植物表达载体pBI121(购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，图谱参见图1)，回收约9500bp大片段，与合成的接头序列连接（Adaptor1：5’CTAGCAAGCTTCTCGAGGATCCTCTAGAG  3’ ； Adaptor2 ： 5’AATTCTCTAGAGGATCCTCGAGAAGCTTG3’，上海生工合成），构建载体pSZH（图3）。

②载体pAN-Gla3的构建

以糖化酶生产菌黑曲霉CICC2462（购自中国工业微生物菌种保藏管理中心）基因组DNA为模板，用GLA3特异性引物（GLA3SENCE1：BglII5’AGATCTACAATCAATCCATTTCGCTATAGTT3’：3；GLA3ANTISENCE1：XbaI5’TCTAGACATAAGGCGGGTTCACATC3’；上海生工合成）进行PCR扩增。在上游引物5’端引入一个BglⅡ位点（如下划线所示），下游引物5’端引入XbaⅠ位点（如下划线所示）。

通过PCR反应扩增得到1200bp左右的特异条带，参见图4。回收片段与pMD18-T载体（购自宝生物工程有限公司）连接，转化大肠杆菌DH5α（购自宝生物工程有限公司）获得pMD-Gla3质粒，送交测序，结果表明正确。

用XbaI、BamHI双酶切载体pAN7-1（购自中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心，图谱参见图7），回收约6000bp的片段，XbaI、BglII双酶切载体pMD-Gla3，回收约1200bp的Gla3片段，将2片段连接，构建载体pAN-Gla3（图5）。

③pSZH-hph载体的构建

用XbaI、XhoI酶切载体pAN-Gla3，回收约3500bp片段。用NheI、XhoI酶切载体pSZH，回收约9500bp片段。将2片段连接，构建载体pSZH-hph（图6）。

④pSZHG、pSZHGS、pSZHGF载体的构建

以黑曲霉CICC2462基因组为模板，分别用GLA5特异性引物（GLA5SENCE：XbaI5’TCTAGACTCGGCGACTTGGTCTTCAC3’；GLA5ANTISENCE：5’ApaI GGGCCCTGCTGAGGTGTAATGATGCTGG3’；上海生工合成）、GLA5S（GLA5+sig）特异性引物（GLA5SENCE同上；GLA5S ANTISENCE：5’ApaI GGGCCCATTTGCCAACCCTGTGCAGAC3’；上海生工合成）、GLA5F（GLA5+glaA498+kex2）特异性引物（GLA5SENCE同上；Gla5FANTISENCE：5’ApaI GGGCCC GCGCTTCTCGGTGCCGCCAGTAGCCACG3’；上海生工合成）、GLA3特异性引物（GLA3SENCE2：5’ApaI、NheI、StuI、ClaI、HindIII：GGGCCC GCTAGC AGGCCT ATCGAT AAGCTT ACAATCAATCCATTTCGCTATAGTT3’；GLA3ANTISENCE2：XhoI5’CTCGAGCATAAGGCGGGTTCACATC3’；上海生工合成）进行PCR扩增。分别可扩增出约1100bp的GLA5片段、约1150bp的GLA5S片段、约2800bp的GLA5F片段和约1200bp的GLA3片段，与预期相符（图7）。将这4个片段分别克隆至载体pEASY-T1SIMPLE（购自北京全式金生物技术有限公司），转化大肠杆菌DH5α获得重组质粒pEASY-GLA5、pEASY-GLA5S、pEASY-GLA5F、pEASY-GLA3，送交测序，结果表明正确。

XbaI、XhoI双酶切载体pSZH-hph，回收约13000bp的载体片段；XhoI/ApaI双酶切载体pEASY-GLA3，回收约1200bp的GLA3片段；XbaI/ApaI双酶切载体pEASY-GLA5、pEASY-GLA5S、pEASY-GLA5F，分别回收约1100bp的GLA5片段、约1150bp的GLA5S片段、约3000bp的GLA5F片段。将载体pSZH-hph片段、GLA3片段和GLA5片段/GLA5S片段/GLA5F片段进行连接，构建载体pSZHG、pSZHGS、pSZHGF（图8）。

实施例2：利用食品级黑曲霉表达系统高效分泌表达木聚糖酶

（1）木聚糖酶基因表达载体构建

①木黑曲霉聚糖酶基因xynB的扩增

以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，用木聚糖酶基因xynB引物（xynB-sense：5’ApaIGGGCCCACCATGCTCACCAAGAACCTTC3’；xynB-antisen：5’HindIIIAAGCTTTTACTGAACAGTGATGGAC3’；上海生工合成）扩增xynB基因，得到约746bp的xynB基因片段（图9）。MD18-基因片段与克隆载体pMD18-T连接，转化大肠杆菌TOP10，提取质粒pMD-xynB，送交测序，结果表明正确。

②木聚糖酶基因黑曲霉表达载体pSZHG–xynB的构建

用ApaI、HindIII双酶切质粒pMD18-xynB，回收约700bp的目的片段，用相同的酶消化载体pSZHG，回收约15000bp的目的片段，将这2个片段连接，构建黑曲霉表达载体pSZH-xynB。

（2）木聚糖酶黑曲霉工程菌的构建

①重组质粒转化农杆菌

采用冻融法将构建好的同源重组表达载体pSZH-xynB转化入农杆菌AGLI（提供来源）中，涂布在含有50mg/L Rif和mg/L Kan的固体YEB培养基上，28℃培养3-4d，待长出单菌落以菌落为模板，以水为阴性对照，以质粒pSZH-xynB为阳性对照，用引物GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2进行PCR鉴定（图10），可扩增出约3000bp目的条带xynB，说明载体pSZH-xynB成功地转入农杆菌AGLI中。

②农杆菌介导法转化黑曲霉

取200μL黑曲霉CICC2462菌丝悬液和150μL农杆菌菌液混匀，将上述混合物涂布到铺有玻璃纸的含200umol/L AS的PDA平板上，28℃共培养2d，将玻璃纸转到含200mg/L头孢噻肟霉素、200mg/L潮霉素B的PDA平板上，32℃培养1d后揭下玻璃纸，继续培养6-8d至长出菌落。将抗性菌落转移到含200mg/L潮霉素B的PDA液体培养基上，进行二次筛选。

③黑曲霉转化子的鉴定

对二次筛选仍然正常生长的黑曲霉菌丝体采用CTAB法提取基因组，以提取的基因组DNA为模板，用引物GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2进行PCR检测，检测结果如图23，共对挑取的67株菌进行PCR检测，结果有47株菌可扩增出约3000bp的目的条带，是阳性重组转化子，xynB基因转化的阳性率为70.15%（图11）。

进一步用鉴定同源重组引物（hph-sense：GACAATGGCCGCATAACAG；hph-antisense：GAAGCCTTGAGCGACGAAT；上海生工合成，hph-sense位于HPH基因内，hph-antisense位于GLA3外侧）对转化子进行PCR检测，筛选同源重组转化子。对12株PCR阳性菌株做PCR鉴定，结果有9株可扩增出约1701bp的目的条带（图12），是同源重组转化子，同源重组率为66.7%。

根据图11、图12可知，这9株菌均为同源重组转化子与非同源重组转化子或出发菌株的混合物，这是由于转化受体为多核菌丝所导致的。

为分离出纯合的同源重组转化子，将同源重组转化子在含有200mg/L潮霉素B的PDA液体培养基中连续传代，液体培养物涂在含有200mg/L潮霉素B的PDA固体培养基上，28℃培养3-4d后，挑取单菌落于PDA液体培养基中培养，待长出大量菌丝后，提取基因组DNA，用引物GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2做PCR鉴定，鉴定结果如图13，共检测26个菌落，均只扩增出约3000bp的目的条带xynB，没有约4900bp的糖化酶基因条带，结果表明这26个菌落均为纯合的同源重组菌株，命名为B10-5。

④同源重组菌株中潮霉素抗性基因的消除

载体pSZH-xynB构建时在潮霉素抗性基因两端各引入了一段顺向重复的约1.1kb的GlaA终止子序列GLA3，通过这两段终止子序列之间的同源重组删除掉HPH基因，获得符合食品级生产要求的重组菌。

为此将上述筛选出的纯合同源重组转化子B10-5在不含潮霉素的PDA液体培养基中连续传代5代，之后菌丝体均匀地涂布在不含潮霉素的PDA平板上，32℃培养3-4d后，将平板上长出的单菌落一一对应地转移至含潮霉素的PDA平板上，以出发菌株CICC2462为阴性对照，32℃培养3-4d。提取两个在含潮霉素的PDA平板上不生长的对应菌落（命名为B10-5-100﹑B10-5-111）和两个在含潮霉素的PDA平板上生长的对应菌落的基因组DNA，以基因组DNA为模板，分别用引物GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2和同源重组引物（hph-sense和hph-antisense）分别进行PCR鉴定，鉴定结果分别如图14和图15。

在图14中，泳道4和5为挑取的在含潮霉素的PDA平板上不生长的对应菌落，扩增出了约3000bp的目的条带xynB基因。在图15中，泳道4和泳道5为在含潮霉素的PDA平板上不生长的对应菌落，不能扩增出1701bp的目的带。说明在含潮霉素的PDA平板上不生长的菌落中的目的基因XYNB仍整合在糖化酶基因位点，而HPH基因已被消除。

（3）重组蛋白表达的检测

考虑到在纯合同源重组菌株中，糖化酶基因已经被木聚糖酶基因所置换，失去了出发菌株CICC2462对液化淀粉的良好利用能力，因此对工程菌的发酵条件进行了探讨。在糖化酶摇瓶发酵条件下（每升培养基含120克液化淀粉、20毫升玉米浆、20克豆饼粉，pH5.5～6.0），分别对CICC2462，已删除HPH基因的纯合同源重组菌株B10-5-100﹑B10-5-111，B10-5-100与CICC2462分别按10：1和5：5比例接种，非纯合菌株B10的发酵液上清进行酶活检测（采用DNS法测定木聚糖酶活性。木聚糖酶酶活力单位定义，在50℃，pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位），当培养到9d时酶活达到最高，发酵液上清中木聚糖酶酶活分别为39u/mL，435u/mL，370u/mL，355u/mL，5830u/mL，7480u/mL。对摇瓶培养9d后的发酵液上清进行SDS-PAGE分析，如图16，可见样品5：5、B10在约24kDa有一条明显的蛋白条带，而样品CICC2462、B10-5-100﹑B10-5-111、10：1基本看不清带，说明在纯合同源重组菌株中的确由于失去了糖化酶的合成能力而不能很好的利用液化淀粉，从而影响了菌株的生长和产酶。而纯合同源重组菌株的这种缺陷可以通过将纯合同源重组菌株与出发菌株混合培养，或利用非纯合的同源重组菌株进行发酵所弥补。

进而将重组菌株B10-5-100﹑B10-5-111分别接入含有5%﹑7.5%和10%葡萄糖的发酵培养基（其它成分为每升培养基含20克液化淀粉、20毫升玉米浆、20克豆饼粉，pH5.5～6.0）中，摇瓶培养，当培养到5d时，样品100-5，100-7.5，100-10，111-5，111-7.5，111-10的酶活力分别为2080u/mL，2240u/mL，3280u/mL，3040u/mL，3360u/mL，3920u/mL。取发酵液上清进行SDS-PAGE分析，在约24kDa都有明显的蛋白条带（图17）。说明以葡萄糖代替液化淀粉后，重组菌株B10-5-100﹑B10-5-111能够生长和产酶。

总之，利用本发明所提供的表达系统，所构建的食品级木聚糖酶工程菌在摇瓶发酵条件下酶活可达到7000u/mL以上。

实施例3：利用食品级黑曲霉表达系统高效分泌表达甘露聚糖酶

（1）载体构建，方法同实施例2。

①甘露聚糖酶基因MAN的扩增

以黑曲霉CICC2462基因组DNA为模板，用甘露聚糖酶基因MAN引物（MAN sence：5’ApaI GGG CCCACCATGGGGTCGTTAGAGGCTG3’，；MAN antisence5’EcoRV GATATCTTATTTTCGGTCCACTTGGTC3’，上海生工合成）扩增约1300bp的MAN基因片段，PCR扩增结果见图18。将该片段克隆至载体pMD18-T，获得质粒pMD-MAN，送交测序，结果表明正确。

②黑曲霉表达载体pSZH-MAN的构建

用ApaI、EcoRV双酶切质粒pMD-MAN，回收约1300bp的目的片段，用ApaI、StuI双酶切载体pSZHG，回收约15000bp的目的片段，将这2个片段连接，构建黑曲霉表达载体pSZH-MAN。

（2）甘露聚糖酶黑曲霉工程菌的构建，方法同实施例2

①重组质粒转化农杆菌

载体pSZH-MAN农杆菌转化子PCR鉴定结果如图19所示，各转化子均可扩增出约1300bp的目的片段，证明pSZH-MAN确已转入农杆菌中。

②  农杆菌介导法转化黑曲霉

对转化子基因组DNA用GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2引物进行PCR检测，检测结果如图20。泳道9-11均可扩增出约3600bp的目的条带，为阳性转化子。用引物hph-sense、hph-antisense对3株阳性转化子进行PCR检测，其中2株可以扩增出约1701bp的目的条带，为同源重组转化子（图21）。

（3）重组蛋白表达的检测

分别对初始菌株黑曲霉CICC2462和2株同源重组转化子的发酵上清液进行酶活检测（培养基为每升含100g葡萄糖、20克液化淀粉、20毫升玉米浆、20克豆饼粉，pH5.5～6.0），结果表明培养8d时2株同源重组转化子酶活达最高，分别为5467.2U/mL、2986.6U/mL，而出发菌株酶活仅为170.4U/mL（酶活力定义为：每小时水解槐豆胶产生1mg还原糖（以甘露糖计）所需酶量为一个酶活力单位）。对摇瓶培养8d后的发酵液上清进行SDS-PAGE分析，如图22，从蛋白电泳图可见，在约44kDa，样品1、2有一条明显的蛋白条带，而出发菌株无此条带。

实施例4：利用食品级黑曲霉表达系统高效分泌表达牛凝乳酶

（1）载体构建，方法同实施例2

①牛凝乳酶基因cym的扩增

取小牛皱胃，液氮快速冷冻后研磨，用RNAiso Reagent（购自购自宝生物工程有限公司）提取总RNA，用PrimeScript^TM One Step RT-PCR Kit（购自购自宝生物工程有限公司）扩增牛凝乳酶，cym引物为cymSENCE：5’XbaI TCTAGAGCTGAGATCACCAGGATC3’；cym ANTISENCE：5’HindIII AAGCTTCAGATGGCTTTGGCCAG3’（上海生工合成）。扩增得到1150bp的目的条带（图23）。将该片段克隆至载体pMD18-T，转化大肠杆菌DH5α获得重组质粒pMD-CYM，送交测序，结果表明正确。

②黑曲霉表达载体pSZHGS-CYM、pSZHGF-CYM的构建

XbaI、HindIII双酶切质粒pMD-CYM，回收约1150bp的cym基因片段，NheI、HindIII双酶切载体pSZHGS-CYM、pSZHGF-CYM，分别回收约15000bp、17000bp的载体片段。将cym基因片段分别与载体片段连接，构建表达载体pSZHGS-CYM、pSZHGF-CYM。

（2）牛凝乳酶黑曲霉工程菌的构建，方法同实施例2。

①重组质粒转化农杆菌

载体pSZHGS-CYM、pSZHGF-CYM农杆菌转化子PCR鉴定结果如图24、25所示。在图24的pSZHGS-CYM转化农杆菌AGL1PCR鉴定结果中，所有转化子均可扩增出1150bp的目的条带，证明pSZHGS-CYM已转入农杆菌中。在图25的pSZHGF-CYM转化农杆菌AGL1PCR鉴定结果中，所有转化子均可扩增出5200bp的目的条带，证明pSZHGF-CYM已转入农杆菌中。

③农杆菌介导法转化黑曲霉

对转化子基因组DNA用GLA5SENCE、GLA3ANTISENCE2引物进行PCR检测，筛选阳性转化子，检测结果如图26、27。图26为pSZHGS-CYM黑曲霉转化子PCR验证结果，其中泳道4-8均可扩增出约3500bp目的条带，为阳性转化子。图27为pSZHGF-CYM黑曲霉转化子PCR验证结果，其中泳道3、4均可扩增出约5200bp目的条带，为阳性转化子。

用引物hph-sense、hph-antisense对阳性转化子进行PCR检测，筛选同源重组转化子（图28、29）。图28为pSZHGS-CYM黑曲霉同源重组转化子PCR检测结果，其中泳道7、8扩增出约1701bp的目的条带，为同源重组转化子。图29为pSZHGF-CYM黑曲霉同源重组转化子PCR检测结果，其中泳道2扩增出约1701bp的目的条带，为同源重组转化子。

（3）重组蛋白表达的检测

分别对初始菌株黑曲霉CICC2462、2株转pSZHGS-CYM同源重组转化子和1株转pSZHGF-CYM同源重组转化子的发酵上清液（培养基为每升含100g葡萄糖、20克液化淀粉、20毫升玉米浆、20克豆饼粉，pH5.5～6.0）进行酶活检测（40min凝结1mL10%脱脂奶粉的酶量定义为一个Soxhlet单位），结果表明培养8d时转化子酶活达最高，2株转pSZHGS-CYM同源重组转化子发酵上清液酶活分别为480SU/mL、923SU/mL，转pSZHGF-CYM同源重组转化子的发酵上清液酶活为1263SU/mL，而出发菌株测不出酶活。

Claims (12)

1.Ti质粒黑曲霉基因置换表达载体，其特征在于，其T-DNA区域元件排列次序如下：黑曲霉靶基因启动子、多克隆位点、黑曲霉靶基因终止子、构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA、黑曲霉筛选标记基因、黑曲霉靶基因终止子。

2.权利要求1所述载体，其特征在于，所述黑曲霉靶基因为黑曲霉糖化酶基因glaA。

3.权利要求1或2所述载体，其特征在于，所述黑曲霉靶基因启动子还包括带有信号肽编码序列的黑曲霉靶基因启动子或带有融合蛋白编码序列的黑曲霉靶基因启动子。

4.权利要求1所述载体，其特征在于，黑曲霉筛选标记基因为潮霉素磷酸转移酶基因HPH。

5.权利要求1所述载体，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述黑曲霉糖化酶基因启动子核苷酸序列如SEQ ID NO.16784-7845bp位置所示，多克隆位点核苷酸序列如SEQ ID NO.17846-7875bp位置所示，黑曲霉糖化酶基因终止子核苷酸序列如SEQ ID NO.17876-9074bp位置与11344-12542bp位置所示，构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因启动子PgpdA核苷酸序列如SEQ ID NO.19081-10128bp位置所示，黑曲霉筛选标记潮霉素磷酸转移酶基因HPH核苷酸序列如SEQ ID NO.110301-11320bp位置所示。

6.权利要求3所述载体，其特征在于，黑曲霉糖化酶基因启动子下游带有黑曲霉糖化酶基因分泌信号肽编码序列sig，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

7.权利要求3所述载体，其特征在于，黑曲霉糖化酶基因启动子下游带有黑曲霉糖化酶基因glaA的N端498个氨基酸的编码序列和切割位点kex2的编码序列，所述glaA的N端498个氨基酸核苷酸序列如SEQ ID NO.31-1743bp位置所示，所述kex2核苷酸序列如SEQ ID NO.31744-1752bp位置所示。

8.权利要求1所述载体用于构建黑曲霉工程菌。

9.权利要求8所述方法，其特征在于，将目的基因克隆到所述载体的多克隆位点，获得目的基因表达载体，通过农杆菌介导法将目的基因转化黑曲霉，获得目的基因在靶位点整合的不含有筛选标记的食品级黑曲霉工程菌。

10.权利要求9所述方法，其特征在于，将黑曲霉内切木聚糖酶基因XynB克隆到载体pSZHG的多克隆位点，获得目的基因表达载体pSZHG-xynB；通过农杆菌介导法将XynB基因转化黑曲霉，获得XynB基因在黑曲霉糖化酶位点整合的不含有筛选标记基因的食品级黑曲霉工程菌。

11.权利要求9所述方法，其特征在于，将黑曲霉甘露糖酶基因MAN克隆到载体pSZHG的多克隆位点，获得目的基因表达载体pSZHG-MAN；通过农杆菌介导法将MAN基因转化黑曲霉，获得MAN基因在黑曲霉糖化酶位点整合的不含有筛选标记基因的食品级黑曲霉工程菌。

12.权利要求9所述方法，其特征在于，将牛凝乳酶基因cym克隆到载体pSZHGS或pSZHGF的多克隆位点，获得目的基因表达载体pSZHGS-CYM和pSZHGF-CYM；通过农杆菌介导法将cym基因转化黑曲霉，获得cym基因在黑曲霉糖化酶位点整合的不含有筛选标记基因的食品级黑曲霉工程菌。

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