CN108441508B - 地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用 - Google Patents

地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用，本发明通过基因工程的方法通过敲除地衣芽孢杆菌基因组内的lrpC基因，得到地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC，该菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了10%以上。

Description

地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用
技术领域
本发明涉及地衣芽孢杆菌菌株改造领域，尤其是一种通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用。
背景技术
地衣芽孢杆菌杆菌属于革兰氏阳性菌，其是公认的具有生物安全性(GRAS)的重要工业微生物菌株。由于地衣芽胞杆菌具有遗传背景清晰、工业应用价值高等特点，近年来被广泛用来研究。
目前，地衣芽胞杆菌主要用于发酵生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素等生物化工产品。杆菌肽又名枯草菌素，其可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素(如青霉素、庆大霉素等)具有协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。
地衣芽胞杆菌DW2是一株产杆菌肽的野生菌株，该菌株目前已保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M2011344。
杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，杆菌肽的组成氨基酸包括鸟氨酸(Orn)，D-苯丙氨酸(D-Phe)，异亮组氨酸(His),D-天冬氨酸(D-Asp),天冬酰胺(Asn)、赖氨酸(Lys),D-谷氨酸(D-Glu)，半胱氨酸(Cys)，亮氨酸(Leu)，异亮氨酸(Ile)和缬氨酸(Val)11种氨基酸。亮氨酸应答蛋白(Lrps)是一种转录调控因子，LrpC(LrpC为lrpC基因的表达产物)作为Lrps家族的成员，其也是一种亮氨酸应答蛋白。LrpC能在细菌和古细菌中调节多种细胞过程的转录因子，其可以调节100多个基因的表达。但是，目前的研究尚未解析出LrpC的具体调控机理，因此，也无法推断出：LrpC与亮氨酸合成以及杆菌肽产量之间的关系。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法，此构建方法是通过敲除地衣芽孢杆菌DW2基因组中的lrpC基因来构建地衣芽孢杆菌基因工程菌，所得到的基因工程菌的杆菌肽产量有了大幅提升。
通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的方法，包括以下步骤：
(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；
(2)采用限制性内切酶Xba I和Sac I对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；
(3)准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶Xba I和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；
(4)将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC；
(5)将lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lrpC基因的上游臂或lrpC基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
(6)挑选lrpC基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lrpC基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除lrpC基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC；
其中，上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的lrpC基因为SEQUENCE LISTING中所示。
本发明人首次尝试构建敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC，得到了大幅提高地衣芽胞杆菌DW2的杆菌肽产量的技术效果，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。与地衣芽孢杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC的杆菌肽产量提高了10％以上。本发明的研究结果表明：敲除lrpC基因是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法。
本发明的目的之二在于根据上述通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC。
本发明的目的之三在于根据上述通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO3和0.5-2g/L(NH4)2SO4。
附图说明
图1为lrpC基因的上游同源臂和下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNAmarker，泳道2为lrpC基因的上游同源臂，泳道3为lrpC基因的下游同源臂；
图2为地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC的PCR验证图，泳道1为DNA marker，泳道2为地衣芽胞杆菌DW2的验证条带，泳道3为地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC的验证条带；
其中，图1和图2中的DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
具体实施方法
通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法，包括以下步骤：
(1)以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；
(2)采用限制性内切酶Xba I和Sac I对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；
(3)准备质粒T2(2)-ori，并采用限制性内切酶Xba I和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；
(4)将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC；
(5)将lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC转入地衣芽胞杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lrpC基因的上游臂或lrpC基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
(6)挑选lrpC基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lrpC基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除lrpC基因的地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC；
其中，上述步骤中的地衣芽胞杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；
所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的lrpC基因为SEQUENCE LISTING中所示。
通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法的具体实施方式如下：
1、步骤(1)的具体操作步骤为：
以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lrpC基因的上游同源臂(509bp，所用引物为lrpC-F1和lrpC-R1)和lrpC基因的下游同源臂(516bp，所用引物为lrpC-F2和lrpC-R2)；再利用重叠延伸PCR方法将lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A(1025bp)；其中，用于扩增lrpC基因的上、下游同源臂的引物为：
lrpC-F1：GCGAGCTCCCGTTATTTCTTCTTCTGA、
lrpC-R1：ATAAACGCTTCGATCTGCTCTTTCGGTCACAGACG、
lrpC-F2：CGTCTGTGACCGAAAGAGCAGATCGAAGCGTTTAT、
lrpC-R2：GCTCTAGAAGACCGATGAAATCCACAG；
2、步骤(2)的具体操作步骤为：
采用限制性内切酶Xba I和Sac I对步骤(1)得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A(1023bp)；
3、步骤(3)的具体操作步骤为：
准备质粒T2(2)-ori(其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献下述文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短短小芽孢杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441)，并采用限制性内切酶Xba I和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori(4250bp)；
4、步骤(4)的具体操作步骤为：
将步骤(2)得到的酶切基因片段A与步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori(4250bp)经DNA连接酶(市售的DNA连接酶均可，通常为T4 DNA连接酶)进行连接，得到连接产物；将该连接产物转入大肠杆菌(具体为大肠杆菌DH5α)，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1276bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：敲除载体T2(2)-ΔbcaP)；
将步骤(2)得到的酶切基因序列A连接到步骤(3)得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到bcaP基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC；并对lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC进行PCR验证，其验证引物为：
T2-F：ATGTGATAACTCGGCGTA、
T2-R：GCAAGCAGCAGATTACGC；
5、步骤(5)的具体操作步骤为：
将lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC转入地衣芽孢杆菌DW2中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)，得到阳性转化子；将阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的转接培养数次后，并以T2-F和ΔlrpC-KYR为引物(或以T2-R与ΔlrpC-KYF为引物)进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1264或1520bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
其中，ΔlrpC-KYF和ΔlrpC-KYR的序列为:
ΔlrpC-KYF：ACAAAATAAATAATCCGCCGTGAAG、
ΔlrpC–KYR：CAAGTCGACGATGGCGGCCGGTTTG；
6、步骤(6)的具体操作步骤为：
将步骤(5)得到的PCR检测出现1264bp条带的单交换菌株和步骤(5)得到的PCR检测出现1520bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为ΔlrpC-KYF和ΔlrpC-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在2054bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽孢杆菌DW2；在1466bp处出现电泳条带时，说明DW2的基因组上的lrpC基因成功敲除，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的lrpC敲除菌株(即地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC)。
本发明人根据上述通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到了地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC。
本发明人根据上述通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0～7.2。
所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO3和0.5-2g/L(NH4)2SO4。
本发明人根据上述地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用步骤提供了15种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例15的种子培养基和发酵培养基的配方。
表1
Figure GDA0002646864560000071
其中，上述实施例中均采用本发明专利方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC。所述种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽孢杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1％接种量接种于种子发酵的培养基后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2％(体积百分比)，转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。
本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6mm×250mm)；流动相为A:B＝35:65(A相：100mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300mL水中混合均匀；B相：520mL甲醇与40mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30℃；紫外检测器波长：254nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量(见表2)。
表2
Figure GDA0002646864560000081
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽孢杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌DW2ΔlrpC的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升(至少提高10％以上)，说明：本发明的技术方案在提高地衣芽孢杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。
序列表
<110> 绿康生化股份有限公司
<120> 通过敲除lrpC基因构建地衣芽孢杆菌的方法及菌株及其应用
<130> DS-P18017
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 429
<212> DNA
<213> Bacillus licheniformis
<400> 1
atgaaaattg atgacctcga tgttaaaatc ataaccgaat taaagaaaga cagccgttta 60
tcgatgcggg agctgggcag gaagatcagc ctttccgcgc cgtctgtgac cgaaagagtc 120
aggcggctcg aatcgttcgg catcattaaa aaatatacgc ttgacatcga ttaccaaaag 180
gtcggtcttc ccgtatcctg catcattgaa gcaacggtga aaaacgggga atacgaaagg 240
tttaaagcat atatcgaacg cctcccgaac attgaattct gctaccggat cgcgggagcc 300
gcctgctata tgctgaaaat caatgcagag agcctggcgc agatcgaagc gtttatcaat 360
gaaacatcac catatgccca aaccgtgaca cacgtcattt tttctgaaat tgaaataaag 420
gaatcgtga 429

Claims (4)

1.通过敲除lrpC基因构建得到的地衣芽孢杆菌（ Bacillus licheniformis ）DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用，所述地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC的具体构建方法包括以下步骤：
（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂；再利用重叠延伸PCR方法将lrpC基因的上游同源臂和lrpC基因的下游同源臂拼接在一起，得到融合基因序列A；
（2）采用限制性内切酶Xba I和Sac I对步骤（1）得到的融合基因序列A进行双酶切，得到酶切基因序列A；
（3）准备质粒 T2(2)-ori，并采用限制性内切酶Xba I和Sac I对质粒T2(2)-ori进行双酶切，得到酶切质粒T2(2)-ori；
（4）将步骤（2）得到的酶切基因序列A连接到步骤（3）得到的酶切质粒T2(2)-ori中，得到lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori- lrpC；
（5）将lrpC基因敲除质粒T2(2)-ori-lrpC转入地衣芽孢杆菌DW2中，经卡那霉素抗性筛选得到阳性转化子，抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到lrpC基因的上游臂或lrpC基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；
（6）挑选lrpC基因的上游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与lrpC基因的下游臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那霉素的培养基中经过数次转接培养，PCR法筛选得到敲除lrpC基因的地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC；
其中，上述步骤中的地衣芽孢杆菌DW2均为于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心、保藏编号为CCTCC NO：M2011344的地衣芽孢杆菌DW2；
所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的lrpC基因如SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的通过敲除lrpC基因构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，该应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。
3.根据权利要求2所述的通过敲除lrpC基因构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：8-10g/L蛋白胨，3-6g/L酵母浸出粉，7-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。
4.根据权利要求2所述的通过敲除lrpC基因构建得到的地衣芽孢杆菌DW2ΔlrpC在杆菌肽生产中的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：80-100g/L豆粕；15-45g/L玉米淀粉；4-8 g/LCaCO3和0.5-2 g/L (NH4)2SO4。
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