CN108865965B

CN108865965B - 强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用

Info

Publication number: CN108865965B
Application number: CN201810897429.3A
Authority: CN
Inventors: 陈守文; 蔡冬波; 吴非; 李俊辉; 陈晓斌; 楼丽君; 邱湘琪
Original assignee: Lifecome Biochemistry Co ltd
Current assignee: Lifecome Biochemistry Co ltd
Priority date: 2018-08-08
Filing date: 2018-08-08
Publication date: 2021-03-16
Anticipated expiration: 2038-08-08
Also published as: CN108865965A

Abstract

本发明提供一种强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2‑yugT的应用，本发明通过基因工程的方法在地衣芽孢杆菌DW2的基因组内插入葡萄糖苷酶YugT的基因—yugT，达到了强化葡萄糖苷酶YugT表达的目的。相对于地衣芽胞杆菌DW2来说，本发明所构建得到的菌株在杆菌肽发酵过程中发酵液中杆菌肽的产量提高了18%以上。

Description

强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用

技术领域

本发明属于基因工程菌改造技术领域，尤其是一种强化葡萄糖苷酶YugT表达的地衣芽胞杆菌菌株及制备方法和应用。

背景技术

地衣芽胞杆菌是公认的具有生物安全性（GRAS）的重要工业微生物菌株，其广泛存在于自然界中，其属于革兰氏阳性菌。目前，由于地衣芽胞杆菌具有遗传背景清晰、培养条件简单、工业应用价值高等特点，因此近年来被广泛研究。目前，地衣芽胞杆菌被主要用来生产聚γ-谷氨酸、杆菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素及各种酶制剂等生物化工产品。与此同时，其也可以作为良好的异源蛋白表达宿主菌，从而应用于异源蛋白的表达。

杆菌肽是一类由12个氨基酸残基组成的环肽类抗生素，其氨基酸包括鸟氨酸（Orn），D-苯丙氨酸（D-Phe），异亮组氨酸（His）, D-天冬氨酸（D-Asp）, 天冬酰胺（Asn）、赖氨酸（Lys）, D-谷氨酸（D-Glu），半胱氨酸（Cys），亮氨酸（Leu），异亮氨酸（Ile）和缬氨酸（Val）11种氨基酸。杆菌肽可以抑制或杀灭某些致病菌，强烈抑制革兰氏阴性菌的生长，并与其它抗生素（如青霉素、庆大霉素等）具有协同增强效应；并且，其几乎不会在动物的肠道内被吸收，而且排泄迅速，没有残留，因此被广泛应用于饲料添加。

地衣芽胞杆菌中存在着众多与菌株代谢产物的合成息息相关的基因，而，杆菌肽的产量与何种基因相关仍然是个未知数，通过何种基因改造的方式得到高产杆菌肽的工程菌也有待进一步的研究。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种强化葡萄糖苷酶YugT表达的地衣芽胞杆菌菌株（Bacillus licheniformis）的制备方法，此构建方法通过在地衣芽胞杆菌的基因组内插入葡萄糖苷酶YugT的基因—yugT，达到了强化葡萄糖苷酶YugT表达的目的。

强化YugT表达的地衣芽胞杆菌菌株的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因片段，再在yugT基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yugT表达元件；

（2）同时，以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因的上游同源臂和yugT基因的下游同源臂；

（3）通过重叠延伸PCR将步骤（2）得到的yugT基因的上游同源臂、步骤（1）得到的yugT表达元件和步骤（2）得到的yugT基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：yugT基因的上游同源臂-yugT表达元件-yugT基因的下游同源臂；

（4）采用BamHI和 XbaI限制性内切酶对步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（5）准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；

（6）将步骤（4）得到的酶切基因片段和步骤（5）得到的线性质粒片段经 DNA连接酶进行连接，得到整合质粒T2(2)-yugT；

（7）将步骤（6）得到的整合质粒T2(2)-yugT转入地衣芽胞杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到yugT基因的上游同源臂或yugT基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选yugT基因的上游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与yugT基因的下游同源臂与地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了yugT基因的地衣芽胞杆菌DW2-yugT（简称：Bacillus licheniformis DW2- yugT）；

其中，所述的地衣芽胞杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；

所述地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA序列中的yugT基因为SEQUENCE LISTING中所示。

本发明人首次尝试构建强化yugT基因表达的地衣芽胞杆菌，成功得到了强化yugT基因表达的地衣芽胞杆菌DW2-yugT，为提高杆菌肽产量提供了一种新策略。

本发明的目的之二在于根据上述强化YugT表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-yugT。

本发明的目的之三在于上述地衣芽胞杆菌DW2-yugT在杆菌肽生产中的应用，其应用步骤包括：A种子发酵，B生产发酵。

所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH 7.0 ~ 7.2。

所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO₃和0.5-2g/L (NH4)₂SO₄。

与地衣芽胞杆菌DW2相比，通过本发明构建得到的地衣芽胞杆菌DW2–yugT的杆菌肽产量提高了18%以上。本发明的研究结果表明：强化表达葡萄糖苷酶基因yugT是一种十分有效的提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量的方法。

附图说明

图1为步骤（1）得到的yugT基因片段的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNA Marker，泳道1为yugT基因片段；

图2为步骤（1）得到的yugT表达元件的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为yugT表达元件；

图3为步骤（2）得到的yugT基因的上游同源臂、下游同源臂的琼脂糖凝胶图；其中，泳道M为DNA marker，泳道1为yugT基因的上游同源臂，泳道2为yugT基因的下游同源臂；

图4为步骤（6）的整合表达载体T2(2)-yugT进行菌落PCR验证的琼脂糖凝胶图；其中，泳道1为DNA Marker，泳道2为菌落PCR验证条带；

其中，上述DNA Marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000 bp，3000 bp，2000 bp，1500 bp，1000 bp，750bp，500 bp，250 bp，100 bp。

具体实施方式

现根据附图具体阐述本发明的较佳实施方式：

一种强化YugT表达的地衣芽胞杆菌的构建方法，包括以下步骤：

上述葡萄糖苷酶YugT公布于美国国立生物技术信息中心—NCBI的基因库中。

一种强化YugT表达的地衣芽胞杆菌的构建方法的具体操作步骤为：

1、步骤（1）的具体操作步骤为：

根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的yugT基因的基因序列，设计yugT基因的上游引物（yugT-F）和下游引物（yugT-R）；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以yugT基因的上游引物、下游引物进行PCR扩增得到yugT基因片段（1683bp，如图1所示）；

其中，yugT-F和yugT-R的序列为：

yugT-F：AGGTAAGAGAGGAATGTACACATGACAAGGGCATGGTGGAAAGA、

yugT-R：GAAATCCGTCCTCTCTGCTCTTTTATAAATCGCCGATTTCCTGT；

再以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR分别扩增得到P43启动子（所用引物为P43-F和P43-R）和淀粉酶终止子（所用引物为TamyL-F和TamyL-R），随后将P43启动子、yugT基因片段和淀粉酶终止子通过SOE-PCR连到一起（所用引物为P43-F和TamyL-R），得到yugT基因片段上游连接有P43启动子、同时下游连接有淀粉酶终止子的基因片段，此基因片段即为完整的yugT表达元件（2483bp，如图2所示）；

其中，P43-F、P43-R、TamyL-F、TamyL-R的序列为：

P43-F：GACAGCAGCCCGCAAGTTTTCTGAACCGTCTGGATG、

P43-R：TCTTTCCACCATGCCCTTGTCATGTGTACATTCCTCTCTTACCT、

TamyL-F：CAGGAAATCGGCGATTTATAAAAGAGCAGAGAGGACGGATTTC、

TamyL-R ：GCACATCGGTCAGAACAGAATAATCGTATTCCACGCTTTC ；

2、步骤（2）的具体操作步骤为：

根据地衣芽胞杆菌DW2基因组DNA序列中的yugT基因的上、下游序列，设计yugT基因的上游同源臂引物（A-F和A-R）、下游同源臂引物（B-F和B-R）；并以地衣芽胞杆菌DW2的基因组DNA为模板，分别以yugT基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到yugT基因的上游同源臂（584 bp，如图3所示）和yugT基因的下游同源臂（536 bp，如图3所示）；

其中，A-F、A-R、B-F、B-R的序列为：

A-F ：CGGGATCCCAGACACTTTTTCAAGGATGAGCGG、

A-R ：CATCCAGACGGTTCAGAAAACTTGCGGGCTGCTGTC、

B-F ：GAAAGCGTGGAATACGATTATTCTGTTCTGACCGATGTGC、

B-R ：GCTCTAGATGTCCAATCGGTCTCAGCAGCCTTT；

3、步骤（3）的具体操作步骤为：

通过重叠延伸PCR将步骤（2）得到的yugT基因的上游同源臂、步骤（1）得到的yugT表达元件和步骤（2）得到的yugT基因的下游同源臂连接到一起（所用引物为A-F和B-R），构成目的基因片段（3603bp），该目的基因片段的排列顺序为：yugT基因的上游同源臂-yugT表达元件-yugT基因的下游同源臂；

4、步骤（4）的具体操作步骤为：

采用BamHI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段（3601bp）；

5、步骤（5）的具体操作步骤为：

准备质粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性内切酶对质粒 T2(2)-ori（其中，质粒T2(2)-ori的构建方法为：将来自pE194质粒的194-ori、来自于pDG780质粒的卡那霉素抗性基因、来自质粒pBluescript II SK(+)-X52328的pUC-ori通过PCR反应扩增，并回收、酶切。按照194-ori，卡那霉素抗性基因，pUC-ori的顺序连接。此构建方法参考文献：郭兴华,熊占等(1991)枯草杆菌-大肠杆菌多功能穿梭载体的构建.生物工程学报7(3):224-229和彭清忠,张惟材等(2002)短小芽胞杆菌-大肠杆菌穿梭分泌表达载体的构建.生物工程学报18(4):438-441）进行双酶切得到线性质粒片段（4250bp）；其中，所述的限制性内切酶BamHI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；

6、步骤（6）的具体操作步骤为：

将步骤（4）得到的酶切基因片段和步骤（5）得到的线性质粒片段经 DNA 连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。若转化子的PCR验证结果为：在3853bp处出现电泳条带，说明整合表达载体构建成功，上述转化子为阳性转化子(命名为：整合表达载体T2(2)-yugT，如图4所示)；

其中，T2-F和T2-R的序列为:

T2-F: ATGTGATAACTCGGCGTA、

T2-R: GCAAGCAGCAGATTACGC

7、步骤（7）的具体操作步骤为：

将整合表达载体T2(2)-yugT转入地衣芽胞杆菌DW2中，在37℃的条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证（所用引物为：T2-F和T2-R）。若转化子的PCR验证结果为：在3853bp处出现电泳条带，证明：整合表达载体T2(2)-yugT成功转入地衣芽胞杆菌DW2中，此时，该转化子为阳性转化子（即转入了整合表达载体T2(2)-yugT的地衣芽胞杆菌DW2）；

8、步骤（8）的具体操作步骤为：

将步骤（7）得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12 h，并以T2-F和yugT-KYR为引物（或以T2-R与yugT-KYF为引物）进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1364bp或3847bp长度的条带，即证明为单交换菌株；

其中，yugT-KYF和yugT-KYR的序列为:

yugT-KYF： TCCGATGCACATCAGGTTTGCAA、

yugT-KYR： CGGCTGCCCCGTGCCGTTTCT；

9、步骤（9）的具体操作步骤为：

将步骤（8）得到的PCR检测出现1364bp条带的单交换菌株和步骤（9）得到的PCR检测出现3847bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证（引物为yugT-KYF和yugT-KYR）。若转化子的PCR验证结果为：在1396bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为地衣芽胞杆菌DW2；在3879bp处出现电泳条带时，说明yugT基因成功整合到地衣芽胞杆菌DW2的基因组上，该转化子为阳性转化子。本发明的转化子的菌落PCR验证结果为：在3879bp处出现电泳条带，证明该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的yugT整合菌株（即地衣芽胞杆菌DW2-yugT）。

根据上述强化YugT表达的地衣芽胞杆菌的构建方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-yugT。

本发明人根据上述地衣芽胞杆菌DW2-yugT在抗菌肽生产中的应用步骤提供了14种实施例，并在表1中分别列举了实施例1-实施例14的种子培养基和发酵培养基的配方。

表1

其中，上述实施例中均采用本发明专利方法构建得到的地衣芽胞杆菌DW2-yugT菌株；种子发酵的具体步骤为：先将地衣芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1%接种于装有5mL LB培养基中，180～300r/min、温度37℃，培养10～14小时，然后将菌种活化后的菌液以体积百分比按1%接种量接种于种子发酵的培养基（实施例1-14中的种子发酵的培养基均为液体培养基，若需要种子发酵培养基为固体培养基时，仅需在原有的种子发酵的培养基（即液体培养基）的配方的基础上加琼脂 15 ~ 18 g/L即可）后于180～300r/min、37℃中培养10～12小时，得到种子培养的菌液；生产发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入25～150mL的生产发酵的培养基，然后将种子培养的菌液以接种量为2%（体积百分比），转速180～300r/min，温度37℃，发酵培养48小时，得到生产发酵的菌液。上述种子发酵的具体步骤和生产发酵的具体步骤均为现有技术。

本发明人采用高效液相色谱(HPLC)方法对上述实施例中生产发酵的菌液中杆菌肽的产量进行测定。测定条件具体为：使用Agilent 1200液相色谱仪检测；色谱柱为Hypersil BDS C18(5μm,4.6 mm×250 mm) ；流动相为A:B＝35:65(A相：100 mL pH6.0磷酸盐缓冲液到300 mL水中混合均匀；B相：520 mL甲醇与40 mL乙腈混合均匀)；流速：1.0mL/min；柱温30°C；紫外检测器波长：254 nm；进样量20μL。根据杆菌肽标准品制作的标准曲线计算出生产发酵的菌液中杆菌肽的产量（见表2）。

表2

从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵的条件下，相对于现有技术的地衣芽胞杆菌DW2来说，采用本发明的地衣芽胞杆菌DW2-yugT的生产发酵的菌液中杆菌肽效价有了大幅提升（提高18%以上），说明：本发明的技术方案在提高地衣芽胞杆菌杆菌肽产量方面具有重大应用价值。

序列表

<110> 绿康生化股份有限公司

<120> 强化YugT表达的地衣芽孢杆菌菌株及制备方法和应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1683

<212> DNA

<213> 地衣芽孢杆菌DW2(Bacillus licheniformis)

<400> 1

atgacaaggg catggtggaa agaggctgtc atatatcaag tgtatccgcg cagttttatg 60

gattcgaacg gggatggcat cggagatatc aacgggatca gagagaagct tccgtatatc 120

agggagctcg gggcagatgc catttggatt tgtccggtct ttgattctcc caatgccgat 180

aacggttatg acatcaggga ttatcaaagc attatgccgg aatttggcac gatggacgac 240

tttgacgctc tgctgactga agcgcatcag ctcggaatga aactgatcat cgatctcgtc 300

atcaatcata cgagcgatga acatccatgg tttatcgaat caagggcaga gcggaattcc 360

gggaagcggg actggtatat ttggcaagac ggaaaggacg ggagcgaacc gaacaactgg 420

gaaagcatat tcggcggctc agcctggact tatgacgaaa aaacagagca atattatctg 480

cacctgtttc acgaaaagca gccggatctg aattgggaaa acagtgacat gcgaagcgct 540

ctttatgaca tggtcaactg gtggcttcaa aaaggaatcg acgggttcag ggttgacgcg 600

atttcacaca ttaagaaaaa agaaggactt ccggatctgc cgaatccgga agggctctct 660

tttgtgcctt catttgctta tcatatgaat gtcgacggga ttatagcgtt attgcaggaa 720

ctaaaagaaa atacgttcgc cgggtatccc catatcatga cagtcggcga agcaaacggt 780

gtcagcgctg aagaagcgga ggactgggtt ggagaatcaa acgggatatt cagcatgatt 840

ttccaatttg aacacctcgg tctttggggg attgaaggcg gagaactcga tctccccgaa 900

ctcaagcgga tattgtcaaa ctggcaatcg gctcttgagg ggaaagggtg gaacgcgctt 960

tttatcgaaa atcatgatca accccgggcc gtttcagtct ggggagatga cgggaaatac 1020

agagtagaca gcgccaaggc cttagctgcg atgtattttt tgatgaaagg caccccgttt 1080

atttatcaag ggcaggaaat cggaatgaca aacgcgattt tcttcgatat agatgattat 1140

gatgacgtat cgattaaaaa tgattaccgg attcaaaaag aaaagggccg ctcacacgaa 1200

gacatcatga aggcggtttg gaaaaagagc agggatcacg cccgcacgcc gatgcaatgg 1260

acggatcggc caaatgccgg ctttactaaa ggagaaccgt ggctctgcat gaacgaaaat 1320

tacaagctga tcaatacagt tcatcagcag catgaccccc ggtcagtcta tcatttttat 1380

aaacggttga tcgcgatcag aaagcggtat gacgtcttca tcgacggatc atatgaactg 1440

ctcttgcctg aggaccggca gattttcgca tacttgcgga agcttcggga agaaacggcc 1500

atcgtgatcg tcaaccttag cgcgcgccag gcgtattacc accatcccgc atacccgtta 1560

tgtacggacg gactgctgct gtcaaatgct gatatcaacg cgcacaagca ccttacatct 1620

tttgtgatga agccttatga ggcgcgcgtt tacatgatca gacaggaaat cggcgattta 1680

taa 1683

Claims

1.强化yugT表达的地衣芽孢杆菌（ Bacillus licheniformis） DW2-yugT的应用，其特征在于，所述地衣芽孢杆菌DW2-yugT应用于杆菌肽生产中，所述地衣芽孢杆菌DW2-yugT的构建方法，包括以下步骤：

（1）以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因片段，再在yugT基因片段上游连接P43启动子、下游连接淀粉酶终止子，构成完整的yugT表达元件；

（2）同时，以地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA为模板，PCR扩增出yugT基因的上游同源臂和yugT基因的下游同源臂；

（4）采用BamHI和XbaI限制性内切酶对步骤（3）得到的目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段；

（7）将步骤（6）得到的整合质粒T2(2)-yugT转入地衣芽孢杆菌DW2中，以卡那青霉素抗性作为筛选标记，筛选得到阳性转化子，并抽质粒进行菌落PCR验证，将验证成功的阳性转化子在45℃条件下转接培养数次后，进行菌落PCR检测，得到yugT基因的上游同源臂或yugT基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株；

（8）挑选yugT基因的上游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株与yugT基因的下游同源臂与地衣芽孢杆菌DW2基因组DNA产生单交换的阳性单交换结合子菌株混合接种于37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，再经PCR法筛选得到整合了yugT基因的地衣芽孢杆菌DW2-yugT；

其中，所述的地衣芽孢杆菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武汉的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2011344；

所述地衣芽孢杆菌DW2的基因组DNA序列中的yugT基因如 SEQ ID NO.1 所示。

2.根据权利要求1所述的强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用，其特征在于，该应用步骤包括： A种子发酵，B生产发酵。

3.根据权利要求2所述的强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用，其特征在于，所述种子发酵的培养基配方为：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化钠，pH7.0 ~ 7.2。

4.根据权利要求2所述的强化yugT表达的地衣芽孢杆菌DW2-yugT的应用，其特征在于，所述生产发酵的培养基配方为：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO₃和0.5-2g/L (NH₄)₂SO₄。