CN110295189B - 4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素a发酵产量中的应用 - Google Patents

4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素a发酵产量中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术和发酵领域，具体涉及4‑氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用。本发明以质粒T2(2)‑Ori为基础，通过构建4‑氨基丁酸氨基转移酶基因gabT的敲除载体T2‑△gabT，成功在解淀粉芽胞杆菌LX‑12中敲除了gabT基因，得到了解淀粉芽胞杆菌工程菌LX‑12△gabT。与对照菌LX‑12相比，工程菌株LX‑12△gabT的IturinA产量至少提高了30%以上。

Description

4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的 应用
技术领域
本发明属于生物技术和发酵领域，具体涉及4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用。
背景技术
伊枯草菌素(IturinA)是主要由枯草芽胞杆菌和解淀粉芽胞杆菌合成产生的一种环脂肽，其分子结构包含由七个氨基酸残基组成的肽链和一条β-氨基脂肪酸侧链,氨基酸组成包括天冬酰胺(Asn)，谷氨酰胺(D-Gln)，丝氨酸(L-Ser)，脯氨酸(L-Pro)，酪氨酸(D-Tyr)，因其表现出很强的抗菌活性与溶血活性，对环境友好，所以在植物病害的生物防治等诸多领域有着非常重要的价值。脂肽类抗生素主要应用于农业生物防治、医药、石油开采、食品保藏、环境治理及化妆品等领域。
基因gabT编码4-氨基丁酸氨基转移酶，它是合成1-脱氧野尻霉素的途径基因。
目前尚无4-氨基丁酸氨基转移酶可对伊枯草菌素A的产量相关的报道。本申请通过敲除解淀粉芽胞杆菌中4-氨基丁酸氨基转移酶基因gabT，使得IturinA的产量有大幅度提升。为IturinA高产提供一种新的策略。
发明内容
本发明的目的在于提供了4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用，包括利用本领域的常规方案，将解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)中的4-氨基丁酸氨基转移酶基因敲除、沉默或降低表达；即可提高该菌株的伊枯草菌素A的产量。
以上所述的应用中，优选的，所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)为解淀粉芽胞杆菌LX-12，保藏编号为CCTCC NO：M2015234。
以上所述的应用中，所述的4-氨基丁酸氨基转移酶的基因为SEQ ID NO.1所示。
以上所述的应用中，优选的，当采用基因敲除的方式时，包括下述步骤：
(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出gabT基因的上游同源臂和gabT基因的下游同源臂；
(2)通过重叠延伸PCR将gabT基因的上游同源臂和gabT基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：gabT基因的上游同源臂-gabT基因的下游同源臂；
(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
(4)将步骤(2)得到的酶切目的片段和步骤(3)得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-△gabT；
(5)将敲除质粒T2(2)-△gabT转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，筛选即得缺失了gabT基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT。
以上所述的应用中，优选的，采用敲除基因的方式获得的缺失株，发酵时所用的发酵培养基：豆粕50-90g/L，玉米淀粉30-70g/L，KH2PO4 1.0-2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.50-1.0g/L、FeSO4·7H2O 0.10-0.30g/L、MnSO4·H2O 0.01-0.05g/L，pH6.2～7.2。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
本发明人首次尝试通过缺失gabT基因，来提高IturinA的产量，为提高IturinA产量提供了一种新策略。与解淀粉芽胞杆菌LX-12相比，通过本发明构建得到的解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT的IturinA产量提高了至少30％。本发明的研究结果表明：通过缺失gabT基因来提高IturinA产量是一个十分有效的方法。
附图说明
图1为实施例1步骤(1)得到的gabT基因的上游同源臂和下游同源臂及其重叠延伸后的目的基因片段的琼脂糖凝胶图；
其中，泳道1为DNA marker，泳道2为gabT基因的上游同源臂，泳道3为gabT基因的下游同源臂；泳道4为步骤(2)得到的目的基因片段的琼脂糖凝胶图。
图2为实施例1步骤(4)得到的敲除质粒T2(2)-△gabT菌落PCR验证的琼脂糖凝胶图；
其中，泳道1为DNA marker，泳道2为敲除质粒T2(2)-△gabT的PCR验证条带。
图3为实施例1步骤(5)得到的阳性转化子LX-12/T2(2)△gabT菌落PCR验证的琼脂糖凝胶图；
其中，泳道1为DNA marker，泳道2为LX-12/T2(2)-△gabT菌落PCR验证的条带。
图4为实施例1步骤(7)得到的缺失菌株LX-12△gabT进行菌落PCR验证图；
其中，泳道1为DNA marker，泳道2为回复突变结果即gabT菌落PCR验证条带，泳道3为敲除质粒T2(2)-△gabT双交换的菌落PCR验证的条带。
其中，上述DNA marker泳道中从上到下的条带对应的分子量依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1500bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1：
4-氨基丁酸氨基转移酶基因缺失株解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT的构建：
1、根据解淀粉芽胞杆菌LX-12基因组DNA序列中的gabT基因的上、下游序列，设计gabT基因的上游同源臂引物(T-F1和T-R1)、下游同源臂引物(T-F2和T-R2)；并以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，分别以gabT基因的上游同源臂引物、下游同源臂引物进行PCR扩增得到gabT基因的上游同源臂(598bp)和gabT基因的下游同源臂(607bp)；
其中，T-F1、T-R1、T-F2、T-R2的序列为：
T-F1；GCTCTAGAAATAGCGGTGAGGATAATCGTGC
T-R1：CTCACTTGATTTCCTCCAATAGCTTCCTTCGTTCCCACAAATACC
T-F2：GGTATTTGTGGGAACGAAGGAAGCTATTGGAGGAAATCAAGTGAG
T-R2：CGAGCTCTTGAAAACAAAAACCCCGCCA
2、通过重叠延伸PCR将gabT基因的上游同源臂和gabT基因的下游同源臂连接到一起(所用引物为T-F1和T-R2)，构成目的基因片段(1205bp)，该目的基因片段的排列顺序为：gabT基因的上游同源臂-gabT基因的下游同源臂；
3、采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段(1196bp)，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段(4244bp)；其中，所述的限制性内切酶SacI和XbaI限制性内切酶均购自北京全式金生物技术有限公司；
4、将酶切基因片段和线性质粒片段经T4DNA连接酶进行连接，得到连接产物；通过氯化钙转化法将该连接产物转入大肠杆菌DH5α，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1504bp处出现电泳条带，说明敲除载体构建成功，上述转化子为阳性转化子，命名为：敲除载体T2(2)-△gabT；
5、将敲除载体T2(2)-△gabT通过电击转化的方法转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，在37℃的条件下经含有卡那青霉素抗性的培养基进行筛选，筛选得到转化子，对转化子挑质粒进行菌落PCR验证(所用引物为：T2-F和T2-R)。若转化子的PCR验证结果为：在1504bp处出现电泳条带，证明：敲除载体T2(2)-△gabT成功转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，此时，该转化子为阳性转化子，即转入了敲除载体T2(2)-△gabT的解淀粉芽胞杆菌LX-12；
6、将步骤5得到的阳性转化子在45℃条件下、含有卡那青霉素抗性的培养基上转接培养3次，每次培养12h，并以T2-F和△gabT-KYR为引物(或以T2-R与△gabT-KYF为引物)进行菌落PCR检测单交换菌株，扩增出1643bp或2921bp长度的条带，即证明为单交换菌株；
△gabT-KYF：CCGCCAAGGCAATAAACAG
△gabT-KYR：TGACGCTTTCTTCCACTCC
7、将步骤6得到的PCR检测出现1643bp条带的单交换菌株和步骤6得到的PCR检测出现2921bp条带的单交换菌株混合接种培养，在37℃、不含有卡那青霉素的培养基中经过数次转接培养，挑转化子进行菌落PCR验证(引物为△gabT-KYF和△gabT-KYR)。若转化子的PCR验证结果为：在2911bp处出现电泳条带时，说明基因回复突变，该转化子为解淀粉芽胞杆菌LX-12；在1633bp处出现电泳条带时，说明解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组上缺失了gabT的基因，该转化子为阳性转化子。随后针对阳性转化子进行DNA测序进一步验证，得到双交换成功的gabT缺失菌株(即解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT)。
实施例2：
敲除4-氨基丁酸氨基转移酶基因在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用：
本实施例，针对不同的发酵培养基配方，考察了解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT的产伊枯草菌素A的能力(同时也在这18种培养基中接种解淀粉芽胞杆菌LX-12作为对照)，18组培养基配方具体如表1所示：
表1不同发酵培养基配方pH6.9～7.2
Figure BDA0002146150630000041
Figure BDA0002146150630000051
种子液获得的具体步骤为：先将解淀粉芽胞杆菌活化，即从甘油管以体积百分比1％接种于装有5mL LB培养基中，250r/min、温度37℃，培养12小时，然后将活化的菌液以体积百分比1％接种量接种于表1中的发酵培养基，250r/min、37℃中培养12小时，得到种子培养液；
发酵的具体步骤为：向500mL三角瓶中装入150mL的表1中的发酵培养基，然后将种子培养液以接种量为3％(体积百分比)，转速250r/min，温度28℃，发酵培养72小时，得到发酵液。
本发明人采用液相检测的方法对上述发酵液中IturinA的产量进行测定。测定条件具体为：取1.5mL发酵液于2mL离心管中，10000r/min离心15min，取300μL上清液于1.2mL甲醇中，摇匀浸提1h，然后10000r/min离心15min，0.22μm滤膜过滤后，样品用于HPLC检测。
HPLC系统为Agilent 1260series，色谱柱为Lichrospher C18(规格：5μm，25cm×4.6mm)，流动相为10mmol/L乙酸铵/乙腈＝65:35(V/V)，进样量为10ul，检测波长为210nm，流速为1.0mL/min。根据液相法计算出生产发酵液中IturinA的产量(表2)。
表2不同培养基配方发酵后的伊枯草菌素A产量
Figure BDA0002146150630000061
从表2可看出，在相同的种子发酵和生产发酵条件下，相对于现有技术的解淀粉芽胞杆菌LX-12来说，采用本发明的解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT的生产发酵的菌液中IturinA产量有了大幅提升(至少提高30％)，说明：本发明的技术方案在提高芽胞杆菌IturinA产量方面具有重大应用价值。
序列表
<110> 湖北大学
<120> 4-氨基丁酸氨基转移酶在提高伊枯草菌素A发酵产量中的应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1278
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gtggtatttg tgggaacgaa ggaaatcacg aatccagaca gcttgtatta cagtgttgac 60
gatgtagtaa tggagcgcgg agaagggatt tacctgtacg atcaagaggg gaatgagtac 120
attgattgcg cttctgccac atttaacttg aatttaggat acggtaacaa agaagtcatt 180
gatacggtta aagaacaagc cgataagctg atccatgtga catcatcttt tcaaacagac 240
gccgtaaata aactggcaga aaaactagta gaaatcgccc ccgataatct cacaaaagta 300
caccctaaag tcagcagcgg ttccggtgca aatgaaggag ctattaaaat ggctcagtat 360
tactccggaa aaaccgatgt catctcctta tttcgaagcc acctcggaca aacgtatatg 420
acttccgctt tgtccggcaa ctcattcaga aaagaacctt tcccgccgca aatttctttt 480
ggccttcaag tccccgatcc gtattgcagc cgctgttttt ataatcagaa acctgattca 540
tgcggtatgc tgtgcgtaga aagaattaat gattttattg agtatgcgag taatggaaaa 600
attgccgcca tgattattga accgatatcc ggaaacggtg gaaacgtcgt tccgcctaaa 660
gagtatttta aacagctgag acagctttgt gatgaacacg atatcgccct gatttttgat 720
gaaattcaga ccgggttcgg acggacgggc aaaatgtttg ccgcggacca cttcgatgtg 780
aaacctaata tgatgacggt agcaaaaggg ctcgggggca caggcttcca agtcgccgcc 840
actctgacgg aggacaagta taccgggctt ccggggtata cgcactcctt cacgtacggc 900
tcaaatgtga tggccgccgc tgccgcgtgt aaaaccatag atatcatgca gcgtccggga 960
tttttggaaa atgtaacgac ggtcggtcat tatattatgg atcgcttaga aacgatgaaa1020
gaggatttcg cttttatttc tgaggtaaga ggcgtcggtc ttatgatcgg tgtggagatt1080
gtaaaagaga acaatgaacc ggatgtggag ctgaccaatt atattgcaaa acgggcaatg1140
gattacgggc tgattctccg gacatcccgt tacgggttcg gaaatgtatt taaaatccgt1200
ccgcctttaa ccattacact tagtgaagcc gaagtgctct gctacagact tcgcaagcta1260
ttggaggaaa tcaagtga 1278
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gctctagaaa tagcggtgag gataatcgtg c 31
<210> 3
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctcacttgat ttcctccaat agcttccttc gttcccacaa atacc 45
<210> 4
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggtatttgtg ggaacgaagg aagctattgg aggaaatcaa gtgag 45
<210> 5
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgagctcttg aaaacaaaaa ccccgcca 28
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgccaaggc aataaacag 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgacgctttc ttccactcc 19

Claims (2)

1.4-氨基丁酸氨基转移酶在提高解淀粉芽胞杆菌发酵生产伊枯草菌素A的产量中的应用；
(1)以解淀粉芽胞杆菌LX-12的基因组DNA为模板，PCR扩增出gabT基因的上游同源臂和gabT基因的下游同源臂；
上游同源臂引物T-F1和T-R1：
T-F1；GCTCTAGAAATAGCGGTGAGGATAATCGTGC
T-R1：CTCACTTGATTTCCTCCAATAGCTTCCTTCGTTCCCACAAATACC；
下游同源臂引物T-F2和T-R2：
T-F2：GGTATTTGTGGGAACGAAGGAAGCTATTGGAGGAAATCAAGTGAG
T-R2：CGAGCTCTTGAAAACAAAAACCCCGCCA；
(2)通过重叠延伸PCR将gabT基因的上游同源臂和gabT基因的下游同源臂连接到一起，构成目的基因片段，该目的基因片段的排列顺序为：gabT基因的上游同源臂-gabT基因的下游同源臂；
(3)采用SacI和XbaI限制性内切酶对目的基因片段进行双酶切得到酶切基因片段，同时，采用SacI和XbaI限制性内切酶对质粒T2(2)-ori进行双酶切得到线性质粒片段；
(4)将步骤(2)得到的酶切目的片段和步骤(3)得到的线性质粒片段经T4-DNA连接酶进行连接，得到敲除质粒T2(2)-△gabT；
(5)将敲除质粒T2(2)-△gabT转入解淀粉芽胞杆菌LX-12中，筛选即得缺失了gabT基因的解淀粉芽胞杆菌LX-12△gabT；
所述的解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)为解淀粉芽胞杆菌LX-12，保藏编号为CCTCC NO：M2015234；
所述的4-氨基丁酸氨基转移酶的基因为SEQ ID NO.1所示。
2.根据权利要求1所述的应用，在应用过程中使用的发酵培养基配方，包括豆粕50-90g/L，玉米淀粉30-70g/L，KH2PO4 1.0-2.0g/L，MgSO4·7H2O 0.50-1.0g/L、FeSO4·7H2O0.10-0.30g/L、MnSO4·H2O 0.01-0.05g/L，pH6.2～7.2。
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CN102492639B (zh) * 2011-11-29 2013-03-06 南京大学 利用rna聚合酶突变提高环脂肽类抗生素产量的突变体及制法和应用
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