CN111218467B - 一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用 - Google Patents

一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用，通过构建自主装模块质粒pDGI‑7S6‑P43‑PhoD‑MTSase‑spyCatcher‑6xHis和质粒pAX01‑7S6‑P43‑PhoD‑spyTag‑linker‑spyTag‑MTHase‑spyTag‑6xHis，将构建的自组装模块质粒转化进B.subtilis WB800n菌体中获得无痕整合重组B.subtilis WB800n；重组菌进行分泌表达，并进行MTSase‑MTHase多酶复合体的体外组装，进行双酶转化生产海藻糖实验，使海藻糖的转化率提高至81.5％。

Description

一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及 应用
技术领域
一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程技术领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose)是由两分子吡喃环葡萄糖以1,1-糖苷键连接而成的非还原性二糖，广泛存在于细菌、酵母、真菌、植物、动物等生物体体内。
海藻糖广泛存在于自然界中，有甜度适中，性质稳定，不易分解，无还原性等特殊性质，以及生物大分子保护剂等。尤其对生物大分子有着非特异性的保护作用，因此在医学、农业、化妆品、食品等行业应用潜力巨大。自20世纪80年代开始，关于海藻糖生理生化和分子生物学的研究逐渐兴起，现已成为国际上最近开发的新型天然低聚糖之一。
酶转化法生产海藻糖是生产的主要途径，主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。其中以麦芽糊精或淀粉糖化液为底物经过麦芽寡糖基海藻糖合成酶和麦芽寡糖基海藻糖水解酶的基因工程菌的共同作用生成海藻糖，即双酶法生产海藻糖，受到广泛关注。目前国内海藻糖生产以大肠杆菌为生产菌株，但由于大肠杆菌生产菌株会产生内毒素，限制了海藻糖在食品和医药领域的应用。枯草芽孢杆菌是食品安全菌株，不产生内毒素，但枯草芽孢杆菌对异源酶的表达量比较低，对异源表达多个联级反应酶的催化效率较低。
中国专利文献CN109679887A(申请号：201811490196.1)公开了一种利用高效分泌表达的双酶融合耦合发酵生产海藻糖的方法，该发明公开了通过采用向枯草芽孢杆菌中插入启动子P43、信号肽PhoD、麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase，同时敲除裂解基因Xpf、SkfA、LytC和SdpC后，构建获得重组工程pHT01-P43-PhoD-MTSase-MTHase(LM1234)，并采用了特殊序列的刚性连接，从而实现了目标酶的功能表达。该发明以不产生内毒素的食品安全菌株枯草芽孢杆菌为生产菌，利用相互作用多肽对介导形成多酶复合体，多酶复合体可提高区域内的酶浓度和底物浓度以增加底物通道效应，提高联酶催化效率，克服多酶联级反应效率较低的问题。
中国文献《利用SpyTag/SpyCatcher构建自组装多酶复合体实现高效生物合成》(刘璐，上海交通大学，硕士论文，2018年5月)为了探索spyTag/spyCatcher在大肠杆菌体内外多酶复合体系形成有序自组装分子的能力，利用spyCatcher和spyTag分别与细胞色素单加氧酶突变体P450BM3m(A74G/F87V/L188Q)和葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，GDH)进行融合表达，以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的spyTag/spyCatcher双酶自组装复合体。但是该研究并未对本发明涉及的利用多肽对spyCatcher/spyTag为媒介构建同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及按照不同的组装方式，形成不同比例、不同结构的MTSase-MTHase多酶复合体，提高MTSase和MTHase的联级催化效率。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用。
一种构建同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的方法，包括如下步骤：
步骤1、构建自主装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis，包括如下步骤：
(1)以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD基因片段；
(2)以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段；
(3)以pUC57-spyCatcher质粒为模板PCR扩增spyCatcher基因片段；
(4)利用重叠PCR连接步骤(1)中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤(2)中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段和步骤(3)中的spyCather基因片段，制得P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis融合基因片段；
(5)将可消除抗性的枯草芽孢杆菌amyE基因位点整合载体pDGI-7S6用限制性内切酶BamHI/HindIII进行双酶切，然后与步骤(4)制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到可以消除抗性的无痕整合载体，即为自主装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis；
所述整合载体pDGI-7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71-spc-lox66基因片段替换整合载体pDG1730的第961和第1714碱基之间的壮观霉素抗性基因spc构建而成，并命名pDGI-7S6。
步骤2、构建自组装模块质粒
pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis，包括如下步骤：
a、以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段；
b、以pUC57-spyTag-linker-spyTag质粒为模板扩增spyTag-linker-spyTag基因片段；
c、以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段；
d、利用重叠PCR连接步骤a中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤b中的spyTag-linker-spyTag基因片段、步骤c中的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段制得P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis融合片段；
e、将可消除抗性的枯草芽孢杆菌lacA基因位点整合载体pAX01-7S6用限制性内切酶SacII/BamHI进行双酶切，然后与步骤d制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到无痕整合载体，即为自组装模块质粒pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis；
所述整合载体pAX01-7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71-spc-lox66基因片段插入整合载体pAX01的第2235和第2236碱基之间构建而成，并命名pAX01-7S6。
步骤3、将步骤1和步骤2构建的自组装模块质粒，分别转化进B.subtilis WB800n菌体中，制得重组B.subtilis WB800n，同时将温敏型抗性消除质粒pTSC质粒转入所述重组B.subtilis WB800n中，经变温培养得到可用于食品生产的无痕整合型重组B.subtilisWB800n。
根据本发明优选的：所述步骤(1)中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-1-F：aaaactggtctgatcggatccAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.1下划线为BamHI酶切位点；
P43-PhoD-2-R：GACTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ ID NO.2；
根据本发明优选的，所述步骤(1)中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
PhoD-P43-3-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTC SEQ ID NO.3；
PhoD-MTSase-4-R：GTCAACCATGGCCACTACTTCAAAGGCCCC SEQ ID NO.4；
根据本发明优选的，所述步骤(2)中麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
MTSase-PhoD-5-F：GGGGCCTTTGAAGTAGTGATATCAGCAAC SEQ ID NO.5；
MTSase-spyCatcher-6-R：TGTGTCAACCATGGCCATTCTAACTAGTA SEQ ID NO.6；
根据本发明优选的，所述步骤(3)中spyCatcher基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
spyCatcher-MTSase-7-F:TACTAGTTAGAATGGCCATGGTTGACACA SEQ ID NO.7；
spyCatcher-8-R:ctgcaggaattcgataagcttTTA
Figure BDA0002388058240000031
ATCGATATGGGCA TCTCC SEQ ID NO.8；下划线为HindIII酶切位点，下划虚线为6xHis标签。
根据本发明优选的，所述步骤(1)、(2)或(3)中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
所述72℃延伸30sec/kb，是指在72℃时DNA聚合酶扩增速度30sec/kb，由于扩增的基因长度不同，所以扩增30个循环，72℃延伸的时间不同。
根据本发明优选的，所述步骤(4)中的重叠PCR扩增体系如下，总体积为50μl：
启动子P43基因片段4μl，分泌信号肽PhoD基因片段4μl，MTSase基因片段4μl，spyCatcher基因片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 25μl，加ddH2O至50μl；
重叠PCR的扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，10个循环；72℃延伸5min；
重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μl：
重叠体系10μl，10μmol/L上游引物P43-1-F 2.5μl，10μmol/L下游引物spyCatcher-8-R 2.5μl，2×Phanta Max Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5min。
根据本发明优选的，所述步骤3中将步骤1构建的自组装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis转入B.subtilis WB800n后，整合到基因组中的amyE位点，得到整合型重组菌株；将pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中，获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis。
进一步优选的，所述质粒整合到amyE位点的整合型重组菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL壮观霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL壮观霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。
进一步优选的，所述pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis的筛选：将转化子涂布于5ug/mL红霉素LB平板进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5ug/mL红霉素和100ug/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis。
根据本发明优选的：所述步骤a中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
P43-1-F：aagagtgcggccgcccgcggAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.9；下划线为SacII酶切位点；
P43-PhoD-2-R：GACTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ ID NO.2；
根据本发明优选的，所述步骤a中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
PhoD-P43-3-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTC SEQ ID NO.3；
PhoD-spyTag-4-R：CACAATATGCGCCATTACTTCAAAGGCCCC SEQ ID NO.10；
根据本发明优选的，所述步骤b中，spyTag-Linker-spyTag基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
spyTag-Linker-spyTag-PhoD-5-F：
GGGGCCTTTGAAGTAGCGCATATTGTGATG SEQ ID NO.11；
spyTag-Linker-spyTag-MTHase-6-R：
CATCACAATATGCGCTACTTCAAAGGCCCC SEQ ID NO.12；
根据本发明优选的，所述步骤c中，麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因MTHase+spyTag基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如下：
MTHase-spyTag-Linker-spyTag-7-F：ATAAACCGACAAAATTTTCGTTCGGTGG
SEQ ID NO.13；
MTHase+spyTag-8-R：
gaaatgggatccTCA
Figure BDA0002388058240000051
TTTTGTCGGTTTATACGCATCAACCATCACAATATGCGCTTCTAATTGATATACCC SEQ ID NO.14；
下划线为BamHI酶切位点，下划虚线为6xHis标签。
根据本发明优选的，所述步骤a、b或c中PCR扩增体系如下：
10μmol/L上游引物2.5μl，10μmol/L下游引物2.5μl，基因模板2.5μl，2×PhantaMax Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸30sec/kb，30个循环；72℃延伸5min。
根据本发明优选的，所述步骤d中的重叠PCR扩增体系如下，总体积为50μl：
启动子P43基因片段4μl，分泌信号肽PhoD基因片段4μl，spyTag-linker-spyTag基因片段4μl，MTHase+spyTag基因片段4μl，2×Phanta Max Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
重叠程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，10个循环；72℃延伸5min；
重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μl：
重叠体系10μl，10μmol/L上游引物P43-1-F 2.5μl，10μmol/L下游引物MTHase+spyTag-8-R 2.5μl，2×Phanta Max Master Mix 25μl，加ddH2O到50μl；
重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5min。
根据本发明优选的，所述步骤3中步骤2构建的自组装模块质粒pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis转入B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis后，整合到基因组中的lacA位点，得到整合型重组菌株；将pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中，获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis。
进一步优选的，所述质粒整合到lacA位点的整合型重组菌株筛选：将转化子涂布于含100ug/mL壮观霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100ug/mL壮观霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以上述菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。
进一步优选的，所述pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis的筛选：将转化子涂布于5ug/mL红霉素培养基中进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5ug/mL红霉素和100ug/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌。
上述构建的无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis应用于发酵生产海藻糖。
有益效果
本发明采用不同组装方式的相互作用多肽对spyCatcher/spyTag为媒介，构建含有麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase的组装模块，将组装模块在体外，按照不同的组装方式，形成不同比例、不同结构的MTSase-MTHase多酶复合体，并进行双酶转化生产海藻糖实验。通过实际转化生产海藻糖发现，海藻糖的转化率提高至81.5％。相互作用多肽对spyCatcher/spyTag介导的多酶复合体的自组装，实现麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase形成两个联级酶在结构空间上较近，并且具有底物通道效应的MTSase-MTHase多酶复合体，提高MTSase和MTHase的联级催化效率。
附图说明
图1为多酶复合体海藻糖转化率-实验组柱状图；
图2为实施例5与对比例1-6涉及的不同组装形式的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型；
图中：A，实施例5对应的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型；
B，对比例1对应的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型；
C，对比例2对应的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型；
E，对比例3对应的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型；
F，对比例4对应的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型；
G，对比例5对应的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型；
H，对比例6对应的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型。
具体实施方法
下面结合具体实施例进一步阐述本发明，但本发明的保护范围不限于此。
实施例1：
构建重组质粒
1.pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis质粒构建
(1)克隆得到启动子P43基因片段
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行PCR扩增启动子P43基因片段。
所述启动子P43基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
P43-1-F：aaaactggtctgatcggatccAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.1；
下划线为BamHI酶切位点；
P43-PhoD-2-R：GACTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ ID NO.2；
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物P43-1-F 2.5μL，10μmol/L下游引物P43-PhoD-2-R 2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min；
(2)克隆得到分泌信号肽PhoD基因片段
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行PCR扩增分泌信号肽PhoD基因片段。
所述PhoD信号肽基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
PhoD-P43-3-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTC SEQ ID NO.3；
PhoD-MTSase-4-R：GTCAACCATGGCCACTACTTCAAAGGCCCC SEQ ID NO.4；
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物PhoD-P43-3-F 2.5μL，10μmol/L下游引物PhoD-MTSase-4-R 2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
(3)克隆得到麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段
以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，设计引物进行PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段。
所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
MTSase-PhoD-5-F：GGGGCCTTTGAAGTAGTGATATCAGCAAC SEQ ID NO.5；
MTSase-spyCatcher-6-R：TGTGTCAACCATGGCCATTCTAACTAGTA SEQ ID NO.6；
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物MTSase-PhoD-5-F 2.5μL，10μmol/L下游引物MTSase-spyCatcher-6-R2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 20sec，30个循环；72℃延伸5min；。
(4)克隆得到spyCatcher基因片段
以pUC57-spyCatcher质粒为模板，设计引物进行PCR扩增spyCatcher基因片段
所述spyCatcher基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
spyCatcher-MTSase-7-F：TACTAGTTAGAATGGCCATGGTTGACACA SEQ ID NO.7；
spyCatcher-8-R：
ctgcaggaattcgataagcttTTA
Figure BDA0002388058240000081
ATCGATATGGGCATCTCCTTSEQ ID NO.8；下划线为HindIII酶切位点，下划虚线为6xHis标签。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物spyCatcher-MTSase-7-F 2.5μL，10μmol/L下游引物spyCatcher-8-R 2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸20sec，30个循环；72℃延伸5min；
(5)PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。
(6)将步骤(1)、(2)(3)(4)制得的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、MTSase基因片段、spyCatcher基因片段进行重叠PCR，制得P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis融合基因片段，核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；
重叠PCR的扩增体系如下，总体积为50μL；
启动子P43基因片段4μL；分泌信号肽PhoD基因片段4μL；spyCatcher基因片段4μL；MTSase基因片段4μL；2×Phanta Max Master Mix 25μL；用ddH2O补足至50μL；
所述重叠PCR的扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，10个循环；72℃延伸5min；
所述重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μL：
重叠体系10μl，10μmol/L上游引物P43-1-F 2.5μL，10μmol/L下游引物spyCatcher-2-8-R2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
所述重叠PCR补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5min；
(7)将整合型质粒pDGI-7S6经BamHI和HindIII双酶切与步骤(6)中制得的P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis融合基因片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis。
所述pDGI-7S6质粒酶切体系为：
pDGI-7S6质粒16μL；BamHI 1μL；HindIII 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH2O 4.5μL；
反应条件：37℃反应2h。
质粒双酶切后的产物经质量百分比为1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。
所述多片段无缝克隆连接体系为：
pDGI-7S6质粒152ng；P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis 56ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH2O补足至20μL
反应条件：37℃反应30min。
2.pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis质粒构建
(1)克隆得到启动子P43基因片段
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行PCR扩增启动子P43基因片段。
所述启动子P43基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
P43-1-F：aagagtgcggccgcccgcggAGCTTCGTGCATGCAGGC SEQ ID NO.9；
下划线为SacII酶切位点；
P43-PhoD-2-R：GACTGTCGTATGCCATGTGTACATTCCTCTCTTA SEQ ID NO.2；
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物P43-1-F 2.5μL，10μmol/L下游引物P43-PhoD-2-R 2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸15sec，30个循环；72℃延伸5min；
(2)克隆得到分泌信号肽PhoD基因片段
以枯草芽孢杆菌基因组为模板，设计引物进行PCR扩增分泌信号肽PhoD基因片段。
所述分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
PhoD-P43-3-F：AGAGGAATGTACACATGGCATACGACAGTC SEQ ID NO.3；
PhoD-spyTag-4-R：GTCAACCATGGCCACTACTTCAAAGGCCCC SEQ ID NO.10；
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物PhoD-P43-3-F 2.5μL，10μmol/L下游引物PhoD-spyTag-4-R 2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
(3)克隆得到spyTag-Linker-spyTag基因片段
以pUC57-spyTag-linker-spyTag质粒为模板，设计引物进行PCR扩增spyTag-Linker-spyTag基因片段。
所述相互作用多肽spyTag-Linker-spyTag基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
SpyTag-Linker-spyTag-PhoD-5-F：
GGGGCCTTTGAAGTAGCGCATATTGTGATG SEQ ID NO.11；
SpyTag-Linker-spyTag-MTHase-6-R：
CATCACAATATGCGCTACTTCAAAGGCCCC SEQ ID NO.12；
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物spyTag-Linker-spyTag-PhoD-5-F 2.5μL，10μmol/L下游引物spyTag-Linker-spyTag-MTHase-6-R 2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸10sec，30个循环；72℃延伸5min；
(4)克隆得到MTHase+spyTag基因片段
以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段；
所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段的PCR扩增，引物核苷酸序列如下：
MTHase-spyTag-Linker-spyTag-7-F：ATAAACCGACAAAATTTTCGTTCGGTGG SEQ IDNO.13；
MTHase+spyTag-8-R：
gaaatgggatccTCA
Figure BDA0002388058240000111
TTTTGTCGGTTTATACGCATCAACCATCACAATATGCGCTTCTAATTGATATACCC SEQ ID NO.14；
下划线为BamHI酶切位点，下划虚线为6xHis标签。
所述PCR反应体系如下：
10μmol/L上游引物MTHase-spyTag-Linker-spyTag-7-F 2.5μL，10μmol/L下游引物MTHase+spyTag-8-R 2.5μL，基因模板2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
上述PCR反应按照如下程序进行：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 20sec，30个循环；72℃延伸5min；
(5)PCR结束后通过质量百分比浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。
(6)将步骤(1)、(2)、(3)、(4)制得的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、spyTag-linker-spyTag基因片段、MTHase+spyTags基因片段进行重叠PCR，制得P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis融合基因片段，核苷酸序列如SEQ IDNO.16；
重叠PCR的扩增体系如下，总体积为50μL；
启动子P43基因片段4μL；分泌信号肽PhoD基因片段4μL；spyTag-Linker-spyTag基因片段4μL；MTHase+spyTag基因片段4μL；2×Phanta Max Master Mix 25μL；用ddH2O补足至50μL；
所述重叠PCR的扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，62℃退火15sec，72℃延伸1min 30s，10个循环；72℃延伸5min；
所述重叠PCR的补充体系如下，总体积为50μL：
重叠体系10μl，10μmol/L上游引物P43-1-F 2.5μL，10μmol/L下游引物MTHase+spyTag-8-R 2.5μL，2×Phanta Max Master Mix 25μL，用ddH2O补足至50μL；
所述重叠PCR补充扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 30s，30个循环；72℃延伸5min；
(7)将整合型质粒pAX01-7S6经SacII和BamHI双酶切与步骤(6)中制得的P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis融合基因片段利用多片段无缝克隆连接，转入大肠杆菌DH5α中；鉴定成功并测序正确后，将制得的重组载体命名为pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis。
所述pAX01-7S6质粒酶切体系为：
pAX01-7S6质粒16μL；SacII 1μL；BamHI 1μL；10×buffer 2.5μL；ddH2O 4.5μL；
反应条件：37℃反应2h。
质粒双酶切后的产物经质量百分比为1％琼脂糖凝胶电泳检测，使用上海生工胶回收试剂盒回收切胶产物。
所述多片段无缝克隆连接体系为：
pAX01-7S6质粒152ng；P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis56ng；Exnase 2μL；5×CE buffer 4μL；ddH2O到20μL
反应条件：37℃反应30min。
将无缝克隆连接产物转化导入大肠杆菌DH5α感受态细胞中。
实施例2：
B.subtilis WB800n电转感受态细胞的制备
挑取新鲜LB固体培养基表面的B.subtilis WB800n单菌落于5mL LB液体培养基中，培养12h；取1mL培养12h培养物接入50mL GM培养基(GM培养基：LB+0.5M山梨醇)中，37℃振荡培养至OD600为1.0。将菌液冰水浴10min，5000rpm，4℃离心8min，收集菌体；用20mL预冷的ETM培养基(ETM培养基：0.5M山梨醇+0.5M甘露醇+10％甘油)重悬菌体，5000rpm，4℃离心8min，去上清，如此洗涤3次；将洗涤后的菌体重悬于500μL ETM培养基中，分装于EP管中，每管分装60μL。
实施例3：
将实施例1制备的重组质粒转入实施例2制备的B.subtilis WB800n中
将6μL pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis质粒加入到60μLB.subtilis WB800n感受态细胞中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(RM培养基：LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100ug/mL壮观霉素的LB平板上，37℃倒置培养，筛选含有抗壮观霉素的菌株为阳性重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis。将壮观霉素抗性消除质粒pTSC转入阳性重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis中，将转化子涂布于5ug/mL红霉素LB平板进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5ug/mL红霉素和100ug/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis。
将6μL pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis质粒加入到60μL B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis感受态细胞中，冰上孵育5min，加入预冷的电转杯(2mm)中，在2500V、5ms条件下进行电转化，电击完毕后，立即在电转杯中加入1mL 37℃预热的RM培养基(RM培养基：LB+0.5M山梨醇+0.38M甘露醇)，37℃振荡复苏培养3h，涂布于含100ug/mL壮观霉素的LB平板上，37℃倒置培养，筛选含有抗壮观霉素的菌株为阳性重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis。将壮观霉素抗性消除质粒pTSC转入阳性重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-Linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis中，将转化子涂布于5ug/mL红霉素LB平板进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5ug/mL红霉素和100ug/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis。
实施例4：
实施例3制备的阳性重组菌的鉴定
将上述阳性重组菌落接种到LB液体培养基中培养过夜，利用上海生物工程有限公司提供的试剂盒提取基因组DNA，以获得的基因组DNA为模板，分别对应的P43-1-F/spyCatcher-8-R和P43-1-F/MTHase+spyTag-8-R为引物进行PCR扩增。
所述菌落PCR扩增体系为20μL：
10μmol/L上游引物1μL；10μmol/L下游引物1μL；基因模板1μL；2×Phanta MaxMaster Mix 10μL；用ddH2O补足至20μL；
所述菌落PCR扩增程序如下：
95℃预变性3min；95℃变性15sec，60℃退火15sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5min；
琼脂糖凝胶电泳证明外源片段P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis和P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis已转入B.subtilis WB800n中，将重组菌命名为B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis。
实施例5：
上述制备的阳性重组菌的发酵
a、将重组菌接种于LB固体培养基中，37℃恒温摇床培养12h；
b、将LB固体培养基中重组菌接种于LB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养12h，制得初始种子液；
c、将步骤b制得的种子液按体积百分比1％的比例转接到TB液体培养基中，37℃、200r/min恒温摇床培养10h，制得接种种子液；
d、将步骤c制得的接种种子液按体积百分比10％的比例转接到50L发酵培养基中，在转速500rpm，温度37℃，发酵48h。将发酵液利用陶瓷膜进行过滤，即得去除菌体的发酵液清液。
培养基
LB固体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，琼脂粉2g/L，余量水；
LB液体培养基：蛋白胨1g/L，酵母浸粉0.5g/L，NaCl 1g/L，余量水，pH 7.0；
TB发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，甘油4ml/L，KH2PO4 2.4g/L，K2HPO416.5g/L，余量水；
发酵培养基：胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，蔗糖12g/L，KH2PO4 0.6g/L，K2HPO44g/L，余量水。
上述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase:MTHase＝3:1的多酶复合体。
对比例1
将pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis质粒和pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis质粒转入B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase:MTHase＝1:1的多酶复合体。
对比例2
将pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis质粒和pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis质粒转入B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase:MTHase＝2:1的多酶复合体。
对比例3
将pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis质粒和pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-linker-spyTag-6xHis质粒转入B.subtilisWB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-linker-spyTag-6xHis。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase:MTHase＝4:1的双酶复合体。
对比例4
将pDGI-7S6-P43-PhoD-spyCatcher-MTSase-spyCatcher-6xHis质粒和pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis质粒转入B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/P43-PhoD-spyCatcher-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase:MTHase＝1:2的多酶复合体。
对比例5
将pDGI-7S6-P43-PhoD-spyCatcher-linker-spyCatcher-MTSase-spyCatcher-6xHis质粒和pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis质粒转入B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/P43-PhoD-spyCatcher-linker-spyCatcher-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase:MTHase＝1:3的多酶复合体。
对比例6
将pDGI-7S6-P43-PhoD-spyCatcher-linker-spyCatcher-MTSase-spyCatcher-linker-spyCatcher-6xHis质粒和pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis质粒转入B.subtilis WB800n菌中，制得阳性重组菌，命名为B.subtilis WB800n/P43-PhoD-spyCatcher-linker-spyCatcher-MTSase-spyCatcher-linker-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-MTHase-6xHis。
采用实施例5的发酵方法对阳性重组菌进行发酵，所述阳性重组菌进行分泌表达，并进行MTSase-MTHase多酶复合体的体外组装，发酵上清液中形成MTSase:MTHase＝1:4的多酶复合体。
效果例
检测实施例5和对比例1-6阳性重组菌发酵上清液中双酶的转化率
检测方法：向实施例5与对比例1-6阳性重组菌发酵液上清液中加入20％的麦芽糊精和5％的环糊精葡萄糖基转移酶，控制温度55℃、pH 5.5、100rpm/min转速搅拌进行转化，转化8h加入0.1％的α-淀粉酶，55℃处理12h，100℃处理10min，使酶失活，检测反应液(糖化液)中海藻糖的含量，多酶复合体海藻糖的转化率结果见表1和图1。
反应液中海藻糖含量检测方法如下：
通过高效液相色谱测定反应液(糖化液)中所生成的海藻糖的浓度，测定过程中采用氨基柱；柱温为40℃；流动相采用乙腈与水的混合溶液，二者体积比为3:1；流速为1mL/min；检测器为示差检测器；检测时间为20min。
Figure BDA0002388058240000161
实施例5与对比例1-6涉及的不同组装形式的MTSase-MTHase多酶复合体自组装模型及组装模块比例见表2。
表1
实验组 MTSase：MTHase比例 海藻糖的转化率％
实施例5 3:1 81.5
对比例1 1:1 60.4
对比例2 2:1 74.0
对比例3 4:1 79.6
对比例4 1:2 62.7
对比例5 1:3 66.4
对比例6 1:4 67.0
表2
Figure BDA0002388058240000162
结果分析
通过实施例5和对比例1、2、3的海藻糖转化率结果可以看出，随着MTSase的比例增加，转化率逐渐提高，实施例5即本发明涉及的阳性重组菌发酵上清液，形成MTSase:MTHase＝3:1的多酶复合体转化率最高为81.5％，但是当MTSase:MTHase＝4:1时比MTSase:MTHase＝3:1时的转化率略有降低，是由于多个酶之间的空间结构影响与底物的结合能力造成的。由对比例1、4、5、6的转化率结果可以看出，MTSase的比例决定了转化率的大小，是双酶法转化生产海藻糖过程中的限制性因素。本发明以相互作用多肽对为媒介，将多酶联级反应过程中的MTSase和MTHase共价结合在一起，形成具有底物通道效应的MTSase-MTHase多酶复合体，提高联酶催化效率，克服多酶联级反应效率较低的问题，为双酶法工业化生产海藻糖提供了一种新的途径。同时MTSase比MTHase的相对酶活低是双酶法生产海藻糖主要限制性因素，因此通过对MTSase进行改造提高MTSase的酶活或选用更高酶活的MTSase是突破双酶法生产海藻糖生产瓶颈的关键技术。
序列表
<110> 齐鲁工业大学
<120> 一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用
<160> 16
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 1
aaaactggtc tgatcggatc cagcttcgtg catgcaggc 39
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 2
gactgtcgta tgccatgtgt acattcctct ctta 34
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 3
agaggaatgt acacatggca tacgacagtc 30
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 4
gtcaaccatg gccactactt caaaggcccc 30
<210> 5
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 5
ggggcctttg aagtagtgat atcagcaac 29
<210> 6
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 6
tgtgtcaacc atggccattc taactagta 29
<210> 7
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 7
tactagttag aatggccatg gttgacaca 29
<210> 8
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 8
ctgcaggaat tcgataagct tttagtggtg gtggtggtgg tgatcgatat gggcatctcc 60
<210> 9
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 9
aagagtgcgg ccgcccgcgg agcttcgtgc atgcaggc 38
<210> 10
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 10
cacaatatgc gccattactt caaaggcccc 30
<210> 11
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 11
ggggcctttg aagtagcgca tattgtgatg 30
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 12
catcacaata tgcgctactt caaaggcccc 30
<210> 13
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 13
ataaaccgac aaaattttcg ttcggtgg 28
<210> 14
<211> 89
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 14
gaaatgggat cctcagtggt ggtggtggtg gtgttttgtc ggtttatacg catcaaccat 60
cacaatatgc gcttctaatt gatataccc 89
<210> 15
<211> 3136
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 15
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacacatggc atacgacagt cgttttgatg aatgggtaca 480
gaaactgaaa gaggaaagct ttcaaaacaa tacgtttgac cgccgcaaat ttattcaagg 540
agcggggaag attgcaggac tttctcttgg attaacgatt gcccagtcgg ttggggcctt 600
tgaagtagtg atatcagcaa cctacagatt acagttaaat aagaatttta attttggtga 660
cgtaatcgat aacctatggt attttaagga tttaggagtt tcccatctct acctctctcc 720
tgtcttaatg gcttcgccag gaagtaacca tgggtacgat gtaatagatc attcaaggat 780
aaacgatgaa cttggaggag agaaagaata caggagatta atagagacag ctcatactat 840
tggattaggt attatacagg acatagtacc aaatcacatg gctgtaaatt ctctaaattg 900
gcgactaatg gatgtattaa aaatgggtaa aaagagtaaa tattatacgt actttgactt 960
tttcccagaa gatgataaga tacgattacc catattagga gaagatttag atacagtgat 1020
aagtaaaggt ttattaaaga tagtaaaaga tggagatgaa tatttcctag aatatttcaa 1080
atggaaactt cctctaacag aggttggaaa tgatatatac gacactttac aaaaacagaa 1140
ttatacccta atgtcttgga aaaatcctcc tagctataga cgattcttcg atgttaatac 1200
tttaatagga gtaaatgtcg aaaaagatca cgtatttcaa gagtcccatt caaagatctt 1260
agatttagat gttgatggct atagaattga tcatattgat ggattatatg atcctgagaa 1320
atatattaat gacctgaggt caataattaa aaataaaata attattgtag aaaaaattct 1380
gggatttcag gaggaattaa aattaaattc agatggaact acaggatatg acttcttaaa 1440
ttactccaac ttactgttta attttaatca agagataatg gacagtatat atgagaattt 1500
cacagcggag aaaatatcta taagtgaaag tataaagaaa ataaaagcgc aaataattga 1560
tgagctattt agttatgaag ttaaaagatt agcatcacaa ctaggaatta gctacgatat 1620
attgagagat tacctttctt gtatagatgt gtacagaact tatgctaatc agattgtaaa 1680
agagtgtgat aagaccaatg agatagagga agcaaccaaa agaaatccag aggcttatac 1740
taaattacaa caatatatgc cagcagtata cgctaaagct tatgaagata ctttcctctt 1800
tagatacaat agattaatat ccataaatga ggttggaagc gatttacgat attataagat 1860
atcgcctgat cagtttcatg tatttaatca aaaacgaaga ggaaaaatca cactaaatgc 1920
cactagcaca catgatacta agtttagtga agatgtaagg atgaaaataa gtgtattaag 1980
tgaatttcct gaagaatgga aaaataaggt cgaggaatgg catagtatca taaatccaaa 2040
ggtatcaaga aatgatgaat atagatatta tcaggtttta gtgggaagtt tttatgaggg 2100
attctctaat gattttaagg agagaataaa gcaacatatg ataaaaagtg tcagagaagc 2160
taagataaat acctcatgga gaaatcaaat aaaagaatat gaaaatagag taatggaatt 2220
agtggaagaa acttttacca ataaggattt cattaaaagt ttcatgaaat ttgaaagtaa 2280
gataagaagg atagggatga ttaagagctt atccttggtc gcattaaaaa ttatgtcagc 2340
cggtatacct gatttttatc agggaacaga aatatggcga tatttactta cagatccaga 2400
taacagagtc ccagtggatt ttaagaaatt acacgaaata ttagaaaaat ccaaaaaatt 2460
tgaaaaaaat atgttagagt ctatggacga tggaagaatt aagatgtatt taacatataa 2520
gcttttatcc ctaagaaaac agttggctga ggatttttta aagggcgagt ataagggatt 2580
agatctagaa gaaggactat gtgggtttat taggtttaac aaaattttgg taataataaa 2640
aaccaaggga agtgttaatt acaaactgaa acttgaagag ggagcaattt acacagatgt 2700
attgacagga gaagaaatta aaaaagaggt acagattaat gagctaccta ggatactagt 2760
tagaatggcc atggttgaca cacttagcgg ccttagctcc gaacaaggcc agagcggcga 2820
tatgacgatc gaagaagact ccgccacgca catcaagttc agcaaacgcg acgaggatgg 2880
caaggaactg gccggcgcca caatggaact tcgcgacagc agcggcaaaa cgatcagcac 2940
atggatcagc gatggccaag ttaaggactt ctatctttat ccgggcaagt acacgttcgt 3000
cgaaacagcc gccccagatg gctatgaggt tgccacagcc atcacgttta cggtcaacga 3060
acaaggccaa gttacggtta atggcaaggc cacgaaagga gatgcccata tcgatcacca 3120
ccaccaccac cactaa 3136
<210> 16
<211> 2467
<212> DNA
<213> 人工序列(人工序列)
<400> 16
agcttcgtgc atgcaggccg gggcatatgg gaaacagcgc ggacggagcg gaatttccaa 60
tttcatgccg cagccgcctg cgctgttctc atttgcggct tccttgtaga gctcagcatt 120
attgagtgga tgattatatt ccttttgata ggtggtatgt tttcgcttga acttttaaat 180
acagccattg aacatacggt tgatttaata actgacaaac atcaccctct tgctaaagcg 240
gccaaggacg ctgccgccgg ggctgtttgc gtttttgccg tgatttcgtg tatcattggt 300
ttacttattt ttttgccaaa gctgtaatgg ctgaaaattc ttacatttat tttacatttt 360
tagaaatggg cgtgaaaaaa agcgcgcgat tatgtaaaat ataaagtgat agcggtacca 420
ttataggtaa gagaggaatg tacacatggc atacgacagt cgttttgatg aatgggtaca 480
gaaactgaaa gaggaaagct ttcaaaacaa tacgtttgac cgccgcaaat ttattcaagg 540
agcggggaag attgcaggac tttctcttgg attaacgatt gcccagtcgg ttggggcctt 600
tgaagtagcg catattgtga tggttgatgc gtataaaccg acaaaacaaa atacattttc 660
aattacatca gattcatcag gctcaacaac accgacaaca acagcgcata ttgtgatggt 720
tgatgcgtat aaaccgacaa aattttcgtt cggtggaaat attgaaaaaa ataaaggtat 780
ctttaagtta tgggcacctt atgttaatag tgttaagctg aagttaagca aaaaacttat 840
tccaatggaa aaaaacgatg agggattttt cgaagtagaa atagacgata tcgaggaaaa 900
tttaacctat tcttatatta tagaagataa gagagagata cctgatcccg catcacgata 960
tcaaccttta ggagttcatg acaaatcaca acttataaga acagattatc agattcttga 1020
ccttggaaaa gtaaaaatag aagatctaat aatatatgaa ctccacgttg gtactttttc 1080
ccaagaagga aatttcaaag gagtaataga aaagttagat tacctcaagg atctaggaat 1140
cacaggaatt gaactgatgc ctgtggcaca atttccaggg aatagagatt ggggatacga 1200
tggtgttttt ctatacgcag ttcaaaatac ttatggcgga ccatgggaat tggctaagct 1260
agtaaacgag gcacataaaa ggggaatagc cgtaattttg gatgttgtat ataatcatat 1320
aggtcctgag ggaaattacc ttttaggatt aggtccttat ttttcagaca gatataaaac 1380
tccatgggga ttaacattta attttgatga taggggatgt gatcaagtta gaaaattcat 1440
tttagaaaat gtcgagtatt ggtttaagac ctttaaaatc gatggtctga gactggatgc 1500
agttcatgca atttttgata attcgcctaa gcatatcctc caagagatag ctgaaaaagc 1560
ccatcaatta ggaaaatttg ttattgctga aagtgattta aatgatccaa aaatagtaaa 1620
agatgattgt ggatataaaa tagatgctca atgggttgac gatttccacc acgcagttca 1680
tgcattcata acaaaagaaa aagattatta ttaccaggat tttggaagga tagaagatat 1740
agagaaaact tttaaagatg tttttgttta tgatggaaag tattctagat acagaggaag 1800
aactcatggt gctcctgtag gtgatcttcc accacgtaaa tttgtagtct tcatacaaaa 1860
tcacgatcaa gtaggaaata gaggaaatgg ggaaagactt tccatattaa ccgataaaac 1920
gacatacctt atggcagcca cactatatat actctcaccg tatataccgc taatatttat 1980
gggcgaggaa tattatgaga cgaatccttt tttcttcttc tctgatttct cagatcccgt 2040
attaattaag ggtgttagag aaggtagact aaaggaaaat aatcaaatga tagatccaca 2100
atctgaggaa gcgttcttaa agagtaaact ttcatggaaa attgatgagg aagttttaga 2160
ttattataaa caactgataa atatcagaaa gagatataat aattgtaaaa gggtaaagga 2220
agttaggaga gaagggaact gtattacttt gatcatggaa aaaataggaa taattgcatc 2280
gtttgatgat attgtaatta attctaaaat tacaggtaat ttacttatag gcataggatt 2340
tccgaaaaaa ttgaaaaaag atgaattaat taaggttaac agaggtgttg gggtatatca 2400
attagaagcg catattgtga tggttgatgc gtataaaccg acaaaacacc accaccacca 2460
ccactga 2467

Claims (20)

1.一种构建同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1、构建自主装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis，包括如下步骤：
（1）以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43、分泌信号肽PhoD基因片段；
（2）以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段；
（3）以pUC57-spyCatcher质粒为模板PCR扩增spyCatcher基因片段；
（4）利用重叠PCR连接步骤（1）中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤（2）中的麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段和步骤（3）中的spyCather基因片段，制得P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis融合基因片段；
（5）将可消除抗性的枯草芽孢杆菌amyE基因位点整合载体pDGI-7S6质粒用限制性内切酶BamHI/HindIII进行双酶切，然后与步骤（4）制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到可以消除抗性的无痕整合载体，即为自主装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-
MTSase-spyCatcher-6xHis；
所述整合载体pDGI-7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71-spc-lox66基因片段替换整合载体pDG1730的第961和第1714碱基之间的壮观霉素抗性基因spc构建而成，并命名pDGI-7S6；
步骤2、构建自组装模块质粒pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis，包括如下步骤：
a、以枯草芽孢杆菌基因组为模板，PCR扩增组成型启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段；
b、以pUC57-spyTag-linker-spyTag质粒为模板扩增spyTag-linker-spyTag基因片段；
c、以嗜酸热硫化叶菌Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909基因组为模板，PCR扩增麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase+spyTag基因片段；
d、利用重叠PCR连接步骤a中的启动子P43基因片段、分泌信号肽PhoD基因片段、步骤b中的spyTag-linker-spyTag基因片段、步骤c中的麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase
+spyTag基因片段制得P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis融合片段；
e、将可消除抗性的枯草芽孢杆菌lacA基因位点整合载体pAX01-7S6质粒用限制性内切酶SacII/BamHI进行双酶切，然后与步骤d制得的融合基因片段利用无缝克隆技术进行连接，得到无痕整合载体，即为自组装模块质粒pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-
MTHase-spyTag-6xHis；
所述整合载体pAX01-7S6是将Cre/lox定点重组系统的lox71-spc-lox66基因片段插入整合载体pAX01的第2235和第2236碱基之间构建而成，并命名pAX01-7S6；
步骤3、将步骤1和步骤2构建的自组装模块质粒，分别转化进B.subtilis WB800n菌体中，制得重组B.subtilis WB800n，同时将温敏型抗性消除质粒pTSC质粒转入所述重组B.subtilis WB800n中，经变温培养得到可用于食品生产的无痕整合型重组B.subtilisWB800n。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如 SEQ ID NO.3和 SEQ ID NO.4所示。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2）中麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSase基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3）中spyCatcher基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（1）、（2）或（3）中PCR扩增体系如下：
10 μmol/L上游引物2.5 μl，10 μmol/L下游引物2.5 μl，基因模板2.5 μl，2×PhantaMax Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（4）中的重叠PCR扩增体系如下，总体积为50μl：
启动子P43基因片段4 μl，分泌信号肽PhoD基因片段4 μl，MTSase基因片段4 μl，spyCatcher基因片段4 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O至50μl；
重叠PCR的扩增程序如下：
95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，62℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，10个循环；72℃延伸5 min；
重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μl：
重叠体系10μl，10 μmol/L上游引物SEQ ID NO.1 2.5 μl，10 μmol/L下游引物SEQ IDNO.8 2.5 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl；
重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5 min。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中将步骤1构建的自组装模块质粒pDGI-7S6-P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis转入B.subtilis WB800n后，整合到基因组中的amyE位点，得到整合型重组菌株；将pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中，获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述质粒整合到amyE位点的整合型重组菌株筛选：将转化子涂布于含100μg/mL壮观霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100μg/mL壮观霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以所得菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis的筛选：将转化子涂布于5μg/mL红霉素LB平板进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5μg/mL红霉素和100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis。
11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中启动子P43基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.2所示。
12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a中分泌信号肽PhoD基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.10所示。
13.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，spyTag-Linker-spyTag基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
14.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤c中，麦芽寡糖基海藻糖水解酶基因MTHase+spyTag基因片段的PCR扩增引物核苷酸序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
15.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a、b或c中PCR扩增体系如下：
10 μmol/L上游引物2.5 μl，10 μmol/L下游引物2.5 μl，基因模板2.5 μl，2×PhantaMax Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl。
16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤d中的重叠PCR扩增体系如下，总体积为50μl：
启动子P43基因片段4 μl，分泌信号肽PhoD基因片段4 μl，spyTag-linker-spyTag基因片段4 μl，MTHase+spyTag基因片段4 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl；
重叠程序如下：
95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，62℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，10个循环；72℃延伸5 min；
重叠PCR的补充扩增体系如下，总体积为50μl：
重叠体系10μl，10 μmol/L上游引物SEQ ID NO.9 2.5 μl，10 μmol/L下游引物SEQ IDNO.14 2.5 μl，2×Phanta Max Master Mix 25 μl，加ddH2O到50μl；
重叠PCR的补充扩增程序如下：
95℃预变性3 min；95℃变性15 sec，60℃退火15 sec，72℃延伸1min 30sec，30个循环；72℃延伸5 min。
17.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3中步骤2构建的自组装模块质粒pAX01-7S6-P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis转入B.subtilisWB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis后，整合到基因组中的lacA位点，得到整合型重组菌株；将pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中，获得无痕整合重组菌B.subtilisWB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-MTHase-spyTag-6xHis。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述质粒整合到lacA位点的整合型重组菌株筛选：将转化子涂布于含100μg/mL壮观霉素抗性的LB平板，37℃培养12h，用牙签挑取壮观霉素抗性的LB平板上的转化子，分别接种到含有100μg/mL壮观霉素抗性的LB液体培养基，37℃培养12h，分别以所得菌液为模板进行PCR扩增验证，经过琼脂糖凝胶电泳获得相应的目的条带得到整合型重组菌株。
19.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述pTSC质粒转入构建的整合型重组菌株中获得无痕整合重组菌B.subtilis WB800n/P43-PhoD-MTSase-spyCatcher-6xHis/P43-PhoD-spyTag-linker-spyTag-
MTHase-spyTag-6xHis的筛选：将转化子涂布于5μg/mL红霉素培养基中进行筛选，将红霉素LB平板长出的转化子接种于无抗性的LB液体培养基中，经IPTG诱导培养48h；取少量诱导培养后的菌液，涂布于无抗性的LB固体培养基中，待长出单菌落，接种到分别含5μg/mL红霉素和100μg/mL壮观霉素的LB固体培养基中，若在无抗性培养基中生长，分别在红霉素和壮观霉素固体培养基中不生长即获得无痕整合重组菌。
20.权利要求1-19任意之一所述的方法构建的同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌在发酵生产海藻糖中的应用。
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