CN108707634A - 一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用 - Google Patents

一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN108707634A
CN108707634A CN201810569402.1A CN201810569402A CN108707634A CN 108707634 A CN108707634 A CN 108707634A CN 201810569402 A CN201810569402 A CN 201810569402A CN 108707634 A CN108707634 A CN 108707634A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trehalose
solution
coupling production
rice starch
multienzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201810569402.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108707634B (zh
Inventor
吴敬
宿玲恰
封金云
陈春
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Priority to CN201810569402.1A priority Critical patent/CN108707634B/zh
Publication of CN108707634A publication Critical patent/CN108707634A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108707634B publication Critical patent/CN108707634B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/18—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a glycosyl transferase, e.g. alpha-, beta- or gamma-cyclodextrins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/12—Disaccharides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用，属于酶技术领域。本发明以大米淀粉为底物，利用4‑α糖基转移酶和环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活性，采用普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、4‑α糖基转移酶(TaAM)以及环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)进行多酶偶联提高底物利用率，从而提高海藻糖的产量。

Description

一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用
技术领域
本发明涉及一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用，属于酶技术领域。
背景技术
海藻糖(Trehalose)是通过α,α-1,1-糖苷键连接而成的安全的非还原性二糖，广泛存在于自然界中，对生物大分子有着非特异性的保护作用，是一种甜味剂，能更好的改善食品风味，因此被广泛应用于食品、医学、农业、化妆品等行业。
自20世纪80年代后，各国相继开展了海藻糖对生理功能作用的研究，现已成为国际上开发研究的主要低聚糖之一。
海藻糖的合成主要有磷酸化酶法、海藻糖合成酶法和双酶法这三种方法。其中双酶法生产海藻糖转化率高达80％以上，其作用机理为以淀粉为底物经普鲁兰酶脱支为麦芽糊精、麦芽寡糖基海藻糖合成酶作用于底物还原性末端的α-1,4-糖苷建，通过分子内转糖苷作用将α,α-1,4-糖苷键转为α,α-1,1-糖苷键，形成中间产物麦芽寡糖基海藻糖，麦芽寡糖基海藻糖水解酶则专一的内切该中间产物中麦芽寡糖基与海藻糖相连的α,α-1,4-糖苷键，使之分解产生海藻糖和减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖，减少两个葡萄糖单位的新麦芽寡糖作为新底物进行下一轮反应，如此反复交替进行两种酶反应就可以将麦芽寡糖转化成主要为海藻糖，及少量葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的产物。双酶法生产海藻糖以淀粉为底物，具有低成本的优点，但是双酶法麦芽寡糖基海藻糖合成酶对麦芽四糖和麦芽三糖的亲和性较低，导致反应液中的小分子麦芽糖难以利用，使得在工业生产中淀粉底物的利用率降低，从而提高了生产成本。
鉴于此，开发一种能将反应液中小分子麦芽糖进行糖苷化连接的多酶偶联方法对提高海藻糖产量具有十分重要的意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明以大米淀粉为底物，利用4-α糖基转移酶和环糊精葡萄糖基转移酶的歧化活性，采用普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、4-α糖基转移酶(TaAM)以及环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)进行多酶偶联提高底物利用率，从而提高海藻糖的产量。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了一种多酶偶联生产海藻糖的方法，所述方法为以淀粉为底物，经α-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、4-α糖基转移酶(TaAM)、环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)和糖化酶共同作用合成海藻糖。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将大米淀粉配置一定浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液煮沸，加入α-淀粉酶搅拌，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液降温至一定的温度后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、4-α糖基转移酶以及环糊精葡萄糖基转移酶进行酶催化反应，然后灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到合适pH，加入糖化酶糖化。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将大米淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配置一定浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入α-淀粉酶搅拌25～30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至55～65℃后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、4-α糖基转移酶以及环糊精葡萄糖基转移酶，调节pH至5～6，在120～180r/min的转速下于60℃的水浴摇床中进行酶催化反应30～35h，然后沸水浴灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到pH为4～5，加入糖化酶于55～65℃糖化18～24h。
在本发明的一种实施方式中，所述方法为将大米淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配置一定浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入α-淀粉酶搅拌30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、4-α糖基转移酶以及环糊精葡萄糖基转移酶，调节pH为5.5，在150r/min的转速下于60℃的水浴摇床中进行酶催化反应35h，然后沸水浴灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到pH为4.5，加入糖化酶于60℃糖化24h。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的浓度为18～22mM。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的浓度为20mM。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为5～6。
在本发明的一种实施方式中，所述磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液的pH为5.5。
在本发明的一种实施方式中，所述大米淀粉溶液的浓度为12～18wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述大米淀粉溶液的浓度为15wt％。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的添加量为9～11U/g；所述1U为在70℃，pH6.0条件下，1min液化可溶性淀粉生成1μmol葡萄糖当量的还原糖所需的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶的添加量为10U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述α-淀粉酶为来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精溶液的DE值为14～18。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽糊精溶液的DE值为16。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶的添加量为4～6U/g；所述1U为在60℃、pH4.5条件下，1min内转化普鲁兰多糖生成1μmol还原糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶的添加量为5U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述普鲁兰酶为来源于地衣芽孢杆菌(Bacillusderamificans)的普鲁兰酶。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的添加量为2～3U/mL；所述1U为在55℃、pH6.0条件下，1min内能转化麦芽六糖生成1μmol麦芽四糖基海藻糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的添加量为2.5U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶为来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的麦芽寡糖基海藻糖合成酶。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的添加量为2～3U/mL；所述1U为在60℃、pH6.0条件下，1min内能转化麦芽四糖基海藻糖生成1μmol海藻糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的添加量为2.5U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶为来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的麦芽寡糖基海藻糖水解酶。
在本发明的一种实施方式中，所述4-α糖基转移酶的添加量为0.2～0.8U/mL；所述1U为在70℃、pH5.5条件下，1min内能转化马铃薯直链淀粉生成1μmol麦芽糖当量的还原糖所需酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述4-α糖基转移酶的添加量为0.5U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述4-α糖基转移酶为来源于水生栖热菌(Thermusaquaticus ATCC 33923)的4-α糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为0.2～0.3U/mL；所述1U为在50℃、pH5.5条件下，1min内能转化可溶性淀粉生成1μmol麦芽糖当量的还原糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为0.24U/mL。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶为α-环糊精葡萄糖基转移酶或β-环糊精葡萄糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，所述环糊精葡萄糖基转移酶为来源于软化芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-环糊精葡萄糖基转移酶或来源于环状芽胞杆菌(Bacilluscirculans)的β-环糊精葡萄糖基转移酶。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶的添加量为4～6U/g；所述1U为在60℃、pH4.5条件下，1min内转化可溶性淀粉生成1μmol葡萄糖的酶量。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶的添加量为5U/g。
在本发明的一种实施方式中，所述糖化酶为来源于黑曲霉(Aspergillus niger)的α-淀粉酶。
本发明提供了应用上述一种多酶偶联生产海藻糖的方法生产得到的海藻糖。
本发明提供了上述一种多酶偶联生产海藻糖的方法或上述生产得到的海藻糖在制备食品、药品以及化妆品方面的应用。
有益效果：
(1)利用本发明的方法可高效合成海藻糖，以15wt％大米淀粉溶液为底物合成海藻糖的转化率达到72％，而普通双酶法以15wt％大米淀粉溶液为底物合成海藻糖转化率50％左右；
(2)利用本发明的方法可将酶催化反应周期缩短至30h，为工业生产制备海藻糖降低了成本，而普通双酶法合成海藻糖周期为35h，成本较高；
(3)在大米淀粉底物浓度为15wt％的条件下，本发明的方法生产海藻糖的产量高达108g/L，而同等条件下，普通双酶法的产量仅为75g/L。
具体实施方式
下面以淀粉中产物利用率最低放入大米淀粉为例，结合各个实施例对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的检测方法：
转化产物检测方法：
高效液相色谱(HPLC)法：
色谱柱：氨基柱(赛默飞APS-2 HYPERSIL)
流动相为乙腈：水＝80：20。
标准品：称取海藻糖(纯度＝99.5％)标准品0.5g，精确至0.0001g，用超纯水溶解并定容至50mL，摇匀。用0.2um微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用。
样品制备：将糖化结束的催化液于沸水中煮沸10分钟灭酶，用超纯水稀释10倍，12000r/min离心25分钟。用0.2um微孔滤膜过滤，收集滤液供测定用。
试样的测定：首先用流动相以0.8mL/min的流速冲洗管路30分钟，装上色谱柱，正式进样分析前，将所用流动相输入参比池40分钟，走基线，待基线走稳后,将标准溶液和制备好的试样分别进样10uL。根据标准品的保留时间定性样品中的糖组分，根据样品的峰面积，以外标法计算糖组分的浓度。
结果计算：
式中：Cm—海藻糖浓度，单位为(g/L)；
Am—样品峰面积；
As—标准品峰面积；
Cs—标准品质量，g；
海藻糖转化率的计算：
式中：X1—海藻糖转化率，单位为(％)；
Cm—海藻糖浓度，单位为(g/L)；
C0—淀粉浓度，单位为(g/L)。
实施例1：多酶偶联催化与普通双酶法合成海藻糖比较
1)普通双酶法合成海藻糖：将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制15wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，分别加5U/g来源于Bacillusderamificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldariusATCC 33909)MTHase，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应35h后终止反应并加入5U/g糖化酶(购自诺维信生物技术有限公司)调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：海藻糖产量为75g/L，转化率为50％。
2)多酶偶联催化合成海藻糖：将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制15wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，分别加入5U/g来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobusacidocaldarius ATCC 33909)的MTHase、0.24U/mL来源于来源于软化芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-CGTase、0.5U/mL来源于水生栖热菌(Thermus aquaticusATCC 33923)的4-α糖基转移酶，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应30h后终止反应并加入糖化酶调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：海藻糖产量为108g/L，转化率为72％。
3)多酶偶联催化合成海藻糖：将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制15wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成15wt％的麦芽糊精溶液；分别加入5U/g来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTHase、0.24U/mL来源于环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)的β-CGTase、0.5U/mL来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus ATCC 33923)的4-α糖基转移酶，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应30h后终止反应并加入糖化酶调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：海藻糖产量为105g/L，转化率为70％。
结果表明，以15wt％大米淀粉为底物液化为糊精溶液，多酶偶联合成海藻糖的转化率更高，糖化前终反应体系中海藻糖含量提高，同时葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖的含量减少，且反应比普通双酶法合成更高效，普通双酶法及其与TaAM和α-CGT复配或与TaAM和β-CGT复配对海藻糖转化率分别为50％、72％、70％。
实施例2：环糊精葡萄糖基转移酶的添加量对海藻糖产率的影响
1)将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制15wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，加入5U/g的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL的来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTHase、分别添加0.12、0.18、0.24、0.3、0.36U/mL来源于软化芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-CGTase、0.5U/mL来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus ATCC 33923)的4-α糖基转移酶，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应30h后终止反应并加入糖化酶调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：α-CGTase的添加量为0.24U/mL时，海藻糖产量最高，达到108g/L。
结果表明，α-CGTase的最适添加量为0.24U/mL时，此条件下海藻糖转化率达到72％。
2)将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制15wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，加入5U/g的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTHase、分别添加0.12、0.18、0.24、0.3、0.36U/mL来源于环状芽胞杆菌(Bacillus circulans)的β-CGTase、0.5U/mL来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus ATCC 33923)的4-α糖基转移酶，pH5.5，60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应30h后终止反应并加入糖化酶调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：β-CGTase的添加量为0.24U/mL时，海藻糖产量最高，达到104.8g/L。
结果表明，β-CGTase的最适添加量为0.24U/mL时，此条件下海藻糖转化率达到69.8％。
实施例3：反应温度对海藻糖产率的影响
将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制15wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，加入5U/g的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTHase、0.24U/mL来源于软化芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-CGTase、0.5U/mL来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus ATCC 33923)的4-α糖基转移酶，pH5.5，分别放于45、50、60、65℃恒温水浴摇床，150r/min，反应30h后终止反应并加入糖化酶调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：恒温水浴摇床温度为60℃时，海藻糖产量最高，达到107.6g/L。
结果表明，催化反应最适温度为60℃时，海藻糖转化率最高，达到71.73％。
实施例4：pH对海藻糖产率的影响
将大米淀粉加入20mM磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配制15wt％的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液于沸水浴中煮沸，加入10U/mL来源于嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillusstearothermophilus)的α-淀粉酶搅拌25-30分钟，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液于降温至60℃后，加入5U/g的来源于Bacillus deramificans的普鲁兰酶、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTSase、2.5U/mL来源于嗜酸热硫化叶菌(Sulfolobus acidocaldarius ATCC 33909)的MTHase、0.24U/mL来源于软化芽孢杆菌(Paenibacillus macerans)的α-CGTase、0.5U/mL来源于水生栖热菌(Thermus aquaticus ATCC 33923)的4-α糖基转移酶，分别调节pH4.5、5.0、5.5、6.0，分别放于60℃恒温水浴摇床，150r/min，反应30h后终止反应并加入糖化酶调节pH4.5，于60℃恒温水浴摇床，150r/min，糖化24h并煮沸处理。
HPLC检测转化产物，计算海藻糖产率。
检测结果为：催化反应pH为5.5时，海藻糖产量最高，达到108g/L。
结果表明，催化反应的最适pH为5.5时，海藻糖转化率最高达72％。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法为以大米淀粉为底物，经α-淀粉酶、普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)、麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)、4-α糖基转移酶(TaAM)、环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase)和糖化酶共同作用合成海藻糖。
2.如权利要求1所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述方法为将大米淀粉加入磷酸二氢钠-磷酸二氢钠缓冲液中配置一定浓度的大米淀粉溶液，将大米淀粉溶液煮沸，加入α-淀粉酶搅拌，将淀粉溶液液化成麦芽糊精溶液；将得到的麦芽糊精溶液降温至一定的温度后，添加普鲁兰酶、麦芽寡糖基海藻糖合成酶、麦芽寡糖基海藻糖水解酶、4-α糖基转移酶以及环糊精葡萄糖基转移酶进行酶催化反应，然后灭酶得到反应液；将所得的反应液调节到合适pH，加入糖化酶糖化。
3.如权利要求1或2所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述普鲁兰酶的添加量为4～6U/g。
4.如权利要求1-3任一所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述麦芽寡糖基海藻糖合成酶的添加量为2～3U/mL。
5.如权利要求1-4任一所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述麦芽寡糖基海藻糖水解酶的添加量为2～3U/mL。
6.如权利要求1-5任一所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述4-α糖基转移酶的添加量为0.2～0.8U/mL。
7.如权利要求1-6任一所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述环糊精葡萄糖基转移酶的添加量为0.2～0.3U/mL。
8.如权利要求1-7任一所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法，其特征在于，所述糖化酶的添加量为4～6U/g。
9.应用权利要求1-8任一所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法生产得到的海藻糖。
10.权利要求1-8任一所述的一种多酶偶联生产海藻糖的方法或权利要求9生产得到的海藻糖在制备食品、药品以及化妆品方面的应用。
CN201810569402.1A 2018-06-05 2018-06-05 一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用 Active CN108707634B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810569402.1A CN108707634B (zh) 2018-06-05 2018-06-05 一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810569402.1A CN108707634B (zh) 2018-06-05 2018-06-05 一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108707634A true CN108707634A (zh) 2018-10-26
CN108707634B CN108707634B (zh) 2021-08-24

Family

ID=63870443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810569402.1A Active CN108707634B (zh) 2018-06-05 2018-06-05 一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108707634B (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109486786A (zh) * 2018-12-07 2019-03-19 江南大学 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN110055233A (zh) * 2019-04-19 2019-07-26 江南大学 一种热稳定性提高的MTSase突变体及其应用
CN111218467A (zh) * 2020-02-20 2020-06-02 齐鲁工业大学 一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用
CN112941130A (zh) * 2021-04-20 2021-06-11 江苏省奥谷生物科技有限公司 一种多酶复配生产海藻糖的方法
WO2021169096A1 (zh) * 2020-02-24 2021-09-02 江南大学 一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法
CN115554456A (zh) * 2022-10-11 2023-01-03 珠海市雅莎医疗器械有限公司 一种含海藻糖的皮肤屏障修复敷料及制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010064748A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Screening of abundantly secreted proteins and their use as fusion partners for the production of recombinant proteins
CN103789281A (zh) * 2014-02-18 2014-05-14 中国农业大学 一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用
CN106244647A (zh) * 2016-08-24 2016-12-21 山东福洋生物科技有限公司 一种同时制备海藻糖和葡萄糖酸内酯的方法
CN110055233A (zh) * 2019-04-19 2019-07-26 江南大学 一种热稳定性提高的MTSase突变体及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010064748A1 (en) * 2008-12-04 2010-06-10 Korea Research Institute Of Bioscience And Biotechnology Screening of abundantly secreted proteins and their use as fusion partners for the production of recombinant proteins
CN103789281A (zh) * 2014-02-18 2014-05-14 中国农业大学 一种葡聚糖分支酶及其编码基因与应用
CN106244647A (zh) * 2016-08-24 2016-12-21 山东福洋生物科技有限公司 一种同时制备海藻糖和葡萄糖酸内酯的方法
CN110055233A (zh) * 2019-04-19 2019-07-26 江南大学 一种热稳定性提高的MTSase突变体及其应用

Non-Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ASTHANA R K等: "Trehalose-Producing enzymes MTSase and MTHase in Anabaena 7120 under NaCl stress", 《CURRENT MICROBIOLOGY》 *
KAZUHISA MUKAI: "Production of Trehalose from Starch by Thermostable Enzymes from Sulfolobus acidocaldarius", 《STARCH - STARKE》 *
XU Y等: "Cycloamylose production from amylomaize by isoamylase and Thermus aquaticus 4-α-glucanotransferase", 《CARBOHYDRATE POLYMERS》 *
YOSHINOBU T等: "Thermus aquaticus ATCC 33923 amylomaltase gene cloning and expression and", 《APPLIED AND ENVIRONMENTAL MICROBIOLOGY》 *
张力田: "《淀粉糖-第三版》", 31 August 2011, 中国轻工业出版社 *
曹旭: "4-α-糖基转移酶及其酶解大米淀粉的特性研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》 *
朱荣: "4-α-糖基转移酶的重组表达及制备大圆环糊精的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库工程科技I辑》 *
朱荣等: "重组4-α-糖基转移酶转化淀粉制备大元糊精的条件优化", 《食品与生物技术学报》 *
杜立: "糖基转移酶在海藻糖制备中的应用性能表征，分子改造及其发酵优化", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库基础科学辑》 *
杜立等: "提高源自Bacillus circulans 251的β-CGTase对麦芽糖亲和性及其在生产海藻糖中的应用", 《中国生物工程杂志》 *
王金鹏: "4α糖基转移酶环化活性定向控制及其大环糊精产物的分离及应用研究", 《中国博士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *
郝利平等: "《食品添加剂》", 31 July 2016, 中国农业大学出版社 *

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109486786A (zh) * 2018-12-07 2019-03-19 江南大学 一种环糊精葡萄糖基转移酶突变体
CN110055233A (zh) * 2019-04-19 2019-07-26 江南大学 一种热稳定性提高的MTSase突变体及其应用
CN111218467A (zh) * 2020-02-20 2020-06-02 齐鲁工业大学 一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用
CN111218467B (zh) * 2020-02-20 2021-12-21 齐鲁工业大学 一种同步分泌MTHase和MTSase重组枯草芽孢杆菌的构建及应用
WO2021169096A1 (zh) * 2020-02-24 2021-09-02 江南大学 一种多酶耦合生产单一聚合度麦芽糊精的方法
CN112941130A (zh) * 2021-04-20 2021-06-11 江苏省奥谷生物科技有限公司 一种多酶复配生产海藻糖的方法
CN115554456A (zh) * 2022-10-11 2023-01-03 珠海市雅莎医疗器械有限公司 一种含海藻糖的皮肤屏障修复敷料及制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN108707634B (zh) 2021-08-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108707634A (zh) 一种多酶偶联生产海藻糖的方法及其应用
JP3957684B2 (ja) グルカンの製造法およびその調製法
CN102373257B (zh) 低聚异麦芽糖的生产及其用途
EP0327099B1 (en) Cyclomaltodextrin glucanotransferase, process for its preparation and novel microorganism useful for the process
CN104131051B (zh) 一种低聚异麦芽糖的制备方法
CN108486080B (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶及其制备方法
US8871473B2 (en) Method for producing γ-cyclodextrin by simultaneous use of γ-cyclodextrin glycosyltransferase and isoamylase
CN108531466A (zh) 一种产物特异性提高的环糊精葡萄糖基转移酶及制备方法
CN108018268A (zh) 一种提高aa-2g产量的环糊精葡萄糖基转移酶突变体
JPH08311103A (ja) 環状構造を有するグルカンおよびその製造方法
CN108300749A (zh) 一种用双酶法制备直链麦芽五糖的方法
Gastón et al. Maltooligosaccharides production catalysed by cyclodextrin glycosyltransferase from Bacillus circulans DF 9R in batch and continuous operation
CN106480133A (zh) 海洋α‑环糊精葡萄糖基转移酶转化淀粉制备α‑环糊精的方法
CN106755197B (zh) 一种利用直链麦芽低聚糖生成酶制备直链麦芽六糖的方法
JPH0320121B2 (zh)
CN110747245B (zh) 一种利用复合酶制备麦芽低聚糖浆的方法
CN108707633A (zh) 一种多酶复配生产海藻糖的方法及其应用
CN109943609B (zh) 一种温度稳定性高的CGTase及用其制备γ-环糊精
JP5726499B2 (ja) 環状構造を有する分岐状グルカンの製造方法
Tian et al. Amylosucrase: a versatile sucrose-utilizing transglucosylase for glycodiversification
CN108300748A (zh) 一种全酶法制备交替糖寡糖的方法
EP0506790A1 (en) METHOD FOR THE ENZYMATIC CONVERSION OF STARCH IN CYCLODEXTRINE.
JP4011102B2 (ja) グルカンの製造法およびその調製法
JP2001204488A (ja) オリゴ糖の製造方法
JPS5835663B2 (ja) マルトテトラオ−スを含むサイクロデキストリン水アメの製法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant